Herramientas genómicas de

Herramientas genómicas de Saccharomyces cerevisiae aplicadas a la mejora de procesos enológicosAna Vanessa Penacho

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA

UPTAG KanMX4

ORF LEVADURA S. cerevisiae

DOWNTAG

UPTAG

45SH KanMX4 DOWNTAG 45SH

SECUENCIA HOMÓLOGA

SECUENCIA HOMÓLOGA

SECUENCIA HOMÓLOGA

SECUENCIA HOMÓLOGA

PRODUCTO AMPLIFICADO

DNA CROMOSÓMICO

LEVADURA

DNA CROMOSÓMICO

LEVADURA

H

O I

P

PRIMER UT2

PRIMER DT1

PRIMER DT2 PRIMER UT1

PRIMER UT2

PRIMER DT1

PRIMER DT2 PRIMER UT1

Ana Vanessa Penacho Martín Tesis Doctoral - Madrid, 2012

fermentación. Por un lado, se ha planteado el análisis transcriptómico para comprender procesos que hasta ahora no habían sido estudiados por esta metodología, como el efecto fisiológico de la modificación genética en una cepa recombinante de levadura vínica, supersecretora de manoproteínas; o la adaptación fisiológica de las células de levadura a las condiciones de segunda fermentación durante la elaboración de vinos espumosos. Por otro lado, considerando que, a pesar de tratarse de una técnica a escala genómica, el análisis transcriptómico también tiene algunas limitaciones para la identificación de los genes relevantes para el proceso, se ha abordado el análisis sistémico de la adaptación de Saccharomyces cerevisiae al crecimiento en mosto, o al crecimiento a bajas temperaturas (propias de determinadas fermentaciones industriales), mediante la caracterización fenotípica de colecciones a escala genómica de mutantes de deleción de levaduras, tanto homozigotos como heterozigotos (HIP-HOP, HaploInsufficiency Profiling- Homozygous deletion Profiling).

Herramientas genómicas de

Saccharomyces cerevisiae

aplicadas a la mejora de procesos enológicos

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA APLICADA ÁREA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Herramientas genómicas de Saccharomyces cerevisiae aplicadas a la mejora de procesos enológicos

Memoria presentada por Ana Vanessa Penacho Martín

para optar al grado de

Doctor en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Trabajo realizado bajo la dirección de

Dr. Ramón González García y Dra. Eva María Valero Blanco Y la tutoría de

Dra. Mónica Rodríguez García-Risco

INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

D. RAMÓN GONZÁLEZ GARCÍA, DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS, PROFESOR DE INVESTIGACIÓN DEL INSTITUTO DE LAS CIENCIAS DE LA VID Y DEL VINO DEL C.S.I.C Y Dña.

EVA MARÍA VALERO BLANCO, DOCTORA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS, PROFESORA TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR E INGENIERÍA BIOQUÍMICA (ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA) DE LA UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE.

CERTIFICAN: Que la memoria titulada “Herramientas genómicas de Saccharomyces cerevisiae aplicadas a la mejora de procesos enológicos” que presenta Dña. Ana Vanessa Penacho Martín, para optar al grado de doctor, ha sido realizada en el I.M.I.D.R.A. y en el C.S.I.C., bajo nuestra supervisión.

Para dar cumplimiento a lo acordado por la Comisión de Doctorado de esta Universidad firmamos el presente certificado- autorización en Madrid a 21 de Noviembre de 2011.

Fdo.: Dr. Ramón González García Fdo.: Dra. Eva María Valero Blanco

A mi padre, a mi madre A Joe

"La ignorancia genera confianza más frecuentemente que el conocimiento. Son los que saben poco, y no los que saben más, quienes afirman tan positivamente que este o aquel problema nunca será resuelto por la ciencia."

Charles Robert Darwin (1809 - 1882)

i Agradezco al Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria la concesión de una beca predoctoral INIA (BOE núm. 208, 31/08/2006) que me ha permitido realizar la presente Tesis Doctoral. También quisiera mostrar mi gratitud a la dirección de los siguientes centros: Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA), Instituto de Fermentaciones Industriales (IFI), Unité Mixte de Recherche Sciences Pour l'Oenologie (UMR-SPO) e Instituto de las Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV), por permitirme disponer de sus instalaciones para el desarrollo de este trabajo.

Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento y respeto a los directores de esta Tesis, el Dr. Ramón González García y la Dra. Eva María Valero Blanco, por el interés, el tiempo dedicado y la paciencia mostrada en todo momento. Gracias Ramón por tu trato y sencillez, por todo lo que me has enseñado, por velar por mí y mi trabajo en cualquier momento. Gracias Eva por brindarme la oportunidad de comenzar mi formación predoctoral y dirigirme en la distancia, sin tu labor esto no habría sido posible. Ha sido un verdadero placer haber concluido esta Tesis bajo vuestra supervisión y me siento muy afortunada por ello.

A mis compañeros del IMIDRA. A la Dra. Teresa Arroyo Casado por su ayuda incondicional prestada. A Tania Balboa Lagunero, muy especialmente, por iniciar este camino conmigo, por todos los momentos que hemos vivido y lo que hemos aprendido juntas. Al Dr. Gustavo Cordero Bueso, por su alegría y su eterna sonrisa hacia mí.

A mis compañeros del IFI. Al Dr. Alfonso Carrascosa Santiago, la Dra. Rosario Muñóz Moreno, el Dr. José María Barcenilla Moraleda y María Victoria Santamaría Barceló por el apoyo y la colaboración brindada. A toda la pandilla del laboratorio 212: Ángela, Blanca, Chema, Cris, Dani, Edu, José, Gemita, Gerar, Inés, Laura, Mónica, Patri, Pitu, Pura y Wila por cómo hicisteis del día a día un motivo más para querer seguir investigando.

ii

À tous ceux et celles qui ont partagé mon experience française.

Spécialement, au Dr. Bruno Blondin, le maître de mon travail expérimental développé pendant mon séjour à Montpellier. À mes compagnons espagnols adoptés en France: Juanjo, Maite, Rafa

“apolíneo” et Zoel, en raison de son aide avec les échantillonnages nocturnes, tant de "vins synthétiques" comme des "vins naturels". À mes compagnons français: Axelle, Brigitte, Chloé, Christian, Emmanuelle, Isabelle, Jessica, Maeva, Magali, Pierre et Virginie, pour faciliter mon intégration au laboratoire.

A mis compañeros y amigos del ICVV por acompañarme en mi última experiencia predoctoral en La Maravillosa Rioja: Ana, Bea, Cris, Hasna, Javier, Jéromê, José Miguel, José, Jytte, Laura, Lucie, Maite, Manolo, Marc, María, Marie, Marisa, Mercedes, Miguel Ángel, Mike, Nachi, Nieves, Pilar, Rubén, Sara, Silvia, Vava y Zoel.

Por supuesto a mis padres, por enseñarme a ser quien soy y darme más de lo que puedo pedir; a mi padre por su confianza en mí, mostrándome los pasos a seguir, y a mi madre por su eterno cariño, sus cuidados y su paciencia.

