FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
TESIS DOCTORAL
ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN FUNCIONAL DE
LA TETRASPANINA CD9 CON LA INTEGRINA
LFA-1 EN LA SUPERFICIE LEUCOCITARIA
Raquel Reyes Manzanas
Madrid, 2015
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
TESIS DOCTORAL
ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN FUNCIONAL DE LA
TETRASPANINA CD9 CON LA INTEGRINA LFA-1 EN
LA SUPERFICIE LEUCOCITARIA
Memoria para optar al grado de Doctor en Genética y Biología Celular,
presentada por:
Raquel Reyes Manzanas
Licenciada en Biología
Director de la Tesis
Tutor de la Tesis
Dr. Carlos Cabañas Gutiérrez
Dr. José Manuel Sierra Pérez
Universidad Autónoma de Madrid
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa
Este trabajo no podría haber sido realizado sin la ayuda de muchas personas, tanto a nivel científico como personal. De todos he aprendido algo y quiero agradeceros vuestra ayuda.
Este camino comenzó hace unos cuantos años gracias a mi Tutor, José Manuel, al que le debo más que el haberme dado la oportunidad de empezar este camino, porque sin sus consejos y sin su ayuda no hubiese seguido en el mundo científico. Muchas gracias por confiar en mí y por tu apoyo cuando más lo necesitaba.
Carlos, muchísimas gracias por dejarme formar parte de tu laboratorio y enseñarme que la ciencia es más que hacer experimentos. Gracias por tu paciencia, por ayudarme a resolver los problemas que han ido surgiendo, por tus clases de inglés, de botánica, de física… y por tus charlas que me han enriquecido mucho.
Gracias a mis antiguos compañeros del laboratorio 107: María, Juan, José y Raquel por vuestro apoyo. Siempre estuvisteis ahí cuando os necesitaba, vuestras risas siempre me ayudaban a verlo todo de una forma más positiva.
De mis compañeros del 125 sólo puedo decir cosas maravillosas. Muchas gracias a todos por enseñarme a que la ciencia es mucho mejor cuando se colabora entre todos. Álvaro, gracias por enseñarme tanto y por estar ahí siempre que te necesité. Irene, gracias por tu enorme ayuda en el laboratorio y por tu alegría contagiosa. Te echamos mucho de menos cuando te fuiste y siempre estamos esperando tu próxima visita. Grace, gracias por hacerme sentir tan bien cuando llegué al laboratorio. Lorena, gracias por todas tus sugerencias y tus consejos. César y Marian, gracias por ser tan buenos compañeros. Nouf, muchas gracias por tu ayuda en el laboratorio y por enseñarme a ver las cosas desde otro punto de vista. Bea, tu ayuda ha sido indispensable este último año, muchas gracias por ayudarnos a terminar el artículo, pero también muchas gracias por ser tan buena compañera. Yes, reina, empezaste siendo una muy buena compañera, pero has acabado siendo una gran amiga. Hemos aprendido tanto juntas… Tu energía y tu entusiasmo por la ciencia se contagian. Gracias por ayudarme en todo, por escucharme y por hacerme sentir en el laboratorio como en casa. En resumen, gracias por estar ahí.
Gracias a mis “vecinos” Ruth, Javi y Atocha, siempre recordaré nuestras comidas en el CBM. Muchas gracias por hacerme reír cuando más lo necesitaba, por vuestro apoyo y vuestra amistad.
Compañeras del 126, Gema, Elena, Ana, Nuria e Irene, muchas gracias por ayudarme siempre que lo he necesitado. Raquel y Almudena, nos ha tocado vivir juntas la etapa de escritura de la tesis. Muchas gracias a las dos por vuestra ayuda y, sobre todo, por ser tan buenas amigas.
Juan, muchas gracias por tu ayuda y por tus comentarios en los seminarios que siempre han ayudado a mejorar mi trabajo.
Jorge, muchas gracias por tus consejos y por los ratos de café/coca-cola que me han ayudado siempre a despejarme. Te vamos a echar de menos en el CBM.
Gracias al grupo de Manolo López-Cabrera: Pilar, María-Luisa, Angy, Vicente y Adrián, por permitirnos colaborar con vosotros y enseñarnos una parte más clínica de la ciencia.
Muchas gracias Esther y Mymó porque vuestras ideas y sugerencias han sido indispensables en mi trabajo. Zoraida, Henar y Soraya, muchas gracias por ayudarme cuando lo he necesitado.
Quiero destacar la ayuda que siempre he recibido de todos los servicios del CBM. Gracias a Paco y al servicio de instrumentación que siempre nos han ayudado cuando algo se rompía. A Berta y a Silvia, no sólo por vuestra ayuda con la citometría, sino también por ser siempre tan amables. A Carlos, Vero, Ángeles, Maite y Carmen de microscopía, por ayudarme con la obtención de imágenes y con la cuantificación, pero también por vuestras charlas que siempre hacen que las horas en el microscopio pasen más rápido.
También quiero dar las gracias al Departamento de Biología de la UAM, sobre todo a la unidad de genética, por haberme dejado formar parte de este área y por permitirme ayudar en tantas asignaturas, me habéis enseñado mucho.
A mis compañeras de la uni: Blanca, Sofi, Leti, Vir, Esther, Bea, Ana y María, muchas gracias por compartir todos estos años conmigo. Hemos vivido muchas cosas juntas y sé que siempre puedo contar con vosotras.
Finalmente, el mayor de mis agradecimientos va para mi familia. Muchas gracias a mis tíos, a mis primos, a mis suegros y a mis cuñados por todo vuestro apoyo y vuestro ánimo durante esta larga etapa. Gracias a mis abuelos por vuestro gran ejemplo y por vuestro cariño incondicional, siempre os llevo conmigo. Yaya, tu fuerza es increíble, muchísimas gracias por cuidarme como a una hija y por todo tu cariño. Hay un proverbio oriental que dice: “Gobierna tu casa y sabrás cuánto cuesta la leña y el arroz; cría a tus hijos, y sabrás cuánto debes a tus padres”, pues eso papás, que os debo mucho. Siempre habéis estado ahí ayudándome en todo lo que habéis podido y dándome todo vuestro apoyo y amor. Nada de esto hubiese sido posible sin vuestra ayuda, mil gracias. Tates, desde siempre me habéis dado todo, me habéis apoyado y ayudado cada vez que he necesitado algo. Muchas gracias por ser como sois. Sergio, acabas de llegar pero tu sonrisa es la mayor de mis alegrías, haces que todo merezca la pena. Dani, no tengo palabras para agradecerte todo lo que has hecho por mí. Gracias por tu paciencia infinita, por tu apoyo, por venirme a buscar al trabajo cuando salgo tarde, por animarme siempre que lo veo todo negro… En definitiva, gracias por estar siempre a mi lado.
