Crecimiento de Cryptophyta empleando vinazas cubanas como medio de cultivo

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(1)i. Facultad de Química Farmacia Departamento de Ingeniería Química. Crecimiento de Cryptophyta empleando vinazas cubanas como medio de cultivo.. TRABAJO DE DIPLOMA Autor: Lissett Abreu Hernández Tutor: Msc. Ana Celia de Armas Martínez. Santa Clara 2016-2017 "Año 59 de la Revolución". i.

(2) i. Pensamiento i.

(3) ii. ´´La mayoría de la gente dicen que el intelecto es lo que hace a un gran científico. Están equivocados: es el carácter´´. Albert Einstein. ii.

(4) iii. Dedicatoria iii.

(5) iv. En nuestra vida hay personas que siempre han estado ahí, en los buenos y malos momentos, esto para ustedes con todo el amor del mundo. En especial a mi madre y mi hermana por todo, ustedes son mi impulso para vencer los obstáculos que cada día nos pone este largo camino; las amo. iv.

(6) v. Agradecimientos A mi mamita: Por ser la persona más especial de mi mundo, por tantos años de apoyo incondicional, de amor, de entrega, de desvelos, de alegrías; no sé lo que haría sin ti. Gracias por estar ahí en todo momento y sentir que este también es tu gran triunfo. Te amo infinitamente. Ami papi y mis hermanas: Papa esto es para ti espero que te sientas muy orgulloso de la hija que has formado en todos estos años, por tus enseñanzas y amor. A Samy y Angie, mis niñas adoradas, espero convertirme en un ejemplo a seguir para ustedes. Gracias por compartir tantos años de alegrías y tristeza conmigo y saber sobrellevarme. Los quiero mucho. A Anita: El resto de mis días no van a alcanzarme para agradecerte todo lo que has hecho por mí, por tantas horas de sacrificio y entrega, por ese amor que llevas contigo siempre y que das sin esperar nada a cambio, por apoyarme cuando no pensaba llegar al final, por ser mi amiga, mi hermana, mi madre. A Diami, el Pelusi y el resto de tu familia por convertirse en la mia. A toda mi familia: Saben que pueden contar conmigo para lo que sea. Muchas gracias por estar presentes y brindarme todo el amor del mundo. Para los que ya no están pero que siguen ocupando un lugar muy especial en mi corazón. A mis amigos: Los de toda la vida: Luisi, Liany, Nelita y Darita, los quiero mucho gracias por soportarme tantos años y estar ahí siempre que los he necesitado. A Dany, Yene, Vane, Lissetik, Arito, Yami, Yedi, Mayriña y Mario por convertirse en mi familia y compartir tantos momentos juntos, espero que las distancias no nos separen jamás. A mis compañeros de grupo: Por compartir estos años de alegrías y vicisitudes, nunca los olvidaré. A mis profesores: Por sus estos años de sacrificio y dedicación que permitieron formarme como una profesional, esto hubiera sido imposible sin ustedes. A todos los que de una forma u otra han pasado y han dejado su huella en mi camino. A los personas que me estiman, quieren y que sienten suyo este logro.. “A todos muchas gracias”. v.

(7) vi. Resumen. En la presente investigación se estudió el crecimiento de Cryptophyta empleando vinazas como medio cultivo. Se utilizó la vinaza procedente de la destilería “Heriberto Duquesne” la cual contiene minerales como K, Ca y Mg y valores de DQO y DBO 5 de 31 919,6 y 19 151,76 mg/l respectivamente. Para el desarrollo experimental se propuso un diseño Placket-Bürman considerándose dos variables falsas y como reales concentración de vinaza, luz, ph del medio, aireación y tiempo de crecimiento, así como peso seco total y remoción de carga contaminante y minerales como parámetros finales. Los indicadores analizados para el crecimiento fueron conteo celular, peso seco, densidad óptica y clorofila total. La mayor productividad fue de 5 995,4 mg y se alcanzó con 100% de vinaza, 24h de luz, ph ocho, aireación y siete días de crecimiento. Al analizar los modelos obtenidos en la producción de biomasa la concentración de vinaza es la variable más significativa, mientras que, en la remoción de DQO-DBO5 y minerales lo es la luz y concentración respectivamente. A partir de estos resultados se propuso un esquema tecnológico utilizando 330 m3 de vinaza para obtener 1 500 kg/d de biomasa. En el análisis económico no resulta atractivo considerar la inversión de la planta sola pues se obtiene un VAN de $ 2 966 139,35, una TIR del 28 % y un PRD de 7,1 años. Sin embargo, si se anexa a una destilería instalada o forma parte de la inversión de una nueva destilería, se alcanza un PRD de 0,9 o 4 años respectivamente.. vi.

(8) vii. Abstract In the present investigation the growth of Cryptophyta was studied using stillage as half culture. The stillage from the "Heriberto Duquesne" distillery was used, which contains minerals such as K, Ca and Mg and COD and BOD5 values of 31 919.6 and 19 151.76 mg / l respectively. For the experimental development a Placket-Bürman design was proposed considering two false variables and as real concentration of stillage, light, medium pH, aeration and growth time, as well as total dry weight and removal of pollutant load and minerals as final parameters. The indicators analyzed for growth were cell count, dry weight, optical density and total chlorophyll. The highest productivity was 5 995.4 mg and was achieved with 100% stillage 24 h light, pH eight, aeration and seven days of growth. When analyzing the models obtained in the production of biomass, the concentration of stillage is the most significant variable, whereas in the removal of COD-BOD5 and minerals it is the light and concentration respectively. From these results a technological scheme was proposed using 330 m3 of stillage to obtain 1 500 kg / d of biomass. In the economic analysis, it is not attractive to consider the investment of the plant alone because a NPV of $ 2 966 139.35, a IRR of 28% and a PRD of 7.1 years is obtained. However, if it is attached to an installed distillery or forms part of the investment of a new distillery, a PRD of 0.9 or 4 years respectively is reached.. vii.

(9) viii. Índice Introducción .......................................................................................................................... 1 Capítulo I: Marco Teórico. .................................................................................................... 3 1.1. Algas. Generalidades. .............................................................................................. 3. 1.1.1. Taxonomía de las algas. Divsiones. ................................................................. 3. 1.2. Microalgas. Características generales. ................................................................... 6. 1.3. Aplicaciones de las microalgas. .............................................................................. 8. 1.4. Medios de cultivos de microalgas. ........................................................................ 12. 1.4.1. Factores de impacto en el crecimiento de microalgas ................................. 13. 1.5. Cinética de crecimiento de las microalgas. .......................................................... 19. 1.6. Sistemas de cultivos de microalgas. ...................................................................... 23. 1.6.1. Sistemas de cultivos abiertos. ........................................................................ 23. 1.6.2. Sistemas de cultivo cerrados. ......................................................................... 25. 1.7. Vinazas como medio de cultivo para microalgas. ................................................ 27. Conclusiones Parciales: .................................................................................................... 28 Capítulo II: Desarrollo Experimental. .................................................................................. 29 2.1. Procedimiento experimental. ................................................................................. 29. 2.1.1 2.2. Identificación de la especie a cultivar. ............................................................... 30 Desarrollo experimental. ....................................................................................... 30. 2.2.1. Diseño experimental Plackett-Bürman............................................................... 30. 2.2.2. Cultivo en Medio Bold Basal. ............................................................................. 32. 2.3. Descripción de los experimentos. .......................................................................... 32. 2.3.1. Ajuste de los parámetros de cultivo. .............................................................. 33 viii.

(10) ix 2.4. Determinaciones experimentales a los cultivos de microalgas. ............................ 33. 2.4.1 2.4.2 2.5. Cálculos a realizar.......................................................................................... 39 Parámetros finales medidos ............................................................................... 41. Resultados del diseño de experimentos. ................................................................. 42. 2.5.1. Resultados e interpretación por el método factorial completo. ................... 45. Análisis de los resultados. ................................................................................................ 48 Capítulo III: Diseño y evaluación económica de una planta de producción de biomasa a partir de microalgas. ............................................................................................................. 50 3.1. Propuesta de planta para la obtención de biomasa de Cryptophyta. .................... 50. 3.2. Balances de masa. .................................................................................................. 51. 3.2.1. Preparación de la vinaza. ............................................................................... 52. 3.2.2. Producción de biomasa. ................................................................................. 52. 3.2.3 3.3. Separación de biomasa....................................................................................... 53 Selección y diseño del equipamiento...................................................................... 57. 3.3.1. Diseño del sistema de preparación de la vinaza. ........................................... 57. 3.3.2. Crecimiento de microalgas. Diseño de canales abiertos. .............................. 58. 3.3.3. Separación de la biomasa. .............................................................................. 61. 3.4. Evaluación económica. .......................................................................................... 63. 3.4.1. Evaluación económica de la planta de producción de biomasa de. Cryptophyta. ................................................................................................................. 63 3.4.2. Evaluación económica de una planta de producción de biomasa anexa a. una destilería de 500 Hl ya instalada. ......................................................................... 67 3.4.3. Evaluación económica de una planta de producción de biomasa incluidaen la. inversión de una destilería de 500 Hl . ......................................................................... 69 ix.

