La matriz extracelular en mecanorreceptores de vertebrados

Texto completo

(1)UNIVERSIDAD DE OVIEDO Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud. La Matriz Extracelular en Mecanorreceptores de Vertebrados. Jorge García Piqueras Tesis doctoral, 2019.

(2)

(3) UNIVERSIDAD DE OVIEDO Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud. La Matriz Extracelular en Mecanorreceptores de Vertebrados. Jorge García Piqueras Tesis doctoral, 2019.

(4)

(5) RESUMEN DEL CONTENIDO DE TESIS DOCTORAL 1.- Título de la Tesis Español: LA MATRIZ EXTRACELULAR EN MECANORRECEPTORES DE VERTEBRADOS. Inglés: THE EXTRACELLULAR MATRIX IN VERTEBRATE MECHANORECEPTORS. 2.- Autor Nombre: DNI/Pasaporte/NIE: JORGE GARCÍA PIQUERAS Programa de Doctorado: CIENCIAS DE LA SALUD Órgano responsable: CENTRO INTERNACIONAL DE POSTGRADO. FOR-MAT-VOA-010 (Reg.2018). RESUMEN (en español). Los mecanorreceptores son estructuras nerviosas especializadas que se encargan de percibir los estímulos táctiles. Se encuentran distribuidos por todos los tejidos de los vertebrados, en el inicio de las vías aferentes sensitivas. En la piel, los corpúsculos de Meissner y Pacini son mecanorreceptores de adaptación rápida y bajo umbral encargados del tacto ligero y tacto profundo respectivamente. Ambos están formados por un axón rodeado por células de Schwann modificadas, y en el caso de los corpúsculos de Pacini, también por tejido conectivo organizado formando una cápsula. Los complejos célula de Merkel-axón son mecanorreceptores de adaptación lenta y bajo umbral responsables de diferentes sensaciones del tacto fino; están formados por una asociación sinapsis-like entre un axón y una célula de Merkel epitelial que se localiza en la base de la epidermis. Dos de los aspectos menos conocidos sobre los corpúsculos sensitivos cutáneos son, por un lado, la matriz extracelular y, por otro, los cambios en estas estructuras durante el proceso de envejecimiento. La primera parte de la tesis se compone de cuatro publicaciones distintas relacionadas con la matriz extracelular. En la primera se ha investigado el origen endoneural o perineural de los distintos compartimentos de los corpúsculos de Pacini humanos; el principal resultado ha sido la identificación de una lámina intermedia CD34-positiva alrededor del núcleo interno, de origen endoneural. En la segunda se ha analizado la expresión del glicosaminoglicano condroitín sulfato en los corpúsculos sensitivos: mientras que los corpúsculos de Meissner no expresan proteoglicanos de condroitin sulfato, en los corpúsculos de Pacini se expresan asociados a la lámina intermedia endoneural CD34-positiva. En el tercer trabajo se ha estudiado el patrón de expresión de otro glicosaminoglicano, el heparán sulfato: tanto en los corpúsculos de Meissner como en los de Pacini, los proteoglicanos de heparan sulfato están asociados a la membrana basal, la cual es especialmente prominente en las primeras lamelas del núcleo externo de los corpúsculos de Pacini. En el cuarto estudio se ha determinado la expresión de los Pequeños Proteoglicanos Ricos en Leucina (SLRPs) de clase I y clase II, ambas de localización extracelular, en los corpúsculos de Pacini: los proteoglicanos biglicano, decorina, lumicano, osteomodulina y fibromodulina se expresan en el núcleo interno y en el núcleo externo; todos ellos excepto la osteomodulina también están presentes en la cápsula externa; contrariamente, la osteomodulina sí se expresa en la lámina intermedia, donde los demás están ausentes. La segunda parte de la tesis tiene un capítulo metodológico, para determinar datos cuantitativos y cualitativos sobre los mecanorreceptores cutáneos, que se ha utilizado en el estudio del envejecimiento y establece las bases para su utilización para la validación de la biopsia cutánea en el diagnóstico de neuropatías periféricas. En el quinto y último trabajo se ha realizado un análisis de los cambios cualitativos y cuantitativos que aparecen en los corpúsculos de Pacini y de Meissner y en los complejos célula de Merkel-axón como consecuencia del envejecimiento. Además, se ha evaluado la expresión de la mecanoproteína Piezo2 (principal canal iónico implicado en la función mecanorreptora) y la expresión del sistema neurotrófico TrkB-BDNF (responsable del desarrollo y mantenimiento de los mecanorreceptores cutáneos) en sujetos de edad avanzada..

(6) RESUMEN (en Inglés). Mechanoreceptors are specialized nervous structures involved in sensing tactile stimuli. They are localized throughout all the vertebrate tissues at the beginning of the sensory afferent nerve fibres. In the skin, Meissner’s and Pacinian corpuscles are rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors, responsible for fine and deep touch respectively. Both of them consist of an axon surrounded by modified Schwann cells, and in the case of Pacinian corpuscles, also by organized connective tissue forming a capsule. Merkel’s cells-axon complexes are slowly adapting low-threshold mechanoreceptors responsible for several light-touch sensations; they consist of a synapsis-like association between an axon and an epithelial Merkel’s cell, which is localized in the basal epidermis. Two of the least known topics about cutaneous sensory corpuscles are, on the one hand, the extracellular matrix, and on the other hand, the changes on these structures during the aging process. The first part of the thesis is compound by four different publications related to the extracellular matrix. In the first one, it has been investigated the endoneural or perineural origin of the different human Pacinian corpuscle compartments; the main result has been the identification of an endoneurial intermediate CD34-positive layer around the inner core. In the second one, it has been analysed the expression of chondroitin sulfate glycosaminoglycan: whereas Meissner’s corpuscles do not express chondroitin sulfate proteoglycans, in Pacinian corpuscles they are expressed in association to the endoneural CD34-positive intermediate layer. In the third work it has been studied the expression pattern of another glycosaminoglycan, the heparan sulfate: in both Meissner and Pacinian corpuscles, the heparan sulfate proteoglycans are associated to the basement membrane, which is specially prominent in the first lamellae of the outer core of the Pacinian corpuscles. In the fourth study, it has been established the expression of extracellular classes I and II Small Leucine-Rich Proteoglycans (SLRPs) in Pacinian corpuscles: biglycan, decorin, lumican, osteomodulina and fibromodulin are expressed in both the inner and outer core; all of them except osteomodulina are present in the external capsule; contrary, osteomodulina is expressed in the intermediate layer, where the others are absent. The second part of the thesis includes a methodological chapter, in order to define quantitative and qualitative data about cutaneous mechanoreceptors, which has been used in the study of aging and it sets the basis for its utilization for the validation of cutaneous biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathies. In the fifth and last work, it has been analysed the qualitative and quantitative changes occurring in Pacinian and Meissner’s corpuscles and Merkel’s cells-axon complexes with the aging process. Furthermore, it has been evaluated the expression of Piezo2 mechanoprotein (main ionic canal involved in the mechanoreceptive function) and the expression of TrkB-BDNF neurotrophic system (responsible for the development and maintenance of cutaneous mechanoreceptors) in elderly subjects.. SR. PRESIDENTE DE LA COMISIÓN ACADÉMICA DEL PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA SALUD.

(7) ÍNDICE 1.- Introducción 2.- Estado actual del problema 2.1. Sistema somatosensorial del tacto 2.2. Formaciones nerviosas sensitivas: corpúsculos sensitivos 2.2.1. Corpúsculos de Meissner 2.2.2. Corpúsculos de Pacini 2.2.3. Complejos célula de Merkel-axón 2.3. Matriz extracelular: glicosaminoglicanos y proteoglicanos 2.3.1. Conceptos generales de la matriz extracelular 2.3.2. Proteoglicanos y glicosaminoglicanos de la matriz extracelular 2.3.3. Localización de los proteoglicanos en el sistema nervioso periférico 2.3.4 Función de los proteoglicanos en el sistema nervioso periférico 2.4. Edad y tacto 2.4.1. Envejecimiento del sistema somatosensorial del tacto 2.4.2. Cambios edad-dependientes en los mecanorreceptores cutáneos de mamíferos. 3.- Hipótesis de trabajo y objetivos 4.- Material y técnicas 4.1. Material 4.2. Técnicas 4.2.1. Tinción hematoxilina-eosina 4.2.2. Inmunohistoquímica simple indirecta 4.2.3. Doble inmunohistoquímica indirecta 4.2.4. Doble inmunofluorescencia indirecta con microscopía confocal 4.2.5. Análisis cuantitativo 4.2.6. Análisis estadístico. 5.- Resultados 5.1. CD34 5.2. Condroitín sulfato 5.3. Heparán sulfato 5.4. SLRPs 5.5 Capítulo libro 5.6. Envejecimiento. 6.- Discusión 7.- Conclusiones 8.- Bibliografía.