13 ÍNDICE Agradecimientos ... 7 Índice ... 11 Abreviaturas ... 15 Resumen ... 19 Introducción ... 23 Tetraspaninas ... 25 Introducción ... 25 Estructura ... 27
Interacciones de las tetraspaninas ... 29
Funciones ... 33
La tetraspanina CD9 ... 35
Integrinas ... 39
Introducción ... 39
Estructura ... 40
Activación de las integrinas ... 43
Funciones ... 47
La integrina leucocitaria LFA-1 ... 49
Complejos integrina/tetraspanina ... 51 Objetivos ... 53 Materiales y métodos ... 57 Cultivos celulares ... 59 Anticuerpos y reactivos ... 59 Plásmidos y transfecciones ... 60 Citometría de flujo ... 60
Inmunofluorescencia, microscopía confocal y TIRF ... 61
Ensayos de hibridación por proximidad (PLAs) ... 63
Preparación de extractos de proteína y análisis por western-blot ... 63
Ensayos de co-inmunoprecipitación de proteínas ... 64
Experimentos de entrecruzamiento químico (crosslinking) ... 65
Ensayos de arrastre o pull-down con proteínas de fusión recombinantes ... 65
Ensayos de adhesión celular ... 66
Ensayos de capacidad citotóxica ... 67
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Resultados ... 69
La tetraspanina CD9 interacciona con la integrina LFA-1 en la superficie celular de diferentes tipos de leucocitos ... 71
La interacción entre CD9 y LFA-1 se realiza a través del dominio LEL de CD9 ... 80
Anticuerpos anti-CD9 inhiben la adhesión mediada por la integrina LFA-1 ... 82
Los anticuerpos anti-CD9 inhiben la actividad citotóxica mediada por LFA-1 ... 84
La neoexpresión o la inhibición de la tetraspanina CD9 regula la adhesión de LFA-1 a su ligando ICAM-1 ... 85
CD9 no produce cambios en el estado de afinidad de la integrina LFA-1 ... 87
CD9 regula la adhesión mediada por LFA-1 mediante cambios en el agrupamiento de la integrina ... 89
La presencia de CD9 aumenta el número de agrupamientos de LFA-1 en la membrana plasmática pero reduce su tamaño ... 90
CD9 afecta a la extracción de CD9 de la membrana plasmática ... 93
Discusión ... 95
Conclusiones ... 105
Bibliografía ... 109
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CASTELLANO
INGLÉS
AcM Anticuerpo monoclonal Monoclonal antibody
ADAM Desintegrina y metaloproteinasa A desintegrin and metalloproteinase
ALCAM Molécula de adhesión celular del
leucocito activado
Activated leukocyte cell adhesion molecule
BCECF-AM
2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(6)-carboxifluoresceína-acetoximetil éster
2′,7′
-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein-acetoxymethyl ester
BCL-2 Linfoma de célula B-2 B-cell lymphoma-2
BCR Receptor de células B B-cell receptor
BSA Albúmina de suero bovina Bovine serum albumin
CD Antígeno de diferenciación Cluster of differentiation
c-SMAC Complejo supramolecular de activación
central
Central supramolecular activating cluster
DNA Ácido desoxirribonucleico Deoxyribonucleic acid
DOCK-1 Proteína de citocinesis-1 Dedicator of cytokinesis-1
EAPs Plataformas de adhesión endotelial Endothelial adhesive platforms
EGF Factor de crecimiento epidérmico Epidermal growth factor
EGFR Receptor del factor de crecimiento
epidérmico
Epidermal growth factor receptor
ERM Ezrina, radixina y moesina Ezrin, radixin y moesin
ESM Error estándar de la media Standard error of the mean
FAK Quinasa de adhesión focal Focal adhesion kinase
FBS Suero fetal bovino Fetal bovine serum
FITC Isotiocianato de fluoresceína Fluorescein isothiocyanate
GSH Glutatión reducido Reduced glutathione
GST Glutatión S-transferasa Glutathione S-transferase
HB-EGF Factor de crecimiento epidérmico de
unión a heparina
Heparin-binding epidermal growth factor
HEPES Ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico
4-(2-hidroxethyl) piperazine 1-ethanesulfonic acid
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular-1 Intercellular adhesion molecule-1
ICAP-1 Proteína asociada al dominio
citoplasmático de las integrinas-1
Integrin cytoplasmic domain-associated protein-1
IgSF Superfamilia de las inmunoglobulinas Immunoglobulin superfamily
IL-2 Interleuquina-2 Interleukin-2
INT Cloruro de 2-(p-Iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5- fenil tetrazolio
2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride
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LAK Asesinas activadas por linfoquinas Lymphokine-activated killer
LDH Lactato deshidrogenasa Lactate dehydrogenase
LEL Dominio extracelular grande Large extracellular loop
LFA-1 Antígeno asociado a la función de los
linfocitos-1
Lymphocyte function-associated antigen-1
MHC Complejo mayor de histocompatibilidad Major histocompatibility complex
MIDAS Sitio de adhesión dependiente de ion
metálico
Metal ion dependent adhesion site
NAD+ Nicotinamida adenina dinucleótido Nicotinamide adenine dinucleotide
NK Asesina natural Natural killer
PBS Tampón fosfato salino Phosphate buffered saline
PI3K Fosfatidilinositol-3 quinasa Phosphatidylinositol 3-kinase
PI4K Fosfatidilinositol-4 quinasa Phosphatidylinositol 4-kinase
PIP2 Fosfatidilinositol-4,5-bifosfato Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
PKC Proteína quinasa C Protein kinase C
PLAs Ensayos de hibridación por proximidad Proximity ligation assays
PMA Acetato de forbol miristato Phorbol myristate acetate
PSI Plexina-semaforina-integrina Plexin-semaphorin-Integrin
p-SMAC Complejo supramolecular de activación
periférico
Peripheral- supramolecular activating cluster
RNA Ácido ribonucleico Ribonucleic acid
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SDS Dodecilsulfato sódico Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Dodecilsulfato sódico – electroforesis en gel de poliacrilamida
Sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis
SEL Dominio extracelular corto Short extracellular loop
shRNA ARN pequeño en horquilla short hairpin RNA
TBS Tampón Tris salino Tris buffered saline
TCR Receptor de células T T-cell receptor
TEM Microdominio enriquecido en tetraspaninas
Tetraspanin-enriched microdomain
TGF-α Factor de crecimiento transformante alfa Transforming growth factor alpha
TIRF Fluorescencia de reflexión interna total Total internal reflection fluorescence
VCAM-1 Molécula de adhesión vascular-1 Vascular cell adhesion molecule-1
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La tetraspanina CD9 interacciona con distintos miembros de las subfamilias β1,β3 y β4 de las integrinas. A través de esta interacción CD9 regula la adhesión, la migración y la señalización celular. Sin embargo, hasta este momento no se había descrito ninguna interacción de esta tetraspanina con miembros de la subfamilia β2. Los resultados de colocalización, hibridación por proximidad y co-inmunoprecipitación, que se presentan en esta tesis, muestran que CD9 se asocia con la integrina de la subfamilia β2 LFA-1 en la superficie de distintos tipos de leucocitos (linfocitos T, B y células monocíticas). Esta interacción es resistente a condiciones de solubilización fuertes, lo que apunta, junto con los resultados de los ensayos de pull-down y entrecruzamiento químico, a una interacción directa entre las dos moléculas que se produce a través del dominio extracelular grande de CD9. Además, CD9 regula funcionalmente a la integrina LFA-1, puesto que la presencia de esta tetraspanina inhibe la adhesión de LFA-1 a su ligando ICAM-1 y la citotoxicidad celular dependiente de esta unión. La regulación de CD9 sobre LFA-1 no implica cambios en la afinidad de la integrina, pero sí cambios en su avidez que se evidencian por la alteración causada por CD9 en el patrón de distribución de LFA-1 en la superficie celular. Curiosamente, la regulación que ejerce CD9 sobre la adhesión de integrinas de la subfamilia β1 es inversa a la observada para la integrina LFA-1.
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The tetraspanin CD9 interacts with different members of the β1, β3and β4 subfamilies of integrins and through these interactions regulates cell adhesion, migration and signalling. However, the interaction of CD9 with any member of the β2 subfamily of integrins had not been reported so far. The confocal microscopy co-localization, in situ Proximity Ligation Assays and co-immunoprecipitation results that are presented here show that CD9 associates with the β2 integrin LFA-1 on the surface of different types of leukocytes (including T, B and monocytic cells). This association is resistant to stringent solubilisation conditions which, together with data from chemical crosslinking and pull-down experiments, suggests a primary/direct type of interaction mediated by the large extracellular loop (LEL) of the tetraspanin. CD9 exerts inhibitory effects on the adhesive function of LFA-1 and on LFA-1-dependent leukocyte cytotoxic activity. The mechanism responsible for the negative regulation exerted by CD9 on LFA-1 adhesion does not involve changes in the affinity state of this integrin but seems to be related to alterations in its state of aggregation. Interestingly, CD9 regulates in an inverse manner the adhesive properties of the β1 and β2 integrins expressed on the same leukocytes.
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TETRASPANINAS
Introducción
Las tetraspaninas son una superfamilia de pequeñas proteínas de membrana que se encuentran ampliamente distribuidas en eucariotas. Existen miembros de esta familia de proteínas en hongos (ej. Rhizopus oryzae), plantas (ej. Arabidopsis thaliana), nematodos (ej.
Caenorhabditis elegans), insectos (ej. Drosophila melanogaster) y vertebrados (ej. Mus musculus), lo que indica que estas moléculas aparecieron pronto durante el proceso de evolución (Boucheix y col., 2001; Hemler, 2003). En la especie humana se han caracterizado 33 tetraspaninas diferentes (Charrin y col., 2014; García-España y col., 2008; Hemler, 2008) entre las que se incluyen: I. Los antígenos celulares de diferenciación (CD) leucocitarios CD9, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82 y CD151 (Boucheix y Rubinstein, 2001; Hemler, 2003; Tarrant y col., 2003); II. Las proteínas del aro exterior del fotorreceptor de la retina Rom1 y RDS/periferina (van Soest y col., 1999); III. Las tetraspaninas que se han identificado en tumores TALLA-1, CO-029 y SAS (Jankowski y col., 1994; Szala y col., 1990); IV. Las uroplaquinas UP1a y UP1b que forman parte del urotelio (Sun y col., 1996); y V. Diferentes tetraspaninas que han sido descubiertas mediante la búsqueda en bases de datos a través de
Figura 1: Árbol de las distancias genéticas entre las diferentes tetraspaninas de mamíferos. La longitud de los brazos indica la distancia genética entre las tetraspaninas (0,1 = 10 % de diferencia en la
secuencia de aminoácidos). Todas las
secuencias usadas son de humano, excepto BAB22942.1m que es de ratón. (Modificado de Hemler, 2003).