(11) x Conclusiones Parciales ..................................................................................................... 72 Conclusiones ........................................................................................................................ 73 Recomendaciones................................................................................................................ 74 Bibliografía ........................................................................................................................... 75 Anexo 1: Principales grupos taxonómicos de las algas. .................................................. 88 Anexo 2: Principales tipos de sistemas de cultivos. ......................................................... 89 Anexo 3: Usos de las vinazas. ........................................................................................... 91 Anexo 4: Determinación de la Demanda Química de Oxígeno (DQO). PT-ME-11. ........ 92 Anexo 5: Cálculo de los coeficientes utilizados en el diseño de experimentos. .............. 97 Anexo 6: Análisis estadístico del diseño experimental de Placket-Bϋrman. .................. 98. x.

(12) Introducción Introducción El desarrollo de la industria azucarera en Cuba ha permitido el surgimiento de una fuerte producción de derivados a partir de los productos, subproductos o corrientes residuales. Estas facilidades hacen que este sector se pueda integrar en el concepto de biorrefineria de forma tal que se logre emplear de forma integral a la caña de azúcar como fuente de biomasa para la obtención de productos de alto valor, coproductos y energía. En la actualidad, la producción de alcohol a partir de miel representa uno de los derivados más significativos que tiene la producción de azúcar, ya sea por su valor así como la variedad de mercado como producto final. Es por ello que constantemente se desarrollan investigaciones que logren perfeccionar la eficiencia industrial a fin de alcanzar mayor rentabilidad económica sin afectar el medio ambiente. Sin embargo, en este proceso productivo, se separa una corriente residual en gran cantidad, las vinazas, que en muchas ocasiones representa el principal problema de contaminación que tienen las destilerías. Las vinazas se caracterizan por ser un residual con una alta carga contaminante pero que a su vez es rico en nutrientes, razón por la cual son destinadas para fertirriego, producción de levadura torula o biogás. No obstante, recientemente se han realizado investigaciones que utilizan las vinazas como medio de cultivo de microalgas, como Chlorella o Spirulina de forma que estos microorganismos puedan aprovechar los nutrientes presentes en este residual para su crecimiento y desarrollo y así disminuir el poder contaminante de las vinazas, obteniendo además una biomasa de microalgas que puede tener diferentes usos, aunque en Cuba no se ha profundizado en estos estudios. Por ello se presenta como problema científico de esta investigación: Problema científico: No se han identificado las condiciones idóneas para el cultivo y crecimiento de microalgas en vinazas procedentes de destilerías cubanas.. 1.

(13) Introducción Hipótesis: Si se identifican las condiciones idóneas para el cultivo y crecimiento de microalgas en vinazas cubanas, es posible integrarlo a las producciones de las destilerías como sistema de tratamiento de este residual. Objetivo general: Determinar las condiciones idóneas para el cultivo y crecimiento de microalgas en vinazas procedentes de destilerías cubanas. Objetivos específicos: . Identificar la especie de microalgas con posibilidades de adaptación para el crecimiento en vinazas procedentes de destilerías cubanas.. . Determinar las condiciones idóneas para el cultivo y crecimiento de microalgas en vinazas a escala de laboratorio.. . Diseñar la tecnología para el cultivo y crecimiento de microalgas.. . Evaluar técnico y económicamente la tecnología propuesta.. 2.

(14) Capítulo 1: Marco Teórico Capítulo I: Marco Teórico. 1.1 Algas. Generalidades. En la guía de consulta de diversidad vegetal de FACENA (UNNE) se plantea que antiguamente las algas formaban una categoría taxonómica denominada Algae (Algas) dentro de la División Tallophyta. Esta división hace referencia a organismos donde no se diferencian raíz, tallo y hojas. Se llama algas a diversos organismos fotosintetizadores de organización sencilla que viven en el agua o en ambientes muy húmedos. Muchas son unicelulares microscópicas (conocidas como microalgas), otras son coloniales y algunas han desarrollado anatomías complejas, incluso con tejidos diferenciados. Según el Glosario de Botánica General de la Universidad Nacional de la Patagonia, San Juan Bosco, la mayoría de las algas son capaces de elaborar sustancias orgánicas a partir del dióxido de carbono (CO2) y de sustancias inorgánicas disueltas en el agua. Este proceso denominado fotosíntesis se cumple a través de la clorofila, un pigmento verde presente en las células, que actúa transformando la energía luminosa en energía química. La mayoría presentan una pared celular formada por moléculas de celulosa, son principalmente acuáticas, aunque existen algunas terrestres, pudiendo estar adheridas a diversos substratos (como rocas, plantas y animales), su color varía, verdes (carófitas, clorófitas), rojas, amarillas o café. Se pueden reproducir de forma asexual, por bipartición, en unicelulares, y por fragmentación, en pluricelulares. Aunque también se reproducen de forma sexual formando gametos.. 1.1.1 Taxonomía de las algas. Divsiones. De acuerdo a la guía de consulta citada anteriormente existen varios sistemas de clasificación de las algas, sin embargo la mayoría de los ficólogos continúan utilizando la clasificación propuesta por Bourrelly como aparece en la tabla 1.1 (Anexo 1):. 3.

(15) Capítulo 1: Marco Teórico Tabla 1.1: Principales características de los grupos taxonómicos de las algas. Grupos Taxonómicos. Pigmentos Fotosintéticos. Flagelos. Sustancias de reserva. Cyanobacteria. Clorofila aficobiliproteínas (ficocianina y ficoeritrina). Xantofilas. No hay. Almidón de cianofíceas.. Rhodophyta. Clorofila a y d, biliproteínas. No hay. Almidón de florídeas.. Xanthophyceae. Clorofila a y c, ß- carotenos y xantofilas.. Flagelos heterocontos. Crisolaminarina; lípidos. Crysophyceae. Clorofila a y c, fucoxantina. Bacillariophyceae. Clorofila a y c, fucoxantina. 1 flagelo barbulado (gametas masculinas). Crisolaminarina; lípidos. Phaeophyceae. Clorofila a y c, fucoxantina. Presentan 2 flagelos. Crisolaminarina y manitol. Dinophyceae. Clorofila a y c, ßcarotenos y xantofilas.. Presentan 2 flagelos. Criptamilon. Cryptophyceae. Clorofila a, c2, ß carotenos, diadinoxantina, xantofilas. Presentan 2 flagelos. Criptamilon. Chlorophyta. Clorofila a y b acompañadas de xantofilas.. Generalmente 2 (o más) flagelos.. Almidón verdadero.. Euglenophyta. Clorofila a y b, ß- carotenos y xantofilas.. Presentan 2 flagelos.. Paramilon. División Cryptophyta Es un grupo pequeño de algas unicelulares con unas 200 especies que viven en aguas marinas y continentales.[] Son miembros importantes del fitoplancton y se pueden encontrar en aguas estancadas, soportando moderados niveles de contaminación. En general, son mixótrofas, es decir, capaces tanto de la fotosíntesis como de la fagotrofia (Adl, 2012). La ingestión fagotrófica de bacterias les proporciona la fuente de fósforo y nitrógeno que necesitan en condiciones de escasez de nutrientes. Aproximadamente la mitad de las especies son de agua dulce y la otra mitad marinas. Son especialmente abundantes en aguas frías y parecen ser muy sensibles a la cantidad de luz que reciben (Lee, 2008). Las criptofitas son biflageladas, con células ovales y aplanadas y con un tamaño de alrededor de 10-50 μm (figura 1.1). Algunas se presentan en formas cocoides o. 4.

