Influencia de la polinización cruzada en la formación de semillas en mandarinas cv Clemenules y W Murcott

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(1)PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO MAGISTER EN FISIOLOGIA Y PRODUCCIÓN VEGETAL. INFLUENCIA DE LA POLINIZACIÓN CRUZADA EN LA FORMACIÓN DE SEMILLAS EN MANDARINAS CV. CLEMENULES Y W.MURCOTT. Tesis presentada como requisito para optar al grado de. Magister en Fisiología y Producción Vegetal por:. Massiel Paulina Castro Oyarzún. Comité de Tesis Profesor Guía: Johanna Mártiz Profesor Informante: Gloria Montenegro Junio 2018 Santiago-Chile.

(2) Agradecimientos En primer lugar quisiera agradecer al Comité de Citricos-Asoex por permitirme desarrollar esta tesis bajo el marco del proyecto. “Diseño de una estrategia para reducir la presencia de. semillas en mandarinas de Exportación” A mi profesora guía, Johanna Mártíz por impulsarme a realizar el magister, por su confianza y por su constante apoyo en el desarrollo de esta investigación. A mi profesora informante, Gloria Montenegro por su disposición y contribución a la realización de este estudio. A mis compañeros y amigos de laboratorio de Cítricos UC, Mati, Maca, Dani y Karen por su inmenso apoyo y risas constantes. A mis grandes amigas Paola Belen y Nachita Arías, por el cariño, amistad y terapias espirituales. A David, por su preocupación, apoyo y paciencia y a mi madre, por su amor incondicional.. 2.

(3) A la vida…. 3.

(4) Índice de contenidos 1.. Introducción ........................................................................................................... 3. 2.. Materiales y métodos ............................................................................................. 6 2.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas .................................................................... 6 2.2 Ensayos de germinación de polen..................................................................... 11 2.3 Evaluación de temperatura ................................................................................ 12. 3.. Resultados y discusión ........................................................................................ 13 3.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas .................................................................. 13 3.2 Porcentaje de germinación de polen in vitro ...................................................... 23 3.3 Evaluación de la influencia de la temperatura en la germinación de polen y formación de semillas .............................................................................................. 30. 4.. Conclusiones ....................................................................................................... 33. 5.. Referencias.......................................................................................................... 35. 1.

(5) Abstract Massiel Paulina Castro Oyarzún. Influencia de la polinización cruzada en la formación de semillas en mandarinas cv. Clemenules y W.Murcott. Tesis, Magister en Fisiología y Producción Vegetal, Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago, Chile. 38 pp. Clemenules and W. Murcott mandarins are the most produced varieties in Chile, due to its high organoleptic quality and the ability to produce seedless fruits in isolation, due to parthenocarpy. However, given the introduction of new citrus crops and the close proximity of the orchards is that cross-pollination is developing. Due to the compatibility between different citrus crops with mandarins, seed formation occurs in the fruits. The aim of this study was to evaluate the seed formation capacity of different citrus groups, such as tangerines and hybrids (Clemenules, W. Murcott, Fortune, Orri and Tangelo Minneola); lemon trees (Eureka, Benjamín Andes, Fino 49 and Messina) and orange Valencia Late. Conducted pollination trials on Clemenules and W. Murcott in two citrus areas of Chile during two seasons (2016 and 2017) were made. Before to pollination, in vitro pollen germination tests were carried out. For the evaluation of environmental conditions on seed formation, meteorology data were collected and evaluated at the time of flowering and fruit set. Pollen cross-pollination of the mandarins and hybrid over Clemenules crops were the ones that caused the greatest number of seeds in both zones and study seasons, being the cultivar most susceptible to seed development compared to W. Murcott. In addition, a positive relationship is established between the number of seeds per fruit and the percentage of pollen germination. Key words: Mandarins, cross pollination, seeds, pollen germination.. 2.

(6) 1. Introducción La capacidad partenocárpica de las variedades de cítricos para producir frutos sin semillas está relacionada con los diferentes tipos de esterilidad gamética que pueden producirse (Tadeo et al., 2003). La esterilidad gamética consiste en la incapacidad de producir óvulos o polen fértil (Agustí et al., 2003). Los cítricos presentan esterilidad y/o incompatibilidad, lo que evita la formación de semillas, sin embargo, este fenómeno en la mayoría de los casos se produce de manera parcial (Montalt, 2009). La partenocarpia obligada se refiere al cuajado de frutos sin la necesidad del algún estimulo externo, como el polen. Dentro de este grupo se encuentran las naranjas Washington Navel y la mandarina satsuma (Gravina et al., 2011). Las clementinas presentan partenocarpia facultativa, son autoincompatibles y aunque el polen el capaz de germinar en el estigma, el ovario desarrolla fruta sin semillas sino se produce polinización cruzada (Mesejo et al., 2013). La mandarina Afourer, también conocida como W.Murcott, es patentada como autoincompatible, produce frutos de gran calidad y sin semillas en ausencia de polinización cruzada (Gravina et al., 2016) La presencia de semillas en los frutos es uno de los factores que más afecta la calidad de consumo fresco de mandarinas (Pardo et al., 2007), ya que actualmente unas de las características más requeridas es la ausencia de semillas, causando un problema económico con graves pérdidas en varios lugares del mundo. En la década de los 80 se definió como fruta sin semillas a aquellas frutas que contenían menos de cinco semillas, sin embargo, actualmente se considera fruto sin semilla si el número de estas es inferior a una de doce frutos (Mautone et al., 2016).. 3.