(8) 1. INTRODUCCIÓN.

(9) El grupo de investigación en el que se ha realizado el presente trabajo de tesis doctoral, denominado SINPOS (Sistema Nervioso Periférico y Órganos de los Sentidos) perteneciente al Cluster de Biomedicina del Campus de Excelencia Internacional de la Universidad de Oviedo, tiene entre sus líneas de investigación prioritarias el estudio de los corpúsculos sensitivos cutáneos. Los análisis incluyen la estructura, perfil inmunohistoquímico, desarrollo y envejecimiento, así como diferentes patologías del sistema nervioso en las que se ven alterados. El resultado de 30 años de investigación ha dado lugar a numerosas publicaciones científicas en prestigiosas revistas internacionales (ver revisiones Vega y Cols., 1996; 2009; 2012; Montaño y Cols., 2010; del Valle y Cols., 2012). Los conocimientos acerca de los corpúsculos sensitivos están en continua expansión. A lo largo de los años, se ha tratado de descubrir la naturaleza de las células que forman los distintos compartimentos de los corpúsculos sensitivos cutáneos, así como de determinar marcadores específicos para cada uno de ellos. Un área de especial interés ha sido el estudio del patrón de expresión proteico en los constituyentes celulares de los corpúsculos sensitivos. El grupo SINPOS ha contribuido notablemente en este campo de investigación, demostrando la expresión de numerosas proteínas en los distintos tipos celulares de los corpúsculos: proteínas ligantes del calcio, filamentos intermedios, receptores de factores de crecimiento, neurotrofinas o canales iónicos. Teniendo. en. cuenta. que. los. corpúsculos. sensitivos. son. funcionalmente. mecanorreceptores, la presencia de canales iónicos en ellos da apoyo molecular a la mecanorrecepción y mecanotransducción (García-Añoveros y Cols., 2001; Cabo y Cols., 2012; 2015; Alonso-González y Cols., 2017; García-Mesa y Cols., 2017). Sin embargo, tras varias décadas estudiando los corpúsculos sensitivos en nuestro grupo de trabajo todavía existen vacíos de conocimiento sobre estas estructuras sensitivas, y con esta tesis doctoral se pretende llenar o completar alguno de ellos. En primer lugar, se tratará de establecer la naturaleza del núcleo externo de los corpúsculos de Pacini humanos, desconocida hasta el momento, mediante inmunohistoquímica para marcadores de células endoneural o perineural..

(10) En segundo término, estudiar la matriz extracelular de los corpúsculos de Meissner y de Pacini humanos, la cual ha sido ignorada casi por completo en los estudios sobre estas estructuras, en lo que concierne a uno de sus componentes principales: los proteoglicanos. Y por último, las variaciones inmunohistoquímicas en algunas proteínas presentes en los corpúsculos sensitivos asociadas con el envejecimiento, ya que se ha demostrado que con la edad se produce un deterioro de la sensibilidad táctil que podría deberse, al menos en parte, a alteraciones en los corpúsculos sensitivos. Actualmente, tan solo se han publicado datos aislados y poco congruentes sobre los cambios edaddependientes del aparato sensitivo de la piel. En el presente trabajo de tesis doctoral se estudian en detalle los cambios cuantitativos, cualitativos y morfológicos que aparecen en los corpúsculos sensitivos cutáneos humanos con la edad. La consecución de los objetivos planteados, los cuales se detallarán más adelante, contribuirá a ampliar el conocimiento sobre los corpúsculos sensitivos. El trabajo permitirá determinar el origen celular del núcleo externo de los corpúsculos de Pacini, con especial interés de la lámina intermedia (referida como zona de crecimiento) y de forma indirecta, identificar marcadores específicos para ella. Por otra parte, tomando como referencia las funciones de los proteoglicanos en el sistema nervioso periférico (regeneración/degeneración axonal, mantenimiento estructural, mecanotransducción, etc.; ver para una revisión Chen y Birck, 2013), los resultados que se aporten sobre la expresión y distribución de estas moléculas dentro de los corpúsculos sensitivos permitirán hipotetizar sobre el papel que desempeñan en estas formaciones sensitivas. Finalmente, el análisis de los corpúsculos sensitivos humanos a diferentes edades, proporcionará datos más fiables que los existentes hasta la fecha para establecer el papel de la porción más periférica del sistema nervioso periférico en la disminución de la sensibilidad táctil que ocurre con el envejecimiento. En la última década, los corpúsculos sensitivos se han convertido en un elemento clave para el diagnóstico clínico mediante biopsia cutánea de algunas neuropatías periféricas y enfermedades neurodegenerativas (Herrmann y Cols., 2007; Nolano y Cols., 2008; Almodovar y cols., 2012; Nolano y Cols., 2017). Este estudio constituirá una base.

(11) fundamental para establecer qué variaciones en estas formaciones sensitivas son propias de la edad y no están asociadas a patologías, lo cual permitirá incluir de forma sistemática a los corpúsculos sensitivos en la biopsia cutánea con fines diagnósticos.

(12) 2. ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA.

(13) El eje central de esta tesis doctoral está constituido por los corpúsculos sensitivos cutáneos, considerados funcionalmente mecanorreceptores. Con el fin de poder abordar los objetivos del trabajo, realizar una adecuada interpretación y discusión de los resultados es necesario realizar una revisión detallada sobre la estructura y características funcionales de estas formaciones sensitivas..

(14) 2.1. Sistema somatosensorial del tacto De los cinco sistemas sensoriales clásicos (auditivo, olfatorio, somatosensorial, gustativo, y visual) solo el sistema somatosensorial es multimodal, es decir, es el único capaz de detectar diferentes tipos de estímulos específicos tales como la posición de las articulaciones (propiocepción), dolor, temperatura y tacto. Este último, a su vez, incluye una gran variedad de componentes entre los que se encuentran la detección de la curvatura, dureza, forma textura y presión. La piel humana posee una rica inervación sensitiva a expensas de las prolongaciones periféricas de las neuronas sensitivas localizadas a nivel de los ganglios sensitivos de los pares craneales y de los ganglios raquídeos. Los extremos terminales de dichas prolongaciones finalizan mayoritariamente a nivel de la dermis, formando los denominados corpúsculos sensitivos o formaciones nerviosas sensitivas (Malinovský, 1990; 1996) (Figura 1). Algunos de estos órganos especializados funcionan como mecanorreceptores ya que tienen la capacidad de detectar, discriminar y transducir los estímulos mecánicos y, posteriormente, transmitir la información al sistema nervioso central.. Figura 1. Esquema de la organización anatomofuncional de las neuronas periféricas de la sensibilidad general del dolor y el tacto (tomado de SG Waxman, Clinical Neuroanatomy)..

(15) Los corpúsculos sensitivos están formados por las mismas estructuras básicas que constituyen las fibras nerviosas: a) Axón central (zona dendrítica): formado a partir del extremo terminal de la prolongación periférica del axón de las neuronas sensitivas periféricas. Puede pertenecer a cualquier subtipo de fibra nerviosa (Lawson, 1992), aunque en el caso de los corpúsculos sensitivos cutáneos de los mamíferos, suelen ser fibras Aα, Aβ y Aδ (Dalsgaard, 1988; Perl, 1992). b) Células de Schwann modificadas (células gliales periaxónicas): constituyen el núcleo interno de los corpúsculos de Pacini y las células lamelares de los corpúsculos de Meissner, y la glia asociada a los demás tipos de corpúsculos sensitivos (Vega y Cols., 1992, 1993). Se originan a partir de células de la cresta neural (Renehan y Munger, 1990; Saxod, 1996; Feito y Cols., 2018). c) Estructuras relacionadas con el endoneuro: corresponden al estrato intermedio de los corpúsculos de Pacini del mesenterio del gato descrito por Ide y Hayashi (1987) y se originan a partir de fibroblastos endoneurales (Munger e Ide, 1988). d) Estructuras relacionadas con el perineuro: corresponden a la cápsula de los corpúsculos (en el caso de estar presente) y las lamelas del núcleo externo de los corpúsculos de Pacini (Munger e Ide, 1988). Se originan por condensación a partir del mesénquima local (Halata y Cols., 1990). Debido a la continuidad estructural de los elementos que los forman, los corpúsculos sensitivos y las fibras nerviosas comparten la mayoría de sus características inmunohistoquímicas (Vega y Cols., 1994; 1996) (Figura 2). En los mamíferos, los corpúsculos de Meissner, los corpúsculos de Pacini y los complejos célula de Merkel-axón representan tres tipos de formaciones nerviosas sensitivas cutáneas diferentes en base a su estructura y organización tisular. Los corpúsculos de Pacini son el prototipo de corpúsculos capsulados mientras que los corpúsculos de Meissner representan a los no capsulados o parcialmente capsulados. Funcionalmente, ambos son receptores de bajo umbral y adaptación rápida y dependen de fibras nerviosas sensitivas Aα y Aβ originadas de neuronas sensitivas de tamaño grande o intermedio (Perl, 1992; Zelená, 1994; Johnson, 2001). Los complejos célula de Merkel-axón son una asociación, a modo de sinapsis, entre una célula.