(16) Capítulo 1: Marco Teórico palmeloides (grupos de células rodeadas de una cubierta de mucílago) y existe un género filamentoso. También pueden formar quistes, rodeados de una pared celular y en animación suspendida, que les permiten sobrevivir en condiciones desfavorables. La mayoría fotosintéticos y, estos, con un sólo cloroplasto con un pirenoide central.. Figura 1.1. Especie Cryptophyta.. Además no presentan una verdadera pared celular. La cubierta específica que rodea a la criptofita es un periplasto de dos capas, una interna y otra externa a la membrana plasmática. La capa externa es fibrosa, mientras que la interna presenta placas proteináceas. En todas las especies de agua dulce está presente una vacuola contráctil para la regulación de la presión osmótica localizada en el vértice de la célula. La reproducción es asexual, por simple división longitudinal y la mitosis es abierta. Las especies sésiles o coloniales producen zoosporas (Grim & Staehelin, 1984). Dentro de los principales caracteres químicos que presentan se encuentran los que se resumen en la tabla 1.2. Tabla 1.2: Principales caracteres químicos de las Cryptophytas. Tipo. Especificidad. Pigmentos fotosintéticos. Clorofilas a y c2. Ficobiliproteínas en el interior de los tilacoides. Xantofilas y b-caroteno. Sustancias de reserva. Almidón entre las membranas del cloroplasto. Por otra parte se distinguen tres órdenes en dos clases (Adl, 2012).. 5.

(17) Capítulo 1: Marco Teórico Tabla 1.3: Órdenes pertenecientes a las Cryptophytas. Órdenes de Cryptophyceae. Principales Características. Cryptomonadales. Presentan cloroplastos o leucoplastos, estos últimos presentes en tres linajes que perdieron la capacidad fotosintética. No presentan citostoma ni citofaringe, aunque son capaces de ingerir bacterias aparentemente utilizando vacuolas contráctiles. Comprende unos veinticinco géneros y a la mayor parte de las especies. Goniomonadales. Carecen de todo tipo de plastos y presentan un citostoma que utilizan para la ingestión de bacterias. Solo se ha descrito un género, Goniomonas. Kathablepharida. Grupo de organismos depredadores relacionados con los anteriores, ingieren presas eucariotas a través de un citostoma apical con el apoyo de bandas de microtúbulos longitudinales. No se han observado plastos, aunque algunas especies son cleptoplásticas, robando los cloroplastos de las presas que ingieren. Se conocen unos cuatro géneros.. 1.2 Microalgas. Características generales. Las microalgas son un conjunto heterogéneo de microorganismos fotosintéticos unicelulares procariotas (cianobacterias) y eucariotas (diatomeas y algas verdes), que se localizan en hábitats diversos tales como aguas marinas, dulces, salobres, residuales o en el suelo, bajo un amplio rango de temperaturas, pH y disponibilidad de nutrientes; se les considera responsables de la producción del 50% del oxígeno y de la fijación del 50% del carbono en el planeta (Mata, 2010) (Palomino A., 2013). Generalmente obtienen la energía fotosintéticamente a partir de la radiación solar y se desarrollan en base a materia inorgánica: son organismos fotoautótrofos. No obstante, hay especies capaces de crecer utilizando la materia orgánica como fuente de carbono. Por tanto, en función de su metabolismo es posible establecer la siguiente clasificación (Lores H., 2015):. 6.

(18) Capítulo 1: Marco Teórico Tabla 1.4: Clasificación de las algas de acuerdo al metabolismo. Tipo. Características. Fotoautótrofas. Obtienen la energía de la luz solar y su fuente de carbono son compuestos inorgánicos.. Fotoheterótrofas. Obtienen la energía del sol y utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Mixotróficas. Utilizan independientemente fuentes de carbono orgánicas o inorgánicas para su desarrollo, pero su fuente de energía sigue siendo la luz. Heterótrofas. Son capaces de utilizar la materia orgánica tanto como fuente de energía como fuente de carbono, por lo que tienen la capacidad de desarrollarse en ausencia de luz. Como fórmula molecular de las microalgas se puede emplear, a modo general, la propuesta por Grobbelaar (2004) (Ruiz Martínez, 2011):. , de donde se. deduce que un kilogramo de microalgas contendría los compuestos según se muestran en la figura 1.2: 9% 1%. 30%. 52%. Carbono Hidrógeno Oxígeno Nitrógeno Fósforo. 8% Figura 1.2: Composición principal de las microalgas.. Las microalgas producen lípidos, proteínas y carbohidratos en cantidades grandes en periodos de tiempos cortos. Son capaces de fijar CO2 y liberar O2 a la atmósfera y representan los microorganismos que mayor velocidad de crecimiento tienen. Sus principales ventajas, mencionadas por Campbell, Chisti, Huntley, Li et al., Khan et al., (citadas en Gouveia, 2011) son (Palomino A., 2013):. 7.

(19) Capítulo 1: Marco Teórico . Mayor rendimiento de crecimiento y producción de biomasa por hectárea. (aproximadamente 3.8% frente a 0.5% que producen los cultivos energéticos convencionales como caña de azúcar, palma, maíz, etc) . Mayor capacidad de captar el CO2 (por cada 100 t de microalgas producidas, se. consumen 183 t de CO2 (Chisti, 2007). . Capacidad de crecer en medio líquido marino o en aguas residuales, con lo que se. reduce el consumo de agua dulce para su producción.. 1.3 Aplicaciones de las microalgas. El uso de las microalgas como fuente bioenergética es prometedor debido a (Palomino A., 2013):  Los tiempos de duplicación de biomasa durante la fase de crecimiento exponencial pues son relativamente bajos (3,5 horas), manteniendo un contenido de lípidos hasta del 80% por biomasa seca (Chisti, 2007).  El contenido de lípidos puede variarse dependiendo de la composición del medio de crecimiento (Widjaja, 2009).  Crecen tanto en agua dulce como salada y no necesitan establecerse en tierras fértiles (Ahmad, 2011) Igualmente se utiliza para la biorremediación de aguas residuales, producen biomasa con un valor añadido generando coproductos o subproductos, además de ser una fuente de energía en la generación de biocombustibles (Bermeo Castillo, 2011). Alimentación Las microalgas pueden utilizarse directamente como alimento, para incrementar el contenido en principios nutritivos de alimentos preparados y como agente prebiótico con un efecto positivo en la salud humana y animal, lo que ha permitido el desarrollo de mercados para los productos derivados de ellas (Becker, 2004). Los géneros con mayor coeficiente de digestibilidad y valor biológico son Scenedesmus, Chlorella y Spirulina (Pal, 2011).Las microalgas sintetizan y acumulan gran variedad de carbohidratos como almidón o glucógeno fácilmente digeribles y sin restricciones para su. 8.

(20) Capítulo 1: Marco Teórico uso como fuente de alimento (Becker, 2004).bfrh Ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga presentes constituyen un mercado bien establecido tanto en alimentación humana como animal (acuicultura). Así mismo, contienen un amplio rango de esteroles y vitaminas usados principalmente como constituyentes de alimentos funcionales (Borowitzka, 2013). La biomasa de microalgas es rica en pigmentos que se utilizan como colorantes alimentarios y precursores de vitaminas. En acuicultura tienen aplicación para mejorar la supervivencia y maduración del sistema inmunge y la pigmentación de la carne y piel de pescados y crustáceos (Walker, 2005). Fertilización Las microalgas pueden ser utilizadas como fertilizantes en agricultura sostenible. Dentro de las comunidades microbianas desarrolladas en los suelos, junto a las cianobacterias juegan un papel fundamental en la recirculación y biodisponibilidad de elementos importantes como P y por tanto, en el acondicionamiento de suelos agrícolas (Singh, 2011). Actualmente se está poniendo en práctica el uso de microalgas para incrementar la productividad de cultivos como leguminosas y frutales (Prasanna, 2013) (Ismail, 2011). Biorremediación Se ha propuesto el uso de microalgas en procesos de biorremediación tales como eliminación de dióxido de carbono proveniente de gases de escape de plantas industriales, tratamientos de aguas residuales o remoción de metales pesados provenientes de efluentes contaminados por la minería o zonas altamente contaminadas (McHenry, 2013) (Orandi, 2013), así como la eliminación de compuestos fenólicos y pesticidas (Subashchandrabose, 2013). El oxígeno producido por los cultivos de microalgas como resultado de la fotosíntesis supone una clara mejora en el proceso. Así mismo, las microalgas favorecen la retirada de nitrato, fosfato e iones metálicos. Para dar salida a esta biomasa de microalgas se plantea la instalación de plantas de biogás y generación de calor o electricidad a partir de la biomasa algal (Acien Fernandez, 2012) (Ahmad, 2013). Generación de productos de interés Entre todos los usos comerciales ya mencionados, la generación de productos con aplicación industrial constituye en la actualidad el aspecto central de la biotecnología de. 9.