(7) Dada la cercanía entre plantas de Clementinas y W. Murcott en las principales zonas citrícolas del país, ha conllevado a que ambos grupos se vean afectados, ya que, al no existir una barrera física, se produce polinización cruzada y con ello la formación de semillas en los frutos (Vargas, 2016). En Chile la normativa de exportación de mandarinas varía dependiendo del destino, sin embargo, en términos generales la aceptación es que de cada 100 frutos, un máximo de 10 frutos pueden presentar 1 a 2 semillas, siempre que el 4% no supere las 2 semillas. Aproximadamente un 35% de la fruta exportada ha sido descartada por presentar un número superior de semillas al aceptado (Comité de Cítricos, 2017), lo que en consecuencia ha conducido que en los últimos años, gran parte de las exportaciones de cítricos chilenos han debido enviar su fruta a Estados Unidos, principal mercado de destino, bajo la denominación “Almost seedless” (Vargas, 2016). Las principales variedades plantadas en Chile son las mandarinas clementinas (Citrus clementina Hort. Ex tanaka) tales como Clemenules, Orogrande y Oronules, las cuales son cosechadas desde mayo hasta mediados de agosto y la mandarina W. Murcott (Citrus reticulata Blanco), la cual se cosecha desde agosto hasta mediados de noviembre (Comité de cítricos, 2018) siendo actualmente una de las variedades más populares en nuestro país (Polanco, 2017). Ambos tipos de mandarinas tienen muy buen color de cascara, son fáciles de pelar (“easy peeler”) y no producen semillas cuando se cultivan de forma aislada. Sin embargo, pueden producir semillas fácilmente al existir huertos aledaños de otras especies de cítricos con polen compatible (Chao, 2005; Gravina et al., 2011). La notable presencia de variedades de cítricos con polen compatible como Fortune, Nova y otros híbridos de mandarinas, así como la abundancia de colmenas durante el período de floración, han favorecido que las Clementinas y W. Murcott sean polinizadas y fecundadas con pólenes foráneos y fértiles, capaces de inducir la formación de semillas (Pardo et al., 2007).. 4.

(8) La polinización y consiguiente fecundación puede verse afectada por factores ambientales, hormonales y nutricionales. Dentro de los factores ambientales, la temperatura y la humedad relativa son los más importante (Fasiolo y Rey, 2013). Es por esto que se han investigado diferentes alternativas para evitar la presencia de semillas, como la malla antipolinización que permite reducir la presencia de semillas en mandarinas de exportación (Mártiz, 2017), al restringir la polinización cruzada entre los diferentes cultivares de cítricos (Stander y Cronjé, 2016). Además, se han explorado varias estrategias de mejoramiento como la introducción de la esterilidad masculina citoplasmática, la manipulación de la ploidía, mutación inducida y transgénie (Distefano et al., 2012). Dado que el número de semillas formadas en los frutos de los cultivares de mandarinas Clemenules y W.Murcott varía según las diferentes especies de cítricos que las polinizan y que la temperatura es un factor determinante en el porcentaje de germinación de polen se esperaría obtener frutos con un número de semillas variable, dependiendo de la zona y temporada en que se cultive. Para dilucidar la hipótesis se plantea como objetivo evaluar el efecto del polen de diferentes cultivares de cítricos en la formación de semillas mediante polinización cruzada en clementinas Clemenules y mandarinas W.Murcott en la zona centro norte de Chile.. 5.

(9) 2. Materiales y métodos 2.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas Se establecieron dos ensayos en dos zonas citrícolas de Chile, en la primavera del 2016. El primero, denominado “Zona Norte” se estableció en Ovalle, Región de Coquimbo, Chile (30º34’17’’Sur - 71º24’54’’Oeste). Dentro del mismo campo, se seleccionó un huerto de Clemenules (Citrus clementina hort. ex Tanaka), injertadas sobre Carrizo, plantados a 5.5 x 3 m, y otro huerto de mandarinas W.Murcott (Citrus reticulata Blanco), injertadas sobre portainjerto C35 plantadas a 5.3 x 2.4m, ambos huertos separados por 5 Km aproximadamente y una Viña entre ambos, lo que evitaría la polinización cruzada. El segundo ensayo se estableció en Mallarauco “Zona Centro”, Provincia de Melipilla, Región metropolitana, Chile (33º33’41’’Sur - 70º58’37’’Oeste). En donde se seleccionaron dos huertos, uno de clementinas Clemenules sobre Carrizo plantadas a 6 x 3 m y otro de mandarinas W. Murcott sobre Rubidoux plantadas a 4,5 x2 m. La recolección de las flores de los cultivares utilizados como parentales paternos se realizó entre la última semana de Septiembre (semana 39) y la primera semana de Octubre (semana 40) del año 2016 , cuando la temperatura ambiente alcanzó entre los 20-25º C. Las flores que se recolectaron se encontraban en estadio 59 de la escala BBCH, en donde la mayoría de las flores tienen sus pétalos cerrados , adquieren la forma de una bola hueca y alargada (Agustí et al., 1997) y las anteras se encuentran de color amarillo palido o amarillo, según la especie y variedad. Posteriormente las flores recolectadas se almacenan en bolsas de papel dentro de un cooler en frío hasta la extracción de polen.. 6.

