Interleukin-5 ELISA
Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de
Interleucina-5 (IL-5) en sobrenadantes de cultivo celular y suero humanos.
BE53051
96
2-8°C
INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO
1. Uso Propuesto ... 2
2. Resumen ... 2
3. Principio de Ensayo ... 2
4. Reactivos Suministrados ... 3
5. Instrucciones de Almacenamiento ... 3
6. Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento ... 4
7. Material Requirido Pero No Suministrado... 4
8. Precauciones de Uso ... 5
9. Preparación de los Reactivos ... 6
10. Protocolo de Ensayo ... 8
11. Calculo de Resultados ... 11
12. Límites ... 12
13. Pruebas Funcionales ... 13
14. Información de pedidos ... 14
15. Resumen: Preparación de Reactivos ... 14
16. Resumen de Protocolo de Ensayo ... 15
1.
Uso Propuesto
El ELISA IL-5 humana es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa de la IL-5 humana.
El ELISA IL-5 humana es para el diagnóstico in vitro. No debe utilizarse en los procedimientos terapéuticos.
2.
Resumen
Se describió la IL-5 humana como un factor de sustitución de linfocitos T y como un factor II de crecimiento de linfocitos B, según su inducción de proliferación y secreción de Ig mediante los linfocitos B activados. Además, se atribuyeron otras tantas actividades a esta citocina, incluidas la inducción de crecimiento y la diferenciación de eosinófilos a partir de los mielohemocitoblastos, la inducción de la expresión de mIL-2R en linfocitos B activados y aumento de la secrección de IgA mediante linfocitos B estimulados por LPS. Se ha demostrado que la IL-5 se produce gracias al subconjunto de linfocitos TH2 de clones de linfocitos TH
humanos. El espectro de las actividades biológicas de la IL-5, tanto en los linfocitos B como en otros tipos de células, sugiere que la IL-5 cumple una función importante en las actividades de los linfocitos TH2.
La IL-5 es una glucoproteína con alta glucosilación, que tiene un peso molecular nativo de entre 45 y 60 kDa, con múltiples subunidades de entre 24 y 28 kDa en condiciones de reducción.
3.
Principio de Ensayo
Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos anti-IL-5 humana.
Figura 1
La IL-5 humana presente en la muestra o el estándar se une a los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se agrega un anticuerpo anti-IL-5 humano conjugado a biotina que se une a la IL-5 humana capturada por los primeros anticuerpos.
Figura 2
Después de la incubación se elimina el conjugado no unido mediante una etapa de lavado. Se agrega una solución de estreptavidina-peroxidasa de rábano qui se une al conjugado de biotina anti-IL-5. Figura 3 Estándar o Muestra Conjugado Biotina
Micropocillos Recubiertos
Primera Incubación
Segunda Incubación
Después de la incubación se elimina la estreptavidina-HRP no unida mediante una etapa de lavado y se agrega una solución de Substrato reactiva a Enzima Peroxidasa a los pocillos.
Figura 4
Se forma un producto de color proporcional a la cantidad de la IL-5 presente en la muestra o el estándar. La reacción es terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a 450 nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones estándar de IL-5 y se determina la concentración de IL-5 humana en la muestra.
Figura 5
4.
Reactivos Suministrados
1 bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales anti-IL-5 humana.
1 vial (70 μL) de Conjuguado de Biotina (anticuerpos monoclonales anti-IL-5 humana) 1 vial (150 µL) con Estreptavidina-HRP
2 viales de Estándar IL-5 humana liofilizado, 1 ng/mL después de la reconstitución 1 vial (12 mL ) de Diluyente de Muestras
1 vial (5 mL) de Solución Buffer de Ensayo Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20 y BSA al 10 %)
1 frasco (50 mL) de Solución Buffer de Lavado Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20)
1 vial (15 mL) de Solución de Substrato (tetrametil-benzidina) 1 vial (15 mL) de Solución de Parada (1M Acido Fosfórico) 4 Tapas para placas, Adhesivas
5.
Instrucciones de Almacenamiento
Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C. Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los reactivos a dicha temperatura fría (2 °C y 8 °C). En las etiquetas figuran las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos. Sólo se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado en la primera manipulación.
