Espectrometría de Masa
(ESI-IT)
Aplicación al estudio de proteínas
Lanais-Pro
Ionización
Analizador
Detector
Esquema básico de un MS
Electron ionization Magnetic Sector
Chemical ionization Time of Flight ( TOF )
Beam techniques Triple cuadrupole
MALDI
Ion Trap
Electrospray
APCI
Cyclotron
/
Fourier
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption
Electrospray
Electrospray
+ + + + + + + + + + + + + + + +Capillary column
Capillary column
effluent
effluent
Optional coaxial
Optional coaxial
sheath liquid
sheath liquid
and
and
optional coaxial
optional coaxial
drying gas
drying gas
Entrance to mass
Entrance to mass
spectrometer
spectrometer
Heated desolvation region
Heated desolvation region
+2 kV to +5 kV
+2 kV to +5 kV
Desolvated peptide
Desolvated peptide
ions
ions
Charged droplets
Charged droplets
+ + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +++ + + + + + + + +++ + +++ + + + + + + + +++Ionización
Time of Flight
Cuadrupole
Trampa iónica
Cyclotron/Fourier
Interpretación de un espectro de masas
Recordar que MS
distingue m/z
- Una misma molécula puede cargarse de maneras diferentes,
tomando distinta cantidad de protones.
- Dos señales en el espectro no necesariamente significa que hay
dos entidades moleculares.
-Para calcular la masa original, debe conocerse la carga ( z)
del ión.
CISTEINA
TREONINA
ARGININA
. . . . . . . . .
4.29
33.96786683(11)
34S
0.76(2) 32.97145850(12) 33S94.93
31.97207069(12)
32S
0.205(14) 17.9991604(9) 18O 0.038(1) 16.99913150(22) 17O99.757(16)
15.9949146221(15)16O
-0.368(7) 15.0001088984(9) 15N99.632(7)
14.0030740052(9)14N
-3.0160492675(11) 3H 0.0115(70) 2.0141017780(4) 2H99.9885(70)
1.0078250321(4)1H
-14.003241988(4) 14C1.07
13.0033548378(10)13
C
98.93
12
12C
% A+2 Iso%
A+1 Iso%
Resolución isotópica
1 Da
[M+H]
+
myoglobin
#
1
RT:
0.01
AV:
1
NL:
1.54E7
T:
+ p Full ms [ 600.00-2000.00]
600
800
1000
1200
1400
1600
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
R
e
la
ti
v
e
A
b
u
n
d
a
n
c
e
+11
1541.9
+12
1413.5
+13
1305.0
+14
1211.9
+15
1131.1
+16
1060.5
+17
998.2
+18
942.9
+19
893.3
+20
848.6
+21
808.2
+22
771.5
+23
738.1
Orígen de los distintos iones
n = 20
n = 22
n = 18
n = 16, m/z = 1060
n = 23, m/z = 738
n = 21
n = 19
n = 17
Mioglobina
ESI
MALDI
Muestra
Líquida Sólida
Fuente
Presión atmosférica Vacío
Iones formados
Multiplicidad de cargas Un solo protón
Acople a HPLC
Ideal
Difícil
Reuso de la muestra
No Si
G L D I Q K
Estructura interna
Fragmentación en las uniones peptídicas
Tandem Mass Spectrometry
MS/MS
Triple cuadrupolo
Trampa iónica
G L D I Q K
y5 y4 y3 y2 y1
b1 b2 b3 b4 b5
Estructura interna
Fragmentación en las uniones peptídicas
Tandem Mass Spectrometry
MS/MS
G L D I Q K
673.4
527.2
b5
399.1
b4
286,0
b3
b2
171.0
y2
275.2
y3
388.2
y4
503.3
y5
616.3
Espectro MS/MS
L
E
A
I
N
Y
M
A
….LEAINYMA…
Estrategias en el estudio de proteínas
Bottom-up
Se aplica a sistemas de baja complejidad.
La proteína se digiere en solución o “ in gel “ y el digerido
completo se analiza por Masa
Shotgun
Se aplica a sistema complejos.