(10) En laboratorio se procesaron las flores para la extracción de polen desde las anteras, se removieron los pétalos con pinzas dejando el disco floral con los filamentos y las anteras,. las. que. fueron. pasadas. por harneros. de. 1mm2,. permitiendo el. desprendimiento de las anteras de los filamentos. Las anteras se recolectaron por separado según la variedad y se depositaron en placas Petri en una capa simple sin sobreponerse entre ellas, para su posterior secado. Las placas Petri fueron puestas a 20°C durante 12 horas. Cuando el 70% de las anteras se encontraban abiertas, se almacenaron en contenedores tipo eppendorf de 2 ml hasta el 50% de su capacidad. Los tubos eppendorf se almacenaron a -20º C hasta su utilización en campo. Para realizar las polinizaciones dirigidas en campo, se seleccionaron 10 árboles del cultivar Clemenules y 10 árboles de W.Murcott con altura y volumen de copa similar y se realizaron 150 polinizaciones manuales distribuidas completamente al azar sobre brotes del tipo solitario, campanero y mixto, con polen de 10 especies de cítricos, tales como. Mandarinas. Clemenules, W.Murcott, Fortune, Orri, Tangelo Minneola;. Limoneros Eureka, Fino 49, Messina, Benjamín Andes y Naranja Valencia late (Cuadro 1). Se seleccionaron flores en estado 59 de la escala BBCH (Agustí et al., 1997), en el cual el estigma se encuentra receptivo.. 7.

(11) Cuadro 1. Tratamientos de polinizaciones cruzadas entre los cultivares maternos Clemenules y W.Murcott y los cultivares paternos. cv. paterno. cv. materno Clemenules. W.Murcott. Clemenules. Control. T1. W.Murcott. T1. Control. Fortune. T2. T2. Orri. T3. T3. Tangelo Minneola. T4. T4. Eureka. T5. T5. Fino 49. T6. T6. Messina. T7. T7. Benjamín Andes. T8. T8. Valencia Late. T9. T9. Las flores a polinizar fueron enmasculadas y polinizadas de manera manual, mediante el uso de un pincel nº 4 de pelo sintético marca Artel, previamente desinfectado con etanol. Posteriormente los brotes polinizados fueron embolsados con mallas hasta la época de caída fisiológica, para evitar la contaminación con polen proveniente de otra fuente. En cada malla polinizada se colocó una etiqueta con el cruzamiento (Parental materno x parental paterno), el número de flores polinizadas y la fecha de polinización (Figura 1). Cinco meses después de la polinización (marzo 2017) se cosechó la fruta para cuantificar la presencia y número de semillas por fruto. Para el conteo de semillas, los frutos fueron cortados en forma transversal superficialmente, con la precaución de no cortar las semillas.. 8.

(12) Durante la primavera del 2017 se repitieron las polinizaciones dirigidas en los huertos de Clemenules y W.Murcott de la Zona Norte para comparar ambas temporadas y evaluar el efecto de las condiciones ambientales en la formación de semillas. En la Zona Centro el ensayo se estableció en Puchuncaví, ubicado en la Quinta Región, 32º42’32’’Sur - 71º14’14’’Oeste. Se seleccionó un huerto de clementinas Clemenules sobre Carrizo plantados a 5 x 2,5 m y un huerto de mandarinas W.Murcott plantado sobre portainjerto C35 a 5 x 2 m de distancia. Transcurridos cinco meses (marzo 2018), se cosechó y analizó la fruta proveniente de las polinizaciones realizadas en primavera, con el mismo protocolo de las polinizaciones descritas anteriormente. El diseño experimental correspondió a un diseño completamente al azar, con 9 tratamientos correspondientes a las diferentes polinizaciones cruzadas (cultivar materno x cultivar paterno), la unidad experimental fue cada flor polinizada con los diferentes pólenes con 150 repeticiones. El análisis de varianza se realizó en el programa estadístico Infostat, utilizando la prueba de Tukey con un nivel de confianza del 95 % (α= 0,05), en el que se consideró una muestra de 10 frutos de cada cruzamiento. Los cruzamientos en los que se obtuvo un número inferior de frutos cuajados no fueron considerados para el análisis estadístico.. 9.

(13) Figura 1. (A) Estado de botón floral de Naranjo Valencia late. (B). Procesamiento de flores. (C) Recolección de anteras de Cítricos. (D) Polinización manual de flores. (E) Embolsado de flores polinizadas. (F) Fruto cuajado.. 10.

(14) 2.2 Ensayos de germinación de polen Los pólenes recolectados para realizar las polinizaciones cruzadas, fueron sometidos a ensayos de germinación previo a ser utilizados. Estos ensayos se realizaron en el Laboratorio de Frutales de Hoja persistente de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Para el análisis de germinación de polen se prepararon medios de cultivo en placas Petri de tamaño 60 x 15 mm. El medio utilizado para la incubación del polen fue preparado con agar 1%, ácido bórico 0,1%, sacarosa 20% y nitrato de calcio 0,8% (Ramos et al., 2008). En cada placa se sembraron los granos de polen de manera uniforme y se incubaron a 25º C durante 24 horas. Cada placa fue evaluada a las 4 y 24 horas transcurridas desde la incubación. Para determinar el porcentaje de germinación de los pólenes, se seleccionaron y analizaron 4 cuadrantes de las fotografías tomadas a las placas Petri obtenidas desde la cámara ProgRes C3 (Jenoptik Germany) que posee el microscopio Olympus CX-31 con aumento de 40 X. El conteo de granos de polen germinados se midió en 1 mm2 utilizando el software WCIF Image J v1.37 (Wright Cell Imaging Facility, University Health Network Research, Canadá). Se consideró como polen germinado aquellos con tubo polínico con una longitud de al menos el doble de la del grano de polen. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA de una vía). Luego se realizó una comparación múltiple de medias utilizando la prueba de diferencia mínima significativa (LSD Fisher) con un nivel de confianza del 95% (α= 0,05).. 11.