(16) epitelial (célula de Merkel) y axones de neuronas sensitivas de tipo Aβ. También son de bajo umbral pero de adaptación lenta (Johnson, 2001; Zimmerman y Cols., 2014) (Figuras 1 y 2).. Figura 2. Tipos y fisiología de los corpúsculos sensitivos cutáneos (tomado de Delmas y Cols., 2011)..

(17) 2.2. Formaciones nerviosas sensitivas: corpúsculos sensitivos 2.2.1. Corpúsculos de Meissner Los corpúsculos de Meissner son estructuras sensitivas complejas localizadas en el interior de las papilas dérmicas de la piel glabra con su eje mayor dispuesto perpendicularmente a la superficie epidérmica. Suelen tener forma ovoide y su tamaño varía entre 30-200 micras de longitud y 25-70 micras de diámetro (Guinard y Cols., 2000; Vega y Cols., 2012) (Figura 3). Están formados por terminales axónicos y células no nerviosas de naturaleza glial, denominadas células lamelares o laminares, dispuestas a modo de pila de monedas (lamelas) con su eje mayor paralelo a la superficie cutánea y núcleos de disposición periférica. Pueden presentar una cápsula incompleta, sobre todo en la parte basal del corpúsculo, formada por fibroblastos. Una de las características morfológicas de los corpúsculos de Meissner es el curso serpenteante del axón entre las lamelas. Este axón contiene numerosos filamentos intermedios (neurofilamentos) en su parte central y abundantes mitocondrias dispuestas preferentemente bajo el axolema. Cerca de la membrana hay vesículas de transcitosis que recuerdan a las sinápticas. Además del axón principal, los corpúsculos de Meissner pueden contener axones accesorios, en número variable, considerados de naturaleza nociceptiva en base a los marcadores que expresan (Paré y Cols., 2001). Normalmente, las fibras nerviosas que forman los corpúsculos de Meissner pierden la vaina de mielina cuando entran en el corpúsculo, en el que pueden penetrar por la base, por un lado o por la parte distal (Figuras 3 y 4). No obstante, se ha demostrado que el axón del 25% de los corpúsculos de Meissner de la piel digital humana presenta segmentos de mielina en su interior (García-Suárez y Cols., 2009)..

(18) Figura 3. Estructura de un corpúsculo de Meissner. Izquierda: hematoxilina-eosina (e: epidermis). Derecha: representación tridimensional (tomado de http://images.wellcome.ac.uk).. Las células lamelares son células de Schwann modificadas (Idé, 1982) y comparten con ellas la mayoría de sus características inmunohistoquímicas (ver Vega y Cols., 1996) (Figura 4). Tienen una morfología acintada o laminar y se disponen orientadas hacia el axón, con los núcleos en la periferia. Sus cuerpos están rodeados por una membrana basal que se pierde en la superficie de contacto con la fibra nerviosa (Vega y Cols., 1995). Las lamelas contienen filamentos intermedios (de vimentina y no proteína gliofibrilar ácida) y mitocondrias, así como vesículas de transcitosis (Munger e Idé, 1988). Entre ellas, hay un espacio interlamelar casi virtual que se encuentra ocupado principalmente por fibras de colágeno (Takahashi-Iwanaga y Shimoda, 2003).. Figura 4. Perfil inmunohistoquímico de los corpúsculos de Meissner de la piel digital humana. Axón reactivo para NFP (a) y células lamelares para S100 (b,c) y vimentina (d) (e: epidermis) (cortesía de J.A. Vega)..

(19) Ocasionalmente, los corpúsculos de Meissner poseen una cápsula incompleta formada por fibroblastos y fibras de colágeno. La cápsula está ausente a nivel superior del corpúsculo, mientras que en la base inferior está compuesta por 2-4 estratos de células capsulares aplanadas con fibrillas elásticas de colágeno dispuestas en los espacios intercelulares. Estas células capsulares de la base pueden estar cubiertas por láminas basales que estarían ausentes del resto del corpúsculo (Zelená, 1994). Funcionalmente, los corpúsculos de Meissner son los responsables principales del tacto fino. Se trata de mecanorreceptores de adaptación rápida, que responden a estímulos comprendidos entre los 10 y 400 Hz, con una sensibilidad máxima para 100200 Hz (Johnson, 2001). Por lo que se refiere a su composición proteica, la figura 5 resume las principales proteínas descritas en los corpúsculos de Meissner según su localización. El axón presenta inmunorreacción para marcadores neuronales generales como la enolasa neuronal específica y la proteína PGP9.5 (Vega y Cols., 1996; Pawson y Cols., 2000), además de para la subunidad de 200 kDa del neurofilamento, lo cual subraya el carácter mecánico del mismo (Vega y Cols., 1996). También contiene proteínas ligantes de calcio (calbindina D-28K, parvalbúmina, calretinina, y neurocalcina), las cuales regulan presumiblemente la homeostasis del calcio axónico en la transducción mecanoeléctrica (Vega y Cols., 1996; Albuerne y cols., 1998; Galeano y cols., 2000). La β-arrestin-1 axónica juega un papel importante en la desensibilización e internalización de los receptores asociados a proteínas G. Esta molécula emigra desde las neuronas de los ganglios espinales a los corpúsculos que las suplen (Komori y cols., 2003). Otras moléculas relacionadas con el crecimiento axónico, como la proteína GAP-43, también están presentes en los corpúsculos cutáneos de Meissner (Verzé y cols., 2003)..

(20) Figura 5. Representación de las proteínas que se expresan en los corpúsculos de Meissner según su localización (azul: células lamelares; rojo: axones accesorios; amarillo: axón principal).. Desde principios de este siglo, diferentes familias de canales iónicos, especialmente los pertenecientes a las superfamilias de degenerina/epitelial- Na+ (DEG/ENaC) y Transient Receptor Potential (TRP) han sido foco de interés en el estudio de los corpúsculos sensitivos debido a su implicación en el proceso de mecanotransducción. En este sentido, nuestro grupo de investigación ha centrado sus esfuerzos en la localización de diferentes potenciales mecanoproteínas en los corpúsculos sensitivos, ampliando considerablemente los conocimientos sobre este tema. A nivel proteico, se han localizado BNaC1α, ASIC2, TRPV4 y TRPC6 en el axón principal de los corpúsculos de Meissner de la piel digital humana (García-Añoveros y cols., 2001; Cabo y cols., 2012; 2015; Alonso-González y cols., 2017). Recientemente, hemos detectado en esta situación el canal PIEZO2, perteneciente a una familia de canales iónicos reciente.

(21) identificada y caracterizada, relacionado de forma directa con la mecanotransducción del tacto fino (García-Mesa y cols., 2017). Respecto a los axones accesorios que ocasionalmente suplen los corpúsculos, se han detectado en ellos diferentes neuropéptidos como la sustancia P, CGRP, hormona estimulante de los melanocitos, galanina o somatostatina, todos ellos relacionados con la nocicepción. Por supuesto estos axones también presentan inmunorreactividad para anticuerpos neuronales específicos, especialmente la PGP9.5 (Johansson y Cols., 1999; Paré y Cols., 2001). En cuanto a las células lamelares, la vimentina es el principal filamento intermedio de su citoesqueleto, y no la proteína gliofibrilar ácida (GFAP) como cabría esperar dada la naturaleza glial de estas células (Vega y Cols., 1996). Además, Calavia y Cols. (2012) demostraron la presencia de otro filamento intermedio, la nestina, en una pequeña población de las células lamelares vimentina positivas, relacionándola con un posible nicho de células neurales pluripotenciales presentes en los corpúsculos sensitivos. La proteína ligante de calcio S100 es específica de las células lamelares y se co-localiza con la parvalbúmina o calbindina D-28k (Vega y Cols., 1996). Por otro lado, los receptores para las neurotrofinas p75, TrkA y TrkB también se detectan en este tipo celular (Vega y Cols., 1993; Vega y Cols., 1994a; Bronzetti y Cols., 1995; Calavia y Cols., 2010), así como el receptor para el factor de crecimiento epidérmico (Vega y Cols., 1994b). Además, la membrana basal de las células lamelares contiene laminina y colágeno tipo IV (Pawson y cols., 2000). Existen algunas proteínas que no son específicas de ninguno de los componentes de los corpúsculos y aparecen tanto en el axón como en las células lamelares. Es el caso del canal iónico ASIC2 y el de algunas proteínas ligantes de calcio, que como se ha mencionado previamente, aparecen en el axón pero también en una pequeña población de las células lamelares (Vega y Cols., 2012; Cabo y Cols., 2015).. 2.2.2. Corpúsculos de Pacini Los corpúsculos de Pacini son los corpúsculos sensitivos de mayor tamaño (hasta 4 mm su eje mayor y 2 mm su eje menor), tienen forma ovoide y detectan la presión y la.

