Espectrometría de Masa

52 

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Texto completo

(1)

Espectrometría de Masa

(ESI-IT)

Aplicación al estudio de proteínas

Lanais-Pro

(2)

Ionización

Analizador

Detector

Esquema básico de un MS

(3)

Electron ionization Magnetic Sector

Chemical ionization Time of Flight ( TOF )

Beam techniques Triple cuadrupole

MALDI

Ion Trap

Electrospray

APCI

Cyclotron

/

Fourier

(4)

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption

(5)

Electrospray

(6)

Electrospray

+ + + + + + + + + + + + + + + +

Capillary column

Capillary column

effluent

effluent

Optional coaxial

Optional coaxial

sheath liquid

sheath liquid

and

and

optional coaxial

optional coaxial

drying gas

drying gas

Entrance to mass

Entrance to mass

spectrometer

spectrometer

Heated desolvation region

Heated desolvation region

+2 kV to +5 kV

+2 kV to +5 kV

Desolvated peptide

Desolvated peptide

ions

ions

Charged droplets

Charged droplets

+ + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +++ + + + + + + + +++ + +++ + + + + + + + +++

Ionización

(7)

Time of Flight

(8)

Cuadrupole

(9)

Trampa iónica

(10)

Cyclotron/Fourier

(11)
(12)
(13)

Interpretación de un espectro de masas

Recordar que MS

distingue m/z

- Una misma molécula puede cargarse de maneras diferentes,

tomando distinta cantidad de protones.

- Dos señales en el espectro no necesariamente significa que hay

dos entidades moleculares.

-Para calcular la masa original, debe conocerse la carga ( z)

del ión.

(14)

CISTEINA

TREONINA

ARGININA

(15)
(16)

. . . . . . . . .

4.29

33.96786683(11)

34S

0.76(2) 32.97145850(12) 33S

94.93

31.97207069(12)

32S

0.205(14) 17.9991604(9) 18O 0.038(1) 16.99913150(22) 17O

99.757(16)

15.9949146221(15)

16O

-0.368(7) 15.0001088984(9) 15N

99.632(7)

14.0030740052(9)

14N

-3.0160492675(11) 3H 0.0115(70) 2.0141017780(4) 2H

99.9885(70)

1.0078250321(4)

1H

-14.003241988(4) 14C

1.07

13.0033548378(10)

13

C

98.93

12

12C

% A+2 Iso

%

A+1 Iso

%

(17)
(18)

Resolución isotópica

1 Da

[M+H]

+

(19)

myoglobin

#

1

RT:

0.01

AV:

1

NL:

1.54E7

T:

+ p Full ms [ 600.00-2000.00]

600

800

1000

1200

1400

1600

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

R

e

la

ti

v

e

A

b

u

n

d

a

n

c

e

+11

1541.9

+12

1413.5

+13

1305.0

+14

1211.9

+15

1131.1

+16

1060.5

+17

998.2

+18

942.9

+19

893.3

+20

848.6

+21

808.2

+22

771.5

+23

738.1

(20)

Orígen de los distintos iones

n = 20

n = 22

n = 18

n = 16, m/z = 1060

n = 23, m/z = 738

n = 21

n = 19

n = 17

Mioglobina

(21)

ESI

MALDI

Muestra

Líquida Sólida

Fuente

Presión atmosférica Vacío

Iones formados

Multiplicidad de cargas Un solo protón

Acople a HPLC

Ideal

Difícil

Reuso de la muestra

No Si

(22)
(23)
(24)
(25)
(26)
(27)
(28)

G L D I Q K

Estructura interna

Fragmentación en las uniones peptídicas

(29)

Tandem Mass Spectrometry

MS/MS

Triple cuadrupolo

Trampa iónica

(30)

G L D I Q K

y5 y4 y3 y2 y1

b1 b2 b3 b4 b5

Estructura interna

Fragmentación en las uniones peptídicas

(31)

Tandem Mass Spectrometry

MS/MS

G L D I Q K

673.4

527.2

b5

399.1

b4

286,0

b3

b2

171.0

y2

275.2

y3

388.2

y4

503.3

y5

616.3

(32)
(33)

Espectro MS/MS

L

E

A

I

N

Y

M

A

….LEAINYMA…

(34)

Estrategias en el estudio de proteínas

Bottom-up

Se aplica a sistemas de baja complejidad.

La proteína se digiere en solución o “ in gel “ y el digerido

completo se analiza por Masa

Shotgun

Se aplica a sistema complejos.