(15) 2.3 Evaluación de temperatura Para la evaluación de la temperatura se analizaron los datos entregados por la Estación metereológica El Sauce perteneciente a Agrícola Tamaya, Ovalle. Los parámetros analizados fueron temperatura máxima, mínima y media, y grados días (base 12,5ºC), desde el mes de octubre a diciembre, es decir, desde floración a caída fisiológica.. 12.

(16) 3. Resultados y discusión 3.1 Ensayos de polinizaciones dirigidas En la figura 2 se observa el número promedio de semillas formadas por fruto en clementinas Clemenules el año 2016 en la zona Norte. Los diferentes cultivares parentales de cítricos muestran diferencias significativas entre ellos en la formación de semillas, destacando los tratamientos con polen de mandarina W.Murcott, Fortune y Tangelo Minneola, todos con un mayor número de semillas en comparación con los tratamientos con limoneros Fino 49 y Messina. Estos resultados concuerdan con un estudio realizado por Bono et al. (2000) en España, en donde bajos condiciones de polinización cruzada W.Murcott y Fortune producen 27 y 24 semillas en promedio respectivamente.. Figura 2. Número promedio de semillas por fruto en clementinas Clemenules en zona norte formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05).. 13.

(17) En la zona centro la cantidad de semillas que fueron generadas por el grupo de las mandarinas sobre Clemenules fue significativamente superior al grupo de los limoneros y al naranjo Valencia (Figura 3), lo que coincide con los resultados obtenidos de las polinizaciones de la zona Norte. Chao et al., 2005, señala que las polinizaciones cruzadas sobre Clemenules con polen de W.Murcott formó 25, 4 semillas promedio por fruto en la primera temporada y 32 semillas promedio por fruto en la segunda temporada de estudio, lo que concuerda con los resultados obtenidos en este ensayo.. Figura 3. Número promedio de semillas por fruto en clementinas Clemenules en zona centro formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05).. 14.

(18) De Azevedo et al., (2013) indica que las polinizaciones dirigidas sobre Clemenules con polen de las variedades de Naranja Valencia, mandarina W.Murcott y tangelo Nova provocó la formación de frutos con semillas. Los tratamientos de polinizaciones cruzadas sobre W. Murcott en la zona norte el año 2016 mostraron diferencias significativas entre el polen de Naranjo Valencia en comparación con los limoneros Fino 49, Eureka y Messina (Figura 4). Estudios realizados por Gravina et al., (2011) sobre polinización cruzada en mandarina W.Murcott indican que el polen de naranja Valencia fue el que produce el mayor número de semillas por frutos.. Figura 4. Número promedio de semillas por fruto en mandarinas W.Murcott en zona norte formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05).. 15.

(19) En la Zona Centro el año 2016, las polinizaciones realizadas sobre W.Murcott mostraron diferencias significativas entre los tratamientos, destacando la mandarina Fortune y Tangelo Minneola como las que generaron mayor número de semillas promedio por fruto. Los tratamientos con polen de limoneros no arrojaron diferencias significativas con el tratamiento testigo, sin embargo, las polinizaciones con. 35 30 25. a. a. a. a. c. c. Fo rtu ne. a. 5. a. Or ri. a. va le nc ia. 10. ín. 15. in ne ol a. 20. Co nt ro l M es sin a. b. s. M. m en ul e. Cl e. Be nj am. ka Eu re. 49. 0 Fin o. N° Semillas promedio /fruto. Clemenules si provocó diferencias significativas con el tratamiento control (Figura 5).. Variedades de cítricos. Figura 5. Número promedio de semillas por fruto en mandarinas W.Murcott en zona centro formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos durante la primavera 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05).. 16.

(20) En el cuadro 2 se observa que en la Zona Norte (Ovalle) y Zona Centro (Mallarauco) en el 2016, Clemenules presentó un número de semillas promedio significativamente superior comparado con W.Murcott. Esto podría indicar que Clemenules es una variedad más susceptible al desarrollo de semillas, al tener mayor compatibilidad de polen con otros cítricos en comparación con W.Murcott. Un estudio con muestras de campo de un huerto de Clemenules y W.Murcott, se encontró un máximo de 36 semillas por fruto en Clemenules y un máximo de 16 semillas por fruta en la mandarina W.Murcott. Por lo tanto, cuando hay fuentes de polen compatibles, el número máximo de semillas por muestra de campo es similar al número de semillas obtenidas por polinización manual (Chao, 2005), al encontrarse mayor número de semillas en Clemenules versus W.Murcott. Cuadro 2. Comparación del número de semillas promedio por fruto entre W.Murcott y Clemenules en la Zona Norte (Ovalle) y Zona Centro (Mallarauco) en 2016. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p < 0,05). Zona. Cultivar Materno. Ovalle. W.Murcott. Mallarauco. N° semillas promedio/fruto 2,6 a. Clemenules. 5,7 b. W. Murcott. 4,0 a. Clemenules. 11,5 b. 17.