Substrato
Tercera Incubación
6.
Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento
Sobrenadantes de cultivos celulares y suero fueron probados con este ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuadas para su uso en el ensayo. Separar el suero o plasma del coágulo o de las células lo antes posible después de la coagulación y separación.
Prestar atención a un "Efecto Gancho" posible debido a la alta concentración de las muestras (ver capítulo 11). Las muestras que contienen un precipitado visible deben aclararse antes de su uso en el ensayo. No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas
Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congeladar a -20 °C para evitar la pérdida de IL-5 humana bioactiva. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2 °C y 8 °C (para la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5).
Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente.
7.
Material Requirido Pero No Suministrado
- Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL
- Micropipetas monocanales de 5 μL a 1000 μL con puntas desechables - Micropipetas multicanales de 50 μL a 300 μL con puntas desechables - Depósito para micropipetas multicanales
- Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos
- Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación - Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm
(opcional: 620 nm longitud de onda de referencia) - Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio
8.
Precauciones de Uso
- Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por lo tanto, recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de seguridad para recomendaciones específicas.
- Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en procedimientos terapéuticos.
- No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes. - No usar reactivos caducados
- No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación. - No pipetear con la boca
- No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos - Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas.
- Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las muestras y reactivos.
- Evitar el contacto de la solución de substrato con agentes oxidantes y metales. - Evitar salpicaduras y la generación de aerosoles.
- Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo uso.
- Usar recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato. - La exposición a los ácidos inactiva el conjugado.
- Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos. - La solución de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso.
- Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado durante un mínimo de 1 hora a 121.5 °C.
- Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0 % de hipoclorito sódico. Dejar actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico.
9.
Preparación de los Reactivos
Las Soluciónes de Buffer Concentradas deben de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluídas antes de iniciar el procedimiento del ensayo. Si en las Soluciónes de Buffer Concentradas se han formado cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución.
9.1. Solución Buffer de Lavado (1x)
Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz aforado de 1000 mL limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.
Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2 °C y 25 °C. La Solución Buffer de Lavado (1x) permanece estable durante 30 días
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado (1x) de acuerdo a la siguiente tabla:
Número de Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) (mL) Agua Destilada (mL) 1 - 6 25 475
1 - 12 50 950
9.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)
Vierta todo el contenido (5 mL) de la Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) en un matraz limpio aforado de 100 mL. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada aun volumen final de 100 mL. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.
Conserve la solución a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C. La Solución Buffer de Ensayo permanece estable durante 30 días.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Ensayo (1x) de acuerdo a la siguiente tabla:
Número de Tiras Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (mL) Agua Destilada (mL) 1 - 6 2.5 47.5
1 - 12 5.0 95.0
9.3. Preparación de Conjugado de Biotina
Utilice el Conjugado de Biotina antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución.
Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluirlo en una proporción de 1:100 con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado de Biotina de acuerdo a la siguiente tabla:
Número de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1 - 6 0.03 2.97
9.4. Estreptavidina-HRP
Utilice la Estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución.
Justo antes de utilizar la solución concentrada de Estreptavidina-HRP, se debe diluirlo en una proporción de 1:200 con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Estreptavidina-HRP de acuerdo a la siguiente tabla:
Número de Tiras Estreptavidina-HRP (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1 – 6 0.03 5.97
1 - 12 0.06 11.94
9.5. Estándar IL-6 Humana
Reconstituir el Estándar IL-6 humana añadiendo agua destilada.
El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Girar o mezclar cuidadosamente para garantizar una solubilización completa y homogénea (concentración del estándar reconstituido = 1 ng/mL). Permitir que el estándar reconstituido se asiente durante 10-30 minutos. Mezclar bien previamente a realizar las diluciones.
Tras su uso los restos del estándar no pueden ser almacenados y deben ser descartados.
Las diluciones estándares pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (véase 10.c) o alternativamente en tubos (véase 9.5.1).
9.5.1. Dilución Estándar Externa
Rotular 7 tubos, uno para cada curva estándar. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.
Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estándar como se indica a continuación: Pipetear 225 µL de Diluyente de Muestras a todos los tubos.