Muchas proteínas se digieren en conjunto y se realiza un 2D

HPLC ( intercambio + reversa ) antes de analizar por Masa.

Top-down

Las proteínas se colocan en el Masa SIN digerir previamente.

Mediante diferentes protocolos y equipos, se fragmentan las

proteínas parcialmente DENTRO del Masa

(35)

Tres maneras de usar MS para identificar proteínas

PMF Peptide Mass Fingerprint

Una lista de masas peptídicas provenientes de la digestión de UNA proteína

.

Sequence Query ó Sequence Tag

Una corta secuencia deducida manualmente a partir del espectro de fragmentación,

junto a las masas faltantes a uno y otro lado

.

(3)

MS/MS Ion Search

Espectros de fragmentación de los diferentes péptidos, provenientes de una

o varias proteínas, son comparados con los teóricos esperados a partir de las

bases de datos.

(36)

Peptide Mass Fingerprint

699 1462 2225 2988 3751 4514 Mass (m/z) 624.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % I n te n s it y 4700 Reflector Spec #1[BP = 882.6, 625]

8

8

2

.5

9

4

2

7

1

3

.4

4

2

4

1

2

9

9

.6

7

4

1

9

9

6

.6

3

3

2

1

1

0

0

.6

1

2

3

9

0

0

.4

1

5

5

1

0

6

7

.5

2

6

2

1

7

4

2

.9

6

3

6

2

2

6

5

.2

9

6

4

2

1

0

3

.1

4

8

2

1

4

5

7

.7

8

7

0

1

1

6

5

.7

9

3

2

8

6

2

.4

4

2

4

1

8

0

3

.7

9

9

3

1

5

8

4

.8

5

4

7

1

2

6

5

.6

7

2

4

9

6

2

.5

1

2

6

1

0

5

8

.5

9

3

6

1

3

6

1

.7

7

2

9

7

8

1

.4

3

1

0

2

0

0

3

.0

3

0

3

7

0

0

.4

0

2

5

1

4

6

2

.8

4

8

4

2

4

5

0

.1

6

5

8

1

7

7

8

.1

6

5

3

3

0

0

2

.5

9

3

5

2

7

3

0

.4

5

7

5

1

6

0

1

.7

4

6

0

2

8

4

7

.6

1

4

3

2

2

7

0

.3

3

7

4

1

6

9

6

.8

8

8

2

(37)

Sequence Tag

(38)

RT:

0.46 - 61.28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

R

e

la

ti

v

e

A

b

u

n

d

a

n

c

e

1195

1072

1199

1187

1701

1211

1697

975

1215

983

939

1275

1713

1179

1689

1283

935

1681

1287

1725

1485

1673

843

1315

1733

1669

839

1657

1744

1327

1752

1611

2085

1827

809

1354

801

783

74 70

208

418 531

748

NL:

1.92E7

TIC MS

Bsa 0,05 ul

MS/MS Ion search

(39)

E:\BSAVERDE 09/01/2007 11:43:17 21,0 21,5 22,0 22,5 23,0 23,5 24,0 24,5 25,0 Time (min) 0 50 967 883 907911 919 923 963 945 887 915 879 891 899 949 871 927 935 867 851 860 941 960 848 827 837 825 NL: 1,54E7 TIC MS BSAVERDE 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 50 100 570,1 722,5 431,4 571,1 646,6 1167,4 741,6 795,1 1138,5 1291,1 1444,4 388,4 458,4 883,3 1007,5 1411,5 1560,4 1620,1 1777,9 1821,6 1935,5 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0 50 100 818,3 321,0 560,8 588,3 717,4 388,2 819,4 289,1 800,4 178,0 459,9 589,4 854,0 964,1 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 50 100 584,5 1167,4 1007,4 249,0 321,1 535,3 892,2 1150,3 778,1 640,7 434,1 1266,4 1315,2

Full Scan

Fragmentación ión 722,5

Fragmentacion ión 570,1

Scan 887

Scan 888

Scan 889

(40)

Manipulación de los datos experimentales

-Agrupar los scans que hayan realizado la misma tarea ( fragmentación de

un mismo ión )

-Proponer una masa molecular, ya sea proveniente de un Zoom o en base

al análisis del espectro de fragmentación.