A Joe, mi rumbo, mi sentido y mi orientación, por mil cosas, pero fundamentalmente por la alegría que me aporta día a día con cada uno de sus gestos. Si esta Tesis ha llegado a su fin es gracias a ti.

A mis íntimos amigos, por confiar en mí, por estar allí desde siempre en mis buenos y malos momentos. A Helena, mi más preciada y querida amiga, y a mi cuadrilla de “amiguitos del metal”: Alba, Anabel, Chicho, Cris, Fer, Gato, Irene, Miguel, Lolo, Luis, Marcos, María, Quique, Roci, Silvia y Tanya. Todos vosotros, tan ajenos a la ciencia, pero tan cerca de mí.

A todos los que me han acompañado durante este largo camino, que aquí acaba.

Í Í Í N N N D D D I IC I C CE E E

3

I. ABREVIATURAS...9

II. RESUMEN...15

III. PLANTEAMIENTO DE TESIS...19

1. PROYECTOSDELATESIS...21

2. OBJETIVOSDELATESIS...22

3. PRODUCCIÓNCIENTÍFICADELATESIS...24

IV INTRODUCCIÓN...25

1. LAPRODUCCIÓNDELVINO...27

1.1. Aspectos generales de la Viticultura...27

1.2. Tecnología de la vinificación...28

1.2.1. Procesos pre-fermentativos...29

1.2.1.1. Despalillado y estrujado...29

1.2.1.2. Técnicas de maceración...30

1.2.1.3. Prensado...30

1.2.1.4. Sulfitado. Control de la oxidación...31

1.2.1.5. Desfangado...32

1.2.2. Enzimas empleadas en vinificación...32

1.2.3. Microbiota de la fermentación alcohólica...33

1.2.3.1. Características generales de S. cerevisiae...34

1.2.4. Selección de cepas de levadura...36

1.2.5. Control de la fermentación alcohólica...37

1.2.6. Fermentación maloláctica...38

1.2.7. Procesos post-fermentativos...38

1.2.7.1. Trasiego...39

1.2.7.2. Estabilización del bitartrato potásico...39

1.2.7.3. Estabilización de la turbidez proteica...39

1.2.7.4. Filtración...40

1.2.8. Crianza...41

4

1.2.9. Elaboración de los vinos espumosos...42

1.2.9.1. Origen y métodos de elaboración...42

1.2.9.2. Toma de espuma...44

2. LA PARED CELULAR DE LAS LEVADURAS...47

2.1. Composición y organización molecular de la...47

pared celular 2.1.1. β-1,3-glucano...48

2.1.2. β-1,6-glucano...50

2.1.3. Quitina...50

2.1.4. Manoproteínas...51

2.1.4.1. Importancia de las manoproteínas en...53

Enología 2.2. Integridad de la pared celular...55

3. LA RESPUESTA AL ESTRÉS EN S. cerevisiae...59

3.1. Respuesta al estrés térmico...60

3.1.1. Respuesta al estrés por bajas...61

temperaturas 3.2. Respuesta a estrés oxidativo...62

3.3. Respuesta a estrés osmótico...63

3.4. Respuesta a estrés por etanol...64

4. AVANCES EN GENÓMICA DE LEVADURAS...66

4.1. Evolución de las herramientas de estudio...66

fermentación del mosto de uva por S. cerevisiae 4.2. Estrategia HIP-HOP. Nuevo abordaje en...69

Genómica Funcional V. MATERIALES Y MÉTODOS ...75

1. MATERIALES...77

1.1. Microorganismos utilizados...77

1.1.1. Cepas de levadura...77

1.2. Cebadores...78

5

1.3 Microarrays de DNA...80

1.3.1. Microarrays de dos canales...80

1.3.2. Microarrays de un canal...80

2. MÉTODOS...81

2.1. Medios de cultivo .. 83

2.2. Experimentos de fermentación, ensayos...88

fenotípicos de crecimiento y de sensibilidad a estrés 2.2.1. Monitorización y control de la fermentación...88

2.2.2. Envejecimiento sobre lías...89

2.2.3. Floculación inducida por calcio...90

2.2.4. Crecimiento en fuentes de carbono no...91

fermentables y tolerancia a los factores de estrés 2.2.5. Experimentos de segunda fermentación...92

2.2.6. Floculación espontánea durante la segunda...93

fermentación 2.2.7. Estudio fenotípico individual de colecciones...95

de cepas de deleción de S. cerevisiae en mosto modelo y en frío (13 ºC) 2.2.8. Estudio de la sensibilidad de mutantes...997

deficientes en el crecimiento en ausencia de aminoácidos a diversos factores de estrés 2.3. Métodos de manipulación y análisis de ácidos...98

nucleicos 2.3.1. Tratamiento de material para la eliminación...98

de RNasas 2.3.2. Aislamiento de RNA...99

2.3.2.1. Recuento y conservación de células...99

2.3.2.2. Extracción y purificación de RNA total...99

2.3.2.3. Tratamiento con DNasas de RNA purificado...101

2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)...101

en tiempo real 2.5. Separación de RNA por electroforesis en geles...102

6

de agarosa

2.6. Transcripción inversa, marcaje y purificación...103

2.6.1. Síntesis de cDNA y marcaje en microarrays...103

de dos canales 2.6.2. Síntesis de cDNA y marcaje en microarrays...103

de un canal 2.7. Hibridación, escaneo y análisis de la expresión...104

génica diferencial mediante microarrays de DNA 2.7.1. Análisis de microarrays de dos canales...104

2.7.2. Análisis de microarrays de un canal...105

2.8. Análisis genómico funcional...106

2.9. Determinación de metabolitos...108

2.9.1. Cuantificación de glucosa, fructosa,...108

glicerol y etanol 2.9.2. Cuantificación de manoproteínas...109

2.9.3. Cuantificación de aminoácidos libres...110

2.10. Análisis estadístico de los datos...110

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...113

CAPÍTULO1. ESTUDIOTRANSCRIPTÓMICODELASEGUNDA...115

FERMENTACIÓNDECEPASINDUSTRIALESDE S. cerevisiae 1. ANTECEDENTES...117

2. RESULTADOSYDISCUSIÓN...118

2.1. Cinética de la segunda fermentación...118

2.2. Estudio transcriptómico de la segunda...121

fermentación 2.2.1. Efecto del etanol... 123

2.2.1.1. Expresión de genes de función...123

mitocondrial, respiración aeróbica y metabolismo oxidativo 2.2.1.2. Expresión de genes del peroxisoma...125

2.2.1.3. Expresión de genes de autofagia...126

7

2.2.2. Efecto de otros factores ambientales... 132

2.2.3. Comparación con perfiles... 138

transcriptómicos durante la primera fermentación 3. CONCLUSIONES... 148

CAPÍTULO 2. CARACTERIZACIÓN DE CEPAS RECOMBINANTES...149

DE S. cerevisiae SUPERPRODUCTORAS DE MANOPROTEÍNAS 1. ANTECEDENTES... 151

2. RESULTADOS... 152

2.1. Envejecimiento sobre lías... 152

2.2. Expresión génica durante la fermentación.. 156

2.3. Fenotipo de floculación... 165

2.4. Otros fenotipos relacionados con cambios.. 166

en el perfil transcripcional 3. DISCUSIÓN ... 167

3.1. Expresión de genes relacionados con la... 167

superficie celular 3.2. Liberación de manoproteínas y autolisis... 171

3.3. Floculación ... 172

3.4. Genes relacionados con el metabolismo... 173

oxidativo 4. CONCLUSIONES... 174

CAPÍTULO 3. ESTUDIO FENOTÍPICO DE COLECCIONES...177

DE CEPAS DE DELECIÓN DE S. cerevisiae 1. ANTECEDENTES... 179

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN... 181

2.1. Estudio fenotípico individual de colecciones ..181

de cepas de deleción de S. cerevisiae en mosto modelo 2.1.1. Deficiencia de crecimiento en mosto... 181

8

modelo-amonio

2.1.2. Efecto de la fuente de nitrógeno... 182

en el crecimiento de mutantes defectivos en mosto modelo-amonio 2.1.3. Características de los genes necesarios... 193

para el buen crecimiento en mosto sintético 2.1.4. Genes necesarios para el crecimiento... 196

con amonio como única fuente de nitrógeno 2.2. Estudio fenotípico individual de la colección ....206

heterozigota de cepas deleción de de S. cerevisiae en frío (13 ºC) 3. CONCLUSIONES... 212

VII. CONCLUSIONES GENERALES ...215

VIII. LISTADO DE FIGURAS, TABLAS Y ANEXOS...219

IX. BIBLIOGRAFÍA...231

A AB A B B R R R E E E V V V I I I A AT A T T U U U R RA R A AS S S

11

®, TM Trademark (marca registrada)

% Porcentaje

º Grados

º C Grados centígrados

∆ Símbolo de deleción génica

< Menor que

> Mayor que

 Más-menos

A Adenina a.C. Antes de Cristo ATP Adenosín trifosfato ATPasa Adenosín trifosfatasa C Carbono

Ca²⁺ Catión calcio

CaCl₂ Dicloruro cálcico

cAMP Adenosín monofosfato cíclico

CO₂ Dióxido de carbono

CoCl₂·6H₂0 Cloruro de cobalto hexahidratado cRNA RNA complementario

Ct Valor de ciclo umbral (cycle threshold) en RT-qPCR CuSO4·5H2O Sulfato de cobre (II) pentahidratado

Cy3 Fluoróforo cianina 3 Cy5 Fluoróforo cianina 5

D.O. Densidad óptica

DEPC DiEtilPiroCarbonato

DNA Ácido desoxirribonucleico

ECR Early Cold Response

EDTA Ácido etilén diamino tetracético

ESR Environmental Stress Response

FDR False Discovery Rate

Fold change Cambio en el nivel de expresión génica

FSR Fermentation Stress Response

FunCat MIPS Functional Catalogue FuncSpec Functional Specification

12

G Guanina

g Gramos

g/L Gramos/litro

g/mL Gramos/mililitro

G₁ Fase GAP 1/growth (Intervalo 1)

G₂ Fase GAP 2/growth (Intervalo 2)

G418 Geneticina

GEF Guanoside Nucleotide Exchange Factor

GO The Gene Ontology Project

GPI GlicosiFosfatidilInositol

GTP Guanosín trifosfato

h Hora

H₂O Agua

H₂O₂ Peróxido de hidrógeno

H3BO3 Ácido ortobórico

HCl Ácido clorhídrico

HI Yoduro de hidrógeno

HIP HaploInsufficiency Profiling HOG High Osmolarity Glicerol Response

HOP HOmozygous deletion Profiling

HPLC High-Performance Liquid Chromatography

HSE Heat Shock Element

HSF Heat Shock Factor

K₂SO₄ Sulfato potásico

KCal Kilocalorías

KH₂PO₄ Fosfato monopotásico

KI Yoduro potásico

KOH Hidróxido potásico

L Litros

LCR Late Cold Response

Leu Leucina

Log₂ Logaritmo en base 2

Lys Lisina

M Molaridad (moles/litro). Fase de mitosis

13 MAPK Mitogen Activated Protein Kinase

MATa Mating-type a (tipo sexual a) MAT Mating-type  (tipo sexual )

Met Metionina

mg/L Miligramos/litro

mgmL Miligramos/mililitro

Mg²⁺ Catión magnesio

MgSO₄·7H₂O Sulfato de magnesio heptahidratado

MIPS Munich Information Center for Protein Sequences

mL Mililitros

mL/L Mililitros/litro

mm Milímetros

mM Milimolar (milimoles/litro)

MnSO₄·H₂O Sulfato de manganeso monohidratado

mRNA RNA mensajero

N Nitrógeno. Normalidad (equivalentes-gramo/litro)

NAC N-acetil-L-cisteína

NaCl Cloruro sódico

NaMoO₄·2H₂O Molibdato de sodio dihidratado

NaOH Hidóxido sódico

(NH4)6Mo7O24·4H20 Molibdato de amonio tetrahidratado nm Nanómetros

NTU Nefelometric Turbidity Units

O Oxígeno

O₂^- Anión superóxido

OH^- Radical hidroxilo

OMG Organismo modificado genéticamente

OPA Oftaldialdehido

ORF Open Reading Frame (marco abierto de lectura) p-valor Valor de probabilidad

p/v Relación peso/volumen

pb Pares de bases

PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)

14

Pir Protein with Internal Repeats pmol/µL Picomoles/microlitro

rDNasa I Desoxirribonucleasa I recombinante

RNA Ácido ribonucleico

RNasa Ribonucleasa

ROS Reactive Oxygen Species

rpm Revoluciones por minuto

rRNA 18 S RNA ribosomal 18 S (subunidad pequeña) rRNA 25 S RNA ribosomal 25 S (subunidad grande)

RT-qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

S Fase de síntesis

SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAM Significance Analysis of Microarrays

SGD Saccharomyces Genome Database

STRE Stress Responsive Element

T Timina

tRNA RNA de transferencia

UDP Uridina difosfato

UFC/g Unidades formadoras de colonias/gramo

URA Uracilo

UTP Uridina trifosfato

UV Ultravioleta

V/cm Voltios/cm

v/v Relación volumen/volumen

Vol., vol. Volumen

Vs., vs. Versus

x g Unidad de RFC (Fuerza Centrífuga Relativa) X-fold Número de veces (nivel de expresión)

YKO Yeast Knock-Out strains

ZnSO4 Sulfato de zinc

L Microlitros

µm Micrómetros

R RE R E E S SU S U U M M M E E E N N N

17 La Biotecnología Enológica es un campo en constante evolución, tanto por el desarrollo de nuevas cepas de bacterias y levaduras de uso enológico, procedimientos de mejora de las cepas existentes, o herramientas enzimáticas para modular la composición final de los vinos; como por la incorporación de nuevos métodos de Biología Molecular que permiten avanzar en nuestra comprensión de la fisiología y la genética de los microorganismos de uso enológico. En este contexto, destaca en los últimos años la incorporación de la tecnología de microarrays de DNA para el análisis de la expresión génica (transcriptómica) de Saccharomyces cerevisiae a lo largo de la fermentación alcohólica. Los estudios de este tipo han permitido tener actualmente una imagen bastante completa de los procesos que son importantes en la célula de levadura para su adaptación a las diferentes fases del proceso, complementando numerosos conocimientos previos obtenidos mediante estudios fisiológicos o genéticos convencionales (no a escala genómica).

En esta Tesis Doctoral, se ha planteado la aplicación de metodologías a escala genómica para mejorar nuestra comprensión sobre procesos enológicos de fermentación. Por un lado, se ha planteado el análisis transcriptómico para comprender procesos que hasta ahora no habían sido estudiados por esta metodología, como el efecto fisiológico de la modificación genética en una cepa recombinante; o la adaptación de las levaduras a las condiciones de segunda fermentación durante la elaboración de vinos espumosos. Por otro lado, considerando que el análisis transcriptómico también tiene algunas limitaciones para la identificación de los genes relevantes para el proceso, ya que sólo se detectarán aquellos que presenten un nivel de expresión diferencial, se ha abordado el análisis sistémico de la adaptación de S. cerevisiae al crecimiento en mosto y al crecimiento a bajas temperaturas (propias de determinadas fermentaciones enológicas industriales), mediante la caracterización fenotípica de colecciones a escala genómica de mutantes de deleción de levadura (tanto homozigotos como heterozigotos).

18

Dado que, como se puede apreciar, esta Tesis Doctoral aborda cuestiones relevantes para diversos tipos de fermentaciones enológicas (convencional, espumosos, frío, fermentación con cepas recombinantes), y diversas metodologías de escala genómica (transcriptómica, fenotipado de colecciones de mutantes de deleción de S. cerevisiae), en la introducción se describen aspectos diversos que se han considerado necesarios para facilitar al lector la comprensión de los diferentes capítulos y apartados que comprenden la Tesis.

P P P L L L A AN A N N T T T E EA E A AM M M I I I E E E N NT N T TO O O D D D E E E T T T E E E S SI S I I S S S

21 1. PROYECTOS DE LA TESIS

Esta Tesis doctoral se ha realizado gracias al desarrollo de una beca de formación del personal investigador del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (BOE núm. 208, 31/08/2006) en el período comprendido entre los años 2007-2011, y está basada en los resultados obtenidos en los siguientes proyectos de investigación:

 RTA2005-00169-00-00 “Genómica funcional aplicada a la mejora del proceso de toma de espuma en la elaboración de vinos espumosos por el método tradicional”.

 HF2006-0066 “Genómica funcional aplicada a la mejora del proceso de toma de espuma en la elaboración de vinos espumosos por el método tradicional”. Acción integrada con Francia.

 AGL2006-02558 “Desarrollo de nuevos métodos de obtención de manoproteínas de Saccharomyces cerevisiae para vinificación”.

 AGL2009-07327 “Identificación de genes relevantes implicados en la adaptación diferencial de levaduras enológicas a las diferentes etapas de la fermentación mediante nuevas aproximaciones de genómica funcional”.

La labor experimental se desarolló en los siguientes centros de investigación durante los citados períodos de tiempo.

- Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (Madrid, España). Período de beca predoctoral: Enero de 2007-Marzo de 2009.

- Instituto de Fermentaciones Industriales (Consejo Superior de Investigaciones Científicas). Actualmente, este centro

22

forma parte del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (Madrid, España). Contrato predoctoral de investigador en formación: Marzo de 2009-Enero de 2011.

- Unité Mixte de Recherche Sciences Pour l'Oenologie.

Institute National de la Recherche Agronomique (Montpellier, Francia). Estancia de doctorado: Octubre-Noviembre de 2008, Marzo-Julio de 2009.

- Instituto de las Ciencias de la Vid y del Vino. Complejo Científico Tecnológico de la Universidad de La Rioja- Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Logroño, España). Estancia de doctorado: Septiembre de 2009-Enero de 2011. Contrato de técnico de investigación (Universidad de La Rioja): Febrero de 2011-Abril de 2011.

2. OBJETIVOS DE LA TESIS

En esta Tesis se propusieron los siguientes objetivos fundamentales:

1.- Caracterización tecnológica de la cepa recombinante de S. cerevisiae EKD-13, superproductora de manoproteínas.

1.1.- Estudio de la cinética de liberación de manoproteínas y el proceso de autolisis durante la fermentación alcohólica y el envejecimiento sobre lías.

1.2.- Estudio de la floculación inducida por calcio en mosto modelo. Estudio de la floculación espontánea durante la segunda fermentación en vino base comercial.

1.3.- Crecimiento en fuentes de carbono no fermentables y estudio de la tolerancia a los factores de estrés osmótico y oxidativo.

23 1.4.- Análisis de la expresión génica durante el proceso fermentativo para conocer el efecto de la deleción de KNR4 en el metabolismo de la pared celular y la regulación del ciclo celular, e identificación de fenotipos de interés tecnológico.

2.- Estudio de la expresión génica de la cepa industrial de S. cerevisiae EC1118 durante la segunda fermentación de vinos espumosos.

2.1.- Seguimiento de la cinética de segunda fermentación en vino base comercial.

2.2.- Análisis del perfil transcripcional bajo condiciones reales de segunda fermentación con el objetivo de comprender la acción de los principales factores que afectan la fisiología de las levaduras durante la misma. Identificación de similitudes y diferencias con la adaptación transcripcional a las condiciones estándar de vinificación.

3.- Análisis HIP-HOP de colecciones de cepas de deleción de S. cerevisiae. Identificación de genes cuya deleción confiera haploinsuficiencia/haploeficiencia en heterozigosis, o ventajas/desventajas selectivas en homozigosis, durante la fermentación alcohólica.

3.1.- Estudio fenotípico individual de dos colecciones de mutantes de la cepa S. cerevisiae BY4743: colección diploide heterozigota y homozigota en mosto modelo y en frío (13 ºC).

3.2.- Estudio de la sensibilidad de mutantes deficientes en el crecimiento en ausencia de aminoácidos a diversos

24

factores de estrés: acidez (pH 3.0), calor (37 ºC), estrés osmótico (sorbitol 1 M) y etanol (6 %).

3. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DE LA TESIS

Esta sección pretende mostrar una recopilación ordenada de la producción científica de estos años de experimentación, quedando recogida en las siguientes publicaciones:

 Penacho, V., Valero, E., Gonzalez, R. Transcription profiling of sparkling wine second fermentation. International Journal of

Food Microbiology. In Press. Accepted.

doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.11.005.

 Penacho, V., Blondin, B., Valero, E., Gonzalez, R.

Flocculation and transcriptional adaptation to anaerobiosis are enhanced in a recombinant wine yeast strain defective for KNR4/SMI1. Biotechnological progress. Applied Cellular Physiology and Metabolic Engineering. Accepted.

DOI: 10.1002/btpr.734.

 Penacho, V., Salvado, Z., Gonzalez, R., Valero, E., Novo, M.

Identification of individual stress factors in winemaking by chemogenomic profilling. Esta parte experimental ha dado lugar a dos artículos, actualmente en realización.

Cabe destacar que este trabajo también ha dado lugar a numerosos pósters (4) y comunicaciones orales (2) en congresos tanto nacionales como internacionales, así como presentaciones en simposios (1) y cursos de especialización metodológica (1).

I IN I N NT T T R R R O O O D D D U U U C C C C C C I I I Ó Ó Ó N N N

27 1. LA PRODUCCIÓN DEL VINO

1.1. Aspectos generales de la Viticultura

La vid (Vitis vinifera L.), comúnmente empleada en la elaboración del vino, procede de Asia menor, de las regiones cercanas al Mar Negro y al Mar Caspio (Winkler et al., 1974). Es una planta que demanda calor y es sensible a las heladas tanto invernales como primaverales, lo cual condiciona no sólo su desarrollo vegetativo, sino la maduración de sus frutos, que requieren luz y temperaturas apropiadas. Se ubica dentro de los frutales con mayor tradición e historia en el mundo, siendo cultivada entre 50° latitud Norte y 45° Sur. La superficie de viñedos en el mundo representa alrededor de 7.9 millones de hectáreas. Cada hemisferio se subdivide en cuatro bandas climáticas: tropical, sub-tropical, templada y fría. Según estas subdivisiones, el 70.5% de la superficie dedicada a la Viticultura está situada en la zona templada y el 20.3% está en la zona fría; sólo el 6.3% del total está cultivado en las zonas tropicales y subtropicales (Fregoni, 2007).

Las condiciones ambientales de un área geográfica determinada y la evolución en los gustos de los consumidores han sido los motores, y a la vez las herramientas, que han dirigido la selección de las distintas variedades de V. vinifera, y la distribución más o menos generalizada de los genotipos resultantes. Actualmente, se conocen más de 5000 variedades de V. vinifera y otras tantas de híbridos con otras especies de Vitis. La variedad de vid utilizada para la vinificación, influye en la composición y calidad del vino. La elección de la variedad de vid es crucial y depende de muchos factores, ya sean biológicos, climáticos o económicos. De hecho, la optimización de la calidad de la uva gracias a la gestión adecuada de las vendimias, ha sido uno de los principales objetivos de los viticultures. A este respecto, ha surgido un nuevo concepto de Viticultura durante la última década denominada Viiticultura de precisión, cuyo objetivo es diferenciar zonas de diferente calidad

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dentro de la misma parcela (Arnó et al., 2009; Bramley, 2001; Bramley y Lamb, 2003; Martínez-Casasnovas y Bordes, 2005).

La elección adecuada de la uva es clave para el éxito de la elaboración del vino. El principal factor biótico que afecta al crecimiento de la vid es el insecto del orden de los hemípteros Phylloxera vastatrix.

Este parásito de la vid es comúnmente conocido como Phylloxera, aunque actualmente su nombre científico aceptado es Dactylosphaera vitifoliae. La maduración de la uva es una fase decisiva para determinar el momento óptimo de vendimia (Coombe y McCarthy, 2000; Kanellis y Roubelakis- Angelakis, 1993); un elevado contenido de azúcares, un peso adecuado de los frutos, poca acidez, riqueza de color (debido a los pigmentos antociánicos) y aromas característicos, son los principales criterios a la hora de cosechar el fruto maduro (Boulton et al., 1998). Sin embargo, el grado de maduración apropiado depende del tipo de vino que se va a producir. Para determinar el momento óptimo de vendimia se lleva a cabo un muestreo aleatorio y representativo de las uvas del viñedo, con las que se determinan los índices de madurez. Una vez seleccionado dicho momento, se han de perseguir dos objetivos primarios a la hora de vendimiar: recolectar la mayor cantidad posible de frutos completos y sin daños, y transportarlos rápidamente a la bodega, en las condiciones idóneas.

1.2. Tecnología de la vinificación

La fermentación alcohólica es considerada la aplicación biotecnológica de microorganimos más antigua que se conoce (Samuel, 1996). Los primeros vestigios de la producción de vino aparecieron en un ánfora en el poblado neolítico de Hajji Firuz Tepe, en los montes Zagros (Irán), entre el 5.400 y el 5000 a.C. (Cavalieri et al., 2003, McGovern et al., 1986).

Las diferentes prácticas enológicas aplicadas a la producción del vino juegan un papel clave en la calidad del mismo. Entre otras, se

29 incluyen procedimientos mecánicos y químicos tales como el despalillado, el prensado, la clarificación y la filtración. Estas prácticas originan una modificación en la composición del mosto y del vino, influyendo claramente en sus propiedades organolépticas. A pesar de presentar propiedades muy distintas, los vinos blancos, tintos y rosados comparten algunos puntos en sus procesos de elaboración.

1.2.1. Procesos pre-fermentativos

1.2.1.1. Despalillado y estrujado

Para la obtención del mosto en la elaboración de vinos tintos y rosados, los racimos son separados de los raspones en un proceso denominado despalillado, el cual ocurre en la bodega y da lugar a la ruptura de los hollejos. Dependiendo del grado de maduración de los raspones, el viticultor ha de seleccionar la cantidad de éstos que deben ser incorporados a la fermentación. Cuando los raspones están inmaduros, pueden aportar notas vegetales y acentuar el amargor debido a los taninos; los cuales, usados correctamente, añaden complejidad a determinados vinos (Ferreira et al., 1995).

Asociado a este primer procedimiento mecánico, se lleva a cabo el estrujado que consiste en romper el hollejo de la uva, de manera que libere el zumo de la pulpa. Esta operación debe ser cuidadosa y enérgica a la vez, sin que se deshagan los hollejos o se trituren las pepitas, ya que esto aportaría al vino una mayor astringencia nada recomendable. Ambos procedimientos permiten el contacto del zumo liberado con la superficie interna del hollejo, lo que da lugar a un aumento de la extracción de sus compuestos, y con ello, de la concentración de polifenoles y de moléculas responsables del aroma del vino (Flanzy, 2003; Gómez-Míguez et al., 2007).

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1.2.1.2. Técnicas de maceración

La maceración en frío consiste en una conservación del mosto durante varios días a bajas temperaturas (10-15 ºC) en presencia de los hollejos, hasta que se extrae la suficiente cantidad de color. Esta técnica es fundamentalmente empleada en la producción de vinos blancos y rosados (Jackson, 2008). En los vinos tintos se utiliza para mejorar la extracción de pigmentos de los hollejos. Sin embargo, es importante resaltar que esta técnica sólo es efectiva en presencia de dióxido de azufre (Feuillat 1996; Heatherbell et al., 1996).

El enfriamiento por expansión brusca se emplea en vinos tintos para aumentar el contenido de polifenoles. Esta técnica consiste en un calentamiento rápido de las uvas a presión atmosférica (> 95 ºC), seguida de un fuerte vacío que causa una vaporización instantánea. Esta vaporización induce un aumento de la fragilidad de la pared celular y un enfriamiento de las uvas tratadas (Mountounet y Escudier, 2000), lo cual da lugar a una extracción rápida de los compuestos fenólicos, responsables de varias características sensoriales de los vinos tintos, tales como el color, la astringencia y la idoneidad para el envejecimiento. Estos compuestos están presentes en el mosto de uva, sin embargo, su contenido aumenta a lo largo de la fermentación debido a su mejor solubilidad en etanol.

1.2.1.3. Prensado

Las uvas blancas han de ser prensadas y separadas de los hollejos antes de la fermentación, mientras que las uvas tintas presentan un período de maceración adicional. Los sistemas de prensado son: continuos, horizontales, verticales, por prensas neumáticas, de platos, etc. Durante el prensado, frecuentemente, el mosto es fraccionado según los diferentes ciclos de prensado. La primera fracción, denominado “mosto flor” o

“mosto yema”, es más clara y presenta niveles menores de sólidos en

31 suspensión, contenido fenólico y compuestos del aroma. Las fracciones sucesivas contienen una cantidad mayor de estos compuestos y son más susceptibles a la oxidación por enzimas polifenol oxidasas, también poseen menos acidez (por un mayor contenido de potasio), y concentraciones superiores de polisacáridos y proteínas solubles. Las fracciones de mosto utilizadas dependerán del tipo de vino que se va a elaborar y la calidad del mismo (Jackson, 2008).

En la elaboración de vinos tintos, con el fin de que la extracción de compuestos fenólicos y pigmentos antociánicos fuese mayor, tradicionalmente se recurría al remontado, bazuqueo o inundación. Sin embargo, durante los últimos años se ha introducido en la bodega una nueva técnica más eficaz, el denominado délestage. Éste término procede del francés y se podría traducir al castellano como “deslastrado”, participio del verbo “deslastrar”, verbo que hace referencia a la acción o efecto de quitar lastre para ganar empuje y elevar los globos aerostáticos. La técnica del délestage procede de la Côte du Rhône, y en bodegas tradicionalmente productoras se conoce como rack and return; dicha técnica favorece la extracción de color y de compuestos fenólicos presentes en el sombrero que se forma durante la vinificación de vinos tintos (Ribéreau-Gayon et al., 2004; Sacchi et al., 2005; Zamora, 2003).

1.2.1.4. Sulfitado. Control de la oxidación

El control de la oxidación del mosto, originado por la dilución de oxígeno en el medio, es otro de los aspectos relevantes en la obtención de vinos de calidad. La presencia de dióxido de azufre, adicionado en las etapas iniciales del proceso de elaboración del vino (vendimia, recepción de la uva en bodega y prensado), es fundamental por sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes, que intervienen en la selección de los microorganismos que participan en las primeras fases de la fermentación.

Los niveles de sulfito empleados son tolerados por cepas vínicas de la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae, pero limitan o inhiben por

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completo el desarrollo de otros microorganismos presentes en el mosto natural. La persistencia de una especie concreta de microorganismo durante la fermentación depende además de otros factores como la composición de los mostos (disponibilidad de nutrientes), la temperatura de fermentación, o la microbiota competidora (Lambrechts y Pretorius, 2000).

1.2.1.5. Desfangado

Con el fin de favorecer la retención del carácter afrutado del mosto blanco o rosado y aumentar la calidad del producto final, se separan las materias sólidas en suspensión antes de llevarse a cabo su fermentación (Williams et al., 1978). De esta manera, se obtienen vinos con mayor cantidad de ésteres etílicos y menor contenido de alcoholes fusiles (Kechagia et al., 2008).

La combinación de las técnicas de filtración y centrifugación, aunque aceleran el proceso de clarificación, empobrecen el mosto de sustancias nutritivas tales como ácidos grasos y esteroles (Bertrand y Miele, 1984;

Delfini et al., 1993). La técnica de filtración por vacío tiende a eliminar compuestos sólidos en exceso, lo que se traduce en tiempos de fermentación más largos y una mayor acidez volátil (Ferrando et al., 1998). Con un desfangado estático de 10 a 24 h a una temperatura de 10 a 15 ºC se suele conseguir un buen nivel de clarificación. En algunos casos se utilizan coadyuvantes o temperaturas más bajas para favorecer dicha clarificación.

1.2.2. Enzimas empleadas en vinificación

Comúnmente se emplean enzimas de uso alimentario para mejorar la maceración, la filtración y la clarificación del mosto, la extracción de precursores del aroma así como de compuestos fenólicos responsables del

33 color de los vinos tintos, la liberación de compuestos del aroma de sus precursores glicosilados, y para alcanzar la estabilidad microbiológica (http://www.oiv.int/oiv/cms/index?lang=es). El Código Enológico Internacional permite el uso de enzimas en vinificación, incluyendo las fuentes aceptadas de producción (especialmente microorganismos), los sitios activos específicos, sus aplicaciones y las substancias condicionantes de la actividad enzimática (http://www.oiv.int/oiv/files/5 - Publications/5 - 1 Publications OIV/EN/5-1-12_Codex_2011_EN.pdf)

1.2.3. Microbiota de la fermentación alcohólica

La fermentación del mosto de uva comporta la biotransformación de los azúcares mayoritarios en alcohol y dióxido de carbono. Durante este complejo proceso bioquímico y ecológico tiene lugar el desarrollo secuencial de diferentes especies de microorganismos, marcadas por las características del mosto en cada momento, así como por la microbiota presente en el viñedo, en la uva y en la bodega. En general, las uvas maduras presentan poblaciones microbianas del orden de 10³-10⁵ UFC/g.

Estas poblaciones están principalmente compuestas por diferentes especies de levaduras, bacterias acidolácticas y hongos filamentosos (Fleet, 1999).

Las primeras etapas del proceso fermentativo están dominadas por cepas de levadura presentes durante la vendimia o en la bodega, correspondientes a los géneros Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Dekkera, Hanseniaspora y su forma imperfecta Kloeckera, Cryptococcus, Metschnikowia, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces y Zygosaccharomyces, globalmente conocidas como levaduras no-Saccharomyces (Heard y Fleet, 1985; Pretorius, 2000). Los niveles crecientes de etanol en combinación con la saturación de CO₂ y las condiciones anóxicas, provocan la muerte de la mayoría de las levaduras de estos géneros y su reemplazamiento por el género Saccharomyces, mejor adaptado a la toxicidad del etanol, la anaerobiosis y la presencia de

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sulfitos en el medio. S. cerevisiae es la única especie de la microbiota presente en el mosto capaz de finalizar la fermentación alcohólica.

1.2.3.1. Características generales de S. cerevisiae

Las levaduras son microorganismos eucariotas clasificados dentro del reino Fungi, y en la actualidad hay descritas aproximadamente 900 especies (http://www.cbs.knaw.nl/). Son organismos unicelulares que se multiplican por gemación o por escisión. De acuerdo con su desarrollo sexual, es decir, con el modo de formación de esporas, pueden clasificarse en Ascomicetes y Basidiomicetes. El género Saccharomyces pertenece a la subdivisión de los Ascomicetes, orden Endomicetales, familia Saccharomycetaceae. En 1970, van der Walt definió cuatro grupos dentro del mismo; uno de ellos engloba a levaduras próximas a la cepa tipo de S.

cerevisiae y se designa como Saccharomyces sensu stricto (Barnett et al., 1990). Este grupo incluyó 21 especies en el momento de su definición, sin embargo, posteriores estudios moleculares llevaron a proponer siete especies biológicas diferentes, S. bayanus, S. cariocanus, S. cerevisiae, S.

kudriavzevii, S. mikatae y S. paradoxus (Kurtzman, 2003; Wang y Bai, 2008), y la especie parcialmente alotetraploide S. pastorianus (Rainieri et al., 2006; Vaughan-Martini y Martini, 1998a).

S. cerevisiae se caracteriza por ser un organismo anaerobio facultativo, capaz de desarrollar un metabolismo oxidativo en presencia de oxígeno y fermentativo en su ausencia. Experimenta el fenómeno de represión catabólica mediante el cual, en presencia de glucosa o de algunos otros azúcares fermentables, se encuentran reprimidos, entre otros, los genes requeridos para la respiración. En medio rico en oxígeno el metabolismo de S. cerevisiae pasa por las siguientes fases; durante la fase exponencial del crecimiento, obtiene la energía procedente de la fermentación, utilizando la glucosa como principal fuente de carbono.

Cuando los azúcares se agotan, tiene lugar la desrepresión de los genes implicados en respiración y la célula sufre una adaptación hacia un

35 metabolismo respiratorio (denominada pausa diaúxica). Durante la fase post-diaúxica, las células de S. cerevisiae obtienen energía de la respiración multiplicándose a una velocidad menor que durante la fase exponencial. Una vez agotados los nutrientes, la célula deja de duplicarse y entra en fase estacionaria (Bitterman et al., 2003; Kurtzman y Fell, 1998).

Al igual que ocurre con otros Ascomicetes, S. cerevisiae puede multiplicarse de forma asexual por división vegetativa (gemación multilateral) mientras las condiciones nutricionales del medio sean óptimas, pudiendo entrar en un proceso de reproducción sexual o esporulación si estas condiciones ambientales son adversas (carencia de nutrientes, bajo pH y temperatura, etc.). El ciclo de división celular en la multiplicación vegetativa consiste en cuatro fases: G₁ (período que precede a la síntesis de DNA), S (período de síntesis de DNA), G2 (período anterior a la mitosis), y M (mitosis y citoquinesis). El ciclo celular de la levadura S. cerevisiae se caracteriza por la formación de una yema cuando la célula entra en la fase S. Durante el resto del ciclo celular, esta yema crece hasta que la célula hija se ha formado completamente y se separa de la célula madre al final de la fase M. Esta división es asimétrica siendo la célula madre de mayor tamaño que la célula hija (Gershon y Gershon, 2000). Durante el ciclo de división sexual, dos células haploides de tipo sexual diferente, MATa y MATα, son capaces de conjugarse para dar lugar a una célula diploide que en condiciones de ayuno puede esporular y originar, por medio del proceso de meiosis, cuatro ascosporas haploides (dos MATa y dos MATα) encapsuladas en un asca, que germinarán originando cuatro células haploides que iniciaran de nuevo el ciclo vegetativo en condiciones favorables (Figura I1).

Las cepas que son capaces de mantenerse estables como haploides durante algunas generaciones se denominan heterotálicas, y aquellas que pueden realizar un cambio de tipo sexual, fusionar células de diferente sexo y formar otra diploide se llaman homotálicas. Por lo general, las levaduras vínicas no esporulan fácilmente, y cuando lo hacen con

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frecuencia presentan un porcentaje elevado de esporas no viables (Codón et al., 1995; Mortimer et al., 1994).

Figura I1. Ciclo vital de S. cerevisiae.

1.2.4. Selección de cepas de levadura

Durante la fermentación alcohólica del mosto de uva, además de la transformación de los azúcares en etanol y CO2, las levaduras contribuyen a la modificación de la composición química del mosto produciendo pequeñas moléculas tales como glicerol, acetato, succinato, piruvato, ácidos grasos, varios ésteres, aldehídos volátiles, y compuestos azufrados (Fleet, 1993); así como macromoléculas liberadas de la pared celular, como las manoproteínas. La mayoría de estos compuestos tienen un impacto en el aroma secundario y sabor del vino (Swiegers et al., 2005).

Los criterios de selección de las cepas de levadura vínicas empleados originalmente, se basaban en conseguir una cinética de fermentación rápida, con tiempos de latencia cortos y la capacidad de

Tipo a

Tipo

!

Células diploides (a/!)

Crecimiento vegetativo de las células diploides

Yema

Ayuno,

formación de ascas, meiosis

4 ascosporas haploides dentro de las ascas Ruptura de ascas,

Germinación de esporas Crecimiento vegetativo

de células haploides Apareamiento entre células haploides de sexo opuesto

37 alcanzar la fermentación completa de los azúcares. Esto se relaciona, directa o indirectamente, con otros factores como bajos requerimientos nutricionales, resistencia al azufre y resistencia a diferentes factores de estrés tales como el etanol, las bajas o altas temperaturas, el estrés osmótico u oxidativo y el fenotipo killer. Otros criterios de selección más específicos incluyen la producción de aromas primarios (derivados de la uva) y secundarios (derivados de la fermentación), la producción de glicerol, una baja producción de acidez volátil o de etil-carbamato. En general, todos estos criterios son modulados en función del tipo específico de producción de vino, la composición química del mosto, las condiciones específicas del área de producción o las preferencias del enólogo, siendo la cata el paso final en cualquier proceso de selección de cepas de levadura vínicas.

La mejora genética de levaduras ofrece nuevas posibilidades tanto en términos de los caracteres que han de ser mejorados, como de crear nuevas combinaciones que favorezcan determinadas propiedades que no se encuentran en cepas silvestres. Las principales tecnologías disponibles para la mejora genética de levaduras vínicas son la hibridación sexual, la mutagénesis al azar y la Ingeniería Genética.

1.2.5. Control de la fermentación alcohólica

El control de la fermentación alcohólica es crítico para obtener características sensoriales y aromáticas óptimas de los vinos de calidad.

La fermentación es llevada a cabo, frecuentemente, en tanques de madera o acero inoxidable, y puede ser monitorizada mediante diferentes parámetros tales como la densidad, el pH, la generación de calor, o la evolución de la presión diferencial de CO2 (Martínez et al., 1999).

De hecho, la densidad del mosto es empleada de forma habitual en las bodegas como el parámetro que controla fácilmente la evolución de la fermentación, la cual se considera terminada cuando se alcanza un valor

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de 1000 g/L. Sin embargo, la concentración final de azúcares ha de ser determinada analíticamente para confirmar el final del proceso fermentativo (niveles de glucosa y fructosa inferiores a 2 g/L).

La temperatura de fermentación es otro parámetro tecnológico importante que influye en la calidad del vino. El rango de temperaturas empleado es muy amplio, oscilando desde unos 15 ºC para vinos blancos y rosados, hasta los 30 ºC para vinos tintos. Dado que la fermentación alcohólica es un proceso exotérmico (23.5 KCal liberadas por mol de azúcar fermentado), los tanques de fermentación están equipados con sistemas de enfriamiento que compensan el calor liberado durante el proceso (Sablayrolles, 2009).

1.2.6. Fermentación maloláctica

Una vez que la fermentación alcohólica ha tenido lugar, puede ocurrir un segundo proceso microbiano que afecta las características del producto final. Este proceso, denominado fermentación maloláctica es llevado a cabo por las bacterias ácido-lácticas y recibe su nombre de la principal transformación que tiene lugar durante el proceso: la descarboxilación del ácido málico en ácido láctico. Las tres consecuencias fundamentales de este proceso son: a) un aumento de la estabilidad microbiana del vino debido al reemplazamiento del ácido málico, fuente de energía de algunos microorganismos; b) la desacidificación gradual del vino; c) los cambios sensoriales que afectan a la complejidad del aroma.

1.2.7. Procesos post-fermentativos

Una vez completada la fermentación alcohólica, se procede a la clarificación y estabilización del vino, que implica varios procedimientos destinados a obtener un producto final sin defectos en el aroma o el sabor.

39 1.2.7.1. Trasiego

Se emplea para eliminar los sedimentos de gran densidad depositados en el fondo de las cubas de fermentación (lías, fangos). Este proceso airea el vino, favoreciendo el buen acabado de la fermentación y la posterior estabilización del vino y permitiendo la evaporación de sustancias volátiles y CO₂. El trasiego también se usa para homogeneizar vinos entre diferentes cubas, consiguiendo una mayor uniformidad.

1.2.7.2. Estabilización del bitartrato potásico

Los mostos de uva presentan una amplia variación en las concentraciones de potasio y ácido tartárico, con variaciones menores en el contenido de calcio. A medida que el contenido en alcohol aumenta, la solubilidad del bitartrato disminuye, induciendo la cristalización lenta del bitartrato potásico y el tartrato cálcico, los cuales precipitan espontáneamente. Para conseguir una estabilización rápida, el vino es refrigerado e incubado con cristales de bitartrato potásico para acelerar la precipitación (Boulton et al., 1998). De la misma manera, la adición de sulfato cálcico origina la precipitación del tartrato cálcico y permite una mayor ionización del ácido tartárico y de los iones bitartrato. Otra estrategia denominada estabilización con frío, se basa en el enfriamiento del vino a temperaturas cercanas al punto de congelación. Existen otros métodos alternativos de estabilización no basados en el factor térmico sino en la adición de productos como ácido metatartárico, ácido racémico o manoproteínas (Dupin et al., 2000; Waters et al., 1993; 2000).

1.2.7.3. Estabilización de la turbidez proteica

La turbidez proteica inducida por el calor es un problema común durante la comercialización de vino blanco. Este tipo de deterioro es causado por la agregación de proteínas de la uva que forman partículas opacas.

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Aunque el vino que las contiene es apto para el consumo, afecta negativamente a la aceptabilidad del consumidor. Dicha turbidez se previene gracias a la adsorción de las proteínas sobre bentonita (Ferreira et al., 2002; Høj et al., 2000; Tattersall et al., 2001; Waters et al., 2005).

Otros agentes de estabilización, comúnmente empleados en vinificación, son las proteínas de origen animal, tales como la ovoalbúmina, la lactalbúmina, la caseína, la cola de pescado y las gelatinas. Algunas técnicas de estabilización proteica alternativas son la ultrafiltración (Flores et al., 1990), la adición de enzimas proteolíticas (Waters et al., 1992), la pasteurización rápida (Francis et al., 1994; Pocock et al., 2003), y el uso de otros materiales adsorbentes tales como la resina (Sarmento et al., 2000), los óxidos metálicos (Pashova et al., 2004), el óxido de zirconio (Salazar et al., 2006), o incluso algunos polisacáridos extraídos de algas marinas (Cabello-Pasini et al., 2005). La adición de preparados ricos en manoproteínas es uno de los últimos métodos propuestos para clarificar la turbidez proteica de vinos blancos (Waters et al., 1994a). Recientemente, se ha comprobado que vinos fermentados con cepas de levadura recombinantes, las cuales liberan grandes cantidades de manoproteínas, requieren menor cantidad de bentonita para su clarificación (Gonzalez- Ramos et al., 2009).

1.2.7.4. Filtración

Una vez alcanzada la estabilidad química del vino, éste es almacenado en un nuevo tanque en el cual la estabilización microbiológica es llevada a cabo por filtración.

La elección del sistema de filtración adecuado en cada paso de la clarificación y estabilización es crítica. El sistema más empleado son los filtros de tierra de diatomeas (tales como los filtros de hojas a presión o las precapas), aunque también destacan los medios filtrantes de celulosa, los filtros de membrana y cartucho, y los filtros transversales. Cuando se

41 ha alcanzado la estabilidad química y microbiológica del vino, se procede al embotellado.

1.2.8. Crianza

El envejecimiento oxidativo, el almacenamiento del vino y la crianza en barricas de madera, seguidos de un período de envejecimiento en botella, han sido prácticas comunes en la elaboración del vino. Es posible mejorar las propiedades sensoriales tanto de vinos tintos como de algunos vinos blancos con un buen potencial para la crianza.

Se han empleado tradicionalmente las barricas de madera de roble en el envejecimiento del vino. Este tipo de madera ofrece ventajas para mejorar la calidad del producto final, como la estabilización del color, la clarificación espontánea y una mayor complejidad aromática. La madera de roble es ligeramente porosa y permite una transferencia lenta de oxígeno durante el período de crianza, originando la oxidación de compuestos del vino y una serie de fenómenos fisicoquímicos que mejoran el aroma y el color de los mismos.

El color se intensifica, fundamentalmente, gracias a las reacciones entre taninos y antocianos, aunque también son importantes reacciones en las cuales está implicado el acetaldehído. Como resultado de éstas, la concentración de antocianos libres disminuye y la estructura de los taninos se modifica, causando una reducción de la astringencia del vino. El aumento de la complejidad aromática se debe a la acumulación de ciertos compuestos volátiles derivados de la madera de roble, que son liberados durante la crianza dentro de la barrica. El tipo de madera de roble, su origen y los tratamientos que sufre durante la fabricación de la barrica, así como la edad de ésta, también influyen en la concentración de estos compuestos aromáticos (Ancín et al., 2004; Cadahía et al., 2003;

Chatonnet et al., 1989; 1994; Doussot et al., 2002; Marco et al., 1994).

La crianza es un proceso costoso que requiere períodos de tiempo