(21) En el cuadro 3 se observan los resultados de las polinizaciones realizadas sobre Clemenules durante la primavera del 2017 en la Zona Norte y Centro. En la Zona Norte, el mayor número de semillas promedio por fruto fue provocado por las polinizaciones con W.Murcott en comparación con la mandarina Orri y los limoneros Eureka y Benjamín Andes. En la Zona Centro, hubo un comportamiento similar, en donde el mayor número promedio de semillas por fruto fueron formadas por W.Murcott, seguida por Fortune y Orri, que produce 1,1 semillas promedio por fruto. Cuadro 3. Número promedio de semillas por fruto en Clemenules en Zona Norte (Ovalle) y Centro (Puchuncaví) formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos durante la primavera 2017. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05). Zona Norte (Ovalle) Cultivar Paterno Clemenules Eureka Benjamín Andes Orri W.Murcott. N° de semillas promedio/fruto 0a 0a 0,2 a 1,4 a 25,7 b. Zona Centro (Puchuncaví) Cultivar Paterno. N° de semillas promedio/fruto. Clemenules. 0 a. Orri Fortune W.Murcott. 1,1 a 8,6 b 29,6 c. 18.

(22) El número promedio de semillas por fruto formadas por las polinizaciones realizadas en W.Murcott durante la primavera del 2017 en la Zona Norte y Centro se observan en el cuadro 4. En ambas zonas, el polen que produjo el mayor número promedio de semillas por fruto fue Fortune, con un número de semillas significativamente superior a las formadas por el grupo de los limoneros. Cuadro 4. Número promedio de semillas por fruto en W.Murcott en Zona Norte (Ovalle) y Centro (Puchuncaví) formadas por polinizaciones dirigidas con diferentes cultivares de cítricos durante la primavera 2017. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05). Zona Norte (Ovalle) Cultivar Paterno W.Murcott Messina Tangelo Minneola Orri Benjamín Andes Eureka Fino 49 Valencia Fortune. N° de semillas promedio/fruto 0a 0a 0a 0a 0a 0a 0,1 a 0,2 a 8,3 b. Zona Centro (Puchuncaví) Cultivar Paterno W.Murcott Orri Messina Benjamín Andes Fino 49 Eureka Tangelo Minneola Valencia Fortune. N° de semillas promedio/fruto 0a 0a 0a 0a 0a 0,1 a 0,4 a 7,8 b 8,4 b. 19.

(23) En la Zona Norte (Ovalle), los resultados de las polinizaciones realizadas durante ambas temporadas sobre Clemenules indicaron que el polinizante que produce la mayor cantidad de semillas promedio por fruto correspondió a W.Murcott, siendo significativamente superior al número de semillas producidas por el limonero Eureka y la mandarina Orri. Por otra parte, si bien durante la temporada 2016 el número de semillas fue superior, no existieron diferencias significativas respecto de las temporada 2017 (Cuadro 5). Estudios comparativos de polinizaciones dirigidas con polen de W.Murcott y Tango (Variedad obtenida mediante irradiación de W.Murcott) indican que W.Murcott es capaz de generar 18,8 semillas por frutos en comparación con 0,2 semillas por fruto producidas por Tango. Esto podría relacionarse con el gran poder germinativo del polen de W.Murcott (Williams, 2011). Cuadro 5. Comparación del número promedio de semillas por fruto en Clemenules Zona Norte (Ovalle) durante temporada 2016 y 2017. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05). Cultivar paterno. N° semillas promedio/fruto. Clemenules. 0,0 a. Orri. 1,2 a. Eureka. 5,4 a. W.Murcott. 22,5 b. Temporada. N° semillas promedio/fruto. 2017. 6,8 a. 2016. 7,8 a. 20.

(24) Las polinizaciones cruzadas sobre W.Murcott en la Zona Norte (Ovalle) indicaron que el polen del naranjo Valencia Late es el polinizante que produce un mayor número de semillas en comparación al grupo de los limoneros Messina, Eureka y Fino 49. Al comparar ambas temporadas se observa que durante la temporada 2016 el número promedio de semillas fue superior a las formadas en la temporada 2017 (Cuadro 6). Cuadro 6. Comparación del número promedio de semillas por fruto en W.Murcott en la Zona Norte (Ovalle) durante temporada 2016 y 2017. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05). Cultivar paterno. N° semillas promedio/fruto. W.Murcott. 0,0 a. Messina. 0,2 a. Eureka. 0,8 a. Fino 49. 1,0 a. Valencia Late. 3,5 b. Temporada. N° semillas promedio/fruto. 2017. 0,1 a. 2016. 2,1 b. 21.

(25) Figura 6. (A) Semillas de W.murcott en Clemenules, (B) Ausencia de semillas de Eureka en Clemenules, (C) Semillas de Valencia Late en W.Murcott (D) Semillas de Eureka en W.Murcott. En la figura 6 se aprecian las semillas formadas por la mandarina W.Murcott y el limón Eureka en Clemenules (A y B) y las semillas de Naranjo Valencia Late y limonero Eureka en W.Murcott.(C y D). 22.

(26) 3.2 Porcentaje de germinación de polen in vitro El porcentaje de germinación de polen in vitro es variable y depende de la especie y variedad de cítricos, de la temperatura de floración (Pardo et al., 2007) y de la temperatura de incubación del polen (Distefano et al., 2012). En el cuadro 7, se observan los porcentajes de germinación del polen de los diferentes cultivares de cítricos utilizados para la polinizaciones cruzadas en este estudio, señalando que existen diferencias significativas entre los diferentes especies y cultivares de cítricos. Cuadro 7. Porcentaje de germinación de polen in vitro de las diferentes variedades de cítricos. Letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos (p <0,05) Variedades de cítricos Valencia Late Benjamín Andes Eureka Clemenules Messina Fino 49 Orri W.Murcott Fortune Minneola. % Germinación de polen 1,46 a 1.50 a 1,67 a 1,85 a 8,67 b 8,96 b 15,80 c 25,91 d 31,12 d 39,24 e. El porcentaje de germinación del grano de polen para el naranjo Valencia late fue de 1,46 %. Pardo et al., (2007) indica que en general la germinación de las diferentes variedades de naranjo Valencia es bajo, sin embargo, el porcentaje de viabilidad de polen fue de 20,9 % (Domingues, 1999), lo que podría relacionarse con el mayor número de semillas formadas por fruto cuando se utilizó como polinizante de W.Murcott (Cuadro 6).. 23.