(22) vibración. Se distribuyen por la mayoría de los órganos y tejidos, como páncreas, mesenterio, mesocolon, adventicia de vasos y anastomosis arteriovenosas, piel, tendones y ligamentos. En la piel, los corpúsculos de Pacini se sitúan en la dermis profunda (Zelená, 1994). Al microscopio óptico muestran un aspecto típico en “bulbo de cebolla”, debido a una serie de formaciones laminares, más o menos concéntricas, dispuestas en torno al axón. Se diferencian en ellos dos compartimentos denominados núcleo interno y núcleo externo, ambos rodeados por una cápsula densa constituida por un número variable de láminas (Figura 6 y 7).. Figura 6. Estructura de un corpúsculo de Pacini. Izquierda: hematoxilina-eosina (c: cápsula; ne: núcleo externo; ni: núcleo interno). Derecha: representación tridimensional (modificado de http://images.wellcome.ac.uk).. En la parte central del núcleo interno se dispone el axón, generalmente único, aunque ocasionalmente puede contener hasta cinco o más (García-Suárez y Cols., 2010) (Figura 7). De forma característica, un axón mielínico de tipo Aα o Aβ entra por uno de los polos del corpúsculo y termina en un engrosamiento con espículas denominado zona dendrítica. El axón contiene neurofilamentos en su parte central, microtúbulos dispersos y mitocondrias en grupos bajo el axolema. La fibra nerviosa que suple el corpúsculo, en su trayecto intracorpuscular, mantiene uno o dos segmentos de mielina y luego se rodea por las prolongaciones de las células laminares que forman el núcleo interno (Bell y Cols., 1994). Además del axón principal, mecánico, los corpúsculos de Pacini pueden tener fibras nerviosas accesorias, finas y amielínicas (fibras C o fibras postganglionares simpáticas) que siguen un curso serpenteante en contraposición al trayecto longitudinal de la fibra principal (Malinovský y Pác, 1982)..

(23) Las láminas o lamelas que forman el núcleo interno son células de Schwann modificadas (Figura 7). Tienen una disposición muy compacta ya que están muy próximas entre ellas. Permanecen separadas únicamente por espacios casi virtuales que contienen fibrillas de colágeno muy finas (Idé y Cols., 1988; Malinovský y Cols., 1990) y diferentes componentes de la matriz extracelular (Dubový y Bednárová, 1999; Pawson y Cols., 2000; Sames y Cols., 2001). Las lamelas del núcleo interno carecen de lámina basal, salvo las más externas (Munger e Idé, 1988).. Figura 7. Perfil inmunohistoquímico de los corpúsculos de Pacini de la piel digital humana. Axones reactivos para el neurofilamento (NFP) y células del núcleo interno para S100P (cortesía de J.A. Vega).. El núcleo externo está formado por células aplanadas que rodean por completo al núcleo interno, formando capas separadas entre sí por un compartimento con diferentes componentes de la matriz extracelular (Dubový y Bednárová, 1999; Pawson y Cols., 2000; Sames y Cols., 2001). Las células del núcleo interno muestran uniones tipo “gap” o comunicantes, mientras que las lamelas del núcleo externo tienen uniones intercelulares de tipo “tigh junction” o estrechas (Munger e Ide, 1988). Entre los núcleos interno y externo se dispone un estrato celular intermedio, que ha sido demostrado de manera fehaciente en los corpúsculos de Pacini del mesenterio del gato (Idé y Cols., 1988; Munger e Idé, 1988; Pawson y Cols., 2000) y, recientemente, en los corpúsculos de Pacini humanos por nuestro grupo de investigación (GarcíaPiqueras y Cols., 2017). La cápsula es continuación del perineuro del tronco nervioso que inerva el corpúsculo (Zelená, 1994). Su función podría ser la de aportar cierta tensión al núcleo externo (Munger e Idé, 1988). En ella se localizan vasos sanguíneos y macrófagos. Se ha sugerido que la cápsula y sus lamelas no solo tienen importancia en el procesamiento.

(24) de los estímulos mecánicos, sino que constituyen una parte del sistema metabólico del corpúsculo (Malinovský y Cols., 1990). La estructura de un corpúsculo de Pacini no es uniforme a lo largo del recorrido del axón, sino que se distinguen tres zonas de acuerdo a las relaciones entre él y las células periaxónicas (Malinovský y Cols., 1986) (Figura 8): a) segmento preterminal: situado dentro de la cápsula y en la que el axón aún permanece envuelto por la vaina de mielina y las células de Schwann; b) segmento terminal: las láminas se disponen formando dos mitades simétricas, separadas entre sí por las denominadas “clefts” o hendiduras. En esta zona, el axón se caracteriza por emitir pequeñas prolongaciones, espículas, que se introducen en dichas hendiduras. Las espículas siempre encaran las dos hendiduras del núcleo interno en la porción terminal del corpúsculo (Munger e Idé, 1988); y c) segmento ultraterminal: se corresponde con la parte final del axón, que está engrosado y presenta numerosas espículas en su superficie. A este nivel, las células del núcleo interno pierden la simetría bilateral y se disponen de forma irregular.. Figura 8. Componentes estructurales de un corpúsculo de Pacini, representado en cortes transversales a nivel de la zona preterminal (A), terminal (B) y ultraterminal (C) (modificado de Malinovský y Cols., 1986).. Funcionalmente, los corpúsculos de Pacini son mecanorreceptores de adaptación rápida que responden a estímulos vibratorios comprendidos entre los 20 y los 1500 Hz, con sensibilidad máxima en los 200-400 Hz, y por lo tanto, detectan presión y vibración..

(25) Lo mismo que en el caso de los corpúsculos de Meissner, los corpúsculos de Pacini tienen un patrón de expresión proteico muy amplio, que varía en función de los tipo celulares que los forman (Figura 9).. Figura 9. Representación de las proteínas expresadas en los corpúsculos de Pacini según su localización (azul: núcleo interno; verde: lámina intermedia; rojo: núcleo externo y cápsula; amarillo: axón).. El axón central es identificable por la expresión de enolasa neuronal específica, neurofilamento y PGP9.5 (Vega y Cols., 1996a). También se han detectado en él calbindina, parvalbúmina y calretinina, implicadas en la homeostasis para la transducción mecanoeléctrica (Vega y Cols., 1996a). En los últimos años se han localizado además canales iónicos relacionados con la mecanotransducción como.

(26) ASIC2 y ASC1 en el axón de los corpúsculos de Pacini de Macaca fascicularis (Cabo y Cols., 2012) y humanos respectivamente (Calavia y Cols., 2010). Por otro lado, se ha descrito la proteína Bcl-2 en el axón principal (González-Martínez y Cols., 2006). El resto de elementos que constituyen los corpúsculos de Pacini son el núcleo interno, el núcleo externo y la cápsula. Una contribución importante de nuestro grupo de investigación ha sido la identificación de antígenos que son específicos de determinados compartimentos del corpúsculo de Pacini, como la proteína S100 para el núcleo interno (Vega y cols., 1996b) y el CD34 para la lámina intermedia (GarcíaPiqueras y Cols., 2017). Hasta el momento actual, sólo se ha encontrado expresión de la mecanoproteína ASIC2 en el núcleo interno de los corpúsculos de Pacini humanos (Calavia y Cols., 2010; Cabo y Cols., 2015), al igual que la proteína básica de la mielina, cuya expresión se restringe al segmento preterminal del núcleo interno (García-Suárez y Cols., 2009). Sin embargo, la mayoría de las proteínas suelen expresarse en varios elementos corpusculares: 1) los filamentos intermedios vimentina y nestina aparecen en el núcleo interno y núcleo externo (la vimentina también en la cápsula) (Calavia y Cols., 2012); 2) las proteínas de membrana basal colágeno IV y laminina se localizan en todos los elementos no neurales del corpúsculo (Vega y Cols., 1995); 3) los receptores de neurotrofinas TrkA, p75 y EGFR se encuentran en todos los compartimentos (Vega y Cols., 1994a; 1994b), TrkB en el axón y ocasionalmente en las células lamelares del núcleo interno de los corpúsculos de Pacini de Macaca fascicularis (Cabo y Cols., 2015), y su ligando BDNF en el núcleo interno y núcleo externo (Cabo y Cols., 2015). No obstante, también se dan situaciones contradictorias. Mientras que para Britsch (2007) el axón central y las células de Schwann presentan inmunorreactividad para los receptores de neorregulinas erb2, erb3, erb4, nuestro grupo de investigación ha demostrado que erb4 exclusivamente aparece en la cápsula y en el núcleo externo de los corpúsculos de Pacini (González-Martínez y Cols., 2007)..