Muchas proteínas se digieren en conjunto y se realiza un 2D
HPLC ( intercambio + reversa ) antes de analizar por Masa.
Top-down
Las proteínas se colocan en el Masa SIN digerir previamente.
Mediante diferentes protocolos y equipos, se fragmentan las
proteínas parcialmente DENTRO del Masa
Tres maneras de usar MS para identificar proteínas
PMF Peptide Mass Fingerprint
Una lista de masas peptídicas provenientes de la digestión de UNA proteína
.
Sequence Query ó Sequence Tag
Una corta secuencia deducida manualmente a partir del espectro de fragmentación,
junto a las masas faltantes a uno y otro lado
.
(3)
MS/MS Ion Search
Espectros de fragmentación de los diferentes péptidos, provenientes de una
o varias proteínas, son comparados con los teóricos esperados a partir de las
bases de datos.
Peptide Mass Fingerprint
699 1462 2225 2988 3751 4514 Mass (m/z) 624.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % I n te n s it y 4700 Reflector Spec #1[BP = 882.6, 625]8
8
2
.5
9
4
2
7
1
3
.4
4
2
4
1
2
9
9
.6
7
4
1
9
9
6
.6
3
3
2
1
1
0
0
.6
1
2
3
9
0
0
.4
1
5
5
1
0
6
7
.5
2
6
2
1
7
4
2
.9
6
3
6
2
2
6
5
.2
9
6
4
2
1
0
3
.1
4
8
2
1
4
5
7
.7
8
7
0
1
1
6
5
.7
9
3
2
8
6
2
.4
4
2
4
1
8
0
3
.7
9
9
3
1
5
8
4
.8
5
4
7
1
2
6
5
.6
7
2
4
9
6
2
.5
1
2
6
1
0
5
8
.5
9
3
6
1
3
6
1
.7
7
2
9
7
8
1
.4
3
1
0
2
0
0
3
.0
3
0
3
7
0
0
.4
0
2
5
1
4
6
2
.8
4
8
4
2
4
5
0
.1
6
5
8
1
7
7
8
.1
6
5
3
3
0
0
2
.5
9
3
5
2
7
3
0
.4
5
7
5
1
6
0
1
.7
4
6
0
2
8
4
7
.6
1
4
3
2
2
7
0
.3
3
7
4
1
6
9
6
.8
8
8
2
Sequence Tag
RT:
0.46 - 61.28
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
R
e
la
ti
v
e
A
b
u
n
d
a
n
c
e
1195
1072
1199
1187
1701
1211
1697
975
1215
983
939
1275
1713
1179
1689
1283
935
1681
1287
1725
1485
1673
843
1315
1733
1669
839
1657
1744
1327
1752
1611
2085
1827
809
1354
801
783
74 70
208
418 531
748
NL:
1.92E7
TIC MS
Bsa 0,05 ul
MS/MS Ion search
E:\BSAVERDE 09/01/2007 11:43:17 21,0 21,5 22,0 22,5 23,0 23,5 24,0 24,5 25,0 Time (min) 0 50 967 883 907911 919 923 963 945 887 915 879 891 899 949 871 927 935 867 851 860 941 960 848 827 837 825 NL: 1,54E7 TIC MS BSAVERDE 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 50 100 570,1 722,5 431,4 571,1 646,6 1167,4 741,6 795,1 1138,5 1291,1 1444,4 388,4 458,4 883,3 1007,5 1411,5 1560,4 1620,1 1777,9 1821,6 1935,5 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0 50 100 818,3 321,0 560,8 588,3 717,4 388,2 819,4 289,1 800,4 178,0 459,9 589,4 854,0 964,1 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0 50 100 584,5 1167,4 1007,4 249,0 321,1 535,3 892,2 1150,3 778,1 640,7 434,1 1266,4 1315,2
Full Scan
Fragmentación ión 722,5
Fragmentacion ión 570,1
Scan 887
Scan 888
Scan 889
Manipulación de los datos experimentales
-Agrupar los scans que hayan realizado la misma tarea ( fragmentación de
un mismo ión )
-Proponer una masa molecular, ya sea proveniente de un Zoom o en base
al análisis del espectro de fragmentación.