(27) Figura 7. (A) Polen de Clemenules,(B) Polen de W.Murcott, (C) Polen de Fortune, (D) Polen de tangelo Minneola Clemenules presentó un 1,85 % de germinación de polen (Figura 7), lo que coincide con otros estudios donde se señala que la germinación de polen in vitro de esta variedad presentó un bajo porcentaje de germinación con valores inferiores al 8% (Gravina et al., 2011). Esto indicaría que la capacidad para formar semillas de Clemenules en otras variedades de cítricos es débil, sin embargo, al utilizar polen de Clemenules como polinizante de W.Murcott, el número promedio de semillas que genera es significativamente diferente a que W.Murcott fuera autopolinizada con su mismo polen (Figura 5).. 24.

(28) Los resultados de porcentaje de germinación de los limoneros en general en este estudio resultó ser bajo, obteniendo 1,5 % para Benjamín Andes, 1,67 % para Eureka y 8,96 % para Fino 49. Sin embargo, estudios realizados con polen de Eureka indican un 27,4 % de germinación de polen a los 25 °C y 25, 55 % para el limonero Fino 49 (Rabadán, 2016), resultados muy superiores a los obtenidos en este estudio (Cuadro 7). Los resultados obtenidos en Benjamín Andes, son similares a los obtenidos en Eureka, ya que es una variedad obtenida por. mutación espontanea de Eureka. (A.N.A, 2018). Cuando los limoneros fueron utilizados como polinizantes en Clemenules tanto en la Zona Norte como en la Zona Centro, el número de semillas promedio formadas por fruto fue variable, ya que en la Zona Norte el polen de Eureka formó mayor número de semillas en comparación con el polen de Fino 49 (Figura 2), sin embargo, en la zona Centro el polen de Fino 49 fue el que desarrolló un número de semillas promedio por fruto significativamente superior al polen de Eureka (Figura 3). La mandarina Orri presentó un porcentaje de germinación de 15,8 % en las condiciones de este estudio. Sin embargo, estudios realizado por Schneider et al., (2009) indican que la viabilidad del polen fue de 0% y el número de granos de polen germinados en su misma flor polinizados manualmente no supero a 10. A pesar que se obtuvo un porcentaje de germinación mayor al señalado en la literatura, el número de semillas que generó tanto en Clemenules (Cuadro 3) como en W.Murcott (cuadro 4), fueron significativamente menor que las obtenidas por otros polinizantes. Se han realizado diversos estudios sobre el porcentaje de germinación de polen de W.Murcott, los cuales señalan que éste varía según las condiciones de cada estudio. Fasiolo y Rey (2013) obtuvieron un 39 % de germinación de polen in vitro, mientras que otros estudios obtuvieron 25 % (Gravina et al., 2011).. 25.

(29) Bajo las condiciones de este ensayo se obtuvo un 25,9 %, lo cual coincide con los resultados mencionados (Cuadro 7). El alto porcentaje de germinación de polen explicaría el número de semillas que es capaz de producir en frutos de Clemenules (Cuadro 3). La mandarina Fortune y Tangelo Minneola son los cultivares que presentaron el mayor porcentaje de germinación de polen, 31,12 % y 39,24 % respectivamente (Cuadro 7, figura 7), y fueron los que formaron el mayor número promedio de semillas por fruto, tanto en Clemenules (Figura 2 y 3) como en W.Murcott (Figura 5). Asíns et al., (2002) señala que el hibrido Fortune, en condiciones de polinización cruzada con cualquier variedad de clementina, puede producir de 20 a 25 semillas por fruto, datos que concuerdan con los resultados obtenidos en este estudio (Figura 2 y 3). Estudios realizados por Barry (1995), indican que el polen de tangelo Minneola tiene un alto porcentaje de germinación de polen. Barry (1995) realizó una calificación de distintos pólenes de cítricos según el contenido de semillas formadas en Clemenules en tres categorías; clasificando como débil, al limonero Eureka y Valencia Midknight, intermedio a Valencia late y fuerte cuando se utilizó tangelo Minneola. Según Gravina (2014), en condiciones de campo o in vivo, en parentales compatibles, porcentajes de germinación en el estigma superiores al 10% son suficientes para asegurar la fecundación en condiciones de temperatura ideales. En la Figura 8 se observa que existe una correlación lineal positiva de un 60% entre el número de semillas promedio por fruto de mandarinas con el porcentaje de germinación de polen in vitro, es decir, un bajo número de semillas es indicativo de la baja viabilidad de los rudimentos seminales presentes en la flor y viceversa, ya que la polinización forzada conduce a la fecundación de casi todos los óvulos en el ovario (Bermejo, 2011).. 26.