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secuencias consenso, como NET-1, NET-3 o NET-7 (Serru y col., 2000; Todd y col., 1998) (Figura 1). Las tetraspaninas poseen una estructura génica altamente conservada, lo que sugiere que se han formado a partir de un antecesor común mediante un proceso de duplicación (Boucheix y Rubinstein, 2001). La tetraspanina humana más antigua se remonta al momento de la separación entre protóstomos y deuteróstomos (TSPAN15), aunque la mayoría de las tetraspaninas humanas aparecieron cuando se originó el subfilo de los vertebrados (Figura 2) (García-España y col., 2008).
Todas las células de mamífero expresan varias tetraspaninas en su superficie, con excepción de los eritrocitos, pero su distribución varía mucho de unos tipos celulares a otros. Algunas tetraspaninas presentan un patrón de distribución muy amplio, como CD151, CD81 y CD82, mientras que otras pertenecen a estructuras muy especializadas, como UP1a y UP1b que se encuentran en el urotelio o las proteínas RDS/periferina o Rom-1 de los fotorreceptores de la retina. Otros ejemplos de tetraspaninas que poseen una distribución restringida son: CD53, que se encuentra sólo en leucocitos, y CD37, que sólo se expresa de manera abundante en los
Figura 2: Origen de las tetraspaninas humanas. En el esquema se representan los cinco puntos del origen ancestral de las tetraspaninas humanas (mamíferos, tetrápodos, vertebrados, cordados y deuteróstomos). Los distintos puntos están representados por diferentes tonalidades de grises. (Modificado de García-España, 2008).
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linfocitos B (Boucheix y Rubinstein, 2001; Hemler, 2005; Le Naour y col., 2006). La mayoría de las tetraspaninas se expresan en la superficie celular, pero algunas tetraspaninas pueden localizarse también en compartimentos intracelulares. Por ejemplo, CD63 se expresa en los lisosomas y CD151 en endosomas de células endoteliales (Azorsa y col., 1991; Sincock y col., 1999). Otras tetraspaninas como CD37, CD53, CD63, CD81 y CD82 se localizan también en la membrana interna de los compartimentos citoplásmicos ricos en MHC (Major Histocompatibility Complex o complejo mayor de histocompatibilidad) de clase II de linfocitos B y, por tanto, en los exosomas derivados de estos compartimentos (Hammond y col., 1998; Raposo y col., 1996).
Estructura
Los diferentes miembros de la familia de las tetraspaninas no presentan una alta homología de secuencia entre sí; sin embargo, tienen una estructura secundaria y terciaria muy conservada (Yáñez-Mó y col., 2009). Su tamaño varía entre los 204 y los 355 aminoácidos (20-30 kDa) de las tetraspaninas NET-6 y oculospanina, respectivamente (Bassani y Cingolani, 2012). Como su propio nombre indica, las tetraspaninas atraviesan (span) cuatro veces (tetra) la membrana celular delimitando dos regiones extracelulares de diferente tamaño. La primera región extracelular, situada entre el primer y el segundo dominio transmembrana, es la más pequeña (contiene entre 13-31 aminoácidos) y se conoce como dominio extracelular corto o SEL (Short Extracellular Loop). La segunda región extracelular se denomina dominio extracelular grande o LEL (Large Extracellular Loop) y posee entre 62 y 132 aminoácidos (Boucheix y Rubinstein, 2001; Hemler, 2005). El dominio LEL se divide en dos regiones, una región constante que está formada por tres hélices α (A, B y E) y una región variable (poco conservada entre las tetraspaninas) que contiene sitios específicos de unión proteína-proteína. Además, las tetraspaninas poseen un dominio intracelular, formado sólo por 4 aminoácidos situado entre el segundo y el tercer dominio transmembrana, y dos extremos N y C terminales dirigidos hacia el citoplasma (Figura 3) (Berditchevski, 2001; Hemler, 2008).
Las tetraspaninas poseen ciertas características estructurales específicas que las diferencian de otras proteínas con cuatro dominios transmembrana, como la presencia de 4 a 8 cisteínas en la región variable del dominio LEL que se unen entre sí formando dos, tres o cuatro puentes disulfuro que son cruciales para el correcto plegamiento de este dominio (Levy y Shoham, 2005b). Cuatro de estas cisteínas están conservadas en casi todas las tetraspaninas, incluyendo dos cisteínas que se encuentran de 28 a 47 residuos después del tercer dominio transmembrana y que aparecen en un motivo CCG y otra cisteína que aparece aproximadamente 11 aminoácidos antes del cuarto dominio transmembrana (Hemler, 2003). La cuarta cisteína está conservada en
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Figura 3: Estructura de las tetraspaninas. A) Representación esquemática de la estructura desplegada de las tetraspaninas. Las tetraspaninas presentan un dominio extracelular corto (SEL) y un dominio extracelular grande (LEL). La región constante del dominio LEL, sombreada en color rosa, posee tres hélices α (A, B y E). La región variable, sombreada en azul, contiene el motivo CCG y dos puentes disulfuro (marcados con líneas rojas). En algunas tetraspaninas aparece un tercer puente disulfuro que forma un bucle adicional (línea discontinua). En su región transmembrana las tetraspaninas poseen residuos hidrofílicos (esferas grises) y pueden estar palmitoiladas (líneas moradas). B) Representación del plegamiento de una tetraspanina cuando se encuentra en la membrana. Los cuatro dominios transmembrana se pliegan entre sí y los dominios LEL y SEL están muy juntos, lo que confiere a las tetraspaninas forma de barra (modificado de Hemler, 2008).
el 94 % de las tetraspaninas y se encuentra en un dominio PXXC (Pro-Xaa-Xaa-Cys) (Berditchevski, 2001; Stipp y col., 2003).
La estructura del dominio LEL de la tetraspanina CD81 ha sido determinada mediante técnicas de cristalografía y ha permitido profundizar en las funciones de este dominio (Kitadokoro y col., 2001). En esta tetraspanina, la región hidrofóbica que comprende las hélices A, B y E parece ser el sitio de homodimerización. CD81 posee dos hélices α adicionales (C y D) situadas en la región variable del LEL, que probablemente están implicadas en la interacción proteína-proteína (Stipp y col., 2003). Muchas de las interacciones laterales que se han descrito hasta el momento de las tetraspaninas con otras proteínas de membrana son mediadas por la región variable de este dominio. Concretamente, esta región de la tetraspanina CD9 juega un papel fundamental en la fusión óvulo-espermatozoide (Zhu y col., 2002). Además, la mayoría
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de las mutaciones en la periferina/RDS que acaban produciendo una enfermedad se encuentran en esta región (Stipp y col., 2003).
La mayoría de las tetraspaninas contienen residuos glicosilados en el dominio LEL. Sin embargo, CD81 y NET-2 no están glicosiladas y CD9 posee residuos glicosilados en el dominio SEL (Boucheix y Rubinstein, 2001). El estado de glicosilación de las tetraspaninas es muy importante para el establecimiento de interacciones con otras proteínas. Por ejemplo, la asociación de CD82 con α3β1 o con α5β1 es dependiente del grado de glicosilación tanto de la tetraspanina como de la integrina (Ono y col., 2000).
Las colas citoplasmáticas de las tetraspaninas contienen menos de 19 aminoácidos, aunque NET-2, NET-7, periferina/RDS y Rom-1 tienen un dominio C-terminal más largo (Boucheix y Rubinstein, 2001; Charrin y col., 2014). El dominio citoplasmático puede contener sitios de unión a proteínas del citoesqueleto o a moléculas señalizadoras como la proteína quinasa C (PKC - Protein Kinase C) (Zhang y col., 2001b). Las colas citoplasmáticas también pueden presentar motivos estructurales especializados. Un ejemplo es el motivo rico en tirosinas que permite la localización de la tetraspanina CD63 en compartimentos intracelulares como los endosomas (Charrin y col., 2014; Rous y col., 2002).
Los cuatro dominios transmembrana presentes en las tetraspaninas se encargan de estabilizar a estas proteínas durante su biosíntesis y también participan en la interacción de las tetraspaninas con otras proteínas de membrana (Levy y Shoham, 2005b). En estos dominios transmembrana las tetraspaninas tienen residuos hidrofílicos altamente conservados que pueden formar puentes de hidrógeno entre ellos o con otros residuos, estabilizando así la estructura terciaria de las tetraspaninas (Hemler, 2003; Stipp y col., 2003).