(27) 2.2.3. Complejos Célula de Merkel-axón Los complejos célula de Merkel-axón o discos de Merkel son estructuras mecanorreceptoras que consisten en una asociación sinapsis-like entre axones de neuronas sensitivas Aβ y células epiteliales especiales conocidas como células de Merkel (Fleming y Lou, 2013; Zimmerman y Cols., 2014) (Figura 10). Se localizan fundamentalmente en la epidermis de la piel, tanto glabra como pilosa (Moll y Cols., 1986), aunque también pueden encontrarse en mucosas derivadas del ectodermo (Rettig y Halata, 1990).. Figura 10. Complejo célula de Merkel-neurita (modificado de Biology Stack Exchange).. Las células de Merkel tienen forma ovalada, con un eje mayor de 10-15 µm, aunque también pueden presentar morfología de medialuna (Halata y Cols., 2003) (Figura 10 y 11). Normalmente, se localizan en la capa basal de la epidermis de la mayoría de los vertebrados (Moll y Cols., 1996), bien de forma aislada, bien formando grupos (“clusters”). Se anclan a la epidermis mediante finas protuberancias citoplasmáticas y desmosomas proyectados hacia los queratinocitos circundantes del polo opuesto al terminal nervioso (Iggo y Muir, 1969). El citoplasma contiene filamentos intermedios de citoqueratina y gránulos osmófilos densos con neuropéptidos que se acumulan en el polo sináptico (Iggo y Muir, 1969; Halata y Cols., 2003). En la mayoría de las células, la membrana citoplasmática se encuentra estrechamente unida a la membrana del terminal axónico (Chen y Cols., 1973)..

(28) La fibra nerviosa de tipo Aβ que contacta con las células de Merkel es el axón de una neurona mecanosensitiva de bajo umbral y adaptación lenta de tipo I, cuyas terminaciones forman una ampliación discoide en su parte distal para hacer conexión sinapsis-like con el polo basal de las células de Merkel. Esta asociación es la que permite que el complejo sea capaz de iniciar la respuesta para la discriminación táctil (Maksimovic y Cols., 2013; Zimmerman y Cols., 2014).. Figura 11. Perfil inmunohistoquímico del complejo célula de Merkel-Neurita. Izquierda: células de Merkel inmunorreactivas para CK20. Derecha: arriba, célula de Merkel marcada con fluorescencia para CK20 (rojo); abajo, célula de Merkel marcada con fluorescencia para PIEZO2 (verde) y enolasa neuroespecífica (rojo; las flechas blancas denotan la fibra nerviosa) (tomado de García-Mesa y Cols., 2017).. Respecto al origen embrionario de las células de Merkel se han barajado dos hipótesis diferentes. La primera apostaba por un origen de la cresta neural, dado que son células excitables con capacidad de sintetizar neuropéptidos y expresar moléculas presinápticas (Grim y Halata, 2000; Szeder y Cols., 2003). La segunda hipótesis afirma que las células de Merkel son de origen ectodérmico debido a que expresan citoqueratinas de bajo peso molecular, no tienen capacidad mitótica y establecen contactos mediante desmosomas con los queratinocitos (Munger, 1965; Compton y Cols., 1990; Moll y Cols., 1990; Kim y Holbrook, 1995). Actualmente se acepta esta segunda teoría, ya que se ha demostrado que las células de Merkel provienen de células madre epidérmicas (Morrison y Cols., 2009; Van Keymeulen y Cols., 2009)..

(29) Además, en la epidermis se ha identificado una población celular con fenotipo distinto al de los queratinocitos que residen junto a las células de Merkel y con capacidad de regenerar este tipo celular (Woo y Cols., 2010). La función principal del complejo célula de Merkel-axón es la mecanosensación, pero existe una gran controversia sobre el papel que desempeñan las células de Merkel en este proceso. Algunos autores detallan que la fibra nerviosa de tipo Aβ es la responsable de la mecanotransducción en el complejo, mientras que la célula de Merkel ocupa un papel modulador (Kinkelin y Cols., 1999). Otros autores, por el contrario, establecen que la célula de Merkel es el componente indispensable del complejo para la transducción del estímulo mecánico en la señal química que posteriormente activará la fibra nerviosa a la que se encuentra unida (Maricich y Cols., 2009). Una tercera alternativa defiende que ambos son imprescindibles y necesarios, es decir, que tanto la célula de Merkel como la fibra nerviosa están implicadas en el proceso de mecanotransducción (Yamashita y Ogawa, 1991; Fleming y Luo, 2013; Maksimovic y Cols., 2014). En estudios con ratones que carecen de células de Merkel (knock-out para Atoh1), pero que conservan las terminaciones nerviosas de tipo Aβ, no se produce reacción ante estímulos de presión sostenida, resultando la sensación del tacto ligero completamente alterada (Maricich y Cols., 2009). También existen evidencias de que las células de Merkel producen neurotransmisores capaces de actuar sobre la terminación nerviosa a modo de sinapsis-like (Hartschuh y Weihe, 1980; Tachibana y Nawa, 2002; Haeberle y Cols., 2004; Hitchcock y Cols., 2004). Recientemente, se ha demostrado la presencia del canal iónico mecanosensitivo PIEZO2 (Ranade y Cols., 2014; Xiao y Cols., 2014) en las células de Merkel de piel glabra digital humana, pero no en el terminal axónico (García-Mesa y Cols., 2017). Todos estos resultados avalan la segunda de las hipótesis mencionadas anteriormente, según la cual, las células de Merkel transducen los estímulos mecánicos en señales eléctricas mediante PIEZO2 y, en consecuencia, se inducen los potenciales de acción en las fibras aferentes mediante la activación de canales de calcio dependientes de voltaje. Aunque a día de hoy, tampoco puede descartarse la tercera alternativa, en la que ambos componentes del.

(30) complejo serían mecanosensibles y, por tanto, ambos participarían en la mecanotransducción (Maksimovic y Cols., 2013). En la figura 12 se recogen las principales proteinas descritas en las células de Merkel, así como los marcadores inmunohistoquímicos utilizados para su identificación.. Figura 12. Esquema de las proteínas que se expresan en el complejo célula de Merkel-neurita.. En el citoplasma de las células de Merkel se localizan citoqueratinas características de las células epiteliales (Moll y Cols., 1995), además de marcadores neuronales como neurofilamentos, enolasa neuronal específica y PGP9.5 (Leff y Cols., 1985; Dalsgaard y Cols., 1989) y marcadores neuroendocrinos como cromogranina A y sinaptofisina (Moll y Cols., 1995; Ortonne y Cols., 1998). En la membrana hay glicoproteínas como EpCAM y CD200 (Kurzen y Cols., 2003; Woo y Cols., 2010), transportadores de glucosa como GLUT1 y GLUT2 (Hitchcock y Cols., 2004) y receptores como NMDA (Cahusac y Cols., 2005). Dado que tienen la capacidad de transmitir la señal, expresan diversos neuropéptidos y neurotransmisores como VIP, CGRP, sustancia P, serotonina, Metencefalina, somatostatina, bombesina, pancreastatina y CCK8 (Gould y Cols., 1985;.

(31) Hartschuh y Weihe; 1989). Maksimovic y Cols., 2003). La prueba fehaciente de su carácter mecanotransductor es la expresión de PIEZO2 (García-Mesa y Cols., 2017). La fibra nerviosa de tipo Aβ presenta inmunorreacción positiva para marcadores neuronales generales como cabría esperar (Dalsgaard y Cols., 1989; Gould y Cols., 1985; Narisawa y Cols., 1994). Se ha demostrado también la expresión de la proteína mecanotransductora ASIC2 (Cabo y Cols., 2015)..