(30) Además, se aprecian 2 grupos,. el primero (Grupo B) en que las variedades de. cítricos con mayor porcentaje de germinación de polen in vitro fueron las que desarrollan mayor número semillas en los frutos, los que según los resultados obtenidos son atribuidos al grupo de las mandarinas e híbridos y el segundo (Grupo A) en que el porcentaje de germinación de polen es menor y por ende el desarrollo de semillas en los frutos es menor, los cuales corresponden al grupo de los limoneros y naranjo Valencia.. N º s e m illa s p ro m e d io / fr u to. B 30. A. 20. 10 y = 0 ,5 1 9 1 x + 0 ,6 8 6 1 2. r = 0 ,6 0 9 4 p = 0 ,0 0 0 1. 0. 0. 10. 20. 30. 40. 50. % G e rm in a c ió n d e p o le n. Figura 8. Relación entre el número de semillas promedio por fruto y el porcentaje de germinación de polen in vitro de los diferentes cultivares de cítricos.. 27.

(31) En Clemenules se establece una correlación lineal positiva de un 78% entre el número de semillas promedio por fruto y el porcentaje de germinación de polen in vitro de las diferentes variedades de cítricos (Figura 9), lo que indica que esta variedad es más susceptible al desarrollo de semillas en sus frutos en comparación con W.Murcott, en donde la relación es de 20% (Figura 10), lo que coincide con los resultados del cuadro 2. Por otra parte, en Clemenules se distingue claramente la formación de los grupos de variedades que poseen el mayor porcentaje de germinación de polen y que a su vez desarrollan mayor número de semillas por fruto (Grupo B versus Grupo A), sin embargo, en el caso de W.Murcott estos grupos no se distinguen (Figura 10).. N º s e m illa s p ro m e d io / fr u to. B 30. 20. A. 10 y = 0 ,6 4 2 7 x + 0 ,6 7 0 9 2. r = 0 ,7 8 4 4 p < 0 ,0 0 0 1. 0. 0. 10. 20. 30. 40. 50. % G e rm in a c ió n d e p o le n. . Figura 9. Relación entre el número de semillas promedio por fruto en Clemenules y el porcentaje de germinación de polen in vitro de los diferentes cultivares de cítricos. 28.

(32) N º s e m illa s p ro m e d io / fr u to. 15. 10. 5 y = 0 ,1 3 5 2 x + 1 ,1 5 8 5 r. 2. = 0 ,2 0 9 2. p = 0 ,0 8 6 5 n s. 0. 0. 10. 20. 30. 40. 50. % G e rm in a c ió n d e p o le n. Figura 10. Relación entre el número de semillas promedio por fruto en W.Murcott y el porcentaje de germinación de polen in vitro de los diferentes cultivares de cítricos. 29.

(33) 3.3 Evaluación de la influencia de la temperatura en la germinación de polen y formación de semillas En el cuadro 8 se observa que la temperatura media diaria del período de floración y cuaja en el año 2017 fue 1,7 °C inferior a la temperatura media del año 2016, lo cual pudo haber influenciado en el porcentaje de germinación de polen durante el período efectivo de polinización. Según Distefano et al., (2012) uno de los factores ambientales más importantes que podría afectar el rendimiento del polen es el régimen de temperatura durante el período que comprende desde la floración hasta la fecundación, ya que se ve afectada la germinación del polen y la cinética del tubo polínico en el estilo. La temperatura media diaria registrada durante el mes de octubre durante los años 2016 y 2017 (Cuadro 8), fue menor durante la última temporada, lo que pudo haber afectado el poder germinativo del polen y por ende la formación de semillas en los frutos. Cuadro 8. Temperatura media diaria (°C) y Grados día (T° base 12, 5 °C) durante el período que comprende desde la floración a cuaja (Octubre a Diciembre) del año 2016 y 2017) en Zona Norte. Estación meteorológica El Sauce. Temperatura media diaria (°C) 2016. Temperatura media diaria (°C) 2017. Grados día 2016. Grados día 2017. Octubre. 15,1. 11,1. 81,4. -43,0. Noviembre. 16,8. 17,0. 127,7. 134,0. Diciembre. 18,5. 17,2. 120,8. 93,9. Floración - Cuaja. 16,8. 15,1. 329,9. 227,9. 30.

(34) Las bajas temperaturas durante la formación de la flor, reducen la germinación de polen y el número de semillas, como resultado de la disminución en el contenido de almidón y concentraciones de azúcar acumuladas en el grano de polen en las últimas etapas de desarrollo (Shaked et al., 2004). Lo anterior podría explicar la variación entre la formación de semillas durante ambas temporadas, en el caso de Clemenules, si bien no existieron diferencias significativas, en la temporada 2016, el número promedio de semillas por fruto fue superior en comparación con la temporada 2017 (cuadro 5). En el caso de W.Murcott, la formación de semillas durante 2016 fue significativamente superior a las formadas durante el año 2017 (cuadro 6). Se observa que la acumulación de grados día durante la primera temporada de estudio fue mayor que la temporada 2017(cuadro 8), lo que podría afectar la duración e intensidad de la floración. La viabilidad del polen se relaciona con la temperatura de los estadios 55 y 56 BBCH (Agustí et al., 1997), es decir, en estado de botón verde y blanco, y no con la temperatura durante la floración (Gravina, 2014). El número de óvulos que potencialmente podrían desarrollar semillas también es afectado por las bajas temperaturas y disminuye cuando las temperaturas son considerablemente bajas durante floración (Pardo et al., 2007). En un estudio realizado por Bermejo et al., (2012) se determinó que existe una correlación entre las temperaturas mínimas durante el período de floración y el número de semillas formadas, lo que demuestra el efecto negativo de las bajas temperaturas en la cantidad de semillas formadas.. 31.