Pipetear 225 µL de estándar reconstituido (concentración del estándar = 1000 pg/mL) en el primer tubo, etiquetado como S1, y mezclar (concentración del estándar 1 = 500 pg/mL).
Pipetear 225 µL de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como S2, y mezclar completamente antes de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces más de manera que se obtengan los diferentes puntos de la curva estándar (véase figura 6).
Figura 6
10.
Protocolo de Ensayo
a. Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y además añada las tiras para blancos y estándares (de color). Cada muestra, estándar, blanco y la muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras sobrantes y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8 °C.
b. Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 µL de Solución Buffer de Lavado por cada pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos.
Tras el último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo 15 minutos. No deje secar los pocillos.
c. Dilución Estándar en la placa de microtitración
(Alternativamente, la dilución estándar puede ser preparada en tubos – véase 9.5.1) Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras en duplicado a todos los pocillos estándar.
Pipetear 100 µL de estándar preparado (véase Preparación del Estándar 9.5, concentración = 1000 pg/mL) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (véase Tabla 1). Mezclar el contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la pipeta (concentración del estándar 1, S1 = 500 pg/mL), y transferir 100 µL a los pocillos B1 y B2, respectivamente. (véase Figura 7). Cuidar de no rascar la superficie interior de los micropocillos con la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones estándar del human IL-6 ordenadas desde 500 a 7.8 pg/mL. Descartar 100 µL de los contenidos de los últimos micropocillos (G1, G2) usados.
Transferir 225 µL IL-5 Humana Estándar Reconstituido S1 S2 S3 S4 - S7 Diluyente de Muestras 225 µL Descartar 225 µL
Figura 7
En caso de una dilución estándar externa (véase 9.5.1), pipetear 100 µL de estas diluciones estándares (S1-S7) en los pocillos estándares correspondientes de acuerdo con la Tabla 1.
Tabla 1
Tabla describiendo un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras de los micropocillos 1 2 3 4 A Estándar 1 (500.0 pg/mL) Estándar 1 (500.0 pg/mL) Muestra 1 Muestra 1 B Estándar 2 (250.0 pg/mL) Estándar 2 (250.0 pg/mL) Muestra 2 Muestra 2 C Estándar 3 (125.0 pg/mL) Estándar 3 (125.0 pg/mL) Muestra 3 Muestra 3 D Estándar 4 (62.5 pg/mL) Estándar 4 (62.5 pg/mL) Muestra 4 Muestra 4 E Estándar 5 (31.3 pg/mL) Estándar 5 (31.3 pg/mL) Muestra 5 Muestra 5 F Estándar 6 (15.6 pg/mL) Estándar 6 (15.6 pg/mL) Muestra 6 Muestra 6 G Estándar 7 (7.8 pg/mL) Estándar 7 (7.8 pg/mL) Muestra 7 Muestra 7
H Blanco Blanco Muestra 8 Muestra 8 Transferir 100 µL IL-5 Humana Estándar Reconstituido S1 S2 S3 S4 - S7 Diluyente de Muestras 100 µL Descartar 100 µL
d. Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras en duplicado a los pocillos del blanco. e. Añadir 50 µL de cada Diluyente de Muestras a los pocillos con la muestra. f. Añadir 50 µL de cada muestra en duplicado a los pocillos designados.
g. Prepare el Conjugado de Biotina (véase la preparación del Conjugado de Biotina 9.3) h. Añada 50 µL el Conjugado de Biotina a todos los pocillos.
i. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.
j. Prepare Estreptavidina-HRP (véase la preparación de estreptavidina-HRP 9.4).
k. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 3 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso.
l. Añada 100 µL Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos, incluidos los del blanco.
m. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora (en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible)
n. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 3 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso.
o. Pipetee 100 μL de Solución de Substrato TMB y viértalos en todos los pocillos.
p. Incube las tiras de microtitración a temperatura ambiente (18-25 °C) durante aproximadamente 10 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa.
Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del substrato (véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar correctamente los pocillos positivos.
La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de forma individual para cada ensayo.