(32) 2.3. Matriz extracelular: glicosaminoglicanos y proteoglicanos 2.3.1. Conceptos generales sobre la matriz extracelular Los tejidos de los organismos pluricelulares están formados, no solo por un conjunto organizado de células, sino también por componentes no celulares que se localizan en el espacio que rodea a las mismas, donde forman una estructura ordenada denominada matriz extracelular (Alberts y Cols., 2002; Theocharis y Cols., 2016). La matriz extracelular es una red compleja formada por moléculas de diferente naturaleza que pueden ser clasificadas en tres grupos (Alberts y Cols., 2002; Bosman y Stamenkovic, 2003; Theocharis y Cols., 2016) (Figura 13): a) Proteínas fibrosas: diferentes tipos de colágenos y elastinas; b) Proteínas de adhesión: lamininas, fibronectinas, tenascinas, fibulinas y nidógeno; y c) Proteoglicanos constituidos por diferentes tipos de glicosaminoglicanos. No obstante, esta composición es diferente en cada tejido, en cada situación fisiológica/patológica y en cada especie (Frantz y Cols., 2010; Theocharis y Cols., 2016). Dentro de la matriz extracelular de los tejidos, aparecen frecuentemente dos motivos estructurales diferentes (Figura 13): a) Membrana basal: estructura bien definida que se encuentra en el exterior celular, pero inmediatamente a continuación de la membrana citoplasmática (LeBleu y Cols., 2007). Sus componentes más conocidos son colágeno IV y laminina, pero también los proteoglicanos agrina, perlecano y endostatina, y otras glicoproteínas como nidógeno y fibulinas (Sasaki y Cols., 2004). b) Matriz intersticial: correspondiente al resto de moléculas de matriz que rellenan el espacio extracelular sin relación con la membrana basal (Alberts y Cols., 2002; Bosman y Stamenkovic, 2003). Su composición tiene mayor variabilidad según el tejido en el que se encuentra (Couchman y Pataki, 2012). Una de las peculiaridades de la matriz extracelular es su alto grado de dinamismo, es decir, las enzimas son capaces de producir, modificar y degradar la matriz extracelular permanentemente (Page-McCaw y Cols., 2007; Pengfei y Cols., 2011; Bonnans y Cols., 2014)..

(33) Figura 13. Representación general de la matriz extracelular que conforma los tejidos (tomado de https://basicmedicalkey.com/cellular-biology/).. La función principal de la matriz extracelular es actuar como un andamio o armazón (“scaffold”) sobre el que se sustentan y mantienen las células que constituyen los diferentes tejidos (Alberts y Cols., 2002; Theocharis y Cols., 2016). Gracias a las características físicas y bioquímicas de las moléculas que la forman, la matriz extracelular proporciona a los tejidos y órganos propiedades como elasticidad, resistencia, tensión, retención de agua, etc. (Frantz y Cols., 2010). Inicialmente se creía que este era su único cometido, pero con el paso de los años, se ha demostrado que la matriz extracelular también está implicada en importantes procesos celulares como el crecimiento, la morfogénesis, la diferenciación y la homeostasis, mediante la unión de factores de crecimiento y la interacción con receptores celulares (Frantz y Cols., 2010; Clause y Barker, 2013). Tal es la diversidad funcional que un gran número de patologías y enfermedades se deben a alteraciones en los componentes de la matriz extracelular o en las enzimas que los producen, modifican o degradan, por lo que tarde o temprano se convertirá en una importante diana farmacológica (Järveläinen y Cols., 2009)..

(34) 2.3.2. Proteoglicanos y glicosaminoglicanos de la matriz extracelular Los glicosaminoglicanos son polisacáridos lineares constituidos por una unidad disacárida que se repite a lo largo de su estructura molecular. Según el azúcar del disacárido, existen varios tipos de glicosaminoglicanos: hialuronano, heparán sulfato, heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato y keratan sulfato (Schaefer y Schaefer, 2010) (Figura 14). Los glicosaminoglicanos se encuentran unidos a una proteína principal, formando moléculas denominadas proteoglicanos; todos, excepto el hialuronano, que es sintetizado en la superficie celular y liberado directamente en el medio extracelular (Schaefer y Schaefer, 2010). Los proteoglicanos forman parte de la matriz extracelular de todos los tejidos de los mamíferos, ya que todas las células son capaces de sintetizarlos y secretarlos al exterior, insertarlos en la membrana plasmática o empaquetarlos intracelularmente (Gandhi y Mancera, 2008). Pero no todas las matrices extracelulares contienen los mismos proteoglicanos (Couchman y Pataki, 2012). En la matriz extracelular de los mamíferos, se han identificado más de 40 proteoglicanos con una gran variabilidad a nivel genético y proteico, lo cual ha dificultado su clasificación. Según se ha propuesto recientemente, los proteoglicanos pueden agruparse en base a la localización celular y subcelular, la homología de secuencia genética/proteica y la presencia de motivos proteicos particulares (Iozzo y Schaefer, 2015) (Figura 15)..

(35) Figura 14. Esquema molecular de los glicosaminoglicanos (tomado de Papakonstantinou y Karakiulakis, 2009).. En general, los proteoglicanos de heparán sulfato, como por ejemplo las familias de los sindecanos y de los glipicanos, localizados en la superficie celular, actúan como receptores moleculares y participan en diferentes vías de transducción de la señal relacionadas con el desarrollo y la proliferación celular (Carey, 1997; Filmus y Cols., 2008; Lambaerts y Cols., 2009; Filmus y Capurro, 2014). Otro grupo de proteoglicanos de heparán sulfato son los que forman parte de las membranas basales: agrina, perlecano, colágeno XVIII (endostatina) y colágeno XV (Yurchenco y Patton, 2009). Como ya se ha expuesto anteriormente, la membrana basal es una diferenciación de la matriz extracelular que se encuentra en el exterior de la mayoría de células (epiteliales, musculares, adipocitos, células de Schwann, etc.) (Bosman y Stamenkovic, 2003) y que cumple funciones específicas en cada tejido (LeBleu y Cols., 2007)..

(36) Figura 15. Clasificación de los proteoglicanos en mamíferos (tomado de Iozzo y Schaefer, 2015).. Los proteoglicanos de condroitín sulfato son importantes elementos estructurales de la matriz extracelular ya que organizan la correcta disposición de las fibras de colágeno, aportan propiedades viscoelásticas, mantienen la presión osmótica y tienen capacidad de retener agua (Nishimura y Cols., 1998; Heinegård, 2009; Iozzo y Schaefer, 2015). Pero también actúan como correceptores o moduladores de la señal, intervienen en procesos de diferenciación o regeneración celular y están implicados en la plasticidad neuronal (Mikami y Kitagawa, 2013). La familia de hialectanos o.

(37) lecticanos es un ejemplo de proteoglicanos de condroitín sulfato de localización extracelular, especialmente relevantes en el sistema nervioso central (CrespoSantiago, 2004; Howell y Gottschall, 2012). Sin embargo, fosfacano, NG2 y β-glicano son proteoglicanos de condroitín sulfato insertados en la membrana citoplasmática y, por tanto, asociados a la superficie celular (López-Casillas y Cols., 1991; Nishiyama y Cols., 1991; Maurel y Cols., 1994). La familia más grande de proteoglicanos la constituyen los SLRP (“small leucine-rich proteoglycans”), también de localización extracelular, dentro de la cual se distinguen cinco clases. Su similar estructura proteica hace que tengan características y funciones comunes, como por ejemplo, regular la fibrilogénesis mediante la unión a colágenos (Kalamajski y Oldberg, 2010; Chen y Birk, 2013) o influenciar la actividad celular mediante la unión a receptores de superficie celular, factores de crecimiento, citoquinas u otros componentes de la matriz extracelular (Schaefer y Iozzo, 2008). Participan en importantes vías de señalización celular como la del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y la proteína morfogénica ósea (BMP) (Hildebrand y Cols., 1994). Sin embargo, cada uno de ellos también puede desempeñar funciones únicas en tejidos específicos gracias a la variabilidad del extremo N-terminal y a la unión de los diferentes glicosaminoglicanos (Iozzo y Schaefer, 2015).. 2.3.3. Localización de los proteoglicanos en el sistema nervioso periférico En el sistema nervioso periférico, alrededor de las células de Schwann se dispone una membrana basal sobre la que se cimientan el resto de los constituyentes de la matriz extracelular (Feltri y Wrabetz, 2005), entre ellos, los proteoglicanos. Como ya se ha mencionado, algunos de los proteoglicanos de heparan sulfato son constituyentes importantes de la estructura de las membranas basales. Mediante cultivos celulares se ha demostrado que las células de Schwann y las neuronas sensitivas expresan proteoglicanos de heparán sulfato en su membrana basal (Mehta y Cols., 1985); en este sentido, se han detectado tres de ellos (perlecano, agrina y endostatina) en las membranas basales de las células de Schwann de nervios y ganglios periféricos (Halfter y Cols., 1998; Ma y Cols., 1994; Halfter y Cols., 1997; Chernousov y.