Las tetraspaninas presentan varios sitios de palmitoilación que contribuyen a la formación de complejos de tetraspaninas. En las tetraspaninas CD9 y CD151 se encuentran palmitoilados los residuos de cisteína cercanos a los cuatro dominios transmembrana y si se impide la palmitoilación se reducen sus interacciones laterales con otras tetraspaninas. Cabe destacar que la inhibición de la palmitoilación no afecta a los complejos tetraspanina-tetraspanina ya formados, es decir, sólo sería necesaria para la formación inicial de estos complejos (Berditchevski y col., 2002; Charrin y col., 2002; Yang y col., 2002).
Interacciones de las tetraspaninas
La característica más destacable de las tetraspaninas es su capacidad de organizar a otras proteínas de la superficie celular en complejos transductores de señales. Estos complejos multi-moleculares son conocidos como microdominios ricos en tetraspaninas (TEMs –
Tetraspanin-30
Figura 4: Representación esquemática de un microdominio rico en tetraspaninas (TEM). Las tetraspaninas se asocian con integrinas, con receptores de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF) y otras proteínas de membrana formando los TEMs. Además, se pueden unir al colesterol de la membrana, anclar al citoesqueleto de actina mediante su unión a las proteínas ERM y conectar con cascadas de señalización intracelular específicas. Las moléculas no están representadas a escala real (modificado de Yáñez-Mó y col., 2009).
Enriched Microdomains), también llamados red de tetraspaninas (tetraspanin web) (Hemler, 2008; Tarrant y col., 2003). Todavía no se conoce la composición exacta de los TEMs, sin embargo se han caracterizado algunas de las proteínas que los componen: moléculas de adhesión, principalmente integrinas y miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF); factores de crecimiento; receptores celulares y enzimas (Figura 4) (Boucheix y col., 2001; Charrin y col., 2014; Yáñez-Mó y col., 2009). Existe una gran heterogeneidad en el tamaño de estos TEMs entre los distintos tipos celulares. Un ejemplo extremo es el TEM que recubre la membrana apical del epitelio del tracto urinario, donde las uroplaquinas Ia y Ib se asocian con dos proteínas (UPII y UPIII) con una estequiometría 1:1 formando partículas de 16 nm. Sin embargo, en otros tipos celulares los TEMs pueden cubrir áreas de 200-400 nm2 (Yáñez-Mó y col., 2009; Yáñez-Mó y col., 2001).
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Las interacciones de las tetraspaninas con otras moléculas de la superficie celular han sido clasificadas en tres categorías diferentes dependiendo de su estequiometría y de su resistencia a la solubilización con determinados detergentes: interacciones primarias, secundarias y terciarias (Figura 5).
Las interacciones primarias corresponden a asociaciones directas de una tetraspanina con otra proteína y poseen una alta estequiometría y estabilidad frente a detergentes fuertes como el Tritón-X100 (Hemler, 2003). El mejor ejemplo de una interacción lateral altamente específica de una tetraspanina con otra proteína de membrana es la asociación entre CD151 y las integrinas α3, α6 y α7. Hasta el momento no se ha encontrado ninguna célula en la que esté presente la integrina α3β1 y no se encuentre CD151 (Stipp et al., 2003). Otros ejemplos de interacciones primarias son: CD9 con EWI-2, CD81 con EWI-2 y con CD19, y las uroplaquinas Ia y Ib con las proteínas UPII y UPIII respectivamente.
Las interacciones secundarias son más abundantes pero menos robustas que las primarias, aunque siguen siendo estables en detergentes hidrofóbicos como el Brij-96 o el Brij-97. Estas interacciones se producen por la asociación de las diferentes tetraspaninas entre sí, uniendo, de esta forma, diferentes complejos primarios. Por último, las interacciones terciarias son las más
Figura 5: Clasificación de las interacciones de las tetraspaninas. Las interacciones de las tetraspaninas con otras proteínas de membrana se clasifican en tres tipos según su resistencia a la solubilización con determinados detergentes. Las interacciones primarias (A) son resistentes a la solubilización en Tritón-X100 y están compuestas de una tetraspanina (círculos rojos) asociada fuertemente a otra proteína (círculos verde, azul, morado y marrón). Las interacciones de segundo nivel (B) son resistentes a la solubilización en detergentes de fuerza media como el Brij-97. Este segundo nivel está formado por los complejos anteriores (primarios) unidos entre sí a través de interacciones tetraspanina-tetraspanina (representadas por líneas discontinuas). Los complejos de tercer nivel (C) sólo son resistentes a la solubilización en detergentes suaves como el CHAPS y están formados por complejos de segundo nivel asociados entre sí.
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débiles, sólo se pueden detectar cuando se lisan las células con detergentes débiles (como CHAPS o Brij-99) y corresponden a las asociaciones que se observan entre las diferentes proteínas asociadas a las tetraspaninas, dando lugar a grandes agrupamientos de complejos primarios y secundarios que poseen un alto grado de plasticidad (TEMs) (Hemler, 2003; Hemler, 2005).
Para la formación de los TEMs es muy importante la palmitoilación de las tetraspaninas. Al analizar las proteínas que presentan palmitoilación en los complejos de tetraspaninas se ha observado que no sólo las tetraspaninas están palmitoiladas sino que algunas de las proteínas asociadas a las mismas también lo están. Éste es el caso de las subunidades α3, α6 y β4 de las integrinas o EWI-2. La eliminación de esta palmitoilación no rompe las interacciones primarias pero sí reduce las asociaciones secundarias de las tetraspaninas (Hemler, 2005). Por ejemplo, si se eliminan las cisteínas palmitoiladas de la subunidad β4 no se rompe la interacción primaria de CD151 con α6β4 pero sí se pierde la asociación de este complejo con otras tetraspaninas como CD9, CD81 y CD63 (Yang y col., 2004).
Entre las proteínas que componen los TEMs se encuentran: I. Proteínas de la IgSF, como EWI-2, EWI-F, los antígenos CD4 y CD8 de los linfocitos T y los ligandos de adhesión ICAM-1 (InterCellular Adhesion Molecule-1) y VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1); II. Factores de crecimiento como el TGF-α (Transforming Growth Factor-α) y HB-EGF ( Heparin-Binding Epidermal Growth Factor); III. Diferentes integrinas de las subfamilias β1, β2 y β3; y IV. Moléculas señalizadoras, entre las que se encuentran PKC, PI4K (PhosphatidylInositol 4-Kinase) y las proteínas G heterotriméricas (Boucheix y Rubinstein, 2001; Hemler, 2003; Levy y Shoham, 2005a; Yáñez-Mó y col., 2009; Yáñez-Mó y col., 2001).
Entre las interacciones mejor caracterizadas de las tetraspaninas, destaca su asociación con las integrinas β1. Los complejos formados por integrinas β1-tetraspaninas, presentes en muchos tipos celulares, son funcionalmente relevantes y están implicados en la regulación de la migración y la adhesión celular (Berditchevski, 2001; Boucheix y Rubinstein, 2001; Tarrant y col., 2003; Yáñez-Mó y col., 2001). Aunque estas interacciones han sido muy estudiadas, sólo se ha caracterizado la zona de interacción entre una integrina de la subfamilia β1, α3β1, y la tetraspanina CD151. Esta asociación se produce entre la subunidad α de la integrina (concretamente entre los residuos 569 y 705) y el dominio LEL de la tetraspanina (residuos 149-213) (Berditchevski, 2001). A través de esta unión, y de la interacción con otras integrinas (α6β1, α7β1 y α6β4), CD151 regula la adhesión a distintos tipos de laminina, modulando la morfología, la migración, la señalización y la adhesión celular (Hemler, 2005).
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Funciones
Las tetraspaninas participan en una gran variedad de actividades celulares como la adhesión, migración, invasión, supervivencia, diferenciación, comunicación inter e intracelular y la fusión de membranas (Boucheix y Rubinstein, 2001; Hemler, 2005; Yáñez-Mó y col., 2009).