Se recomienda añadir la solución de parada cuando el estándar más alto presente un color azul oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de ELISA a 620 nm. La reacción del substrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcance una DO entre 0.9 y 0.95.
q. Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µL de la Solución de Parada en cada pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solución de Parada de forma rápida y uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse inmediatamente después de añadir la solución de parada o, como máximo, en el plazo de 1 hora si las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8 °C en un lugar oscuro.
r. Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizar los pocillos de blanco para medir el blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la absorbancia de las muestras y de los estandares.
Nota: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados más abajo. De todas formas los resultados siguen siendo válidos.
Concentration (pg/ml) A b s or pt ion 4 5 0 nm 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 Concentration (pg/ml) A b s or pt ion 4 5 0 nm 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10
11.
Calculo de Resultados
- Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio
- Construir una curva estándar mediante la representación de la absorbancia media obtenido para cada estándar frente a la concentración de IL-5 humana con el valor de absorbancia en el eje-y y la concentración en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics.
- Para determinar la concentración de la IL-5 humana circulante para cada muestra, primero encontrar el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una línea horizontal a la curva estándar. En el punto de intersección, extender una línea vertical al eje de abscisas y leer la concentración la IL-5 humana.
- Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido 1:2 las muestras (50 µL de
muestra + 50 µL de Diluyente de Muestras), la concentración leída a partir de la curva estándar se debe multiplicar por el factor de dilución (2x).
- Cálculo de las muestras con una concentración superior al estándar 1, puede dar lugar a
concentraciones incorrectas, bajas en IL-5 humana (Efecto Gancho). Estas muestras requieren más predilución externa según los valores esperados de IL-5 humana con el Diluyente de Muestras para cuantificar con precisión la concentración real de IL-5 humana.
- Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones conocidas de IL-5 humana y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no válidos. - En la figura 8 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para
obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo de tiras ensayadas.
Figura 8
Representativa curva estándar para el ELISA IL-5 humana. Se diluyó la IL-5 humana en serie de 2 etapas en el Diluyente de Muestras. No use esta curva estándar para obtener resultados de las pruebas. Se debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas.
Tabla 2
Datos típicos del ELISA IL-5 humana Longitud de onda: 450 nm
Longitud de onda de referencia: 620 nm Estándar Concentración IL-5 Humana (pg/mL) D. O. 450 nm D.O. Media 450 nm C.V. (%) 1 500.0 2.307 2.316 0.5 2.325 2 250.0 1.718 1.726 0.7 1.734 3 125.0 1.106 1.093 1.7 1.080 4 62.5 0.731 0.707 4.9 0.682 5 31.3 0.402 0.408 2.1 0.414 6 15.6 0.259 0.258 0.5 0.257 7 7.8 0.179 0.169 8.4 0.159 Blanco 0.0 0.075 0.071 0.067
Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo (por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad de color. Los valores medidos siguen siendo válidas.
12.
Límites
- Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva estándar para cada prueba.
- La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada entre los reactivos puede dar resultados erróneos.
- Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser eliminados por un enjuague minucioso.
- Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetear la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo o que se secan.
13.
Pruebas Funcionales
13.1. Sensibilidad
El límite de detección de IL-5 humana definido como la concentración del analito resultando en una absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar), se determinó de ser 1.5 pg/mL (media de 6 ensayos independientes).
13.2. Recuperación
13.2.1.
Intra-ensayoLa recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IL-5 humana. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. El calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 6.6 %.
13.2.2.
Inter-ensayoLa recuperación inter-ensayo dentro de un laboratorio se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IL-5 humana. Dos curvas de calibración se realizaron en cada placa. El coeficiente de variación total calculado de inter-ensayo fue del 6.8 %.
13.3. Recuperación después del Enriquecimiento
La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo cuatro niveles de IL-5 humana en muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron en dos experimentos independientes con 4 repeticiones cada uno.
El suero no enriquecido sirvó como blanco en estos experimentos. La recuperación total media fue del 74 %.
13.4. Dilución en Paralelo
Se analizaron muestras de suero con diferentes concentraciones de IL-5 humana mediante 2 diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno.
La recuperación total fue de 110 %.
13.5. Estabilidad de Muestras
13.5.1.