-Preparar un listado de.
dta
( ThermoFisher ) que incluye
Ión fragmentado Masa Molecular
Espectro obtenido
-Utilización de ese listado para entrar en programas para la identificación
de proteínas
Sequest Summary Setup CreateDTA VuDTA RunSequest Status Summary Utilities Home
Sample: L, S. (BSA 1UL) BSA 1UL sl Db: Bovin3200.fasta (04/26/2006) Inspector View Info Mass: Avg
Datafiles: BSA (05/10/2006-05/10/2006) Dir: slbsa1ul Enz: Trypsin Tot: 598|326|5.4e8
Intensity: Full MS2 Diff Mods: 0.000 C 0.000 S X
Max rank: Max list: Controls:
A gi|1351907|sp|P02769|ALBU_BOVIN 302 63|2.0e8|37% {27,4,0,1,1,5} (6 14 15 18 24 27 35 41 44 47 57 71 74 89 95 100 108 115 116 118 124 125 128 138 143 149 158 160 179 183 204 210 215 218 221 224 235 239 243 248 250 252 282 322 328 331 333 373 392 398 417 475, 23 29 50 92 258 431 477 527, 33 85 216, 199 577, 415 596, 12 38 59 277 295 406 492 522 544)
*SERUM ALBUMIN PRECURSOR gi|162648|gb|AAA51411.1| (M73993) albumin [Bos taurus]
333 1.3e6 1736-1743 2 1.0 2045.3 5.10 0.75 2090 1 23/30 gi|1351907 +2 (R)RHPYFYAPELLYYANK 235 3.1e6 1559-1571 2 -0.5 1481.3 4.33 0.65 1465 1 19/24 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 328 1.8e6 1726-1746 3 -0.5 1890.7 4.27 0.61 1389 1 26/56 gi|1351907 +2 (R)HPYFYAPELLYYANK 417 1.3e6 1878 2 -0.8 1569.5 4.22 0.63 1591 1 19/24 gi|1351907 +2 (K)DAFLGSFLYEYSR 392 2.7e7 1830-1838 2 0.5 1568.2 4.20 0.63 1761 1 19/24 gi|1351907 +2 (K)DAFLGSFLYEYSR 322 2.2e6 1718-1750 3 -0.6 2046.9 4.16 0.60 1570 1 28/60 gi|1351907 +2 (R)RHPYFYAPELLYYANK 218 9.0e6 1530-1540 3 -0.5 1441.2 4.12 0.68 2343 1 29/44 gi|1351907 +2 (R)RHPEYAVSVLLR 118 8.4e6 1352-1384 3 -0.6 1641.5 4.09 0.63 1475 1 26/56 gi|1351907 +2 (R)KVPQVSTPTLVEVSR 215 4.5e6 1523-1550 3 -0.6 1144.0 3.96 0.49 959 1 23/36 gi|1351907 +2 (K)KQTALVELLK 331 3.6e6 1734-1764 2 0.8 1889.3 3.95 0.70 928 1 23/28 gi|1351907 +2 (R)HPYFYAPELLYYANK 282 1.1e6 1642-1646 2 -1.0 1481.7 3.84 0.61 1167 1 18/24 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 74 2.3e6 1242-1264 2 0.0 1250.4 3.64 0.57 946 1 16/18 gi|1351907 +1 (R)FKDLGEEHFK 250 1.7e6 1584-1592 3 0.0 1480.8 3.57 0.52 1197 1 23/48 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 128 5.5e6 1370-1376 2 0.4 1640.6 3.55 0.70 1148 1 20/28 gi|1351907 +2 (R)KVPQVSTPTLVEVSR 115 7.9e5 1344-1366 3 -0.4 1306.9 3.51 0.42 702 1 20/40 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 210 1.2e7 1518-1538 2 0.0 1143.4 3.36 0.49 1200 