La comunicación intercelular es clave en el proceso de activación de los linfocitos (como ocurre en la cooperación entre células B y T o en la presentación de antígeno) y en la extravasación y maduración de los leucocitos (Yáñez-Mó y col., 2001). El hecho de que las células presentadoras de antígeno que no poseen TEMs (como las células dendríticas inmaduras) no sean capaces de producir una buena estimulación de los linfocitos T, hace pensar que las tetraspaninas son moléculas indispensables en el proceso de presentación de antígeno (Tarrant y col., 2003). En este sentido, se ha comprobado que las tetraspaninas CD9, CD53, CD81 o CD82 son capaces de generar señales co-estimuladoras, diferentes e independientes de las que se producen a través de CD28, en el proceso de activación de los linfocitos T mediado por CD3 (Tarrant y col., 2003). Por ejemplo, la co-estimulación producida por las tetraspaninas CD81 y CD9, al contrario de la producida por CD28, no provoca un aumento de IL-2 (Levy y Shoham, 2005b). Las señales co-estimuladoras mediadas por CD81 producen un aumento de la interacción entre el linfocito T y la célula presentadora de antígeno a través de un aumento de la adhesión entre la integrina LFA-1 y su ligando ICAM-1 (Tarrant y col., 2003; Yáñez-Mó y col., 2001). Por otro lado, se ha observado que algunas tetraspaninas se relocalizan en las zonas de contacto de la sinapsis inmune, tanto en los linfocitos T como en las células presentadoras de antígeno. Cuando se produce una sinapsis inmune, las tetraspaninas CD81 y CD82 se relocalizan en el anillo central (c-SMAC, central-SupraMolecular Activation Cluster) de la sinapsis. CD81 es capaz de regular la estructura, la organización y la maduración de la sinapsis inmune y CD82 contribuye a la activación de la sinapsis mediante la regulación del citoesqueleto de actina y aumenta la adhesión de la integrina LFA-1 a su ligando ICAM presente en las células presentadoras de antígeno (Tarrant y col., 2003). Las tetraspaninas CD9 y CD151, contribuyen a la activación de los linfocitos T mediante el reclutamiento a la sinapsis inmune de la integrina α4β1 (y otras integrinas β1) en conformación de alta afinidad (Rocha-Perugini y col., 2014). En la superficie de las células dendríticas la tetraspanina CD9 es necesaria para la asociación lateral heteróloga de las moléculas del MHC de clase II. Además, distintos subtipos de células dendríticas presentan diferente expresión de CD9 en función de su capacidad presentadora de antígeno (Mittelbrunn y col., 2009; Yáñez-Mó y col., 2009).
Además de su papel en la sinapsis inmune, las tetraspaninas están implicadas en la regulación de la movilidad de los leucocitos y en su adhesión a la matriz extracelular o al endotelio, mediante su asociación con las integrinas αLβ2, α4β1 y α5β1. En el proceso de
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extravasación de las células inmunes, las integrinas ejercen un papel fundamental tanto en las células endoteliales como en los leucocitos. En las células hematopoyéticas se expresan diferentes tetraspaninas que se localizan preferentemente en las microvellosidades, que son estructuras fundamentales para establecer las uniones celulares entre los leucocitos y las células endoteliales (Barreiro y col., 2008; Yáñez-Mó y col., 2001).
Algunas tetraspaninas están implicadas en la patogénesis de varios virus y, en la mayoría de los casos, las tetraspaninas regulan la fusión célula-célula o la formación de los sincitios. Se sabe que anticuerpos inhibidores dirigidos frente a las tetraspaninas CD81 y CD9 aumentan la formación de los sincitios producidos por las proteínas de la envuelta del virus VIH y la entrada de este virus en los linfocitos T humanos, mientras que su sobreexpresión hace que las células sean menos susceptibles a la formación de sincitios (Gordon-Alonso y col., 2006). Por otro lado, CD81 se une directamente a la proteína E2 del virus de la hepatitis C y, aunque no es el único receptor del virus, su asociación con la proteína Claudina-1 tiene un papel crucial en la entrada del virus a los hepatocitos (Harris y col., 2008).
La actuación de las tetraspaninas en la migración celular ha sido ampliamente estudiada, ya que están implicadas en la migración tanto de células epiteliales como de células endoteliales. En las células que están migrando, tanto las tetraspaninas como la integrina α3β1 se localizan en las estructuras relacionadas con la motilidad, como los filopodios y las ondulaciones de la membrana plasmática (ruffles) que se producen en la zona de avance de la célula. Además, los complejos formados por integrinas y tetraspaninas son capaces de asociarse a la fosfatidilinositol-4 quinasa (PI4K), que participa en la producción del fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (4,5-PIP2) que es un regulador del citoesqueleto, interviniendo de este modo en la motilidad celular (Boucheix y col., 2001). Por el contrario, en epitelios establecidos y en monocapas de células endoteliales, los complejos tetraspanina-α3β1 se localizan en las uniones intercelulares, ayudando a la cohesión entre las células (Yáñez-Mó y col., 2001).
Como queda demostrado por los datos presentados hasta ahora, las interacciones entre las tetraspaninas y otras proteínas de membrana son muy importantes en muchos y diversos procesos celulares. Por este motivo, no es de extrañar que se alteren los niveles de expresión de las tetraspaninas en la trasformación de las células normales en células tumorales. Los niveles de expresión de ciertas tetraspaninas varían en función del estado de desarrollo del tumor o cuando aparece metástasis. Por ejemplo, CD63 está fuertemente expresado en etapas tempranas del desarrollo de los melanomas, pero su expresión se inhibe en estados avanzados. Otro ejemplo es el de CD9 y CD82 cuya expresión baja en tumores primarios de mama, pulmón, colon y páncreas cuando existe metástasis y, esta bajada, predice una menor tasa de supervivencia (Boucheix y Rubinstein, 2001). Al igual que CD9 y CD82, la mayoría de las tetraspaninas presentan niveles de expresión más bajos en los tumores metastáticos, respecto a
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tumores no metastáticos, con la excepción de las tetraspaninas CD151 y TSPAN8 que promueven la metástasis. CD151 promueve la aparición del tumor, la progresión y la metástasis en cánceres de pulmón y de piel y TSPAN8 potencia la metástasis en melanomas y carcinomas hepatocelulares (Charrin y col., 2014; Hemler, 2014). También se ha observado que el aumento de la expresión de distintas tetraspaninas inhibe el crecimiento tumoral y la invasión. Por ejemplo, la presencia de CD9 reduce la invasión y la metástasis en varios tipos de células cancerosas y también inhibe el crecimiento primario del carcinoma de colon (Ovalle y col., 2007; Yáñez-Mó y col., 2009). Aunque CD9 es considerado como un supresor tumoral, en algunos tipos tumorales, como melanomas, es capaz de favorecer la angiogénesis, la linfangiogénesis, el crecimiento tumoral y la invasión. Los distintos papeles de CD9 en el desarrollo de diferentes tipos de tumores seguramente sean causados por la influencia de las proteínas asociadas a CD9, que varían en función del tipo celular (Hemler, 2014).
Otras funciones en las que también están implicadas las tetraspaninas y que se comentarán en el siguiente apartado son: la formación de miotubos, la fusión de los gametos y la regulación de la mielinización del sistema nervioso periférico (Yáñez-Mó y col., 2001).
Aunque la mayoría de los trabajos realizados con las tetraspaninas están enfocados a estudiar las funciones derivadas de las interacciones laterales de éstas con otras proteínas de la membrana plasmática, las tetraspaninas también son abundantes en los compartimentos vesiculares intracelulares. Por lo tanto los TEMs también podrían estar regulando las uniones de receptores intracelulares o las rutas de reciclaje intracelular. Además, los exosomas son vesículas enriquecidas con tetraspaninas que tienen funciones claras en la activación del sistema inmune y el cáncer (Yáñez-Mó y col., 2009).
La tetraspanina CD9
CD9 es una tetraspanina de 21-24 kDa que se expresa abundantemente en la superficie de células endoteliales, de algunos leucocitos y de muchas células tumorales (Charrin y col., 2001; Hemler, 2014; Yáñez-Mó y col., 2009). En un principio CD9 se caracterizó como un marcador linfohematopoyético. Basándose en los efectos inhibitorios de algunos anticuerpos monoclonales, específicos para esta proteína, en la motilidad y la migración de células tumorales, esta tetraspanina recibió inicialmente el nombre de MRP-1 (Motility-Related Protein-1) (Boucheix y col., 1985; Miyake y col., 1991).
La estructura de CD9 es la típica de una tetraspanina, sin embargo, CD9 se encuentra N-glicosilada en el dominio SEL mientras que la mayoría de las tetraspaninas están N-glicosiladas en el dominio LEL (Boucheix y Rubinstein, 2001). Además, la tetraspanina CD9 está acilada y palmitoilada (Charrin y col., 2002; Seehafer y col., 1988).
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CD9 interacciona con distintas proteínas entre las que se encuentran moléculas de adhesión (como algunas integrinas y ciertos miembros de la IgSF), moléculas del sistema inmune, factores de crecimiento y moléculas señalizadoras, como se resume en la tabla I. CD9 también se asocia directamente con otras tetraspaninas como CD63, CD81, CD82 y CD151 (Le Naour y col., 2006; Rubinstein y col., 1996; Yáñez-Mó y col., 2009).