-Preparar un listado de.

dta

( ThermoFisher ) que incluye

Ión fragmentado Masa Molecular

Espectro obtenido

-Utilización de ese listado para entrar en programas para la identificación

de proteínas

(41)

Sequest Summary Setup CreateDTA VuDTA RunSequest Status Summary Utilities Home

Sample: L, S. (BSA 1UL) BSA 1UL sl Db: Bovin3200.fasta (04/26/2006) Inspector View Info Mass: Avg

Datafiles: BSA (05/10/2006-05/10/2006) Dir: slbsa1ul Enz: Trypsin Tot: 598|326|5.4e8

Intensity: Full MS2 Diff Mods: 0.000 C 0.000 S X

Max rank: Max list: Controls:

A gi|1351907|sp|P02769|ALBU_BOVIN 302 63|2.0e8|37% {27,4,0,1,1,5} (6 14 15 18 24 27 35 41 44 47 57 71 74 89 95 100 108 115 116 118 124 125 128 138 143 149 158 160 179 183 204 210 215 218 221 224 235 239 243 248 250 252 282 322 328 331 333 373 392 398 417 475, 23 29 50 92 258 431 477 527, 33 85 216, 199 577, 415 596, 12 38 59 277 295 406 492 522 544)

*SERUM ALBUMIN PRECURSOR gi|162648|gb|AAA51411.1| (M73993) albumin [Bos taurus]

333 1.3e6 1736-1743 2 1.0 2045.3 5.10 0.75 2090 1 23/30 gi|1351907 +2 (R)RHPYFYAPELLYYANK 235 3.1e6 1559-1571 2 -0.5 1481.3 4.33 0.65 1465 1 19/24 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 328 1.8e6 1726-1746 3 -0.5 1890.7 4.27 0.61 1389 1 26/56 gi|1351907 +2 (R)HPYFYAPELLYYANK 417 1.3e6 1878 2 -0.8 1569.5 4.22 0.63 1591 1 19/24 gi|1351907 +2 (K)DAFLGSFLYEYSR 392 2.7e7 1830-1838 2 0.5 1568.2 4.20 0.63 1761 1 19/24 gi|1351907 +2 (K)DAFLGSFLYEYSR 322 2.2e6 1718-1750 3 -0.6 2046.9 4.16 0.60 1570 1 28/60 gi|1351907 +2 (R)RHPYFYAPELLYYANK 218 9.0e6 1530-1540 3 -0.5 1441.2 4.12 0.68 2343 1 29/44 gi|1351907 +2 (R)RHPEYAVSVLLR 118 8.4e6 1352-1384 3 -0.6 1641.5 4.09 0.63 1475 1 26/56 gi|1351907 +2 (R)KVPQVSTPTLVEVSR 215 4.5e6 1523-1550 3 -0.6 1144.0 3.96 0.49 959 1 23/36 gi|1351907 +2 (K)KQTALVELLK 331 3.6e6 1734-1764 2 0.8 1889.3 3.95 0.70 928 1 23/28 gi|1351907 +2 (R)HPYFYAPELLYYANK 282 1.1e6 1642-1646 2 -1.0 1481.7 3.84 0.61 1167 1 18/24 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 74 2.3e6 1242-1264 2 0.0 1250.4 3.64 0.57 946 1 16/18 gi|1351907 +1 (R)FKDLGEEHFK 250 1.7e6 1584-1592 3 0.0 1480.8 3.57 0.52 1197 1 23/48 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 128 5.5e6 1370-1376 2 0.4 1640.6 3.55 0.70 1148 1 20/28 gi|1351907 +2 (R)KVPQVSTPTLVEVSR 115 7.9e5 1344-1366 3 -0.4 1306.9 3.51 0.42 702 1 20/40 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 210 1.2e7 1518-1538 2 0.0 1143.4 3.36 0.49 1200 1 16/18 gi|1351907 +2 (K)KQTALVELLK 143 1.3e6 1396-1419 2 -0.6 1513.4 3.34 0.62 992 1 20/26 gi|1351907 +2 (K)VPQVSTPTLVEVSR 221 6.0e6 1536-1567 2 0.5 1440.2 3.25 0.68 834 1 16/22 gi|1351907 +2 (R)RHPEYAVSVLLR 71 2.2e6 1234-1238 3 0.0 1250.4 3.08 0.43 1732 1 25/36 gi|1351907 +1 (R)FKDLGEEHFK 124 6.1e5 1363 1 -0.9 1307.4 2.78 0.56 315 1 10/20 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 108 1.2e7 1338-1342 2 0.4 1306.1 2.75 0.51 664 1 15/20 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 41 6.7e6 1127-1147 2 0.1 923.0 2.71 0.40 491 1 12/14 gi|1351907 +2 (K)AEFVEVTK 116 4.2e6 1347-1354 1 0.5 1306.0 2.68 0.48 552 1 13/20 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 57 4.9e5 1175-1193 2 1.5 1386.1 2.66 0.51 595 1 13/22 gi|1351907 +2 (K)YICDNQDTISSK 15 1.8e6 1038-1053 2 0.2 974.9 2.64 0.46 535 1 13/14 gi|1351907 +1 (K)DLGEEHFK 100 3.5e6 1312-1322 2 -0.1 1003.3 2.61 0.59 585 1 13/18 gi|1351907 +2 (K)LVVSTQTALA