(21) Capítulo 1: Marco Teórico microalgas. Muchas especies producen, como resultado de su metabolismo, diferentes compuestos biológicos de interés para las industrias químicas o farmacéuticas, tales como pigmentos, lípidos, polisacáridos, vitaminas, etc. Estos pueden acumularse como parte de la biomasa del alga o en algunos casos, liberarse al medio externo (Gudin, 1986).  Pigmentos Las ficobiliproteínas, además de su uso en como colorante en la industria alimentaria y cosmética, tienen una aplicación interesante en microscopia de fluorescencia e inmunoensayos. Se pueden asociar con una gran variedad de biomoléculas sin alterar sus características de absorción y emisión de luz, tienen alta eficiencia cuántica y son estables en amplios márgenes de pH y temperatura. Su fluorescencia anaranjada es fácil de diferenciar de la fluorescencia verde de los tejidos. Todas estas propiedades las convierte en excelentes trazadores fluorescentes para su aplicación en diagnóstico e investigación biomédica (Glazer, 1994). Los carotenoides muestran una gran diversidad en su distribución, estructura y función. Multitud de estudios han puesto de manifiesto la poderosa actividad antioxidante tanto de b-caroteno como astaxantina y cantaxantina (Borowitzka, 1992). Estos compuestos actúan secuestrando radicales libres de oxígeno, directamente relacionados con la aparición de enfermedades degenerativas, con beneficios para la salud humana y animal previniendo o retrasando algunas enfermedades como cáncer, aterosclerosis, cataratas, etc. Los principales pigmentos explotados comercialmente son b-caroteno y astaxantina (Del Campo, 2007).  Compuestos con actividad biológica Las microalgas son capaces de generar metabolitos secundarios de importancia en biomedicina y agronomía para el desarrollo de compuestos como herbicidas, pesticidas, antibióticos, compuestos anticancerígenos y antivirales, con actividad antiinflamatoria, antitrombótica,. antidiabética,. cardio,. neuro. y. hepatoprotectora,. antianémica. y. antihistamínica (Patel, 2013) (Skjanes, 2013).  Biocombustibles El potencial de la biomasa de microalgas como fuente de materias primas para biocombustible se basa en su rápido crecimiento y alta productividad, no competencia con la agricultura tradicional, posibilidad de utilización de agua residual, salobre o marina y. 10.

(22) Capítulo 1: Marco Teórico elevado contenido en aceite y/o azúcares (Douskova, 2009), (Arnold, 2013) (Maity JP, 2014). En general, la producción de biocombustibles se puede clasificar en dos grupos: por conversión termoquímica y por conversión bioquímica. El primer grupo consiste en la descomposición térmica de la biomasa para producir productos combustibles. La conversión bioquímica en cambio, es la degradación biológica de la biomasa a través de reacciones químicas y biológicas asociadas a procesos metabólicos de microorganismos (figura 1.3) (Brennan, 2010) (Harun, 2011) (Rawat, 2011) (Abdel-Raouf, 2012) (Ho S-H, 2013) (Wang Y, 2012) (SK Prajapati, 2013).. Figura 1.3: Procesos de producción y productos obtenidos usando biomasa microalgal. Fuente: (García, 2011).. Siendo los principales biocombustibles que se pueden obtener a partir de la biomasa algal el biodiesel, bioetanol, biogás y biohidrógeno (Chisti, 2007) (Fernández Lorenzo J., 2014). La posibilidad de explotar comercialmente todo el potencial de productos derivados de microalgas (biorrefineria) puede hacer económicamente factible su escalado (Pires, 2012). Este concepto integral, que implica extraer de la biomasa, de forma secuencial, distintos subproductos hasta obtener un residuo final, necesita aun del desarrollo de tecnologías de separación sin dañar o impedir el aprovechamiento de otros compuestos, de forma económica y con un bajo consumo energético (Vanthoor-Koopmans, 2013).. 11.

(23) Capítulo 1: Marco Teórico  Nuevos desarrollos Se sigue investigando en nuevas aplicaciones y desarrollos para la biomasa de microalgas. Cabe destacar la producción de bioplásticos a partir de polihidroxialcanos (Balaji, 2013) (Borowitzka, 2013), proteínas recombinantes para farmacología y medicina (Potvin, 2010), incremento de la productividad de lípidos y carbohidratos mediante modificación de rutas metabólicas (Angermayr, 2009) (Dexter, 2009) (Blatti, 2013) o mediante la modificación estructural de las células (reducción de los pigmentos antena para disminuir los fenómenos de fotoinhibición o incremento de la eficiencia de la Rubisco) (Huntley, 2007).. 1.4 Medios de cultivos de microalgas. Una de las variables más complejas en el sistema productivo es la composición del medio de cultivo la cual se encuentra íntimamente relacionado con otras variables operativas y fisicoquímicas importantes: pH, temperatura y concentración de CO 2 (Ferreiro, 2011). Del mismo modo, el conocimiento de estos factores posibilita su modulación para conseguir una composición celular determinada y con ello, redirigir el metabolismo del microorganismo hacia la producción del compuesto o proceso deseado (Hu, 2004) (García, 2011) Todos los organismos vivos incluyendo las microalgas requieren de un medio de cultivo que contenga todos los nutrientes esenciales que necesiten para su desarrollo (Edberg, 2010). En la tabla 1.5 se reportan algunos valores de los requerimientos físicos y químicos que generalmente deben presentar los cultivos de microalgas, aunque estos sean particulares de la especie que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo (Rodríguez, 2015).. 12.

(24) Capítulo 1: Marco Teórico Tabla 1.5: Requerimientos principales de cultivos de microalgas.. Físicos. Nutritivos. REQUERIMIENTOS. COMPUESTOS QUIMICOS. VALORES. Luz. -. . 2,000 – 4,000 lux. Temperatura. -. 15 – 22 °C. Salinidad. -. 0,37 %. pH. -. 7–9. C. CO2CO3. g/100 ml. O, H. O2H2O. g/100 ml. N. N2NH4+ NO3. g/100 ml. P. PO4. g/100 ml. S. SO4. g/100 ml. Na, K, Ca, Mg. Sales. g/100 ml. Fe, Zn, Mn, B, Br, Si. Sales. mg/100 ml. Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Al. Sales. mg/100 ml. Vitaminas. B12, tiamina, biotina. mg/100 ml. 1.4.1 Factores de impacto en el crecimiento de microalgas  Luz Como organismos fotosintéticos, las microalgas dependen completamente de la luz que reciban (Assemany, 2015). Su crecimiento es proporcional a la intensidad de luz que recibe, siempre y cuando esta intensidad se sitúe por debajo de un valor límite conocido como intensidad óptima. Por encima de este valor los organismos se ven dañados y por tanto el proceso de fotosíntesis se inhibe, proceso conocido como fotoinhibición (Lores H., 2015).. 13.

(25) Capítulo 1: Marco Teórico. Figura 1.4: Efecto de la intensidad lumínica sobre la actividad fotosintética. Fuente: (Vonshak, 2004). Tomado de (Lores H., 2015).. Los cultivos microalgales exteriores suelen sufrir fotoinhibición en las principales horas del día debido a la alta intensidad lumínica la cual decrece con el aumento de la turbidez (Contreras-Flores C, 2003) (Markou, 2011). En cultivos de microalgas la penetración de la luz se dificulta por el selfshading y por la absorción de la luz. En el primer caso, las mismas algas se “eclipsan” unas a otras dificultando la posibilidad de que todas estén expuestas a una misma intensidad de luz. En el segundo, las algas, a través de sus pigmentos (principalmente las clorofilas) absorben parte de la radiación recibida (Richmond, 2004) (Ferreiro, 2011). A la hora de diseñar los sistemas de cultivo, hay que tener en cuenta que la luz debe llegar a la mayor cantidad de células posibles por lo que es imprescindible considerar tanto la profundidad de los recipientes como la concentración a la que se trabajará. Una profundidad elevada permite el almacenamiento de un mayor volumen, pero la luz no será capaz de llegar a las zonas más interiores. Del mismo modo, intentar retener una concentración elevada de biomasa en el reactor perjudicará la transferencia de la luz a través del medio líquido (Lores H., 2015). Existen diferentes métodos de aplicación de la luz en referencia al tiempo de iluminación. Muchos estudios atribuyen las posibles mejoras de la utilización de ciclos respecto a la iluminación continua a que los tiempos de oscuridad potencian la actividad química que tiene lugar en la fase oscura de la fotosíntesis (Carvalho, 2011) (Lores H., 2015).. 14.