(35) En la mayoría de las especies de cítricos la germinación del polen se incrementa en el rango de 10° a 30 °C, aunque para una misma temperatura se presentan diferencias entre especies, resultando en una interacción genotipo temperatura (Gravina, 2014). Cuando las temperaturas son menores a 20°C se reduce o inhibe totalmente la germinación del grano de polen, sin embargo, cuando las temperatura son elevadas entre 25 y 30 °C la germinación del grano de polen y crecimiento del tubo polínico a lo largo del estigma se ve favorecido (Agustí, 2010). Esto podría explicar la variabilidad en la formación de semillas entre las diferentes especies y cultivares de cítricos, ya que algunos casos el poder germinativo del grano de polen se ve afectado mayormente cuando las temperaturas son bajas. La capacidad de formar semillas, disminuye cuando las temperaturas son notoriamente bajas y superan el nivel de sensibilidad de cada variedad (Gravina, 2014). Los limoneros pueden desarrollar esterilidad inducida por la condiciones ambientales (Agustí et al., 2003) siendo afectado por las bajas temperaturas. En el caso de limón Fino, las bajas temperaturas durante el proceso de formación de flores, disminuyen el poder germinativo del polen (Pardo et al., 2007). Lo anterior, podría explicar que la formación de semillas generadas por polen de Fino 49 fue inferior a las reportadas durante la temporada 2017. Lo mismo ocurre en el Limón Eureka, en donde las bajas temperaturas inducen esterilidad masculina (Yamamoto, 2014), lo cual podría explicar el mismo comportamiento en el desarrollo de semillas generadas por esta variedad.. 32.

(36) 4. Conclusiones Clemenules es una variedad altamente susceptible a ser polinizada por distintos cultivares de citricos en comparación con W.Murcott, existiendo una relación positiva entre el número de semillas promedio por fruto y el porcentaje de germinación de polen in vitro de cítricos. El polen del grupo de mandarinas e hibridos es el que produce la mayor cantidad de semillas en Clemenules y W. Murcott en comparación a pólenes de otros citricos, lo que se traduce en una información trasendental para la toma de decisiones en la combinación de especies y variedades de citricos en un mismo huerto y con huertos vecinos. Se predice que la temperatura durante el período de floración influye en la germinación de polen in vivo y por ende en la formación de semillas.. 33.

(37) Resumen Las mandarinas Clemenules y W.Murcott son las variedades más producidas en Chile, debido a su gran calidad organoléptica y a la capacidad de producir frutos sin semillas en condiciones de aislamiento, debido a la partenocarpia. Sin embargo, dada la introducción de nuevos cultivares de cítricos y la gran cercanía de los huertos es que se está desarrollando polinización cruzada. Dado que existe compatibilidad entre los diferentes cultivares de cítricos con las mandarinas se produce la formación de semillas en los frutos. Con el objetivo de evaluar la capacidad de formación de semillas de los diferentes grupos de cítricos, tales como mandarinas e híbridos (Clemenules, W.Murcott. Fortune, Orri y tangelo Minneola); limoneros (Eureka, Benjamín Andes, Fino 49 y Messina) y naranjo Valencia Late se realizaron ensayos de polinizaciones dirigidas sobre Clemenules y W.Murcott en dos zonas citrícolas de Chile durante dos temporadas (2016 y 2017). Previo a las polinizaciones se realizaron ensayos de germinación de polen in vitro. Para evaluar la influencia de las condiciones ambientales sobre la formación de semillas, se recolectaron y evaluaron datos de meteorología en la época de floración y cuaja. Las polinizaciones cruzadas con polen de los cultivares del grupo de las mandarinas e híbridos sobre Clemenules fueron las que provocaron el mayor número de semillas en ambas zonas y temporadas de estudios, comportándose como el cultivar más susceptible al desarrollo de semillas en comparación con W.Murcott. Además, se establece una relación positiva entre el número de semillas por fruto y el porcentaje de germinación de polen. Palabras clave: Mandarinas, polinización cruzada, semillas, germinación de polen.. 34.

(38) 5. Referencias A.N.A. Andes New Varieties Administration. 2018. Cítricos. Benjamín Andes. Agustí, M., Zaragoza, S., Bleiholder, H., Buhr, L., Hack, H., Klose, R., Staub, R. 1997. Codificación BBCH de los estadios fenológicos del desarrollo de los agrios (Gen. Citrus). Ficha técnica. Serie. Citricultura N° 6, España, Generalitat. Valenciana. Agustí, M. 2010. Fruticultura. Madrid, Mundi –Prensa. 507 p. Agustí, M., Martínez-Fuentes, A., Mesejo, C., Mariano, J., Almela, V. 2003. Cuajado y desarrollo de los frutos cítricos. España, Generalitat Valenciana. 80 p. Asíns, M.J., Juarez, J., Pina, J.A., Puchades, J., Carbonell, E.A., Navarro, L. 2002. Una nueva clementina de baja fertilidad llamada Nulessin. Levante Agrícola, 359, 36-40 Barry, G. 1995. A prediction model to determine the cross-pollination ability of Citrus spp. Tesis de Magister. Universidad de Natal, Pietermaritzburg, Sudáfrica. Bermejo, A., Pardo, J. Cano, A. 2012. Murcott seedless: influence of gamma irradiation on citrus production and fruit quality. Spanish journal of agricultural research, (3), 768-777 Bermejo, A., Pardo, J., & Cano, A. 2011. Influence of gamma irradiation on seedless citrus production: pollen germination and fruit quality. Food and Nutrition Sciences, 2(3), 169-180 Bono, R., Soler, J., Buj, A. 2000. Parámetros de calidad de los cítricos. El problema de las semillas. Comunidad Valenciana Agraria, 16, 7-15.. 35.

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