En los ratones que tienen inhibida la expresión de la tetraspanina CD9 no se observan grandes defectos en el crecimiento, en el desarrollo o en el sistema inmune, aunque estos ratones presentan defectos en la mielinización del sistema nervioso periférico y en las uniones entre algunas de las células nerviosas, tanto del cerebro como del sistema nervioso periférico (Hemler, 2005). Además, en estos ratones existe una anomalía en el proceso de fusión óvulo-espermatozoide que hace que las hembras sean estériles, siendo necesaria la presencia de CD9 para que se produzca correctamente la fusión entre los dos tipos celulares, aunque no es necesaria para su unión (Boucheix y Rubinstein, 2001; Kaji y col., 2000; Le Naour y col., 2000). CD9 también participa en otras funciones en las que se produce fusión celular, como la formación de sincitios en infecciones virales y la fusión de mioblastos para formar fibras musculares. En el proceso de fusión de los mioblastos la inhibición de CD9 retrasa la formación de las fibras musculares en el ratón (Boucheix y Rubinstein, 2001; Hemler, 2005). Al contrario de lo que ocurre en estos procesos, CD9 también puede inhibir el proceso de fusión celular, como ocurre en los monocitos. Se piensa que en este caso CD9 actúa reclutando en los TEMs ciertas proteínas que impiden la fusión celular, como algunas proteasas específicas (Takeda y col., 2003).
Como se ha mencionado en el apartado anterior, la implicación de la tetraspanina CD9 en cáncer ha sido estudiada en profundidad. Se ha comprobado que existe una correlación inversa entre la expresión de CD9 en tumores primarios y el potencial metastático del tumor en melanomas (Si y Hersey, 1993) y carcinomas de colon (Mori y col., 1998), de pulmón (Higashiyama y col., 1995) y de mama (Miyake y col., 1996). Mediante el estudio del efecto que producen ciertos anticuerpos dirigidos frente a CD9 en la movilidad y la migración celular, se ha observado que la sobreexpresión de CD9 en determinados tipos de células tumorales reduce la motilidad y el potencial metastático de estas células (Higashiyama y col., 1995; Mori y col., 1998). Estos efectos de CD9 pueden ser explicados, al menos en parte, por el papel de CD9 sobre la adhesión y migración celular dependiente de integrinas (Boucheix y Rubinstein, 2001; Hemler, 2003). CD9 también reduce la capacidad tumorigénica de células de colocarcinoma humano, puesto que un aumento en la expresión de CD9 reduce la proliferación de las células tumorales y reduce la aparición de tumores en ratones (Ovalle y col., 2007).
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Tabla 1: Moléculas asociadas a CD9.
La tetraspanina CD9 también está implicada en el proceso de extravasación de leucocitos desde el torrente sanguíneo hacia los sitios de infección e inflamación. Este proceso implica una interacción dinámica entre los leucocitos y el endotelio, que es mediada por multitud de
MOLÉCULA ASOCIADA OTRAS TETRASPANINAS REFERENCIAS DE CD9
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN Integrinas
α1β1 (Lozahic y col., 2000)
α2β1 CD151 (Jones y col., 1996; Scherberich y col., 1998)
α3β1 CD63, CD81, CD82, CD151, NAG-2, Co-029 (Jones y col., 1996; Scherberich y col., 1998)
α4β1 CD53, CD81, CD82, CD151 (Rubinstein y col., 1994; Rubinstein y col., 1996)
α5β1 CD151 (Rubinstein y col., 1994)
α6β1 CD63, CD81, CD82, CD151, NAG-2, Co-029 (Berditchevski y col., 1996; Rubinstein y col., 1996) α7β1 CD151 (Berditchevski, 2001)
αIIbβ3 CD151 (Indig y col., 1997; Longhurst y col., 1999)
α6β4 CD151 (Jones y col., 1996) Familia de las inmunoglobulinas
ICAM-1 (Barreiro y col., 2005) EpCAM Co-29, Tspan8, D6.1A (Schmidt y col., 2004) B-CAM (Le Naour y col., 2006) ALCAM (Gilsanz y col., 2013) Otros receptores de adhesión
CD42 (Longhurst y col., 1999; Slupsky y col., 1989) CD44 Co-29, Tspan8, D6.1A (Jones y col., 1996)
CD47 (Longhurst y col., 1999) Claudina-1 (Boucheix y col., 2001) Sindecano (Jones y col., 1996) MOLÉCULAS DEL SISTEMA INMUNE
HLA-DR CD153, CD81, CD82 (Rubinstein y col., 1996) CD2 CD53 (Tarrant y col., 2003) CD3 CD81, CD82 (Toyo-oka y col., 1999) CD4 CD81, CD82 (Toyo-oka y col., 1999) CD5 (Toyo-oka y col., 1999) CD19 CD81 (Horvath y col., 1998) CD46 (Lozahic y col., 2000) FACTORES DE CRECIMIENTO
Pro-TGF-α (Shi y col., 2000) Pro-HB-EGF (Nakamura y col., 1995) MOLÉCULAS DE SEÑALIZACIÓN
CD117 CD63, CD81 (Anzai y col., 2002) GPCR56 CD81 (Little y col., 2004) PI4K CD81, CD151, CD63 (Yauch y Hemler, 2000) PKC CD53, CD81, CD82, CD151 (Zhang y col., 2001b) OTRAS PROTEÍNAS
ADAM2 CD81 (Kaji y col., 2000) ADAM10 CD81, CD82 (Arduise y col., 2008) ADAM17 (Gutiérrez-López y col., 2011) CD36 (Miao y col., 2001)
CD224 CD37, CD81, CD53,CD82 (Le Naour y col., 2006) CTL1/CD92 (Le Naour y col., 2006) CTL2 (Le Naour y col., 2006) EWI-2 CD63, CD81, CD82, CD151 (Stipp y col., 2001) EWI-F CD81 (Charrin y col., 2001) Hem-1 (Le Naour y col., 2006) TADG-15 (Le Naour y col., 2006) Sintaxinas 3 y 4A (Le Naour y col., 2006)
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proteínas presentes en la superficie de estas células. Las tetraspaninas que se encuentran en la superficie del endotelio forman TEMs especializados conocidos como plataformas de adhesión endotelial (EAPs - Endothelial Adhesive Platforms) que, además de tetraspaninas, contienen moléculas de adhesión como ICAM-1 y VCAM-1 (Barreiro y col., 2005). Estos TEMs producen un aumento de la unión entre las células del endotelio y los receptores que se encuentran en la membrana de los leucocitos. Las tetraspaninas que participan en la formación de estas estructuras especializadas son CD9 y CD151, y están implicadas en la organización espacial de la membrana y en el reclutamiento de ICAM-1, que se asocia preferentemente con CD9, y VCAM-1, que se asocia preferentemente con CD151, en las áreas de contacto con los leucocitos (Barreiro y col., 2008).
Además de interaccionar con ICAM-1, CD9 también interacciona con otras moléculas de adhesión de la IgSF, como ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule). A través de esta interacción, CD9 regula tanto las interacciones en trans homofílicas de ALCAM como las interacciones heterofílicas de ALCAM con CD6. Esta regulación se produce mediante un doble mecanismo: 1. CD9 favorece el agrupamiento de las moléculas de ALCAM, aumentando su avidez; y 2. CD9 inhibe a la enzima responsable del corte de ALCAM, ADAM17, con el consiguiente aumento de la expresión de ALCAM en la membrana celular (Gilsanz y col., 2013; Gutiérrez-López y col., 2011; Yáñez-Mó y col., 2011).
CD9 participa en la regulación de la señalización producida por factores de crecimiento. Concretamente, esta tetraspanina se asocia con tres proteínas diferentes que son capaces de unirse al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor): pro-HB-EGF, pro-TGF-α y pro-anfiregulina (Inui y col., 1997; Nakamura y col., 1995; Shi y col., 2000). CD9 aumenta la señalización yuxtacrina mediada por HB-EGF puesto que, aunque no altera los niveles de expresión de esta molécula en membrana, produce un aumento del número de sitios de unión efectivos (Yáñez-Mó y col., 2001).
La tetraspanina CD9 también participa en la organización del citoesqueleto de actina a través de varios mecanismos: I. CD9, como CD82, es capaz de unirse y reclutar en los TEMs a isoformas convencionales de PKC, que son responsables de la regulación del citoesqueleto de actina, (Zhang y col., 2001a); II. CD9 y CD81 se asocian directamente con las proteínas EWI-2 y EWI-F. Estas proteínas son capaces de unirse, también directamente, con proteínas de la familia de las ERM (ezrina, radixina y moesina), que son las moléculas principales de la conexión entre la membrana plasmática y el citoesqueleto (Sala-Valdés y col., 2006). De esta forma, CD9 estaría regulando, a través de la organización del citoesqueleto de actina, funciones como la adhesión, la migración y la polarización celular.