(26) Capítulo 1: Marco Teórico  Temperatura El efecto de la temperatura en las reacciones bioquímicas es también uno de los factores más relevantes que influyen tanto en la composición como en la actividad de las microalgas (Lores H., 2015). La producción algal aumenta proporcionalmente con la temperatura hasta alcanzar el valor óptimo para cada especie. Por encima de esta, aumenta la respiración y la fotorrespiración reduce la productividad global. La temperatura óptima varía entre las especies, pero en general está entre 28° y 35°C (Park J, 2011a). De acuerdo a la temperatura óptima de crecimiento; Chlorella vulgaris podría dividirse en dos tipos de cepas: la de baja temperatura (25-30) oC y alta temperatura (35-40) oC (Sorokin, 1959) aunque su tasa de crecimiento disminuye cuando la temperatura es mayor de 25 oC (Sayed O.H., 2000) (Castro Ruiz C.L., 2011) En un sistema de cultivo cerrado, la temperatura se puede controlar por varios mecanismos, tales como rociadores de agua, inmersión del colector solar en piscinas, reactor dentro de un invernadero, etc. (Martínez, 2008). Por el contrario, en un sistema de cultivo abierto es muy difícil de controlar, aunque se pueden realizar ciertas acciones simples para disminuir el efecto, como cubrir los estanques con plásticos transparentes (Borowitzka, 1999) (Martínez, 2008) (Park J, 2011a) (Hernández-Pérez, 2014). Se ha demostrado que en el caso de que el dióxido de carbono o la luz sean limitantes en el cultivo, la temperatura no ejerce una influencia significativa (Ruiz Martínez, 2011).  pH El pH es un parámetro que puede afectar a numerosos procesos, esencialmente porque marca la biodisponibilidad en el medio de compuestos como nutrientes o metales en función de sus constantes de equilibrio ácido-base. El caso más representativo de este equilibrio son los compuestos de carbono:. 2↔. 3−↔. 2− 3. Las microalgas tienen su rango óptimo de desarrollo entre valores de pH de 7 y 9 (Xu, 2014) (Lores H., 2015) con un óptimo entre 8,2–8,7 (Ruiz Martínez, 2011). Si el medio se aleja de estos límites se altera notablemente su capacidad de crecimiento (Lores H., 2015). El control de pH se consigue mediante aireación o adición de CO2, en este caso la fijación de CO2 provoca un aumento gradual de pH en el medio debido a la acumulación de OH-, lo que puede promover la eliminación de nitrógeno en forma de amoníaco por. 15.

(27) Capítulo 1: Marco Teórico stripping a la atmósfera y eliminación de fósforo por precipitación de ortofosfatos (Ruiz Martínez, 2011).  CO2 Normalmente utilizan el CO2 como fuente de carbono, aunque pueden suplir la necesidad también con iones bicarbonato (HCO3-). Al potenciar el consumo de dióxido de carbono se incrementa el desarrollo y por tanto la eficacia en el consumo del resto de nutrientes. Estequiométricamente las necesidades de CO2 para un sistema de microalgas se estiman en 1,85 g CO2/g biomasa. En un caso real hay que tener en cuenta que parte de la cantidad inyectada al sistema desaparecerá por stripping (Ruiz Martínez, 2011). El consumo normal de las microalgas se sitúa entre 200 y 600 mg/L·d de CO 2, aunque este valor puede variar notablemente dependiendo de las condiciones del sistema y de la especie concreta. No obstante para la fijación de CO2 las especies como Chlorella presentan mejores resultados llegando cerca de los 1800 mg/L·d de CO2 (Lores H., 2015).  Salinidad La salinidad del medio afecta esencialmente a la capacidad de intercambio de sustancias a través de las pareces celulares de los microorganismos, que se rigen por procesos de ósmosis, y consiguientemente la producción de lípidos, la adquisición de nutrientes y la excreción de sustancias de rechazo (Tomaselli, 2004). Para cada especie los efectos se presentarán de manera diferente, afectando en última instancia a la capacidad de creación de biomasa y de eliminación de nutrientes (Lores H., 2015).  Nutrientes . Fósforo. Aunque el contenido en fósforo de las microalgas es menor al 1%, su deficiencia en el medio de cultivo es una de las mayores limitaciones al crecimiento. En los medios de cultivo suele incorporarse en forma de HPO42- o HPO4- (Grobbelaar, 2004) (Martínez, 2008) (Hernández-Pérez, 2014). El fósforo es un componente esencial de los ácidos nucleicos, que gobiernan la síntesis de proteínas de los microorganismos, así como componente del adenosín-fosfato, responsable del correcto funcionamiento del transporte intracelular. En condiciones normales tienen la capacidad de almacenar intracelularmente una cierta cantidad de fósforo denominada minimum cell quota (q0) cuyo valor se sitúa entre el 0,2 % y el 0,4 % de su peso en seco. Sin embargo bajo ciertas condiciones las. 16.

(28) Capítulo 1: Marco Teórico mismas microalgas pueden aumentar este porcentaje hasta llegar a más del 3 %, lo que supone que las microalgas son capaces de almacenar hasta 16 veces su q0. Este efecto es conocido como luxury uptake. El proceso de toma de fósforo puede verse sensiblemente afectado por ausencia en el medio de otros iones como potasio, sodio o magnesio, o incluso por valores de pH inadecuados, excesivamente altos o bajos (Lores H., 2015). Cabe destacar, que un déficit de nutrientes provoca en las microalgas una acumulación de lípidos siempre que haya luz y CO2 disponibles (Rodolfi, 2009) (Khozin-Goldberg, 2006) (Ruiz Martínez, 2011). . Nitrógeno. El nitrógeno es el otro elemento esencial cuya escasez relativa en el medio afecta directamente y de manera negativa el crecimiento de las microalgas. Es el constituyente de aminoácidos y de todas las proteínas sintetizadas a partir de éstos (Lores H., 2015). El contenido en nitrógeno de la biomasa puede suponer desde un 1% hasta más del 10%, y depende de la disponibilidad y el tipo de fuente de nitrógeno. En general, las microalgas pueden tomar nitrógeno del medio en forma de urea, amonio, nitrato, nitrito, nitrógeno gas y óxidos de nitrógeno (NOx) en algunos casos. Las algas mixotróficas pueden utilizar el nitrógeno orgánico en condiciones de baja iluminación, ya que en esta situación suele predominar el metabolismo heterótrofo respecto al autótrofo. Este tipo de algas únicamente utilizan sus funciones heterótrofas en las condiciones excepcionales, sabiendo que cuando se reestablecen las condiciones favorables vuelven a nutrirse de manera autótrofa (Lores H., 2015). . Micronutrientes. En complementación a los macronutrientes, otros elementos están presentes en la estructura citológica o participan en funciones relacionadas con ella. Generalmente estos elementos se encuentran en abundancia en el medio por lo que no limitan la actividad celular por la reducida cantidad que se necesita de ellos, por este motivo son conocidos como “elementos traza” o “micronutrientes” (Reynolds, 2006). En este grupo se hallan el Na, K, Ca, Mg y Cl como más representativos (Lores H., 2015).. 17.

(29) Capítulo 1: Marco Teórico  Oxígeno disuelto El nivel de oxígeno disuelto debe ser controlado en los sistemas de cultivo de microalgas. Los problemas pueden aparecer por un exceso de gas disuelto que puede provocar la inhibición de la fijación de carbono a partir del dióxido de carbono disuelto. Como gas en disolución, su presencia en el medio acuoso estará determinada principalmente por la temperatura que es la que fija la concentración de saturación. El oxígeno es producto de la actividad fotosintética por lo que puede alcanzar valores de hasta 40 mg O2/L en sistemas de cultivo de alta densidad, que junto al efecto de la radiación favorece la aparición de radicales de oxígeno (Ruiz Martínez, 2011). Los radicales tienen gran capacidad de unión con otros compuestos y elementos del medio que pueden resultar tóxicos para las algas. Por esta razón debe disponerse de sistemas que permitan el control y la eliminación del oxígeno del líquido. Generalmente se desorbe (stripping) el gas como consecuencia de la turbulencia provocada por la agitación (Lores H., 2015). La intensa fotosíntesis realizada durante el día en sistemas de cultivos puede aumentar los niveles de oxígeno disuelto a saturación > 200%.  Agitación. En los sistemas destinados al cultivo de microalgas la agitación es un parámetro mecánico a tener en cuenta. Tiene diversas funciones como facilitar la eficiencia del transporte de las sustancias dentro del medio líquido, impedir la sedimentación de las algas (se encuentran en suspensión), homogeneizar el medio y el pH en todo el volumen de reacción, y desplazar a las algas desde zonas oscuras a zonas con iluminación (AST Ingeniería S.L., 2013). Una adecuada homogeneización es necesaria para el buen desarrollo del proceso porque evita la aparición de gradientes de temperatura y de pH, y una buena distribución del oxígeno (Vonshak, 2004). No obstante, las microalgas en general son sensibles a esfuerzos mecánicos, por lo que la intensidad a la que se aplica la agitación debe estar controlada. El sistema convencional de aplicar la agitación es mediante el burbujeo de aire y CO2. Como en todos los casos, la velocidad de gas máxima que podrán soportar las microalgas dependerá de la especie a la que pertenezcan (Lores H., 2015).. 18.