(38) Cols., 1998). Además, se ha localizado perlecano en los nódulos de Ranvier de neuronas periféricas (Bangratz y Cols., 2012). Los otros dos grandes grupos de proteoglicanos de heparán sulfato (sindecanos y glipicanos) también se han descrito en el sistema nervioso periférico. Los glipicanos 1 y 3 se expresan en las neuronas de los ganglios raquídeos (Litwack y Cols. 1994; Bloechlinger y Cols., 2004; Iglesias y Cols., 2008), mientras que los sindecanos 3 y 4 en la periferia de las células de Schwann (Carey y Cols., 1992; Erdman y Cols., 2002; Goutebroze y Cols., 2003) y en los nódulos de Ranvier (Melendez-Vasquez y Cols., 2005). El receptor del factor de crecimiento transformante β3, también conocido como betaglicano, el cual está formado por cadenas de heparan sulfato y de condroitín sulfato, también se expresa en las células de Schwann (Thomas y De Vries, 2007). Los proteoglicanos de condroitín sulfato son mayoritarios en el sistema nervioso central (Bandtlow y Zimmermann, 2000), mientras que en el periférico su distribución es menor o no ha sido tan estudiada hasta la fecha. Mediante microscopia electrónica e inmunohistoquímica, se ha demostrado en nervios periféricos su expresión en la lámina basal de las células de Schwann (Aquino y Cols., 1984) y en el endoneuro alrededor del axón (Tona y Cols., 1993; Morrison y Cols., 1994); concretamente son versicano, agrecano y NG2 (Neural/glial antigen 2; Bode-Lesniewska y Cols., 1996; Rezajooi y Cols., 2004; Ali y Cols., 2011). Además, también se ha encontrado versicano en los nódulos de Ranvier (Melendez-Vasquez y Cols., 2005). Todavía es más desconocido el patrón de expresión de los SLRP en el sistema nervioso periférico y, en la literatura científica, son escasas las menciones a estos proteoglicanos. Estudios de hibridación in situ han demostrado que las células de Schwann expresan decorina (Hanemann y Cols., 1993). También se han detectado decorina y lumicano en ganglios raquídeos al final de la segunda semana de desarrollo del ratón (Wilda y Cols., 2000) y biglicano en el nervio óptico adulto (Ali y Cols., 2011). En relación a los corpúsculos sensitivos, los proteoglicanos se encuentran embebidos en la matriz extracelular correspondiente a cada compartimento corpuscular, aunque a día de hoy, la información existente sobre la misma es escasa. Actualmente, se conoce que tanto los corpúsculos de Pacini como los corpúsculos de Meissner expresan laminina y colágeno tipo IV (componentes de lámina basal) en las células periaxónicas,.

(39) así como en la cápsula (Halata 1975; Zelená 1994; Vega y Cols., 1995). Los estudios de Dubový y Bednárová (1999a) y Chouchkov y Cols. (2003) confirmaron la presencia de distintas lamininas en las zonas de los corpúsculos de Pacini en las que ya se había descrito la lámina basal (próxima a las células perineurales y lamelas), pero también en las células de Schwann modificadas de los corpúsculos de Pacini (Dubový y Bednárová, 1999a; 1999b). Por otro lado, en los espacios interlamelares del núcleo externo y de la cápsula de los corpúsculos de Pacini del mesenterio del gato predomina el colágeno tipo II, mientras que la lámina intermedia contiene colágeno tipo IV (Pawson y Cols., 2000). Los espacios equivalentes de los corpúsculos de Meissner de Macaca fuscata fueron estudiados por Takahashi-Iwanaga y Shimoda (2003), demostrando de igual forma la existencia de colágeno. Todavía resultan más desconocidos los proteoglicanos que componen dicha matriz extracelular en los corpúsculos sensitivos. Los primeros estudios en los que se documenta la presencia de proteoglicanos son los realizados por Dubový y Svízenská (1993) y Dubový y Bednárová (1999). Tan sólo existe otro estudio en corpúsculos de Pacini del mesenterio del gato en el que fueron localizados decorina y biglicano en las lamelas perineurales (Sames y Cols., 2001). No obstante, el contenido de proteoglicanos de la matriz extracelular es complejo y varía en cada zona del corpúsculo (Dubový y Bednárová, 1999).. 2.3.4. Funciones de los proteoglicanos en el sistema nervioso periférico En el sistema nervioso periférico, la matriz extracelular proporciona el entorno físicoquímico adecuado para el desarrollo y la supervivencia de las neuronas y de las células de la glía ya que está implicada en múltiples actividades y procesos celulares (Barros y Cols., 2001; Gardiner, 2011): a) Desarrollo embrionario: el sistema nervioso periférico se forma tras una serie de procesos migratorios coordinados que experimentan las células de cresta neural en los que los proteoglicanos juegan un papel fundamental. La expresión de los proteoglicanos de condroitín sulfato en determinadas zonas, se relaciona directamente con la ausencia de células de cresta neural durante el desarrollo (Perris y Cols., 1991). Por otra parte, los SLRP están prácticamente ausentes.

(40) durante el movimiento de las células de cresta neural, pero muestran un aumento de expresión en la unión dermoepidérmica, lo que les relaciona presumiblemente con la guía de las terminaciones nerviosas sensitivas que inervan la piel (Perris, 1997). Además, los sindecanos podrían estar implicados en la proliferación de las células de Schwann antes de la formación del nódulo de Ranvier (MelendezVasquez y Cols., 2005), así como en las interacciones axogliales en el desarrollo (Goutebroze y Cols., 2003). b) Crecimiento axonal y mielinización: La lámina basal de las células de Schwann, de la que forman parte diferentes proteoglicanos de heparán sulfato, interviene en la migración y diferenciación de las células de Schwann, en su disposición alrededor del axón y, al mismo tiempo junto a integrinas, en la mielinización (McGarvey y Cols., 1984; Anton y Cols., 1994; Shorer y Cols., 1995; Feltri y Cols., 2002). Se ha sugerido que la agrina participa en el proceso de crecimiento axonal mediante la unión a factores de crecimiento y a proteínas de adhesión (Halfter y Cols., 1997). c) Regeneración axonal: En un nervio adulto intacto predominan los componentes de matriz inhibitorios para el crecimiento axonal, de forma que se controla la proliferación neurítica. Sin embargo, en un nervio lesionado, la matriz extracelular cambia su composición para crear un ambiente favorable a la regeneración. Tras una lesión en un nervio periférico, se produce un aumento de proteoglicanos de condroitín sulfato, que impiden la regeneración axonal al inhibir el efecto positivo de las lamininas de las células de Schwann sobre el crecimiento neurítico (Muir y Cols., 1989; Zuo y Cols., 1998). En este mismo sentido, se ha demostrado que la degradación de proteoglicanos de condroitín sulfato en neuronas sensitivas, favorece la regeneración axónica tras una lesión nerviosa (Udina y Cols., 2010). Por el contrario, la expresión de proteoglicanos de heparan sulfato está relacionada con la permisividad para el crecimiento y prolongación axonal, como se ha sugerido con los glipicanos en el proceso de regeneración (Litwack y Cols. 1994; Bloechlinger y Cols., 2004).. Actualmente, poco se conoce sobre la matriz extracelular de los corpúsculos sensitivos de la piel glabra digital humana. La existencia de lámina basal (estructura derivada de la matriz extracelular) en los componentes perineurales de los corpúsculos sensitivos.

(41) (Vega y Cols., 1995; Dubový y Bednárová, 1999; Chouchkov y Cols., 2003), podría estar relacionada con la organización celular (Beck y Cols., 1990) o con la interacción celular mediante receptores de superficie (Edgar, 1989). Tampoco puede descartarse su implicación en el crecimiento axonal (Baron van Evercooren y Cols., 1982; Wang y Cols., 1992; Feltri y Cols., 2002). Los distintos tipos de colágenos caracterizados en los espacios interlamelares de los corpúsculos de Pacini del mesenterio del gato (Pawson y Cols., 2000) y en los espacios equivalentes de los corpúsculos de Meissner de Macaca fuscata (Takahashi-Iwanaga y Shimoda, 2003) pueden desempeñar una función estructural o de regulación como se ha demostrado en las células de Schwann de nervios periféricos (Koopmans y Cols., 2009). Sin embargo, todavía se conoce menos sobre los proteoglicanos que conforman la matriz extracelular de los corpúsculos sensitivos (Dubový y Svízenská, 1993; Dubový y Bednárová, 1999; Sames y Cols., 2001). Estas moléculas son especialmente importantes para las capacidades físico-químicas de los corpúsculos sensitivos, como son la retención de agua, viscoelasticidad, transmisión de la presión, etc. (Sames y Cols., 2001), aunque tampoco pueden descartarse otras funciones..