41

(42)

248 1.2e7 1582-1587 1 0.6 1480.1 2.49 0.13 241 1 12/24 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 398 2.1e7 1839-1852 1 0.7 1568.0 2.49 0.36 363 1 18/24 gi|1351907 +2 (K)DAFLGSFLYEYSR 373 2.0e5 1811 2 0.3 1400.4 2.36 0.60 773 1 15/22 gi|1351907 +2 (K)TVMENFVAFVDK 179 3.4e6 1458-1464 1 0.4 1164.0 2.30 0.55 529 1 13/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 204 9.1e4 1508 2 -0.3 1164.6 2.28 0.45 320 1 10/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 47 1.1e6 1148-1151 1 -1.4 924.4 2.27 0.21 528 1 9/14 gi|1351907 +2 (K)AEFVEVTK 183 7.3e5 1472-1475 1 -1.1 1165.4 2.26 0.45 601 1 12/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 44 5.2e6 1133-1140 1 0.2 922.9 2.21 0.19 763 1 10/14 gi|1351907 +2 (K)AEFVEVTK 89 6.3e6 1286-1303 2 0.1 928.0 2.14 0.27 550 1 11/12 gi|1351907 +2 (K)YLYEIAR 27 4.1e6 1070-1081 1 0.1 789.9 2.13 0.36 480 1 9/12 gi|1351907 +2 (K)LVTDLTK 224 1.8e5 1542 3 -1.0 1285.5 2.05 0.38 616 1 16/40 gi|1351907 +2 (R)HPEYAVSVLLR 160 2.0e5 1427-1455 3 0.1 1825.0 1.94 0.38 285 2 17/60 gi|1351907 +2 (R)RPCFSALTPDETYVPK 138 5.7e5 1391-1415 2 0.7 1163.6 1.92 0.48 237 1 11/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 6 1.0e5 0900-0904 2 0.7 886.3 1.89 0.54 613 1 10/14 gi|1351907 +2 (K)DDSPDLPK 24 7.2e6 1068-1084 2 0.2 789.8 1.69 0.06 212 1 9/12 gi|1351907 +2 (K)LVTDLTK

125 3.5e5 1364-1371 2 0.2 1634.6 1.68 0.32 508 1 15/26 gi|1351907 +1 (K)YNGVFQECCQAEDK 35 4.0e5 1101 1 -1.5 791.4 1.62 0.32 309 1 7/12 gi|1351907 +2 (K)LVTDLTK

33 2.9e5 1094-1098 1 0.3 665.4 1.61 0.16 375 1 8/10 gi|108774 +2 (K)QFGEGK

158 1.1e5 1423 3 0.6 1547.2 1.59 0.35 327 2 15/48 gi|1351907 +2 (K)LKHLVDEPQNLIK 243 7.6e5 1575-1579 3 -0.6 1944.8 1.51 0.33 224 2 15/64 gi|1351907 +2 (K)VHKECCHGDLLECADDR 95 2.5e6 1302-1306 1 0.6 927.5 1.48 0.27 211 1 8/12 gi|1351907 +2 (K)YLYEIAR

252 4.4e6 1591-1594 2 0.3 1015.0 1.48 0.51 260 1 11/16 gi|1351907 +2 (K)QTALVELLK 29 1.2e6 1086-1105 2 -0.4 666.1 1.31 0.03 169 9 6/10 gi|108774 +2 (K)QFGEGK 50 2.7e5 1157-1164 3 0.4 1176.9 1.27 0.06 152 24 12/36 gi|74502 +2 (R)TRVVCQSNNR 527 8.9e5 2074-2110 2 -1.2 1668.2 1.21 0.12 96 5 7/28 gi|122719 +1 (K)VYGRKVLNSFGNAIK 14 7.7e5 1036-1052 1 -0.1 689.9 1.17 0.26 134 2 7/10 gi|1351907 +2 (K)AWSVAR