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Figura 6: Esquema de las proteínas que componen la familia de las integrinas en mamíferos. Se encuentran representadas las 24 posibles combinaciones entre las subunidades
β (círculos azules) y las subunidades α (círculos verdes y marrones). Las subunidades α que
presentan un dominio I están representadas por círculos verdes. Las integrinas que se encuentran sólo en células leucocitarias están marcadas con un fondo morado (modificado de Niu y Chen, 2011).
INTEGRINAS
Introducción
Las integrinas son una familia de receptores de transmembrana heterodiméricos, compuestos por una subunidad α y una β, que participan en una gran variedad de procesos celulares como la adhesión, la migración, la diferenciación y la supervivencia celular (Harburger y Calderwood, 2009; Morse y col., 2014). Estas proteínas se describieron inicialmente como una familia de receptores integrales de membrana que unen el citoesqueleto de la célula con la matriz extracelular (Hynes, 1987). Las integrinas se encuentran exclusivamente en metazoos, puesto que no se han encontrado homólogos en procariotas, hongos o plantas (Hynes, 2002). En mamíferos se han descrito 24 integrinas diferentes, que se obtienen de la combinación de 18 subunidades α con 8 subunidades β (Figura 6) (Hynes, 2002; Kinashi, 2005).
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Las integrinas se pueden clasificar de varias formas: en función de la especificidad de ligando (que está determinada por la subunidad α) o en función de la subunidad β que las compone. Según la subunidad β las integrinas se pueden clasificar en 4 subfamilias: I. La subfamilia β1 que está compuesta por 12 miembros que se unen principalmente a proteínas de la matriz extracelular; II. La subfamilia β2 que está formada por 4 miembros que se expresan exclusivamente en leucocitos; III. La subfamilia β3, formada por 2 miembros, que se conocen como citoadhesinas; y IV. La subfamilia β7 que se expresan en linfocitos y que también está formada por dos integrinas (Hynes, 1992).
Si se clasifican las integrinas en función de la especificidad de unión al ligando obtenemos los siguientes grupos: a) las integrinas que reconocen en sus ligandos la secuencia RGD (integrinas α5, α8, αV y αIIb) que se encuentra, por ejemplo, en la fibronectina y en la vitronectina; b) las que son capaces de unirse a la laminina (α3, α6 y α7); c) aquellas integrinas que son capaces de reconocer distintos tipos de colágeno (α1, α2, α10 y α11); d) las integrinas que se expresan únicamente en leucocitos (αL, αM, αX, αD y αE); y e) las integrinas α4β1, α4β7y α9β1 que reconocen un motivo llamado LDV y se unen tanto a proteínas de la matriz extracelular, como la fibronectina, como a receptores de la superfamilia de las inmunoglobulinas, como VCAM-1 (Humphries y col., 2006; Hynes, 2002; Plow y col., 2000).
La distribución de las integrinas varía mucho en función del tipo celular. Existen integrinas que se encuentran en un único tipo celular, como la integrina plaquetaria αIIbβ3, y otras cuya expresión está restringida a un conjunto concreto de tipos celulares, como las cuatro integrinas de la subfamilia β2, que únicamente se expresan en células leucocitarias. Sin embargo, otras integrinas están presentes en multitud de tipos celulares como la integrina α5β1 (Staunton y col., 2006).
Estructura
Las integrinas son proteínas de transmembrana que están constituidas por una subunidad α (120-180 kDa) y una subunidad β (90-110 kDa), asociadas entre sí de forma no covalente (Figura 7). Tanto las cadenas α como las β de las integrinas presentan un dominio extracelular grande que participa en la interacción con ligandos de la matriz extracelular o de la superficie de otras células, una única región transmembrana y un pequeño dominio citoplasmático (con la excepción del de β4, que tiene un dominio citoplasmático largo) que media la adhesión con el citoesqueleto y con proteínas adaptadoras y señalizadoras (Morse y col., 2014).
A) Subunidad α: Todas las subunidades α de las integrinas presentan, en el extremo N -terminal, una serie de siete secuencias (cada una comprende de 50 a 60 aminoácidos) con homología entre sí. Esta “repetición” de siete secuencias se pliega formando el
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dominio denominado “propulsor-β” (β-propeller). En las últimas 4 secuencias repetidas (o sólo en las tres últimas en algunas integrinas) se encuentran unos motivos estructurales denominados manos EF (EF-hand) que están implicados en la unión de cationes divalentes (Springer, 1997).
De las 18 subunidades α de las integrinas, 9 de ellas (α1, α2, α10, α11, αL, αM, αX,αD y αE) contienen un dominio I (Inserted) (αI), de unos 200 aminoácidos, que se encuentra insertado entre las repeticiones 2 y 3 del dominio β-propeller (Niu y Chen, 2011). Este dominio αI está siempre implicado en la unión de la integrina a su ligando. En el caso de las integrinas que no poseen dominio αI, la región de la subunidad α que participa en la unión al ligando es el dominio β-propeller (Carman y Springer, 2003). En el dominio extracelular de la subunidad α, a continuación del dominio β-propeller, están situados los dominios Thigh (“cadera”), Calf-1 y Calf-2 (“muslos”), que participan en el plegamiento de la integrina (Hynes, 2002).
B) Subunidad β: Teniendo en cuenta su estructura tridimensional, la subunidad β presenta un dominio similar en estructura al dominio αI, denominado dominio βI oI-like, en la
Figura 7: Estructura de las integrinas. A) Esquema de la estructura extracelular de una integrina con
dominio I. La subunidad α presenta un dominio I insertado entre las repeticiones 2 y 3 del dominio β-propeller. Esta subunidad también presenta otros 3 dominios formados por láminas β que se conocen como Thigh y Calf-1 (C1) y Calf-2 (C2). La subunidad β está formada por el dominio βI (o I-like) que está insertado en el dominio híbrido, el dominio PSI, los cuatro dominios similares a EGF (E1-E4) y el
dominio β-terminal (βTD). Ambas subunidades presentan además un dominio transmembrana y una cola citoplasmática (no representados). Las flechas azules representan los motivos MIDAS de los dominios I
y βI implicados en la unión al ligando. B) Representación de la estructura cristalizada del dominio I de la
integrina α2β1. El colágeno, a través de un residuo de glutamato, se une a esta integrina por el motivo MIDAS del dominio I (modificado de Staunton y col., 2006).
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región extracelular más alejada de la membrana plasmática. Este dominio está formado por plegamientos establecidos mediante puentes disulfuro y se encuentra insertado en el dominio híbrido. El resto de la subunidad β está compuesto por el dominio PSI ( Plexin-Semaphorin-Integrin) y por cuatro dominios conocidos como EGF-like domains, que reciben este nombre porque están formados por repeticiones ricas en cisteínas que presentan homología con los módulos del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Estas repeticiones son importantes para dar rigidez a la estructura terciaria de la integrina y, junto con el dominio PSI, han sido implicadas en la regulación de la activación de las integrinas. Finalmente, en la parte carboxilo terminal del dominio extracelular se encuentra el dominio terminal β o βTD (β-terminal domain) (Luo y col., 2007; Staunton y col., 2006).
Tanto el dominio αI como el dominio βI contienen motivos discontinuos MIDAS (Metal Ion Dependent Adhesion Site) o sitio de adhesión dependiente de iones metálicos (Lee y col., 1995; Luo y col., 2007). En las integrinas que poseen el dominio αI, la interacción con el ligando está mediada por el motivo MIDAS de este dominio. Cuando las integrinas no tienen dominio αI, éstas se unen a su ligando a través del motivo MIDAS de la subunidad β (βI) y del dominio β-propellerde la subunidad α. (Hynes, 2002).
Los dominios citoplasmáticos de ambas subunidades son muy cortos (alrededor de 50 aminoácidos), excepto el de la subunidad β4 que tiene un dominio citoplasmático muy largo (1088 aminoácidos), pero son esenciales en la modulación de la afinidad de las integrinas, la unión con el citoesqueleto y en la señalización intracelular (Hynes, 2002). Las colas citoplasmáticas de las subunidades α presentan muy poca similitud entre ellas, sin embargo, las colas de las subunidades β están muy bien conservadas y presentan mecanismos muy similares de regulación (Morse y col., 2014). En la región más próxima a la membrana las colas citoplasmáticas se encuentran unidas por un puente salino que se establece entre un residuo de arginina de la subunidad α y un residuo de aspártico de la subunidad β. Además, a esta unión también contribuyen los residuos hidrofóbicos que se encuentran en la zona amino terminal de los residuos de arginina y aspártico. Esta unión de las colas citoplasmáticas tiene que romperse para permitir el cambio conformacional de las integrinas que da lugar a su activación (Hughes y col., 1995).