1 16/18 gi|1351907 +2 (K)KQTALVELLK 143 1.3e6 1396-1419 2 -0.6 1513.4 3.34 0.62 992 1 20/26 gi|1351907 +2 (K)VPQVSTPTLVEVSR 221 6.0e6 1536-1567 2 0.5 1440.2 3.25 0.68 834 1 16/22 gi|1351907 +2 (R)RHPEYAVSVLLR 71 2.2e6 1234-1238 3 0.0 1250.4 3.08 0.43 1732 1 25/36 gi|1351907 +1 (R)FKDLGEEHFK 124 6.1e5 1363 1 -0.9 1307.4 2.78 0.56 315 1 10/20 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 108 1.2e7 1338-1342 2 0.4 1306.1 2.75 0.51 664 1 15/20 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 41 6.7e6 1127-1147 2 0.1 923.0 2.71 0.40 491 1 12/14 gi|1351907 +2 (K)AEFVEVTK 116 4.2e6 1347-1354 1 0.5 1306.0 2.68 0.48 552 1 13/20 gi|1351907 +2 (K)HLVDEPQNLIK 57 4.9e5 1175-1193 2 1.5 1386.1 2.66 0.51 595 1 13/22 gi|1351907 +2 (K)YICDNQDTISSK 15 1.8e6 1038-1053 2 0.2 974.9 2.64 0.46 535 1 13/14 gi|1351907 +1 (K)DLGEEHFK 100 3.5e6 1312-1322 2 -0.1 1003.3 2.61 0.59 585 1 13/18 gi|1351907 +2 (K)LVVSTQTALA
41
248 1.2e7 1582-1587 1 0.6 1480.1 2.49 0.13 241 1 12/24 gi|1351907 +2 (K)LGEYGFQNALIVR 398 2.1e7 1839-1852 1 0.7 1568.0 2.49 0.36 363 1 18/24 gi|1351907 +2 (K)DAFLGSFLYEYSR 373 2.0e5 1811 2 0.3 1400.4 2.36 0.60 773 1 15/22 gi|1351907 +2 (K)TVMENFVAFVDK 179 3.4e6 1458-1464 1 0.4 1164.0 2.30 0.55 529 1 13/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 204 9.1e4 1508 2 -0.3 1164.6 2.28 0.45 320 1 10/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 47 1.1e6 1148-1151 1 -1.4 924.4 2.27 0.21 528 1 9/14 gi|1351907 +2 (K)AEFVEVTK 183 7.3e5 1472-1475 1 -1.1 1165.4 2.26 0.45 601 1 12/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 44 5.2e6 1133-1140 1 0.2 922.9 2.21 0.19 763 1 10/14 gi|1351907 +2 (K)AEFVEVTK 89 6.3e6 1286-1303 2 0.1 928.0 2.14 0.27 550 1 11/12 gi|1351907 +2 (K)YLYEIAR 27 4.1e6 1070-1081 1 0.1 789.9 2.13 0.36 480 1 9/12 gi|1351907 +2 (K)LVTDLTK 224 1.8e5 1542 3 -1.0 1285.5 2.05 0.38 616 1 16/40 gi|1351907 +2 (R)HPEYAVSVLLR 160 2.0e5 1427-1455 3 0.1 1825.0 1.94 0.38 285 2 17/60 gi|1351907 +2 (R)RPCFSALTPDETYVPK 138 5.7e5 1391-1415 2 0.7 1163.6 1.92 0.48 237 1 11/18 gi|1351907 +2 (K)LVNELTEFAK 6 1.0e5 0900-0904 2 0.7 886.3 1.89 0.54 613 1 10/14 gi|1351907 +2 (K)DDSPDLPK 24 7.2e6 1068-1084 2 0.2 789.8 1.69 0.06 212 1 9/12 gi|1351907 +2 (K)LVTDLTK
125 3.5e5 1364-1371 2 0.2 1634.6 1.68 0.32 508 1 15/26 gi|1351907 +1 (K)YNGVFQECCQAEDK 35 4.0e5 1101 1 -1.5 791.4 1.62 0.32 309 1 7/12 gi|1351907 +2 (K)LVTDLTK
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