Estabilidad Congelación - DescongelaciónAlícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C y posteriormente descongeladas hasta 5 veces, y se determinó las concentraciones del IL-5 humana. No hubo pérdidas significativas de la inmunoreactividad de IL-5 humana por la congelación y descongelación.
13.5.2.
Estabilidad de AlmacenamientoAlícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C, 2-8 °C, temperatura ambiente (TA) y a 37 °C, y la concentración de IL-5 humana fue determinada después de las 24 horas. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad del IL-5 humana durante el almacenamientoen condiciones descritos anteriormente.
13.6. Especificidad
La interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de IL-5 humana. No se ha detectado reactividad cruzada.
13.7. Valores Esperados
No se encontró concentraciones detectables de IL-5 humana en los donantes sanos. Concentraciones elevados de IL-5 humana dependen del tipo de trastorno inmunológico.
13.8. Calibración
El inmunoensayo es calibrado con recombinante IL-5 humana altamente purificada, que ha sido evaluado según el estándar de referencia internacional NIBSC 90/586 y se ha demostrado que son equivalentes. NIBSC 90/586 se cuantifica en unidades internacionales (UI) de una IU que corresponde a 100 pg de la IL-5 humana.
14.
Información de pedidos
Para los pedidos póngase en contacto con:
Véase la última página.
Para preguntas técnicas comuníquese con:
e-mail: IBL@IBL-International.com www.IBL-International.com
15.
Resumen: Preparación de Reactivos
15.1. Solución Buffer de Lavado (1x)
Añadir 50 mL de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada. Número de
Tiras
Solución Buffer de Lavado Concentrada (mL)
Agua Destilada (mL) 1-6 25 475 1-12 50 950
15.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)
Añadir 5 mL Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) a 95 mL de agua destilada. Número de
Tiras
Solución Buffer de Ensayo Concentrada (mL) Agua Destilada (mL) 1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0 15.3. Conjugado de Biotina
Hacer una dilución 1:100 del Conjugado de Biotina en la Solución Buffer de Ensayo (1x):
Número de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1-6 0.03 2.97
1-12 0.06 5.94
15.4. Estreptavidina-HRP
Hacer una dilución 1:200 del Estreptavidina-HRP en la Solución Buffer de Ensayo (1x):
Número de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1-6 0.03 5.97
1-12 0.06 11.94
16.
Resumen de Protocolo de Ensayo
1. Determinar el número requirido de tiras de la placa de microtitulación.
2. Lavar las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado. 3. Dilución estándar en la placa de microtitración: Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras,
por duplicado, a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µL de estándar preparado en los primeros pocillos y crear diluciones estándar mediante la transferencia de 100 µL de pocillo a pocillo.
Deseche 100 µL de los últimos pocillos.
Alternativamente dilución estándar externa en tubos (ver 9.5.1): Pipetear 100 µL de estas diluciones estándares en las tiras de los micropocillos.
4. Añadir 100 μL de Diluyente de Muestras, por duplicado, a los pocillos blancos. 5. Añadir 50 μL de Diluyente de Muestras a los pocillos de muestra.
6. Añadir 50 μL de muestras por duplicado a los pocillos respectivos. 7. Preparar el Conjugado de Biotina.
8. Añadir 50 μL de Conjugado de Biotina a todos los pocillos.
9. Cubrir las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25 °C). 10. Preparar Estreptavidina-HRP.
11. Vaciar y lavar los pocillos 3 veces con Solución Buffer de Lavado. 12. Añadir 100 µL de la Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos. 13. Cubrir las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25 °C). 14. Vaciar y lavar los pocillos 3 veces con Solución Buffer de Lavado. 15. Añadir 100 μL de Solución Substrato TMB a todos los pocillos.
16. Incubar las tiras para approximadamente 10 minutos a temperatura ambiante (18-25 °C). 17. Añadir 100 μL de Solución de Parada a todos los pocillos.
18. Ajustar el fotómetro y medir la absorbancia a 450 nm.
Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras han sido diluidas 1:2 (50 μL de muestra, 50 μL de Diluyente de Muestras), la concentración leída de la curva estándar debe ser multiplicada por el factor de dilución (x 2).
17.
Referencia sobre el Producto
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