En las colas citoplasmáticas se encuentran algunas secuencias conservadas muy importantes. En las subunidades α la secuencia GFFKR regula cambios en la afinidad y, por lo tanto, cambios en el estado de activación de las integrinas (Hynes, 2002). La región adyacente a esta secuencia regula la activación de las integrinas inducida por los ésteres de forbol como el PMA (Phorbol Myristate Acetate) (Weber y col., 1997). Además, la cola citoplasmática de la subunidad α contribuye a la activación de las integrinas específica de tipo celular regulando la
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conformación de la cola citoplásmica de la subunidad β y su asociación con proteínas activadoras, de forma que si se eliminan los residuos posteriores al motivo GFFKR se inhibe la adhesión específica de las integrinas α2β1, α4βa y αLβ2 (Calderwood, 2004). En la subunidad β se encuentra los motivos conservados NPxY (próximo a la membrana) y NxxP (situado más alejado de la membrana) que también son necesarios para la regulación de la activación de las integrinas. Mutaciones en estos motivos impiden la unión de proteínas del citoesqueleto y señalizadoras a las colas citoplasmáticas de esta subunidad de las integrinas (Liu y col., 2000; Morse y col., 2014; Moser y col., 2009).
Activación de las integrinas
Las integrinas pueden activarse mediante estímulos procedentes del medio extracelular o por estímulos intracelulares. La unión de proteínas citoplasmáticas a las colas de las integrinas puede producir el cambio en la afinidad de las integrinas frente a ligandos extracelulares (señalización desde dentro hacia fuera o inside-out). Por otro lado, la unión de ligandos extracelulares a las integrinas puede desencadenar una señalización intracelular (señalización desde fuera hacia dentro o outside-in).
Muchas de las integrinas no se encuentran constitutivamente activas si no que pueden estar expresadas en la superficie celular en una forma inactiva en la que no se unen a sus ligandos y, por lo tanto, no transmiten señales. Un estímulo externo puede hacer que las integrinas cambien a una forma de alta afinidad en un evento rápido y reversible (Luo y col., 2007). Este proceso es muy importante para el desarrollo de las funciones biológicas y su importancia es muy evidente en el caso de las integrinas que expresan las células que circulan por el torrente sanguíneo. Un ejemplo es la integrina αIIbβ3, que es la integrina más expresada en plaquetas y que se encuentra inactiva en las plaquetas que circulan por el torrente sanguíneo. Si esta integrina no se encontrase inactiva las plaquetas podrían unirse a su ligando en el plasma (fibrinógeno) y agregarse produciendo una trombosis (Hynes, 2002). Lo mismo ocurre en el caso de las integrinas de la subfamilia β2 que se encuentran inactivas en las células leucocitarias que circulan por la sangre. Cuando estas células reciben señales activadoras, por ejemplo mediante citoquinas y/o quimiocinas, las integrinas β2 se activan y se unen a sus moléculas ligando, como los ICAMs. Estas moléculas se expresan en las células endoteliales y sus niveles aumentan notablemente en condiciones de inflamación, permitiendo la unión de los leucocitos a las paredes de los vasos sanguíneos o a otras células, promoviendo su extravasación y participación en procesos como la fagocitosis, la citotoxicidad celular o la colaboración entre linfocitos (Hynes, 2002; Morse y col., 2014).
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La capacidad de unión de las integrinas a sus ligandos, y por tanto su capacidad de mediar la adhesión celular, puede ser regulada por dos mecanismos distintos: mediante cambios en la afinidad de la integrina por su ligando y/o en la agregación de las integrinas en la membrana celular, que condiciona su avidez (Carman y Springer, 2003; Stewart y Hogg, 1996) (Figura 8).
A) Afinidad: Los cambios en la afinidad de la integrina por su ligando se producen mediante cambios conformacionales de las integrinas que afectan al sitio de unión al ligando, de forma que se facilita o se impide la interacción integrina-ligando (Bassani y Cingolani, 2012; Chan y col., 2003). En el estado de baja afinidad por sus ligandos, las integrinas se encuentran en una conformación inactiva en la que las colas citoplasmáticas de las subunidades α y β interaccionan entre sí y sus dominios extracelulares se encuentran plegados (en forma de V) desfavoreciendo la interacción con el ligando, puesto que la zona de unión al ligando queda próxima a la membrana celular. Para pasar a un estado de afinidad intermedia las integrinas tienen que desplegarse, adquiriendo una conformación estirada, en la que queda expuesto el sitio de interacción con el ligando (MIDAS). Finalmente, para adquirir un estado de alta afinidad por sus ligandos, debe ocurrir la rotura de la interacción de las colas citoplasmáticas, produciéndose su separación. Este cambio en la región intracelular se transmite a la región extracelular provocando, en el caso de las integrinas cuya subunidad α no posee dominio I, que la hélice carboxilo-terminal (hélice α-7) del dominio βI se desplace, produciendo a su vez un movimiento lateral de 60º del dominio híbrido. Este movimiento provoca que las integrinas adquieran una conformación abierta de mayor afinidad por el ligando, debido a la reorganización en el motivo MIDAS. Cuando las integrinas contienen un dominio αI, la activación de las mismas requiere un paso adicional. En este caso, es necesario un residuo de glutámico presente en la hélice α-7 del dominio αI. Este glutámico actúa como un ligando intrínseco uniéndose al motivo MIDAS del dominio βI. De este modo, cuando las colas citoplasmáticas se separan, el movimiento de la hélice α-7 del dominio βI provoca el desplazamiento de la hélice α-7 del dominio αI, produciendo la reorganización del motivo MIDAS de este dominio, de forma que adquiere una conformación abierta de mayor afinidad por el ligando (Carman y Springer, 2003; Kim y col., 2003; Luo y col., 2007) (Figura 8A).
Proteínas citoplasmáticas como la talina o las kindlinas, que se unen a los motivos NPxY y NxxY de la cola citoplasmática de la subunidad β respectivamente, son capaces de romper las interacciones que existen entre las colas citoplasmáticas de las subunidades α y β favoreciendo su separación y, por consiguiente, la activación de las integrinas. Otras proteínas como la filamina, Dock-1 (Dedicator Of CytoKinesis-1) e
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ICAP-1 (Integrin Cytoplasmic domain-Associated Protein-1), compiten con la talina para unirse a la subunidad β inhibiendo así la activación de las integrinas (Harburger y Calderwood, 2009; Morse y col., 2014).
Algunas integrinas como αLβ2, α4β1 y α7β1 presentan, en determinadas ocasiones, el estado de activación intermedio que parece limitar su repertorio de ligandos a aquellos con los que tienen mayor afinidad de interacción. Este estado de activación permitiría algunas funciones celulares como la unión y el rodamiento de los leucocitos sobre el endotelio (Staunton y col., 2006).
B) Avidez: Las integrinas también pueden aumentar la interacción con sus ligandos mediante la agrupación (clustering) de moléculas de integrina en la membrana, sin producirse cambios en la afinidad, proceso que se conoce cómo regulación de la avidez. Los ligandos de las integrinas poseen generalmente naturaleza multivalente que permite la agrupación de las integrinas, aumentando su densidad en determinados puntos de la membrana. Este incremento de la densidad de receptores en la membrana permite establecer un mayor número de conexiones con el ligando aumentando la adhesión y señalización de las integrinas (Staunton y col., 2006). Estos agrupamientos se producen mediante la participación directa del citoesqueleto, ya que es necesario que se reduzcan transitoriamente las interacciones de las integrinas con el citoesqueleto (cytoskeletal restraints) para que éstas se puedan agregar (Bassani y Cingolani, 2012; Carman y Springer, 2003; van Kooyk y Figdor, 2000).
La activación de las integrinas se puede inducir de manera artificial en el laboratorio. Se puede regular la afinidad de las integrinas mediante el uso de cationes divalentes, como el magnesio o el manganeso que inducen la conformación activa de las integrinas (Carman y Springer, 2003; Dransfield y col., 1992b). También se puede modificar la afinidad de las integrinas usando anticuerpos monoclonales que estimulen de forma específica la molécula, mediante su unión a las subunidades α o β, cambiando su conformación hacia un estado de alta afinidad por sus ligandos (Arroyo y col., 1993). Por otro lado, también se puede aumentar la agrupación de las integrinas en la membrana, es decir la avidez, usando ésteres de forbol como el PMA que aumenta la capacidad de difusión de las integrinas en la membrana plasmática en presencia de ligando. El PMA no sólo aumenta la difusión de las moléculas de integrina, sino que además es capaz de inducir el estado de afinidad intermedia (Carman y Springer, 2003; Kim y col., 2004). También se pueden crear agrupamientos de integrinas usando un anticuerpo secundario que haga de puente entre varios anticuerpos primarios dirigidos frente a alguna de las subunidades de las integrinas.