18 1.3e6 1042-1044 3 0.2 974.8 1.13 0.19 184 2 14/28 gi|1351907 +1 (K)DLGEEHFK 92 3.8e5 1292-1299 2 -0.5 1387.0 1.12 0.31 305 2 11/24 gi|7513524 (R)PDPNSPVQETSSK 239 2.8e5 1566 2 0.0 1284.5 1.12 0.35 62 4 6/20 gi|1351907 +2 (R)HPEYAVSVLLR 216 4.5e5 1528 1 -0.2 1142.6 1.01 0.02 237 3 9/18 gi|1336620 +2 (R)GTPLEDRILK 85 1.9e5 1276 2 1.1 922.0 1.00 0.19 115 11 7/14 gi|1408454 (K)EFAVIDTK

477 1.8e6 1988-1990 2 -0.7 1669.6 0.99 0.04 31 35 6/28 gi|89429 +1 (R)YPLYTKITVDIGTPS 258 9.2e5 1600-1604 1 -0.3 1014.5 0.97 0.18 49 6 6/14 gi|6016049 (R)EHAERLMK

23 8.8e4 1066 1 0.7 974.4 0.93 0.03 97 7 5/14 gi|74502 +1 (K)EEGNWLVK 431 7.7e5 1902-1928 2 -0.3 1254.8 0.85 0.08 213 1 9/18 gi|1109827 (R)KKELLTHWAK 149 2.2e5 1412-1414 2 -0.5 1296.0 0.77 0.00 283 1 9/20 gi|1351907 +2 (K)FPKAEFVEVTK 475 1.8e5 1987 2 1.4 1479.3 0.75 0.31 105 1 6/24 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR

(43)

>

gi|1351907|sp|P02769|

ALBU_BOVIN SERUM ALBUMIN PRECURSOR

MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD

ESHAGCEKSL HTLFGDELCK VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF KADEKKFWGK

YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA

RLSQKFPKAE FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA

IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL

KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL

NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT ALVELLKHKP

KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV STQTALA

Mass (average):

69293.4 Identifier: gi|1351907 Database: C:/Xcalibur/database/Bovin3200.fasta.fasta

Protein Coverage: 273/607 = 45.0% by amino acid count, 31397.1/69293.4 = 45.3% by mass

AEFVEVTK

249 - 256

AWSVAR

236 - 241

DAFLGSFLYEYSR

347 - 359

DDSPDLPK

131 - 138

DLGEEHFK

37 - 44

ECCDKPLLEK

300 - 309

FKDLGEEHFK

35 - 44

FPKAEFVEVTK

246 - 256

HLVDEPQNLIK

402 - 412

HPEYAVSVLLR

361 - 371

(44)

Spot Cutter

Automated

digester

Automated

digester

MALDI

Plate

Spotter

MALDI

TOF

Search

Results

Unidentified

LC/MS/MS

Sequest

Sequest

OK

De Novo sequencing

De Novo sequencing

OK

OK

(45)

Proteómica

Conjunto de técnicas destinadas a la descripción

completa de las proteínas en un sistema ( célula ,

órgano, organismo ), en condiciones fisiológicas y

(46)
(47)

Dificultades a las que se enfrenta en este tipo de trabajos.

-Tenemos, en los humanos por ej, cerca de 22000 genes y

al menos 10 veces más proteínas.

-Algunas fuentes sugieren 1 millón de proteínas diferentes,

teniendo en cuenta las modificaciones.

-El rango dinámico puede llegar a ser de 1 - 1000000.

-Se estima que el 5% de las proteínas, conforman el 80% de

la masa proteica total de un organismo. Cómo analizamos

el restante 95%?.

(48)

Product Ion Scan

• Selection of a single parent ion by Q1 allows

separate product ion scans for coeluting

compounds to be easily generated.

– Provided they don’t have the same mass…

Q0

Q1

Q2

Q3

N

2

CAD Gas

linear ion trap

3x10

-5

Torr

Precursor ion

selection

Ion accumulation

Fragmentation

Exit lens

Steps MS2:

1

2

3 &4

(49)
(50)
(51)

Integrantes del Lanais-pro

Mirtha Biscoglio

Susana Linskens

Carlos Pavan

Daiana Olsen

Leticia Lauria

GRACIAS…..

(52)

LANAIS-PRO

Laboratorio Nacional de Investigación y

Servicios en Péptidos y Proteínas

UBA -CONICET

TE: 54-1-4508-3651

FAX: 54-1-4508-3652

Consultas:

linskens@qb.ffyb.uba.ar

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