(30) Capítulo 1: Marco Teórico  Zooplancton pastoreador y depredadores Los cultivos de microalgas son susceptibles al pastoreo por algunos grupos zooplantónicos, tales como cladóceros, rotíferos o nemátodos, sobre todo en sistemas abiertos (McGriff, 1972) (Park J, 2011a) (Hernández-Pérez, 2014). La presión por predación es tal, que en pocos días pueden reducir la productividad entre un 90 a 99% (Oswald 1980 y Cauchieet al. 1995 en Park et al. 2011a) (Hernández-Pérez, 2014). Estas plagas se pueden tratar mediante medios físicos, tales como filtración, centrifugación, baja concentración de oxígeno disuelto (OD) / alta carga orgánica y tratamientos químicos, como aplicación de hormonas miméticas contra invertebrados, aumento de pH y concentración de amonio libre (Park J, 2011a) (Hernández-Pérez, 2014).. 1.5 Cinética de crecimiento de las microalgas. El crecimiento de una población de microalgas en un cultivo bajo condiciones preestablecidas presenta las siguientes fases de desarrollo (Figura 1.4) (Wolfgang, 1994): 1. Fase de adaptación o ajuste, 2. Fase de crecimiento exponencial, 3. Fase de crecimiento lineal, 4. Fase de retardo, 5. Fase estacionaria y 6. Fase de muerte, tal y como se muestra en la figura 1.5.. Figura 1.5: Fases del desarrollo de un cultivo de microalgas. Fuente: (Wolfgang, 1994). Tomado de (Alvear, 2011). Durante la primera fase cuando un medio es inoculado con la microalga, esta se acopla a las condiciones establecidas, la tasa de crecimiento específico es baja y se incrementa con el tiempo del cultivo y la capacidad biológica de adaptación. En esta etapa las células. 19.

(31) Capítulo 1: Marco Teórico son mucho más sensibles a la temperatura y a cualquier otro cambio en el ambiente en comparación con las demás etapas de desarrollo. En la segunda fase el cultivo se ha adaptado a las condiciones de crecimiento. Aquí las células se duplican en intervalos iguales de tiempo y en un cultivo, sin luz y con nutrientes limitados, el incremento de biomasa de la microalga por unidad de tiempo, es proporcional a la biomasa inicial del cultivo (Rodríguez A., 2006). Esto se expresa por la ecuación característica (1): (. ⁄. ). Donde: N medida de la biomasa o número de células, µ tasa de crecimiento específica para cada organismo y medio de cultivo, t tiempo. El tiempo de duplicación o tiempo de generación es el inverso de la tasa de crecimiento específica, expresado como el lapso entre dos duplicaciones sucesivas. Es decir:. El crecimiento continúa hasta la tercera fase en la cual la multiplicación celular se extiende a una tasa constante, determinada por la naturaleza intrínseca del organismo y las condiciones de cultivo, hasta llegar a ocultarse una célula sobre la otra, lo que produce una disminución de luz. Durante la cuarta fase el tiempo requerido para duplicar la población aumenta, reduciéndose la tasa de crecimiento. Esto se debe a que los nutrientes están disminuidos en el medio y hay un aumento en la concentración de los metabolitos. En la quinta fase la curva de crecimiento presenta el valor aproximado máximo de concentración de biomasa, es una fase corta donde se alcanza un equilibrio entre esta concentración y la pérdida debida a los procesos de degradación. La tasa de crecimiento se compensa con la mortalidad celular, de tal modo que. , donde d es la tasa de. mortalidad. Durante la última fase las células mueren liberando materia orgánica, es decir , la tasa de mortalidad supera la tasa de multiplicación celular. . Esta fase es causada por las. condiciones desfavorables del ambiente, sobre el cultivo y el limitado suplemento de luz y. 20.

(32) Capítulo 1: Marco Teórico nutrientes o la contaminación por otros microorganismos, este tipo de crecimiento ocurre en sistemas cerrados (Rodríguez A., 2006). Dicho crecimiento se expresa como el incremento de la función del tiempo de la biomasa o número de células dentro del cultivo. Existen distintos motivos por los que es de interés la obtención de velocidades de reacción, dentro de ellos, obtener información acerca del mecanismo de la reacción y obtener parámetros cinéticos que pueden permitir conocer la velocidad del proceso en otras condiciones mediante interpolación o extrapolación y posibilitan el diseño del reactor (Catalá, 2013) (Rodríguez, 2015). Señalan (Lee, 2002) que la velocidad de crecimiento depende de la energía luminosa absorbida por las células. Inicialmente, la velocidad de crecimiento es elevada cuando es usado un inóculo pequeño y cantidades suficientes de nutrientes. Los microorganismos exhiben su máxima velocidad de crecimiento en la fase exponencial mientras no esté limitada la luz. Sin embargo, a medida que aumenta el número de células, se incrementa el efecto de “sombra”, de este modo decrece la velocidad de crecimiento específica como respuesta a la energía luminosa recibida por unidad de biomasa. Una interesante característica de esta fase descrita por (Becker, 1994); (Liere, 1982) y citada por (Lee, 2002) es que la biomasa total del cultivo se incrementa linealmente con el tiempo, debido a que la producción por unidad de tiempo, es proporcional a la absorción de luz. Esta fase de crecimiento lineal en cultivos batch, es una característica de los microorganismos fotosintéticos durante el crecimiento fotoautotrófico. Así, el conocimiento de los factores determinantes a partir de la velocidad de crecimiento lineal, puede suministrar una estrategia para optimizar la productividad del cultivo algal.. 1.5.1 Balances de masa Para interpretar la producción de biomasa algal, se necesita representar el mismo ambiente acuático, donde las algas se nutren y se reproducen, el cual según (Stumm, 1981) está acompañado de NO3-, NH4 y HPO4-2, citado además por (Gao, 1994). En este sentido, se realizan balances de masa para calcular las cantidades de sustrato y nutrientes capaz de asimilar las células, así como su rendimiento. Según (Bailey, 1986) las técnicas del balance material se apoyan tanto en relaciones estequiométricas rigurosas, como en relaciones empíricas aproximadas, basadas en consideraciones propias de los bioprocesos.. 21.

(33) Capítulo 1: Marco Teórico En cuanto al balance de masa elemental para describir el crecimiento celular y la actividad metabólica, se puede utilizar la vía clásica de una simple reacción química a partir de la fórmula elemental del material celular seco. Para la célula puede utilizarse una fórmula del tipo: CθHαOβNδ, aunque es conveniente escribir la fórmula para un átomogramo de carbono (θ = 1), lo que implica un valor fijo de los demás subíndices de acuerdo con su composición en la estructura celular específica. En estas condiciones la reacción puede escribirse de la forma siguiente:. Donde: y. son las fuentes de suministro de C y N respectivamente y se considera. que los únicos productos secundarios son el dióxido de carbono y el agua. Se deben tomar algunas consideraciones sobre el balance material para el crecimiento y la formación de productos como el grado de reducción (reductancia) o reductividad (γ), definido por (Eroshin, 1982) como el número de equivalentes de oxígeno requeridos para la oxidación completa de todo el compuesto orgánico que contiene en su estructura un átomo de carbono. (Castellanos, 2001) confirman que el grado de reducción está estrechamente ligado al número equivalente de electrones disponibles del compuesto que posee un átomogramo de carbono. Según (Kurano, 1995) 1,57 g de CO2 se requieren para producir 1 g de glucosa, basado en la siguiente reacción:. Los referidos autores reportaron la fijación de 4 g CO2/L·día a una velocidad de crecimiento de 2,5 g alga/L·día con una relación de 1,6 a 1.Teniendo en cuenta la conversión de glucosa en otros compuestos, como lípidos o almidón, bajo ciertas condiciones; el consumo de CO2 puede ser de 2 g CO2 a 1 g alga. Suponiendo una velocidad de crecimiento de 50g/m2·día, estiman (Schenk, 2008) puede ser posible capturar una tonelada de CO2 por día para una hectárea de estanques algales. De acuerdo a (Chisti, 2007), la biomasa microalgal, en general, contiene 50 % de carbono por peso seco. Un mol de CO2 tiene una masa de 44 gramos, y 12 de ellos son de carbono. Basado en esta suposición (Buehner, 2009) infieren que la expresión de 1 gramo de microalga puede fijar 1,83 gramos de CO2 se deriva de:. 22.