(42) 2.4. Edad y tacto 2.4.1. Envejecimiento en el sistema somatosensorial del tacto En la piel, la pérdida de sensibilidad es una consecuencia inevitable asociada a la edad, debida fundamentalmente a un proceso de denervación y deterioro de las estructuras nerviosas periféricas (Kelly y Cols., 2005; Chang y Cols., 2004; Panoutsopoulou y Cols., 2009). Los estudios realizados hasta la fecha se han centrado preferentemente en las terminaciones nerviosas libres (Wickremaratchi y Llewelyn, 2006; Taguchi y Cols., 2010; Decorps y Cols., 2014). Sin embargo, poco se conoce acerca de los cambios que tienen lugar en los corpúsculos sensitivos, principales estructuras encargadas del tacto, como consecuencia de la edad. En el sistema nervioso periférico, con el envejecimiento, se producen cambios estructurales en las fibras nerviosas, menor densidad de las mismas, afectación de los umbrales de detección y disminución de la velocidad de conducción nerviosa (Cerimele y Cols., 1990; Stevens y Patterson, 1995; Verrillo y Cols., 2002; Perry, 2006). Los cambios estructurales guardan relación con la reducción del diámetro del axón, degeneración axónica, aumento de formas irregulares y aumento del número de fibrillas de colágeno en el endoneuro y el perineuro (Chase y Cols., 1992). La disminución en la velocidad de conducción nerviosa se debe a una mayor vulnerabilidad de la vaina de mielina (Bouche y Cols., 1993; Verdú y Cols., 2000; Di Iorio y Cols., 2006). Los estudios funcionales han demostrado que con la edad se produce una alteración en las habilidades para detectar vibraciones, lo que implica que se requiera mayor amplitud de vibración para percibir la misma magnitud de sensación (Verrillo, 1979; Gescheider y Cols., 1994; Goble y Cols., 1996; Verrillo y Cols., 2002; Perry, 2006). Además, se ha comprobado que con el envejecimiento se deterioran la agudeza y la discriminación espacial táctil (Stevens y Patterson, 1995; Leveque y Cols., 2000), mientras que aumenta el umbral para el tacto fino (Bruce, 1980; Thornbury y Mistretta, 1981)..

(43) 2.4.2. Cambios edad-dependientes en los morfotipos de mecanorreceptores cutáneos La variabilidad en la metodología empleada así como la utilización de modelos animales muy dispares hacen que los escasos resultados existentes sobre los cambios cuantitativos y cualitativos de los corpúsculos sensitivos como consecuencia de la edad sean imprecisos y dispares. Respecto a los corpúsculos de Meissner, hay grandes discrepancias en cuanto a la densidad normal (número de corpúsculos de Meissner/mm2 de piel, “CM/mm2”) ya que no hay un valor standard aceptado como único. Haciendo referencia a una zona concreta de la mano, en la tabla 1 se recogen valores obtenidos en las dos últimas décadas por diferentes grupos de investigación: Tabla 1. Valores de densidad de corpúsculos de Meissner/mm2 según diferentes autores.. Localización Yemas dedos Yemas dedos Yemas dedos Yemas dedos Yema 5o dedo Yema 5o dedo Yema 5o dedo Yema 3er dedo Palma proximal Palma proximal Eminencia tenar Eminencia tenar 1. Densidad (CM/mm2) 1.5 2.70 CM/mm 2.53 CM/mm 25 12 6.77 45 33 1.33 CM/mm 1.35 CM/mm 5.1 2.53. Edad (años) 30.3 68.3 61.2 34.3 43.2 33.7 30.3 68.3 34.3 43.2. Referencia Johnson y Cols., 20001 Kelly y Cols., 20052 Kelly y Cols., 20052 Nolano y Cols., 2008 Herrmann y Cols., 2007 Herrmann y Cols., 2011 Nolano y Cols., 2003 Nolano y Cols., 2003 Kelly y Cols., 20052 Kelly y Cols., 20052 Herrmann y Cols., 2007 Herrmann y Cols., 2011. Humanos y otros primates; 2no tiene en cuenta el grosor de la sección (mm = longitud epidermis).. Como se observa en la tabla, hay grandes diferencias en los valores de densidad que ponen de manifiesto la necesidad de establecer un protocolo adecuado. En relación al envejecimiento, algunos autores afirman que con la edad se produce una reducción de la densidad de corpúsculos de Meissner, la cual ha sido demostrada tanto en humanos (Bolton y Cols., 1966; Bruce, 1980a; 1980b; Schimrigk y Rüttinger, 1980; Thornbury y Mistretta, 1981; Halata y Munger, 1983; Iwasaki y Cols., 2003) como en animales (Mathewson y Nava, 1985; Nava y Mathewson, 1996; Hoffman y Cols., 2004). Los estudios clásicos establecen que la densidad es de 40-50 corpúsculos de Meissner.

(44) por mm2 al final de la infancia (Thornbury y Mistretta, 1981), la cual disminuye progresivamente hasta los 50 años llegando a 10-25 corpúsculos de Meissner por mm2 (Bolton y Cols., 1966; Bruce 1980a; Thornbury y Mistretta, 1981; Halata y Munger, 1983) y alcanza valores mínimos de 5-8 corpúsculos de Meissner por mm2 a partir de los 60 años (Bolton y Cols., 1966; Bruce, 1980b). Contrariamente, otros grupos de investigación no constatan un cambio edaddependiente en la densidad de corpúsculos sensitivos (Nolano y Cols., 2003; Kelly y Cols., 2005). Además de los cambios cuantitativos, se han descrito en detalle, principalmente en modelos murinos, ciertos cambios morfológicos que afectan a la capacidad funcional de los corpúsculos sensitivos: los corpúsculos de Meissner de menor tamaño corresponden a los ratones más jóvenes, los ratones de mediana edad presentan los más grandes y los ratones de edad más avanzada tienen corpúsculos desorganizados y lobulados que decrecen en tamaño hasta atrofiarse por completo. En relación a los componentes corpusculares, las lamelas de los corpúsculos se atenúan y disminuyen en número mientras que el material de la lámina basal se duplica al aumentar las fibrillas de colágeno; el axón se vuelve más complejo con ramificaciones hasta la mediana edad, mientras que en la vejez se pierde la forma característica serpenteante. Además se ha contabilizado un mayor número de papilas dérmicas desocupadas en la piel de los ratones de mayor edad (Nava y Mathewson, 1996; Mathewson y Nava, 1985). Muchas de estas variaciones cualitativas también se han encontrado en los corpúsculos de Meissner humanos (Bolton y Cols., 1966; Bruce, 1980; Matsuoka y Cols., 1983; Iwasaki y Cols., 2003): distribución más irregular, con formas lobuladas u alargadas y alejados de la epidermis u orientados oblicuamente en la papila, mayor tamaño con la edad pero reducción a partir de los 70 años debido a cambios en el tamaño de las células lamelares y formas retorcidas a partir de los 60 años. Los corpúsculos de Pacini de la piel digital humana también sufren un proceso de degeneración y atrofia con la edad, así como una disminución en número (Cauna y Mannan, 1958; Gescheider y Cols., 1994). El tamaño del corpúsculo de Pacini es de.

(45) 500-700 µm al nacer y se incrementa hasta alcanzar los 3-4 mm; pero a partir de los 70 años, el corpúsculo disminuye en dimensión y se vuelve más irregular (Cauna y Mannan, 1958). Además, se ha demostrado que la sensibilidad vibrotáctil que implica a los corpúsculos de Pacini se reduce con la edad (Verrillo, 1979). En el caso de las células de Merkel, también se produce un descenso en número con el envejecimiento tanto en humanos como en modelos murinos (Moll y Cols., 1984; Fundin y Cols., 1997). Nolano y Cols. (2003) determinan que hay una densidad de 4 células de Merkel por mm2 de piel en individuos con edad media de 33.7 años, y además, especifica que el número de corpúsculos de Meissner es 5 veces mayor que el de células de Merkel en la piel digital humana. Otros resultados muy diferentes establecen que hay una densidad media de 1700 células de Merkel por mm 2 en crestas glandulares de piel plantar de fetos humanos de 18-24 semanas, la cual se reduce progresivamente en recién nacido y en adulto (Moll y Cols., 1984). De igual forma, Kim y Holbrook (1995) establecen que en la epidermis palmar de fetos humanos, la densidad llega hasta 1400 células de Merkel por mm2 de piel a las 8 semanas de edad gestacional, momento en el cual el número empieza a caer..

(46) 3. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS.