Departamento de Biología Molecular FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
DESARROLLO DE NUEVAS HERRAMIENTAS PARA EL DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS WEST NILE (NILO
OCCIDENTAL)
Belén Rebollo Polo
Madrid, 2018
Departamento de Biología Molecular FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
Memoria presentada por Belén Rebollo Polo, Licenciada en Bioquímica para optar al grado de doctora en Ciencias por la Universidad Autónoma de Madrid
El trabajo que se describe en esta memoria ha sido realizado en INGENASA y el INIA-CISA bajo la codirección de los Drs. Ángel Venteo Moreno y Miguel Ángel Jiménez Clavero
Parte de la investigación realizada en esta tesis ha sido financiada por el proyecto: EuroWestNile (Ref: EU HEALTH.2010.2.3-3- 261391)
Parece mentira que finalmente llegue este momento…tan esperado durante toda la tesis pero tan difícil de escribir ahora que me veo con la página en blanco.
Tengo mucho mucho que agradecer. Gracias a mucha gente he llegado hasta aquí sin haberme vuelto totalmente loca (aunque se de muchos que no opinan lo mismo).
Como no podría ser de otra manera a la primera persona que tengo que agradecer la posibilidad de escribir esta tesis es a Ángel. No sé todavía cómo accediste y sé que te has arrepentido mil veces…pero espero que el esfuerzo haya merecido la pena. Has sido mentor y amigo aunque me caigas mal porque nunca seré ni la mitad de lista que tú eres. Gracias por la paciencia y por todo lo que me has enseñado, y porque a pesar de todas las cosas has seguido creyendo y apostando por mí. Porque nos quedan muchos ELISAs por hacer y muchas horas que compartir. A la siguiente que tuvimos que engañar fue a Carmen. Gracias porque te fiaste de nosotros, y porque sólo me pusiste la condición de no abandonarla y aunque no te lo creas me he acordado muchas veces durante estos años de esas palabras. Gracias Antonio, tú te sumaste a esta locura porque aunque lo escondas cuando quieres, eres un apasionado de la academia y del conocimiento y eres un CIENTÍFICO como hay pocos, gracias por todos los momentos compartidos y por haberme apoyado tanto tanto contra viento y marea. Eres un espejo en el que mirarse. Y por último que no menos importante a la persona sin la que claramente este trabajo habría sido casi imposible e infinitamente peor. Miguel Ángel, dijiste que sí casi sin pensarlo, y desde el primer momento asumiste tu papel de director y mentor. Me has hecho pensar y crecer como científica, puede que hacerme más tykis jeje, pero siempre con criterio y sabiendo evaluar las diferentes situaciones. Me he sentido muy arropada y he sabido que esto iba a tener fin gracias a ti. Quedan muchas conversaciones pendientes.
Es muy difícil expresar aquí todo lo que siento, y el apoyo que me habéis dado.
Tengo que agradecer a las diferentes versiones de dirección de INGENASA, Belén, Eduardo, Jacques...que me hayan permitido seguir trabajando en este proyecto que espero que haya sido muy fructífero para todos.
A mis compis de laboratorio. Porque sois compis y amigas, porque habéis aguantado con santa paciencia todos mis cambios de humor y mis momentos de bailar y cantar a lo loco. Esther, sabes que no eres solo la reina de los geles, (Que te agradezco infinito) si no también la que me ha echado la bronca con cariño y me ha animado mil veces. Istar, que te voy a contar que no te haya dicho ya…Gracias por los videoconsejos tan útiles que me das y por todos esos momentos compartidos dentro y fuera de aquí, porque tenerte como amiga es un lujo que tengo la suerte de poseer. Isa, mi fan incondicional. Gracias por creer en mí y defenderme a capa y espada de cualquiera, por reír siempre mis gracias y querer siempre lo mejor para mí. Sois las 3 unas mujeres maravillosas, fuertes y valientes y es un orgullo compartir poyata con vosotras (que sí…que vuelvo al laboratorio…no lloréis demasiado).
A todo el Departamento de cultivos (Isa, Diana), en especial a Elena que ha sido capaz de encontrarme cualquier monoclonal rebuscao de los cajones sin protestar y a Ana que me enseñaste con paciencia todo lo que se de cultivos, sacaste el monoclonal que dio vida a la tesis y las conversaciones contigo siempre han sido muy enriquecedoras.
Al Departamento de PCR (Sven, Irene) y en especial Helena que tuviste que sufrir lo que no está en los escritos viendo como deambulaba por las cabinas…y aguantaste y me enseñaste como una campeona.
A Genética, que igualmente me ha echado una mano con un buffer, un gel, un wb o lo que sea.
(Tamara, Nuria, Patricia, Lissette, Luis) y muy muy en especial a Javier: Javi, esta tesis, un porcentaje altísimo es gracias a ti. No solo me has enseñado todo lo quería y más, si no que aguantaste todas y cada una de mis preguntas casi sin salirte de tus casillas e hiciste tuyos todos los experimentos clonando sin descanso cualquier gen que se nos ocurrió. Es difícil que pueda devolverte todo lo que has hecho. Mil gracias.
A mis compis de despachitos…Merce gracias por ser siempre tan atenta, Carmen gracias por ser capaz de explicar las cosas al nivel de cualquiera, tu mente brillante no te impide bajar a la tierra y que yo pueda entenderlo todo. Alba, llegaste más tarde pero llegaste para quedarte, gracias por tus ánimos y comprensión tan necesarios en estos últimos momentos.
MªJo, has sido un apoyo fundamental desde el comienzo del proyecto preocupándote por él y ayudándome en todas las locuras que se nos han ocurrido. Tu fuerza y tu energía se contagian, y son admirables.
Marga, me cuesta mucho poder expresar todo lo que has hecho por mí. Has sido apoyo incondicional, no por eso no diciéndome todo lo bueno y lo malo que pensabas. Gracias por aceptarme y comprenderme como soy, por compartir algunos de mis defectos (jeje) que consuelan a las tontas y por estar siempre dispuesta a discutir con buen criterio resultados, cut offs o medcals…hasta las horas que fuera necesario.
Paloma, tu ayuda personal y profesional ha sido fundamental. Has hecho las veces de directora trabajando los fines de semana, y las horas que fueran para echarme una mano en todo lo que he necesitado. Nuestros momentos en la terraza han sido muy reconfortantes, gracias por escucharme y compartir conmigo tantas cosas.
A mis compis desayuno, Rebe porque eres alegría e inspiración constante, Rubén que me has escuchado con muuucha paciencia todas mis chorradas compartiendo reptiles y lo que se terciara;
esta última etapa ha sido mucho más fácil gracias a ti. Jorge, porque gracias a ti no solo he aumentado mi filmoteca,, si no que he aprendido que la prudencia y el apoyo incondicional existen.
Gracias por no quejarte nunca y aguantarme todas las tonterías y las de mi hija. Moisés, porque los contables sois de todo menos aburridos. Gracias por los momentos y aperitivos compartidos.
que sí que ya sé que estas muy liada…Comerciales consiguiéndome muestras, producción
“regalándome” ese kit que estaba caducado, el bote de diluyente del lote no se cual, este paquete que tiene que salir para antes de ayer…Muchas gracias a tod@s, todo lo que he necesitado me lo habéis proporcionado con cariño y sonrisa.
A los que tenéis un trabajo menos vistoso pero igual de útil y necesario, Gina por perseguirme con las llaves, Sara por estar pendiente de mí, Lourdes que siempre tienes una tontería para sacarme una sonrisa y todo el material preparado a tiempo y Sergio que hemos compartido muchos momentos buenos y es un gusto siempre tener una conversación contigo.
Fuera de INGENASA tengo a muchísimas más personas que han formado parte de esto.
A tod@s mis compis del CISA. Paco, muchas gracias por dejarme escucharte y por enseñarme todos los intríngulis de trabajar en un P3, por no ponerte casi nervioso cuando a tu grito de ¡siguiente perdiz! tardase 3 horas en sacarla del trasportín y por poder cultivar contigo y dejarme todos los virus posibles. Elisa porque fuiste una amiga y alguien de quien aprender un montón. Porque me enseñaste a abrir un bicho…y a ver como flotan los pulmones y eso, no lo olvidaré nunca. Eres una estupenda científica amiga.
Llega el resto…todos los que habéis tenido que escucharme fuera del labo.
A mis amig@s de la uni. A l@s bioquímic@s. Sofía, Cris, Irene, Javi…nos hemos enamorado y desencantado de la ciencia a la vez... Porque no es país para científicas, pero vosotras habéis conseguido darle la vuelta y saber qué es lo que merece la pena de verdad y como compaginar vida familiar y laboral. Javi porque has sabido reinventarte una y mil veces. A mi química favorita Marta.
Gordi eres lo mejor que me dejó la carrera, gracias por todos y cada uno de los momentos que he compartido contigo (no solo los de cañas. que han sido estupendos!!), siempre me has ayudado a seguir creyendo en mi misma. Eres maravillosa y sabes que tqm.
A mis AMIGAS, Cris, Ross, Raquel y Sandra. Porque permanecéis ahí y eso ya es muchísimo. Fea, sabes que no puedo explicar aquí lo que significa para mí tenerte a mi lado. Pensabas que no podía volverme más loca y has visto que si ;). Dale las gracias a la ciencia.
Y por fín a las personas que más quiero. A mi familia. Gracias Tito, por haber estado tan pendiente de mí ofreciéndote a cualquier cosa que necesitase. Abuelito, has sido fuente de conocimiento inagotable, tu pasión por el saber no ha sido incompatible con el cuidado a las personas que querías.
Ha sido maravilloso compartir una parte de tu vida.
Papá, porque sí, es posible que estudiara Bioquimica porque tú me lo dijiste jeje pero de todas formas sé que me habrías apoyado en cualquier cosa que hubiera hecho. Porque tu ansia de conocer mundos diferentes y aun así vivir en una isla desierta ha sido una paradoja muy útil en mi vida. Porque siempre siempre puedo contar contigo.
aprendiendo a vivir sin más techo que el que yo quiera ponerme. Gracias a cómo eres siempre quiero ser mejor persona.
A mis cuñad@s en todas sus versiones porque os parece que lo hago es importante, y eso hace que lo sea más.
A mis hermanas, puf… esta parte es la más difícil…Cómo se puede tener tanta suerte? Yo realmente no me lo creo. Teneros en mi vida es el regalo más grande que nadie me pueda hacer.Mónica, Keppen cariño, sabes que siempre me he fijado en ti para todo. Porque has sabido compaginar el cerebro y el corazón, el cuerpo y el alma estando la primera en la discoteca y en la biblioteca. Porque siempre me has apoyado y has creído que era más capaz de lo que nadie creía. Mery, tus palabras siempre han sido sanadoras, por muy ocupada que estés siempre has tenido un hueco para mí y para darme sabios consejos. Porque has puesto el listón muy alto, y porque es un orgullo decir que eres mi hermana. Loreto…Enana, que voy a decir de ti, si has estado apoyándome desde que naciste. Tengo la suerte de haber seguido muy de cerca cómo te has convertido en la gran mujer que ahora eres y que me deja compartir su vida.
Chema y África. Los que más habéis sufrido mi ausencia y mis cambios de humor. Chema, porque me has apoyado sin preguntar ni entender porque hacía esto, solo porque sabías que era importante para mí. Porque te bebiste mi cerveza y esa será la anécdota que contar de la tesis. Porque siempre siempre has dicho sí de manera absolutamente incondicional. Porque se te ve el orgullo en los ojos y la orgullosa de ti soy yo. África, mi vida sé que te ha costado mucho estar sin mamá pero espero que cuando seas mayor lo entiendas mejor y sigas el camino que decidas sin importar cuantas dificultades te pongan. Has sido una de las razones más importantes por las que he podido acabar esta tesis. Te quiero hija. Maaaaaaaa
Resumen/Summary
El virus West Nile (WNV) es actualmente uno de los patógenos emergentes más notorios por su reciente expansión geográfica y por su importancia en salud pública, sanidad animal y medioambiental. La presente Tesis Doctoral aborda el desarrollo de herramientas útiles en el diagnóstico, vigilancia y control de la infección producida por este virus. Como punto de partida de los diferentes trabajos realizados se obtuvieron los reactivos necesarios para emprender dichos desarrollos, la proteína recombinante no estructural NS1 del WNV y la región estructural completa expresada en forma de cápsida vacía, o “virus-like particle” (VLP). Con estos reactivos se establecieron y ensayaron diversas metodologías de potencial utilidad en el diagnóstico y control de la enfermedad producida por el WNV. En primer lugar, se evaluó la antigenicidad de las VLP obtenidas con el fin de comprobar si podían representar alternativas viables a los antígenos utilizados en la actualidad en los ensayos diagnósticos, resultando aptas para tal fin en los ensayos realizados. En segundo lugar se estudió la respuesta inmune a la proteína NS1 en caballos, comparada con la respuesta a proteínas estructurales en forma de VLP, mediante la técnica de ELISA, con el fin de explorar métodos que permitan diferenciar a través del análisis serológico animales vacunados de infectados. Para ello se analizó un amplio grupo de sueros de caballo de diferentes procedencias geográficas, infectados o vacunados con diferentes tipos de vacunas, tanto de campo como experimentales. Los resultados mostraron que la diferenciación mediante el sistema ensayado es posible en animales vacunados e infectados en condiciones controladas, pero no es tan eficaz en las condiciones prevalentes en el campo. En tercer lugar se puso a prueba la inmunogenicidad y capacidad inmunoprofiláctica de la NS1 en un modelo de hospedador natural, la perdiz roja, resultando en un inesperado efecto de exacerbación de la infección. Finalmente, el último estudio de esta Tesis abordó la evaluación del anticuerpo monoclonal 1D11, generado en el laboratorio en estudios anteriores, como reactivo para la inmunodetección de un amplio rango de variantes del WNV, utilizando para ello técnicas inmunocromatográficas. Los resultados revelaron que el mAb 1D11 puede detectar WNV de todos los linajes ensayados, y diferenciarlo de otros flavivirus relacionados, lo que apunta al 1D11 como inmunoreactivo eficaz para la detección universal del WNV.
West Nile virus (WNV) is currently one of the most remarkable emerging pathogens due to its recent geographical expansion and its importance in public health, animal health and the environment. This Doctoral Thesis deals with the development of useful tools in the diagnosis, surveillance and control of the infection produced by this virus. As a starting point for the different works carried out, the necessary reagents were obtained to undertake these developments, the WNV non-structural recombinant protein NS1 and the complete WNV structural region expressed in the form of an empty capsid, or "virus-like particle" (VLP).
Several methodologies potentially useful in the diagnosis and control of the disease produced by WNV were established and tested with these reagents. First, the antigenicity of the VLP obtained was evaluated in order to verify if they could represent viable alternatives to the antigens used in the diagnostic tests, being suitable for this purpose in the tests carried out. Secondly, the immune response to the NS1 protein in horses was compared with the response to structural proteins in VLP form by means of ELISA techniques in order to explore methods for differentiating vaccinated from infected animals through serological analysis. To do this, a large group of horses’ sera from different geographical origins, infected or vaccinated with different types of vaccines, both in the field and experimentally, were analyzed. The results showed that differentiation using the system under study is possible between vaccinated and infected animals under controlled conditions, but it is not as effective in the conditions prevailing in the field. Third, the immunogenicity and immunoprophylactic capacity of NS1 was tested in a natural host model, the red-legged partridge, resulting in an unexpected exacerbation of the infection.
Finally, the last study of this Thesis addressed the evaluation of monoclonal antibody 1D11, generated in the laboratory in previous studies, as a reagent for the immunodetection of a wide range of WNV variants, using immunochromatographic techniques. The results revealed that the mAb 1D11 can detect all tested WNV lineages, and differentiate this virus from other related flaviviruses, which points to 1D11 as an effective immune reagent for the universal detection of WNV.
Índice
Abreviaturas ...
I. INTRODUCCIÓN ...1
1.1 El virus West Nile. Características generales. ...1
1.2 Estructura y organización...2
1.3 Taxonomía y variabilidad genética. ...5
1.4 Epidemiología y distribución geográfica. ...7
1.5 Historia: expansión geográfica del WNV. ...9
1.5.1 WNV en España ...11
1.6 Ciclo infectivo. ...12
1.7 Patogenia y aspectos clínicos. ...14
1.8 Inmunidad y vacunas frente a WNV ...15
1.8.1 Vacunas ...16
1.9 Diagnóstico. ...17
1.9.1 Métodos directos ...17
1.9.2 Métodos indirectos ...19
II. OBJETIVOS ...25
III. MATERIALES Y MÉTODOS ...29
3.1 Líneas celulares. ...29
3.2 Bacterias. ...29
3.3 Virus. ...29
3.3.1 Virus West Nile ...29
3.3.2 Baculovirus DNA BacPAK6DNA (Bsu36 I digest): ...29
3.4 Animales. ...32
3.5 Anticuerpos. ...32
3.5.1 Anticuerpos específicos: ...32
3.5.2 Anticuerpos conjugados anti-IgGs. ...32
3.6 Plásmidos. ...32
3.7 Oligonucleótidos. ...33
3.9 Materiales y reactivos para inmunocromatografía (IC). ...33
3.10 Tampones, soluciones, medios de cultivo. ...34
3.11 Otros materiales y reactivos. ...34
3.12 Muestras serológicas para estudios de diferenciación de animales infectados y vacunados. ...34
3.12.1 Sueros experimentales. ...35
3.12.2 Sueros de campo. ...35
3.13 Panel de sueros para evaluar la utilidad de las VLP como antígeno para el diagnóstico. ...38
3.14 Cultivos. ...38
3.14.1 Cultivo de células eucariotas. ...38
3.14.2 Crecimiento y titulación virus. ...39
3.14.3 Cultivo y transformación de bacterias. ...39
3.15 Clonaje de proteínas recombinantes del virus West Nile...40
3.16 Expresión y purificación de las proteínas recombinantes. ...41
3.17 Inoculación experimental en perdiz. ...42
3.17.1 Diseño experimental. ...42
3.17.2 Recogida y procesamiento de muestras. ...43
3.18 Técnicas inmunológicas. ...44
3.18.1 Análisis por Western blot. ...44
3.18.2 Inmunofluorescencia. ...44
3.18.3 Técnicas de ELISA. ...45
3.18.3.4 ELISA de bloqueo y ELISA de IgM para valoración de VLP como antígeno para diagnóstico. ...46
3.18.4 Inmunocromatografía en dispositivo de flujo lateral ...47
3.19 Otras técnicas ...49
3.19.1 Microscopía electrónica. ...49
3.19.2 Secuenciación de ácidos nucleicos. ...49
3.19.3 Análisis de los datos y estadística. ...49
IV. RESULTADOS ...53
4.1 Desarrollo de herramientas para el diagnóstico de la infección por WNV. . 4.1.1. Obtención de NS1 recombinante y estudios de caracterización estructural y antigénica. ...53
4.1.2.2 Caracterización de las VLP ...56
4.2 Evaluación de las propiedades antigénicas de las VLP y su utilidad en ensayos de diagnóstico. ...58
4.3 Estudio de la respuesta humoral a la proteína NS1 de WNV en caballos infectados y vacunados con varios tipos de vacuna. ...60
4.3.1 Análisis de anticuerpos en sueros experimentales. ...61
4.3.2 Resultados del análisis de anticuerpos de animales infectados, vacunados y negativos de campo. ...64
4.4 Análisis de la respuesta humoral en perdiz roja tras la administración de la proteína NS1 ...68
4.5 Evaluación de la capacidad de detección de un rango amplio de virus West Nile por el mAb 1D11 mediante inmunocromatografía. ...70
V. DISCUSIÓN ...75
Parte 1: Obtención de NS1 y VLP recombinantes. ...75
Parte 2: VLP de WNV como antígeno para diagnóstico serológico ...77
Parte 3: Diseño y evaluación de un sistema DIVA basado en medición de anticuerpos frente a antígenos estructurales vs no-estructurales de WNV78 Parte 4: La NS1 como inmunógeno en un modelo aviar (Perdiz roja). ...82
Parte 5: Detección universal de WNV por inmunocromatografía basada en un anticuerpo monoclonal específico del DIII de la proteína E de WNV ...84
VI.CONCLUSIONES ...89
VII.BIBLIOGRAFÍA ...93
Publicaciones ... 102
Abreviaturas
Ac: Anticuerpo
AcM: Anticuerpo monoclonal AcP: Anticuerpo policlonal
ADE: Antibody-Dependent Enhancement / Potenciación (de la infección) dependiente de anticuerpos.
ADN: Ácido desoxirribonucleico ARN: Ácido ribonucleico
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero
ATCC: American Type Culture Collection / Colección americana de cultivos tipo BAGV: Virus Bagaza
BBHis: Binding Buffer Histidines / Solución de unión a histidinas
BES: Baculovirus expression system / Sistema de expresión de baculovirus BHK: Línea celular de riñón de hámster
BSA: Albúmina de suero bovino
BSL-3: Biosafety Level 3/ Laboratorio de nivel de bioseguridad 3
CDC: Centers for Disease Control and Prevention / Centros de control y prevención de enfermedades de loe EE.UU.
CISA: Centro de Investigación de Sanidad Animal DAS: Double antibody sandwich/ Doble anticuerpo DENV: Virus del dengue
DICT50: Dosis infectiva en cultivo tisular-50 DIII: dominio III de la proteína E
DIVA: Differentiating Infected from Vaccinated Animals / Diferenciación entre animales vacunados e infectados
DMEM: Dulbecco´s Modified Eagle’s Medium / Medio de Eagle Modificado por Dulbecco dpi: Días post inoculación/infección
ECDC: European Center for Disease Control and Prevention/Centro europeo de control y prevención de enfermedades
ECP: Efecto citopático
EDC: Hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay / Ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima.
His: Histidinas
HRPO: Horseradish peroxidase / Peroxidasa de rábano IC: Inmunocromatografía
IgG: Inmunoglobulina clase G
ISCIII: Instituto de Salud Carlos III
ITV: Virus de la meningoencefalitis del pavo de Israel JEV: Virus de la encefalitis japonesa
LB: Medio de cultivo Luria-Bertani
LB-Amp: Medio LB suplementado con ampicilina 100 µg/ml LFA: Lateral Flow assay / Ensayo de flujo lateral
LFD: Lateral Flow device / Dispositivo de flujo Lateral MAPA: Ministerio de Agricultura y Pesca y Alimentación.
Mdi: Multiplicidad de infección
MVEV: Virus de la encefalitis del Valle de Murray NHS: N-hidroxisuccinimida
NS: No estructural nt: Nucleótido
PBS: Solución salina tamponada con fosfato PBSTB: PBST con BSA 3%
PCR: Reacción en cadena de polimerasa PI: Porcentaje de inhibición de la competición PBS-Arg: PBS con Arginina 0,4M
PBST: PBS con Tween 20 0.05%
prM-E: Unión de las proteínas de la envuelta E y precursora de la de membrana prM RASVE: Red de Alerta Sanitaria Veterinaria
rpm: Revoluciones por minuto
RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS) SLEV: Virus de la encefalitis de Saint Louis
STF: Suero de ternera fetal
TMB: 3,3´, 5,5´-Tetrametilbencidina ufp: Unidades formadoras de placa UsuV: Virus Usutu
VLP: Virus like particle/partículas similares a virus
VNT: Virus neutralización test / ensayo de virus-neutralización WNV: Virus West Nile
YFV: Virus de la Fiebre Amarilla
Introducción
1
I. INTRODUCCIÓN
1.1 El virus West Nile. Características generales.
El virus West Nile (WNV, familia Flaviviridae, género Flavivirus) es un virus transmitido por mosquitos con un amplio rango de hospedadores vertebrados, de los que diferentes especies de aves pueden actuar como reservorios. Es el agente causal de una enfermedad zoonótica, epizoótica y epornítica, considerada emergente o reemergente en muchas partes del mundo, conocida como la encefalitis por WNV (Gray y Webb, 2014).
Actualmente es uno de los virus transmitidos por artrópodos (arbovirus) con más extensa diseminación geográfica y que (dentro de los patógenos emergentes) ha cobrado mayor importancia.
El virus de WNV se aisló por primera vez en 1937 de una mujer en estado febril en el distrito de West Nile en el noroeste de Uganda (Smithburn et al., 1940), que es de donde tomó el nombre, y que a veces se traduce en español como virus del “Oeste del Nilo” o del
“Nilo occidental”. Hasta muchos años después, tras los brotes ocurridos en Israel en 1951- 52, no empezó a ser considerado un patógeno de importancia para el ser humano (Goldblum et al, 1956).
De los años 50 datan los estudios que establecieron su ciclo natural que implica ciertas especies de aves como reservorios y ciertas especies de mosquitos como vectores.
Puede también transmitirse y resultar patogénico en equinos y humanos, aunque éstos no puedan transmitir el virus (Figura 1) (Taylor et al., 1956) por lo que ambos actúan como hospedadores accidentales o en fondo de saco.
Figura 1. Ciclo biológico del virus WN. El virus se transmite entre mosquitos y aves en un ciclo enzoótico.
Ocasionalmente puede saltar a otras especies como humanos o equinos actuando los dos como hospedadores en fondo de saco.
2
1.2 Estructura y organización.
Como en todos los miembros de la familia Flaviviridae, el genoma del WNV consiste en una sola molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de aproximadamente 11 kb de longitud (Guirakhoo F et al., 1992; Lanciotti et al., 1999; Mukhopadhay S et al., 2003). Este ARN funciona como ARNm que comprende un único marco de lectura abierto de 10.301 nt. El ARNm se traduce en una poliproteína de aproximadamente 3400 aa que es procesada por un complejo serín-proteasa viral (NS2b-NS3), y varias proteasas celulares que darán lugar a las 10 proteínas virales maduras: 3 proteínas estructurales y 7 no estructurales (Figura 2A).
Figura 2. A) Esquema de la estructura y organización del genoma del WNV (adaptado ICTV report (https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/positive-sense-rna-viruses/w/flaviviridae/360/genus- flavivirus) B) Estructura tridimensional de virión de WNV. (Adaptado de Viralzone, https://viralzone.expasy.org/24?outline=all_by_species)
La región 5’ del genoma codifica las 3 proteínas estructurales, cápsida o core (C), membrana (M) y envoltura (E), mientras que las 7 proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5) están codificadas en la región 3´. La proteína M se genera a partir de un precursor denominado prM durante un procesamiento proteolítico tardío en la morfogénesis del virión (Stadler K et al., 1997; Roosendhal J et al., 2006).
Desde un punto de vista estructural los viriones son estructuras esféricas, de unos 50 nm de diámetro, que constan de una nucleocápsida que encierra el ARN vírico, y que a su vez está rodeada por una envoltura proteolipídica. La nucleocápsida está formada por
3 un único tipo de proteína, la del core, o C, que tiene 105 residuos aminoácidicos (aa) y que resulta del procesamiento proteolítico de un precursor de 123 aa. Esta proteína se asocia en dímeros que se ensamblan para dar lugar a una estructura esferoide de 30 nm de diámetro. La estructura resultante no tiene una simetría reconocible y tiene una cara interior con residuos aminoacídicos básicos que le confieren una carga fuertemente positiva. Esta cara cargada positivamente es la que está en contacto con el ARN, mientras que la cara exterior hidrofóbica es la que está en contacto con la cara interna de la membrana lipoproteica que forma la envoltura del virión (Figura 2B).
La envoltura del virión inmaduro está formada por una bicapa lipídica, de origen celular, en la que se insertan 60 trímeros de heterodímeros compuestos por 2 proteínas: la proteína prM (165 aa) y la proteína E (495 aa). En esta forma todavía inmadura forman espículas. Estas estructuras protegen al virión de una fusión prematura con las membranas de la vía secretora celular hasta su llegada al trans-Golgi. En ese momento la prM se escinde a M por una proteasa celular denominada furina. Esta escisión desencadena una reordenación estructural en la envuelta, que de estar formada por 60 trímeros pasa a 90 dímeros antiparalelos con simetría icosaédrica (Mukhopadhyay et al., 2003) (Figura 2B).
En una misma partícula viral puede coexistir el precursor prM junto a la forma procesada M. La proporción de una u otra depende de la eficiencia con la que se escinde la prM para dar lugar a la M, que es diferente en distintas poblaciones de virus (Heinz et al., 1994;
Pierson and Diamond, 2012).
La proteína E se compone de 3 dominios unidos entre sí por una región flexible que hace de bisagra. Contiene un sitio de unión al receptor celular y un péptido de fusión. El dominio III forma un bolsillo tipo dominio inmunoglobulina, a través del cual podría interactuar con los receptores de la superficie celular para facilitar la entrada del virión en la célula. Como los demás flavivirus, el WNV entra en las células huésped por endocitosis.
Al entrar, el entorno ácido del endosoma desencadena la trimerización de la proteína E, que permite la fusión de las membranas para liberar la nucleocápsida y el ARN y comenzar la replicación del material genético y el ensamblaje de las nuevas partículas. Las partículas nacientes, en su forma inmadura, se generan en el retículo endoplasmático, y en esta forma no son infecciosas, ya que no pueden fusionarse con la membrana celular del huésped (ver apartado 1.6).
En las infecciones por WNV (y por otros flavivirus) se forman de manera natural partículas subvirales. Estas partículas no infecciosas tienen una envoltura lisa y la mayoría tienen un diámetro de 315 Å (aunque se han encontrado algunas de tamaño mayor de 500 Å) (Mukhopadhyay et al., 2005). Estas partículas se ensamblan igualmente en el retículo
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endoplásmico y sufren las mismas modificaciones que las partículas infecciosas antes de liberarse de la célula huésped. Las partículas solo constan de las proteínas E y M (o, en su caso, prM) y una membrana lipídica. Esto genera diferentes estructuras en función de si la proteasa furina, que escinde la prM-E, es funcional para formar la partícula madura. Estas partículas subvirales pueden ser producidas de manera recombinante co-expresando estas 2 proteínas (Allison et al., 2003, Ferlenghi et al., 2001), lo que parece indicar que las partículas subvirales del WNV se forman sólo por la interacción del heterodímero prM-E.
Las proteínas no estructurales del WNV aún no están completamente caracterizadas. De manera directa o indirecta, todas parecen estar implicadas en la síntesis del ARN viral, y además tienen otras funciones.
La NS1 (46 kDa) es una glicoproteína con 3 sitios de N-glicosilación conservados y 12 cisteínas que forman puentes disulfuro esenciales para la viabilidad del virus (Blitvich et al., 2001). Se encuentra en diferentes grados de oligomerización formando o bien monómeros que son solubles e hidrofílicos, o bien hexámeros compuestos por 3 subunidades diméricas. Los hexámeros se forman cuando es secretada por las células del hospedador vertebrado y circula por la sangre de los individuos infectados para lo que necesita cierto grado de glicosilación (Flamand et al., 1999). Estudios en animales relacionan la abundancia de NS1 circulante con la gravedad de la infección (Macdonald et al., 2005). La NS1 en su forma intracelular funciona como un cofactor de la replicación viral por lo que suele estar localizada en los sitios de replicación del WNV (Mackenzie et al., 1996). La NS1 es una de las proteínas más variables del virus (Ehrbar et al., 2017, Sotelo et al., 2009), siendo algo poco común en una proteína no estructural. Este hecho podría guardar relación con su papel en el reconocimiento antigénico durante la respuesta inmune a la infección. Estas características le hacen tener un papel relevante en diagnóstico (Muller et al., 2013) (ver apartado 1.9).
La NS3 es una proteasa que se encarga del procesamiento de la proliproteína viral y su escisión en las diferentes proteínas. La NS3 solo es activa en presencia de su cofactor NS2B formando el complejo serín-proteasa. Esta proteína también tiene actividades helicasa y trifosfatasa, y se ha postulado que el residuo en posición 249 de su cadena polipeptídica está implicado en la patogenicidad del virus, al menos en determinadas especies de aves (Brault et al., 2007).
La NS5 es la proteína más grande (103 kDa) (Lidenbach y Rice, 2011) y conservada, y tiene 2 tipos de actividades principales: metil-transferasa en la región N terminal (Egloff et al., 2002) y RNA polimerasa (Kamer y Argos, 1984; Koonin, 1991).
5 Las otras proteínas NS2A, NS2B, NS4A y NS4B están aún menos caracterizadas y lo único que se sabe es que son pequeñas proteínas hidrofóbicas que no tienen los motivos conservados característicos de las enzimas conocidas. NS2A (25 kDa) es una proteína transmembrana hidrofóbica que podría estar implicada en replicación del RNA viral y en el ensamblaje de los genomas recién sintetizados dentro del virión. NS2B es una proteína pequeña hidrofóbica que actúa como cofactor de la proteasa/helicasa NS3. La interacción con esta proteína permite el desenrrollamiento del ARN del WNV. NS4A y NS4B son dos proteínas hidrofóbicas con varios dominios transmembrana, la primera actúa como cofactor regulando la actividad helicasa de la NS3 y está asociada con la evasión del sistema inmune, y la segunda parece estar implicada en la replicación viral pero aún no se ha descubierto su función (Blitvich, 2008).
1.3 Taxonomía y variabilidad genética.
El WNV pertenece al género Flavivirus que comprende más de 50 especies de virus distintas, la mayoría transmitidos por picadura de artrópodos. Entre los flavivirus hay muchos que son importantes patógenos para el hombre y los animales tales como el virus de la fiebre amarilla (YFV), que es el virus tipo de la familia y da nombre a la misma (Latín flavus=amarillo), el virus de la encefalitis japonesa (JEV), el virus Dengue (DENV), y el virus Zika (ZIKV), por citar tan sólo algunos ejemplos. Hay una estrecha relación antigénica entre WNV y los otros miembros del género Flavivirus, hasta el punto de que existe reacción cruzada en las pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a estos virus, tal y como se detalla más adelante (apartado 1.9). Esta relación antigénica es especialmente estrecha entre aquellos flavivirus que pertenecen al mismo serocomplejo.
En el caso del WNV, que pertenece al serocomplejo de la encefalitis japonesa, existe reactividad cruzada con otros virus pertenecientes a este grupo, también relevantes para la sanidad animal y/o humana, como el virus de la encefalitis de Saint Louis (SLEV), el virus de la encefalitis del valle de Murray (MVEV), el virus Usutu (USUV) o el propio JEV (Poidinger et al., 1996) (Tabla 1).
Antigénicamente, el WNV no presenta serotipos pero si muestra una gran heterogeneidad genética. Las técnicas de secuenciación han permitido en tiempos relativamente recientes, distinguir entre varios linajes genéticos y numerosos sublinajes y clados, cuya clasificación aún no ha alcanzado consenso entre los diversos autores. En la Tabla 2 se muestra una de las clasificaciones propuestas más recientemente, diferenciándose 7 linajes genéticos (Rizzoli et al., 2015). En lo que sí coinciden todos los autores es en que el linaje 1 y el linaje 2 son los más importantes por su relevancia clínica, distribución geográfica y capacidad de dispersión (Bakonyi et al., 2006).
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Históricamente habían sido los virus pertenecientes al linaje 1 los que causaron un mayor impacto en la salud pública, en consecuenci, éste ha sido el linaje más estudiado.
Además del más virulento por el número de casos clínicos que ha producido, el linaje 1 es el que presenta actualmente una distribución geográfica más amplia, extendiéndose por África, Europa, Asia, Oceanía y América. Dentro del linaje 1 se distinguen 3 sublinajes, o clados: 1a, que es el principal y más extendido; 1b, también conocido como subtipo Kunjin, y que se encuentra presente en Australia, y 1c, presente en la India (nótese que este último sublinaje aparece clasificado por algunos autores como un linaje diferenciado de los demás, el linaje 5 (Bondre, 2007) (Tabla 2). El linaje 2 había estado restringido al continente africano y Madagascar hasta que en 2004 se empezó a detectar su circulación en Europa Central y Oriental. En los últimos años se ha extendido hacia el sur y este de Europa (Hernández-Triana et al., 2014). El resto de linajes conocidos hasta ahora no han sido asociados a ninguna enfermedad, ni en humanos ni en otros animales.
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1.4 Epidemiología y distribución geográfica.
El WNV está clasificado como arbovirus debido a que su transmisión se produce mayoritariamente por picadura de artrópodos, principalmente mosquitos. El ciclo de transmisión del WNV involucra a determinadas especies de mosquitos, sobre todo del género Culex, como vectores de transmisión y a determinadas especies de aves silvestres como hospedadores reservorios. La competencia vectorial es la capacidad de una determinada especie o población de artrópodo para transmitir la infección a un hospedador vertebrado, mientras que la competencia de hospedador es la capacidad de una especie de vertebrado para mantener una viremia suficiente como para transmitir la infección a un artrópodo que se alimente de su sangre. El virus se mantiene así en la naturaleza, en un ciclo enzoótico, o rural, establecido entre vectores y reservorios competentes, al cual está perfectamente adaptado. Sin embargo, en determinadas circunstancias, el virus puede salir de ese ciclo, en un fenómeno que se conoce como “desbordamiento” (o spillover) y afectar a otras especies susceptibles. Para que esto ocurra, un mosquito infectado tiene que alcanzar, picar y transmitir de alguna manera el virus a otras especies susceptibles que no
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participan en el ciclo rural. Este es el caso de los humanos o los equinos (Figura 1), que así pueden adquirir la infección y desarrollar una enfermedad clínica; sin embargo, éstos no pueden transmitir el virus (no son competentes como hospedadores), debido a que en estas especies los niveles de viremia no son suficientes para infectar a los mosquitos cuando son picados por éstos y, por lo tanto, se consideran hospedadores, “en fondo de saco” o accidentales (Kramer et al., 2008). Los vectores con capacidad para transmitir el virus fuera del ciclo enzoótico a veces se les denomina “vectores puente”. Pueden actuar como vectores puente aquellos que habitualmente participan en el ciclo enzoótico, es decir, vectores ornitofílicos (que prefieren picar a aves) pero, que por diversas circunstancias (p ej: disminución de la densidad de aves, debido a la migración estacional…) necesitan picar a otras especies como mamíferos, o bien vectores ambivalentes, que pueden picar indistintamente distintos vertebrados como aves y mamíferos.
El WNV ha sido detectado en más de 60 especies de mosquitos en Norteamérica y 28 en Europa, aunque solo la detección del virus o de su genoma en una especie de mosquito no implica necesariamente que ésta sea un vector competente para la transmisión. Hasta ahora los vectores que han mostrado una mayor competencia para transmitir el virus son los mosquitos del género Culex (Cx) (revisado en Engler et al., 2013).
En África el vector más común es Cx. Univittatus, y en Europa Cx pipiens, aunque Cx perexiguus parece tener un importante papel como vector en ambas orillas de la cuenca mediterránea. Mientras que en Asia es Cx quinquefasciatus, en la India Cx.vishnui. Los mosquitos del género Aedes (Ae) como Ae.aegypti y Ae.albopictus no son buenos vectores para la transmisión del WNV. Además dentro del género Culex, determinadas especies (Cx pipiens, Cx perexiguus) podrían tener un papel relevante como vectores puente (Fonseca
et al., 2004; Martínez de la Puente et al., 2018).
El virus debe replicarse en las células tanto de su hospedador vertebrado como de su vector artrópodo, aunque en estas últimas normalmente no causa daño. Al picar a un vertebrado, una hembra de mosquito bebe entre 0.5 µL-1 µL de sangre y, en el caso de WNV, para que Cx pipiens pueda adquirir virus suficiente, el hospedador debe tener en su sangre de 105.5-107 ufp/ml. El período extrínseco (tiempo que tarda el mosquito en ser infectivo desde que bebe la sangre de un hospedador infectado) es de entre 8 y 14 días.
En ese período el virus ha sido ingerido por el vector, ha colonizado y atravesado su epitelio digestivo, se ha distribuido por la hemolinfa a los distintos órganos, alcanzando las glándulas salivares, ha replicado allí y ha sido excretado a través de la saliva en cantidades suficientes como para ser transmitido a un nuevo hospedador a través de la picadura en la piel. En algunas aves especialmente competentes para la transmisión del WNV, la viremia puede alcanzar títulos de hasta 1012 (Komar et al., 2003). Este es el caso de algunos
9 córvidos y otros paseriformes norteamericanos. Estos títulos tan altos permiten la transmisión del virus a mosquitos menos competentes. También podría ocurrir en el otro sentido, vectores con alta competencia vectorial pueden ser infectados a través de aves con viremias más bajas.
En climas templados la transmisión del WNV ocurre en la temporada estival, dado que es ahí cuando los vectores están activos. Dependiendo de factores climatológicos como la temperatura o la humedad ambientales, la temporada de transmisión puede prolongarse más o menos. Por debajo de ciertas temperaturas los mosquitos disminuyen o cesan en su actividad, entrando en un estado letárgico conocido como “diapausa”. En estas condiciones, la transmisión del virus se ve interrumpida. El virus, sin embargo, a menudo reaparece temporada tras temporada en las mismas zonas geográficas. El mecanismo por el cual sobrevive al invierno (overwintering) en estas zonas es aún desconocido, existiendo varias hipótesis no excluyentes entre sí: 1) infección persistente en los hospedadores vertebrados; 2) infección persistente en vectores “alternativos” como garrapatas o mosquitos en diapausa; 3) persistencia en huevos de mosquitos infectados por transmisión vertical.
En cuanto a los hospedadores, el WNV es un generalista ecológico, con notable capacidad para infectar un amplio rango de vertebrados, incluyendo aves, mamíferos, anfibios y reptiles. Sin embargo, sus principales reservorios se restringen a algunas especies de aves, singularmente de la familia Passeriformes, si bien pertenecer a esta familia no es condición necesaria ni suficiente para constituir un reservorio epidemiológico del WNV, ya que hay paseriformes no competentes y aves pertenecientes a otras familias que pueden actuar como reservorio. Además muchas especies de aves son susceptibles a la enfermedad producida por el virus, que desarrolla una infección sistémica dando lugar a un fallo multiorgánico, a menudo letal.
En general, los mamíferos son considerados hospedadores accidentales o “en fondo de saco”, y no participan en el ciclo de transmisión aunque pueden manifestar síntomas clínicos e incluso a veces sucumbir a una grave enfermedad (ver apartado 1.7).
1.5 Historia: expansión geográfica del WNV.
La reciente propagación del WNV, de mayor importancia en Europa y América, hace que se considere un problema de salud pública de primer orden en los países afectados.
Sin embargo, este virus no es nuevo. Como se ha mencionado anteriormente, se aisló por primera vez en 1937 en Uganda (Smithburn et al., 1940). Los casos humanos y animales provocados por WNV se observaron inicialmente en el África subsahariana (Zaayman y Venter, 2012). Fuera de esta área desde los años 50 se empezaron a notificar casos
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humanos en Egipto (1951) e Israel (1951-52), En Europa, el primer caso clínico humano registrado ocurrió en Albania en 1958, y en Francia en 1962 se declaró el primer brote causando enfermedad en caballos (Calistri et al., 2010). En la década de los 90, la infección por WNV adquirió una mayor importancia internacional como consecuencia de los brotes observados en Rumania (Tsai et al., 1998), Rusia (Platonov et al., 2001), Israel (Bin et al., 2001) y también por brotes menores, pero importantes, que sucedieron en la misma época en Argelia (1996), Túnez (1997), República Checa (1997) e Italia (1998) (Murgue et al., 2001). Después de 1999 la situación epidemiológica cambió a nivel mundial, al notificarse por primera vez la presencia del WNV en el continente americano, concretamente en la ciudad de Nueva York, donde el virus irrumpió de una manera muy agresiva, produciendo 59 casos de encefalitis en humanos, de los que 7 resultaron mortales (Nash et al.,2001;
Mcvey et al., 2015). Desde ese foco en Nueva York se distribuyó al resto del continente americano en muy pocos años (Murray, et al. 2010). En 2001 se registraron brotes en 10 estados diferentes de EEUU, y en 2004 se notificó algún caso en todos los estados continentales del país, excepto en Alaska. Hasta el día de hoy, el WNV ha causado en EE.UU. más de 40.000 casos de enfermedad en humanos, de ellos, 21.000 casos de afección neurológica y más de 2.000 muertes (CDC, 2018). En el resto del continente americano se fue extendiendo paulatinamente alcanzando por el norte a diversos estados de Canadá, y por el sur a varios países de Centro y Suramérica, hasta alcanzar Argentina donde hubo un brote en equinos en 2006. Se cree que todos los brotes causados por WNV en el continente americano han sido causados por virus derivados de una única introducción, de una cepa perteneciente al linaje 1, que fue introducida en Nueva York poco tiempo antes del primer foco detectado en 1999, y que probablemente procediera de Oriente Medio, según indican los estudios filogenéticos realizados (Lanciotti et al, 1999).
Paralelamente a la dispersión del virus en América, en Europa se han declarado numerosos brotes desde 1996. La situación ha ido evolucionando, de forma que los brotes son cada vez más frecuentes, y a la vez la enfermedad ha ido expandiéndose y afectando a cada vez más países. Esta situación empezó a volverse especialmente grave a partir de 2010 y desde esa fecha el ECDC recopila los datos de vigilancia del WNV en Europa (ECDC, 2017). La mayoría de estos brotes están asociados al linaje 1, aunque desde que en 2004 se detectó por primera vez el linaje 2 en el centro y este de Europa, los brotes asociados a éste último han sido cada vez más frecuentes (Hernández-Triana et al., 2014).
El año 2018 está siendo especialmente activo para WNV en Europa, habiéndose declarado hasta el momento de la escritura de esta tesis 1436 casos humanos con 126 muertes. Respecto a los casos equinos, 243 brotes en diferentes países han sido reportados hasta el momento. (Fuente ECDC, WNV 2018)
11 La situación es más complicada si tenemos en cuenta que en paralelo con la expansión del WNV, otros flavivirus transmitidos por mosquitos, igualmente patógenos zoonóticos emergentes, están intensificando su circulación y actividad en diferentes partes del mundo. Se da la circunstancia además, de que muchos de ellos reaccionan de forma cruzada en las pruebas diagnósticas para la detección del WNV, con importantes consecuencias para las estrategias tanto de diagnóstico como de vigilancia y control del virus y la enfermedad (Beck et al., 2013; Llorente et al., 2013; Petersen et al., 2013). Por ejemplo, virus relacionados con WNV circulando en los mismos lugares son: el virus la encefalitis japonesa (JEV) que circula en Asia, el virus de la encefalitis de Saint Louis en América de Norte y del Sur, el virus de la encefalitis del valle de Murray en Australia, el virus Usutu en África y Europa (Gould y Solomon, 2008) y el virus de la meningoencefalitis del pavo de Israel (ITV) en el Medio Oriente (y su virus sinónimo Bagaza (BAGV) en España) (Agüero et al., 2011; Braverman et al., 2003; Fernández-Pinero et al., 2014 ).
1.5.1 WNV en España
Por sus condiciones bioclimáticas y su posición geográfica, la Península Ibérica reúne condiciones muy favorables para la circulación del WNV. Por un lado, es un enclave estratégico en las rutas de migración de aves entre Europa y África, y por otro lado, sus abundantes humedales congregan numerosas especies de aves en hábitats propicios para la proliferación de mosquitos. El clima mediterráneo que predomina en amplias zonas, favorece la existencia de vectores durante períodos relativamente largos del año, lo que facilita el establecimiento del ciclo enzoótico del WNV.
La presencia del WNV en la Península Ibérica fue detectada por primera vez en Portugal a finales de los años ´60, afectando a caballos (Filipe et al., 1990). En España existen evidencias indirectas de la circulación del WNV desde la década de 1970 (Lozano and Filipe, 1998.). Sin embargo, la primera evidencia firme de la circulación del WNV en España se obtuvo en aves de las marismas del Guadalquivir en 2004 (Figuerola et al, 2007), casi simultáneamente al primer caso humano de esta enfermedad en la provincia de Badajoz (Kaptoul et al., 2007). En el verano de 2010 ocurrió el primer brote de encefalitis equina por WNV en nuestro país, en Andalucía Occidental (36 focos declarados, 44 caballos positivos, 9 muertes). Concomitantemente se diagnosticaron dos casos humanos de enfermedad neuroinvasiva en la misma zona (Sotelo et al., 2012). Desde entonces todos los años se declaran focos equinos de esta enfermedad en Andalucía, afectando principalmente a las provincias de Cádiz, Sevilla y Huelva (Figura 3). De nuevo en Cádiz se produjeron tres casos más de enfermedad neuroinvasiva por WNV en 2016, elevando a 6 el total de casos humanos registrados en España hasta hoy.
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A partir de 2014 comenzaron a detectarse casos fuera de Andalucía, con focos equinos declarados en Castilla-La Mancha (2014), Castilla y León (2014 y 2015) y Extremadura (2015, 2016). En total, desde 2010 se han declarado en España 187 focos, afectando a 208 equinos, de los que 34 murieron o fueron sacrificados a consecuencia de la enfermedad (Figura 3). Todos los virus detectados en el Sur y Este de España hasta el momento pertenecen al linaje 1, y están estrechamente relacionados entre sí y con otros aislados de la zona mediterránea occidental (Sotelo et al., 2011a). En 2017, sin embargo, fue detectado en Cataluña (Lérida) un caso de infección letal en un azor común causado por una cepa de linaje 2 del WNV, siendo este el primer caso declarado en España de enfermedad causada por este linaje, y el primero producido por cualquier tipo de WNV en Cataluña (fuente: informe epidemiológico de la fiebre del Nilo Occidental, en España, Noviembre de 2017, (MAPAMA, 2017)).
Figura 3: Localización de focos de WNV en España, 2010-2017. Adaptado de informe del MAPAMA 2017.
1.6 Ciclo infectivo.
En el hospedador vertebrado, el virus se replica primariamente en la piel, en el lugar donde el mosquito ha picado. Después viaja hacia los nódulos linfáticos, desde donde se disemina vía sanguínea a los distintos tejidos diana y ocurre la replicación secundaria del virus. En la mayoría de los hospedadores la viremia es corta, de unos pocos días de duración. En determinadas circunstancias el virus es capaz de atravesar la barrera
13 hematoencefálica e infectar el tejido nervioso, produciendo enfermedad neuroinvasiva, (ver apartado 1.7). La infección a nivel celular se inicia con la unión del virión a receptores celulares, cuya naturaleza aún no se conoce. Se ha sugerido que estos receptores son altamente conservados en diferentes tipos celulares de diferentes especies ya que estudios in vitro demuestran que el virus puede replicarse en un amplio rango de líneas celulares primarias o establecidas de aves, mamíferos, anfibios e insectos. Las partículas virales son internalizadas vía vesículas de clatrina y son transportadas a compartimentos endosómicos (Chu and Ng., 2004; Chu et al., 2006). El anclaje a la membrana celular está mediado por la unión de la proteína E con receptores de la superficie celular que median la endocitosis.
El bajo pH del endosoma provoca la fusión entre las membranas viral y celular desencadenando una reorganización de la membrana y la liberación primero de la nucleocápsida y después del ARN viral al citoplasma por un mecanismo no conocido (Heinz and Allison, 2000). El ARN liberado actúa como ARNm y es traducido por la maquinaria del hospedador. Aunque utilice la maquinaria, no bloquea la traducción en la célula hospedadora. Una vez traducida, la poliproteína se procesa para formar todas las proteínas virales, tanto estructurales como no estructurales (apartado 1.2) y, a partir de ahí puede comenzar la síntesis de nuevos ARN genómicos. El siguiente paso es el empaquetamiento del genoma y ensamblaje del virión que se producirá en asociación con las membranas del retículo endoplásmico. En este compartimento se va formando el virión inmaduro y, posteriormente se producirá la reorganización de la envuelta gracias a la proteasa furina que en el aparato de Golgi provocará la maduración y salida del virón ya maduro (Figura 4).
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1.7
1.8 Patogenia y aspectos clínicos.
El WNV es un virus neurotrópico que puede causar infecciones graves, ocasionalmente letales en aves, caballos y humanos principalmente. La presentación clínica más grave en estas especies incluye signos neurológicos como meningitis y encefalitis, que pueden ser letales en un porcentaje variable pero significativo de los casos.
Está descrito que puede afectar a más de 300 especies de aves distintas. Las aves pueden mostrar síntomas clínicos como ataxia, temblores, desorientación, movimientos en círculo o posturas anormales. Especialmente sensibles se muestran los cuervos americanos (Corvus brachyrhynchus) en los que la infección es letal para el 100% de los individuos inoculados experimentalmente, manifestando signos clínicos a los 4 días post- inoculación (dpi) y sucumbiendo entre 4 y 6 dpi (Komar et al., 2003). El gorrión común también es susceptible a la infección y manifiesta una enfermedad grave con una letalidad de hasta el 50%, dependiendo de la cepa de virus empleada en la inoculación (Komar et
15 al., 2003, Del Amo, 2014a y 2014b). Una revisión sobre las infecciones experimentales por WNV en aves puede consultarse en (Pérez-Ramírez et al, 2014).
En los caballos, el período de incubación del WNV varía entre 3 y 15 días. La mayoría no presenta síntomas clínicos y, cuando los presentan suele ser ataxia de leve a severa, debilidad y fasciculación muscular. El 10% de los casos presentan las formas más severas en las que los caballos sufren encefalitis, muriendo un 33% aproximadamente de los animales con síntomas neurológicos (Revisado en: Angenvoort et al., 2013; Castillo- Olivares y Wood., 2004).
En humanos, la mayoría de las infecciones son asintomáticas y por ese motivo se piensa que la prevalencia/incidencia de la enfermedad provocada por WNV esta subestimada. En el 20% de las infecciones, las personas afectadas desarrollan una enfermedad leve, denominada “fiebre por WNV”, que cursa con fiebre, fatiga, malestar, cefalea, mialgia, debilidad y dificultad de concentración. Con menos frecuencia se pueden presentar síntomas gastrointestinales. Sólo un pequeño porcentaje de los casos infectados (se estima que aproximadamente 1 de cada 150) padece una forma clínica más grave conocida como “enfermedad neuroinvasiva por WNV”, que puede cursar con encefalitis, meningitis o meningoencefalitis, pudiendo acarrear parálisis flácida aguda, retinopatías, uveítis y fotofobia. En los casos de encefalitis, los síntomas van desde una leve desorientación, ataxia, temblores, hasta coma o muerte del paciente. Esta enfermedad neuroinvasiva por WNV es mortal en aproximadamente un 10% de los casos (Petersen et al., 2013).
Las personas que sobreviven a la infección desarrollan una inmunidad de larga duración proporcionada por anticuerpos específicos en el suero. Se ha descrito recientemente que la infección por WNV puede tener secuelas a largo plazo (Murray., 2018).
1.9 Inmunidad y vacunas frente a WNV
Durante la infección por el WNV, la respuesta inmune humoral del huésped se dirige no sólo a las proteínas estructurales sino también a las no estructurales. Los anticuerpos producidos se dirigen principalmente frente a las proteínas E, pre-M, NS1 y NS3, aunque los epítopos inmunodominantes se localizan principalmente en las proteínas E, pre-M y NS1.
La proteína E ha sido descrita como la diana de la mayor parte de los anticuerpos y los principales determinantes neutralizantes mapean en el dominio III de la proteína E (DIII) (Beasley et al., 2004). Es la proteína mayoritaria de la envoltura que recubre al WNV
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y, por ello, la más expuesta a los anticuerpos. Aunque también se producen anticuerpos contra la proteína M (igualmente de la envoltura), solo son neutralizantes los específicos frente a la proteína E.
En los animales infectados por WNV la respuesta de anticuerpos consiste, como en la mayoría de las infecciones virales, en una primera respuesta de Inmunoglobulinas tipo IgM, que se pueden encontrar en suero a partir de día 4-5 post infección y que, en el caso de WNV, es detectable hasta casi 3 meses más tarde. Después se produce una maduración hacia una respuesta tipo IgG que es detectable a partir del día 7-8 y puede durar años. Este tipo de respuestas ocurren también, aunque a un nivel menos marcado, en el caso de la vacunación.
1.8.1 Vacunas
Existen vacunas eficaces para la prevención de la infección por WNV en caballos, pero no para humanos ni para aves.
En Europa, donde el virus ha reaparecido y está activo en muchos países, hay tres vacunas diferentes registradas para la prevención de la infección por el WNV en caballos, basadas en diferentes estrategias: un virus químicamente inactivado (Duvaxyn® WNV, ahora Equip® WNV, Zoetis, Louvain-la- Neuve, Bélgica) una vacuna recombinante viva que emplea el virus de la viruela del canario (Canarypox) expresando los genes que codifican las proteínas estructurales preM/E del WNV (West Nile Proteq®, Merial, Lyon, Francia) y una vacuna quimérica inactivada WNV-YF, donde la cepa vacunal YF-17D del virus de la fiebre amarilla presenta los genes de las proteínas estructurales E y prM de WNV en sustitución de los propios de la cepa vacunal (Equilis® West Nile, Intervet, Boxmeer, Holanda).
En Marruecos, donde también se observa circulación activa de WNV, se ha autorizado una vacuna adicional inactivada contra el WNV (WNVVac®, basada en la cepa Maroc 96-107, Biopharma, Rabat, Marruecos), además de Recombitek® Equine West Nile, que es esencialmente idéntica a Proteq® West Nile (ambas fabricadas por Merial). La primera se suministra liofilizada y requiere resuspensión antes de la administración, mientras que la segunda se suministra en suspensión líquida lista para usar. Todas estas vacunas inducen una respuesta inmune caracterizada por anticuerpos que reconocen de manera eficiente las proteínas estructurales del WNV, que constituyen la parte inmunogénica de la formulación de la vacuna (Bowen et al., 2014, Long et al., 2007, Siger et al., 2006). Estas vacunas recombinantes están basadas en las proteínas estructurales, por lo que no cabe esperar que induzcan anticuerpos contra las proteínas no estructurales (NS).
17 A día de hoy aunque todavía no ha sido aprobada ninguna vacuna para humanos, ha habido muchas aproximaciones. En la actualidad se encuentran 4 desarrollos de potenciales vacunas en distintas fase de ensayos clínicos. Tres de ellos se encuentran en fase I y uno en fase II. Las 3 vacunas de fase I están basadas en diferentes estrategias de ADN recombinante y de virus inactivado. La primera de ellas está basada en la proteína E recombinante purificada (Coller et al., 2012), la segunda en un plásmido de DNA que contiene los genes de las proteínas estructurales prM y E, y una tercera vacuna basada en el esqueleto del virus dengue serotipo 4 que sustituye las proteínas prM y E del virus original por la prM y la E de WNV. La vacuna que se encuentra en fase II está basada en el esqueleto de la cepa atenuada vacunal de la fiebre amarilla YFV-17D conteniendo los genes de la prM y la E de WNV (revisión sobre vacunas de WNV en De Filette et al., 2012).
Al no haberse conseguido todavía una vacuna válida específicamente para humanos ni para aves, se requiere mejorar el conocimiento de la interacción entre la respuesta inmune del huésped y los diferentes componentes virales para identificar nuevos objetivos para el desarrollo de una nueva vacuna. Dentro de estos componentes se ha observado que la proteína no estructural NS1 induce una respuesta inmune en el huésped que parece estar involucrada en la protección contra el WNV en modelos de ratón (Rastogi et al., 2016). Por lo tanto, se considera la proteína NS1 como una candidata prometedora para el desarrollo de futuras vacunas.
1.10 Diagnóstico.
Existen diferentes métodos para el diagnóstico en laboratorio de la infección por WNV. Estos métodos se basan en la identificación directa del virus o su genoma y en métodos indirectos dirigidos a la detección de anticuerpos específicos mediante pruebas serológicas.
1.9.1 Métodos directos
Dentro de los métodos directos, la identificación genómica del virus suele realizarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), generalmente en formato de tiempo real (Del Amo et al., 2013). Otras técnicas igualmente útiles en este sentido, aunque menos utilizadas, son: la LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) (Parida et al., 2004) y la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (Lanciotti et al., 2001), todas dirigidas a detectar ARN del WNV en las muestras. El aislamiento e identificación del virus suele servir como análisis de confirmación, y es además muy útil para la caracterización biológica y molecular del virus implicado en el brote. Las líneas celulares más utilizadas para aislar y crecer WNV son las de mamífero Vero y BHK y las de mosquito C6/36. Igualmente se puede hacer el aislamiento en huevo
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embrionado, tanto mediante inoculación intravenosa como a través de la membrana corioalantoidea. El método de aislamiento por inoculación intracraneal en ratones lactantes, aunque es muy eficaz, está en desuso por motivos éticos y de bienestar animal (Beaty, 1989).
El diagnóstico diferencial es de suma importancia, por lo que los métodos de laboratorio deben diferenciar de manera eficiente entre distintos flavivirus. La identificación directa de flavivirus mediante la metodología RT-PCR, particularmente en su versión en tiempo real, es muy sensible y específica, pero generalmente requiere laboratorios especializados, técnicos cualificados y equipos y suministros costosos. Además, generalmente se realiza en laboratorios centralizados, que requieren el transporte de muestras bien conservadas para soportar envíos potencialmente largos. Por lo tanto, es de gran interés el desarrollo de nuevos métodos que faciliten la detección directa de WNV de manera rápida y económica que pueda evitar estos problemas.
La detección directa de antígenos virales basada en métodos inmunoquímicos (es decir, inmunoensayos enzimáticos, métodos inmunocitoquímicos, pruebas inmunocromatográficas, etc.), especialmente aquellos que usan anticuerpos monoclonales altamente específicos, constituyen herramientas alternativas adecuadas para un diagnóstico directo más rápido, robusto y fácil, con menos requisitos técnicos tanto a nivel de laboratorio y equipos como de personal altamente capacitado (Sastre et al., 2016). En particular, los métodos inmunocromatográficos, a menudo denominados "cromatografías de flujo lateral" (LFA, del inglés lateral flow assay) o " penside tests", combinan algunas características que le hacen ser una buena alternativa a los métodos tradicionales. El LFA es un método muy simple que requiere un procesamiento mínimo de muestra y que permite obtener los resultados en aproximadamente 10 minutos. Además, en este tipo de ensayo, el antígeno no necesita ser fijado o desnaturalizado, por lo que puede interactuar con el anticuerpo de una forma más parecida a su conformación nativa, proporcionando una plataforma óptima para probar la especificidad de un mAb dado. Los LFA son dispositivos portátiles, fáciles de transportar y, por lo tanto, adecuados como pruebas in situ.
Para WNV existe un LFA desarrollado y aprobado para su uso en los EE.UU. Este ensayo sirve para detectar el linaje 1 de WNV en córvidos (Panella et al., 2001). No se ha demostrado que este ensayo en particular cubra toda la diversidad genética demostrada para este virus o por lo menos la mayor diversidad de linajes del WNV presente en Europa.
Además en Europa circulan conjuntamente otros flavivirus que hacen que el diagnóstico del WNV sea aún más complejo. Teniendo esto en cuenta, se necesitan nuevos métodos