(34) Capítulo 1: Marco Teórico ⁄ ⁄ Se pueden realizar además, balances de energía, donde (Bailey, 1986) manifiestan que se necesitan datos de calor de combustión para los análisis energéticos de reacciones de bioprocesos.. 1.6 Sistemas de cultivos de microalgas. Probablemente, la característica más importante de las microalgas es que crecen rápidamente y tienen el potencial de generar una gran cantidad de biomasa en un tiempo relativamente corto. Se pueden resumir las características de los cultivos de microalgas por la elevada capacidad de generación de biomasa, generación de biomasa homogénea, gran variedad de productos y biomoléculas, no necesitan tierra cultivable, requieren nutrientes simples, aprovechan la luz del sol, retiran CO2 de la atmósfera, además tienen eficiencia fotosintética alta comparada con las plantas (Anon., n.d.). En la producción de organismos fotoautótrofos existen dos diseños básicos (Borowitzka, 1999) (Contreras-Flores C, 2003) (Tredici, 2004) (Hernández-Pérez, 2014): cultivos abiertos, donde la biomasa está expuesta a las condiciones medioambientales; y cerrados, denominados fotobiorreactores o PBR (por sus siglas en inglés), con poco o ningún contacto con el medio externo (Contreras-Flores C, 2003) (Tredici, 2004) (Posten, 2009) (Hernández-Pérez, 2014).. 1.6.1 Sistemas de cultivos abiertos. Son los sistemas más comunes (Martínez, 2008) (Posten, 2009) comprenden tanto medios naturales, como lagunas y estanques, como artificiales con variedad de diseños. (Hernández-Pérez, 2014). Sus ventajas radican en el bajo costo y facilidad de construcción y operación, así como en la alta durabilidad (De Godos, 2009) (Martínez, 2008) (Rawat, 2011) (Abdel-Raouf, 2012). Este sistema es de los más rentables, ya que puede ser utilizado para el tratamiento de aguas residuales de distintas fuentes (De Godos, 2009) (Park, 2011b) (Rawat, 2011) (Abdel-Raouf, 2012) lo que disminuye los costos por requerimientos nutricionales del cultivo (Abdel-Raouf, 2012) (FG Acién, 2012). 23.

(35) Capítulo 1: Marco Teórico pudiendo alcanzar una concentración celular hasta 0,7 g/L (Contreras-Flores C, 2003) y productividades por hectárea de hasta 50 t/año (Rawat, 2011) (Hernández-Pérez, 2014). Como desventajas de este sistema se encuentra la baja accesibilidad de las células a la luz, la evaporación, la necesidad de grandes extensiones de terreno y exposición a contaminación por parte de organismos heterótrofos de rápido crecimiento y/o plancton pastoreador (Contreras-Flores C, 2003) (Martínez, 2008) (Posten, 2009) (Park, 2011b) (Rawat, 2011). El control de la temperatura es también complejo en un sistema de cultivo abierto, ya que si bien es verdad que la evaporación ejerce efecto de refrigeración, las oscilaciones diarias no se ven amortiguadas, y por otro lado la evaporación provoca cambios en la composición iónica del medio de cultivo (Ruiz Martínez, 2011). En estos sistemas se encuentra en primera medida el cultivo extensivo, en el cual se usan grandes extensiones de terreno, sin agitación mecánica, con una cierta orientación tal que la turbulencia ocasionada por los vientos de la zona permita la homogenización y movimiento de la masa líquida empleada. El control del medio es mínimo debido a la magnitud del mismo y se tienden a manejar salinidades altas para disminuir el ataque de depredadores sobre la microalga. Además puede funcionar de manera continua o semicontinua, donde el suministro de CO2 es directo regulado por un controlador de pH y una válvula de tipo solenoide en la mayoría de los casos. Luego, está el cultivo intensivo, el sistema más empleado hoy, en donde se controlan todas las variables de crecimiento celular, se utiliza estanques horizontales de poca profundidad, utilizando como sistema de agitación una rueda de paletas a baja velocidad (Alvear, 2011). Existen diferentes tipos de sistemas de cultivos abiertos como las lagunas o estanques naturales (Tredici, 2004) (Lores H., 2015), los sistemas inclinados (Lores H., 2015), los estanques circulares (Tredici, 2004) (Lores H., 2015), así como los estanques raceways (Bermeo Castillo L.E., 2011). (Figura 1.6) (Anexo 2 A). 24.

(36) Capítulo 1: Marco Teórico. Figura 1.6: Principales tipos de sistemas abiertos. Fuente: (López González, 2016).. 1.6.2 Sistemas de cultivo cerrados. Las dificultades en los sistemas de cultivo abiertos han favorecido el desarrollo de los sistemas de cultivo cerrados (Borowitzka, 1999) (Contreras-Flores C, 2003) (Martínez, 2008) (Posten, 2009). Éstos permiten un importante control de los parámetros, disminuyendo sustancialmente los problemas presentes en los sistemas abiertos (Martínez, 2008) (Posten, 2009). Además, permiten realizar cultivos hiperconcentrados, ya sean mixtos o monoalgales, con valores superiores a 1,5 g/L (Lavoie, 1985) (Abdel-Raouf, 2012) pudiendo obtener Alta Densidad Celular (ADC) por sobre 3 g/L o Ultra Alta Densidad Celular (UADC) entre 15 a 80 g/L (Contreras-Flores C, 2003) (HernándezPérez, 2014). Para este tipo de sistemas la luz no incide directamente sobre la superficie del cultivo, pero tiene que pasar a través de las paredes transparentes del reactor para llegar a las células cultivadas. Estos sistemas no permiten o limitan el fuerte intercambio de gases y contaminantes (polvo, microorganismos, hongos, etc), ofrecen protección contra la lluvia, lo que los hace ideales para la mayoría de especies de microalgas que no se pueden. 25.

(37) Capítulo 1: Marco Teórico mantener expuestas por demasiado tiempo al aire libre porque sufren el riesgo de ser dominados por otras especies (Bermeo Castillo, 2011). Los sistemas cerrados presentan múltiples ventajas frente a los reactores abiertos como un uso más eficiente de la irradiancia, que conduce a la producción de cultivos más concentrados, la posibilidad de cultivar todo el año, una disminución de las pérdidas por evaporación, un mejor control de algunas variables como la temperatura y mayor facilidad de operación en continuo (Tredici, 1992) (Borowitzka, 1999) (Grobbelaar, 2009) (García, 2011). Existen diferentes tipos de fotobiorreactores (figura 1.7) como el carrusel (A, vista superior, los bloques negros indican propelas), el plano (B, vista horizontal), con iluminación interna (C, los bloques blancos indican espacios de iluminación), tipo serpentín (D) y el tubular horizontal con sistema airlift (E).. Figura 1.7: Tipos básicos de fotobioreactores. Fuente: (Contreras-Flores C, 2003). Tomado de (Alvear, 2011).. Una manera de evitar algunas de las principales desventajas del uso de las lagunas abiertas y de los fotobiorreactores, es optar por un cultivo que integra ambos sistemas, el sistema de cultivo híbrido (Schenk, 2008) (Bermeo Castillo L.E., 2011). De forma general, se pueden comparar estos sistemas de acuerdo a las ventajas y desventajas que los mismos presentan, tal y como se resumen en la tabla 1.6.. 26.

(38) Capítulo 1: Marco Teórico Tabla 1.6: Comparación de sistemas de cultivo. Tipo de bioreactor. Ventajas. Desventajas. Raceways, Open ponds. Contracción fácil y barata. Fácil manejo y operación.. Pobre utilización de la luz Dificultad en control de la luz y Temperat. Evaporación Contaminación Baja producción. Fotobioreactores. Menor contaminación. Mejor uso de la luz, agua y CO2. Mejor mezcla Mayor control del cultivo. Mayor producción.. Costos elevados Acumulación de O2 Biofouling Daños y estrés celular Deterioro de material. 1.7 Vinazas como medio de cultivo para microalgas. Las vinazas como residual de la producción de alcohol, han constituido desde hace tiempo un grave problema debido a su elevado poder de contaminación, ocasionado principalmente por su gran contenido orgánico. Por ello, todos los enfoques que se han dado al problema de la vinaza buscan eliminar o atenuar los efectos de la polución sobre los ríos, donde tradicionalmente estos derivados han sido descargados. (Chaves-Solera, 1985). Las vinazas contienen un gran contenido de materias orgánicas y nutrientes como, nitrógeno, azufre, fósforo y una gran cantidad de potasio. Entre los compuestos orgánicos más importantes están los alcoholes, ácidos orgánicos y aldehídos. Además contiene compuestos fenólicos recalcitrantes, como las melanoidinas que son ácidas de un pH entre 3 y 4 (Morales-Trujillo, 2011). Su composición depende de las características de la materia prima usada en la producción de alcohol, del sustrato empleado en la fermentación, del tipo y eficiencia de la fermentación y destilación. De manera general los constituyentes son (García A., 2008): . Sustancias inorgánicas solubles en las cuales predominan los iones K, Ca y SO4.. . Células muertas de levadura.. . Sustancias orgánicas volátiles, insolubles o resultantes de los procesos metabólicos. de levaduras y microorganismos contaminantes.. 27.

(39) Capítulo 1: Marco Teórico . Alcohol y azúcar residual.. Algunos de estos compuestos son difíciles de degradar biológicamente y poseen propiedades antimicrobianas y fitotóxicas que impiden el tratamiento eficiente por degradación microbiológica, especialmente aerobia. Estas aguas residuales cuentan con una concentración rica de nutrientes que permiten el desarrollo de las microalgas que requieren nitrógeno y fósforo para su crecimiento. El cultivo de las mismas en aguas residuales tiene dos objetivos: proveer de nutrientes a las microalgas para su desarrollo y reducir la carga de nutrientes en las mismas (tratamiento terciario). Esto se puede lograr gracias a la capacidad depuradora de las mismas conocida como ficorremediación (Prasanna, 2013; Rawat, 2011; Park J, 2011a) definida como el uso de macroalgas y/o microalgas para la eliminación o biotransformación de contaminantes, desde aguas residuales y desde un medio gaseoso (Hernández-Pérez, 2014; Maity JP, 2014; Infante C, 2012; Abdel-Raouf, 2012; SK Prajapati, 2013) (Hongyang S, 2011; González-López CV, 2011; León, 2010; Doušková I, 2010) (Dominic VJ, 2009; Olguín EJ., 2003).. Conclusiones Parciales: 1. La capacidad de las microalgas de crecer en diferentes hábitats y condiciones del medio permite que puedan ser empleadas en la remoción de compuestos presentes en corrientes residuales. 2. Las Cryptophytas pueden vivir en condiciones medioambientales extremas, como escacez de luz y en distintos pH, es por eso que se pueden considerar para crecerlas en vinazas como medio de cultivo. 3. Las vinazas se caracterizan por ser un residual rico en nutrientes que puede ser aprovechado para el crecimiento de microalgas como las Cryptophytas.. 28.

(40) Capítulo 2: Desarrollo Experimental Capítulo II: Desarrollo Experimental. 2.1 Procedimiento experimental. La presente investigación tiene como materias primas principales las vinazas residuales del proceso de destilación de alcohol y el inóculo de microalgas. Para su desarrollo experimental se consideran tres etapas fundamentales: la preparación del medio de cultivo, la etapa de crecimiento celular y por último, la separación de la biomasa obtenida. En la preparación del medio de cultivo se analizan como variables la concentración de vinaza y el pH del medio, en la segunda etapa se determinan parámetros que indican el crecimiento celular en función del tiempo transcurrido, finalmente la efectividad del proceso se determina a través de la biomasa producida y la remoción de los principales componentes presentes en las vinazas. El procedimiento se describe en la figura 2.1.. Figura 2.1. Diagrama para el cultivo de microalgas en vinazas.. En este estudio se emplea como medio de cultivo para el crecimiento de microalgas, la vinaza primaria proveniente de la UEB "Derivados Heriberto Duquesne", perteneciente al municipio de Remedios, en la provincia de Villa Clara. La misma tiene como características físicas principales las presentes en la tabla 2.1.. 29.

(41) Capítulo 2: Desarrollo Experimental Tabla 2.1. Propiedades medidas a la vinaza de Heriberto Duquesne. Parámetros medidos 0. Valores 3. ρvinaza(15 C). 0,890 (g/cm ). Absorbancia a 680 nm. 2, 476 (A). pH. 4.00. DQO. 31919,60 mg/L. DBO5. 19 171,76 mg/L. Por otra parte, empleando un equipo de adsorción atómica SP9 Firma: PYE UNICAM se pudo determinar la presencia de diferentes minerales presentes en la misma, siendo los que se reportan en la tabla 2.2. Tabla 2.2. Minerales determinados a la vinaza. Minerales (% peso) Ca. Mg. Cu. Zn. Fe. K. Na. 7,06. 1,906. 0,01. 0,007. 1,506. 8,539. 0,259. 2.1.1 Identificación de la especie a cultivar. La muestra a utilizar fue recolectada en una laguna perteneciente al municipio de Caibarién, la misma se caracterizaba por ser de color verde y fue revisada por especialistas del Centro de Estudios Ambientales de Cienfuegos (CEAC) con el fin de identificar la especie de microalga presente. En la misma estaba presente una microalga flagelada perteneciente al las Crystophyceae, identificadas por tener células ovales y aplanadas.. 2.2 Desarrollo experimental. 2.2.1 Diseño experimental Plackett-Bürman En el estudio del proceso de cultivo de Cryptophytas en vinazas microalgas, se aplica un diseño factorial completo (Plackett and Bürman, 1946) el cual permite analizar variables reales que indiquen diferentes condiciones de trabajo, así como falsas variables que no son consideradas pero que puedan influir en el comportamiento de los experimentos. Además se aprovechan las bondades que brinda este tipo de diseño, pues permite minimizar las réplicas y gastos experimentales, siendo el recomendado en la literatura científica para estos casos (González, 2003).. 30.

(42) Capítulo 2: Desarrollo Experimental Se selecciona una matriz de diseño de Plackett-Bürman de ocho experimentos y siete variables, considerando solamente el efecto de cinco variables reales, (a saber: X1: concentración; X2: luz; X3: pH, X4 aireación y X5: tiempo), lo que permite utilizar dos falsas variables. La matriz ajustada a las variables reales y falsas consideradas en el desarrollo experimental es como se muestra en la tabla 2.3. Tabla 2.3. Matriz Experimental del Diseño de Plackett-Bürman (González; 2003).. N. X1. X2. X3. Xf1. X4. Xf2. X5. 1. +. +. +. -. +. -. -. 2. +. +. -. +. -. -. +. 3. +. -. +. -. -. +. +. 4. -. +. -. -. +. +. +. 5. +. -. -. +. +. +. -. 6. -. -. +. +. +. -. +. 7. -. +. +. +. -. +. -. 8. -. -. -. -. -. -. -. La matriz de diseño de Plackett–Bürman incluye en la selección de las tres primeras columnas para las variables reales un Plan Experimental de un Diseño Factorial 23, lo cual facilita que se desarrollen experimentos cuyos resultados puedan procesarse considerando dos tipos de diseños experimentales con una idea ya utilizada por (González et al., 1986). Los niveles de las variables reales consideradas se tomaron a partir de los mejores resultados reportados en la literatura (Castro Ruiz C.L., 2011; FERRERO, 2011): X1: Concentración de vinaza, para valores de 50% y 100%. X2: Luz, para ciclos de 12 / 12 h y de 24 h. X3: pH, para valores aproximadamente de 6 y 8. X4: Aireación, (Sí/No). X5: Tiempo de crecimiento para siete y diez días Los parámetros finales (Y) medidos fueron: Producción de biomasa seca en (mg), remoción de DQO y DBO5, remoción de minerales como el calcio (Ca) y el magnesio (Mg).. 31.