UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
EFECTOS DE LA VITAMINA D EN DAÑO GENÓMICO Y SENESCENCIA CELULAR EN EL CONTEXTO DE LA FIBROSIS
INDUCIDA POR BLEOMICINA
TESIS DOCTORAL
TRINIDAD GUIJARRO LÓPEZ
Madrid 2018
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
EFECTOS DE LA VITAMINA D EN DAÑO GENÓMICO Y SENESCENCIA CELULAR EN EL CONTEXTO DE LA FIBROSIS
INDUCIDA POR BLEOMICINA
Memoria presentada por TRINIDAD GUIJARRO LÓPEZ.
Licenciada en Biología, para optar al grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid.
Director de Tesis: Dr. Alberto Zambrano Duarte Tutor: Francisco Sanz Rodríguez
Instituto de Salud Carlos III ISCIII-UAM
Madrid, 2018
CERTIFICA QUE: Trinidad Guijarro López, Licenciada en Biología por la Universidad Complutense de Madrid, ha realizado bajo su supervisión el trabajo titulado:
EFECTOS DE LA VITAMINA D EN DAÑO GENÓMICO Y SENESCENCIA CELULAR EN EL CONTEXTO DE LA FIBROSIS
INDUCIDA POR BLEOMICINA
El cual se considera satisfactorio y apto para ser presentado como Tesis Doctoral en el Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid.
Y para que conste donde proceda, se expide el presente certificado en Madrid a 17 de Septiembre de 2018.
Fdo. Alberto Zambrano Duarte
Investigador de la Unidad Funcional de Investigación de
Enfermedades Crónicas (UFIEC) del ISCIII
Visto a la luz de la evolución, la biología es, quizás, la ciencia más satisfactoria e inspiradora. Sin esa luz, se convierte en un montón de hechos varios, algunos de ellos interesantes o curiosos, pero sin formar ninguna visión conjunta.
Theodosius Dobzhanski
Al finalizar un trabajo tan arduo y lleno de dificultades como el desarrollo de una tesis doctoral es inevitable que te asalte un muy humano egocentrismo que te lleva a concentrar la mayor parte del mérito en el aporte que has hecho. Sin embargo, el análisis objetivo te muestra inmediatamente que la magnitud de ese aporte hubiese sido imposible sin la participación de personas e instituciones que han facilitado las cosas para que este trabajo llegue a un feliz término. Por ello, es para mí un verdadero placer utilizar este espacio para ser justo y consecuente con ellas, expresándoles mis agradecimientos.
En primer lugar, me gustaría dar las gracias al Dr Alberto Zambrano. Gracias por su paciencia, dedicación, motivación, criterio y aliento, que me ha permitido aprender mucho más que lo estudiado en el proyecto.
Agradecer a la Dra. Mª Jesús Fernández Aceñero, del Hospital Clínico San Carlos el análisis patológico de los pulmones.
Dar las gracias a aquell@s que han sufrido y se han enfadado por dentro, porque este día no llegaba, pero nunca han dejado de estar a mi lado:
Gracias a mis padres, hermano y abuelos por haberme apoyado en todas mis decisiones y por estar siempre a mi lado. Agradecer a mi madre y a mi abuela todo lo que me habéis dado, ¡que es demasiado!, ya que sin vuestro sacrificio, comprensión y confianza no hubiese podido avanzar, no solo durante el desarrollo de esta tesis, si no desde que sí mi primer paso. ¡Gracias por ser mi tierra firme por la cual camino! Un agradecimiento especial a mi hermano, que se lo prometí, por ser el técnico informático de esta tesis, encargado de descargarme los programas necesarios y ayudarme cuando el ordenador o los programas mismos me daban problemas y mi única solución era darle un golpe al ordenador. ¡Gracias Salva!
durante mi estancia en microbiología, en especial a Ana y a Marta, por ayudarme siempre que lo necesité, sobre todo, al principio con los cálculos de las concentraciones y por animarme cuando me daba el bajón. También a Manu por compartir conmigo en cultivos sus frustraciones del carné de conducir y hacerme más llevaderas las horas que pasaba en la campana.
A mis amigos. Ana, Fran, JC, Ismael, María, Juanmi y también a Néstor, por escuchar mis quejas y ponerle humor a los momentos más duros de esta tesis. Por animarme a continuar y no dejar que me rindiese. Espero poder ser de igual ayuda para vosotros cuando llegue el momento.
También me gustaría dar las gracias a dos personas sin las que esta tesis no hubiese llegado a buen término, pero que hoy en día no están en mi vida. Dani, muchas gracias por ayudarme siempre que lo necesité y pasarte horas y horas repasando mis conteos celulares para asegurarme de que estaban bien. Cris, gracias por creer siempre en mí y estar ahí siempre que lo necesité tanto dentro del laboratorio como fuera de él.
Gran parte del mérito de esta tesis es vuestro.
Agradecer a Dani (el ingeniero) todo su apoyo, por comprender lo que significa escribir una tesis doctoral, ya que también lo ha vivido en primera persona. Has sido un guía en estos últimos meses. ¡Gracias monito!
Por último, pero no menos importante, me gustaría dar las gracias a algunos profesores, tanto de la carrera como del instituto por animarme siempre a seguir por el camino de la investigación. A Javier, mi profesor de biología y a Ramiro mi profesor de Química del instituto, por contagiarme vuestra pasión por las ciencias. Al Doctor Zaballos por hacerme ver el mundo bajo la luz de la evolución y un agradecimiento muy especial a Julia, para mi eres un modelo a seguir, como mujer, como profesora, como investigadora y como persona.
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RESUMEN
La vitamina D es un secoesteroide conocido principalmente por su función en la regulación del metabolismo mineral y su acción sobre el sistema inmunitario. Además, puede influir en la proliferación y el estado redox celular. Algunas evidencias experimentales y la acumulación de datos epidemiológicos sugieren que la vitamina D puede favorecer la reparación de algunas lesiones en el ADN y que puede actuar como agente antioxidante y antienvejecimiento. La mayoría de las acciones de la vitamina D son genómicas y las ejerce mediante su unión al receptor de la vitamina D (VDR) que pertenece a la superfamilia de receptores nucleares de hormonas.
Los efectos pleiotrópicos de la vitamina D pueden influir en multitud de enfermedades crónicas como las que cursan con fibrosis. En el caso de la fibrosis hepática, por ejemplo, se ha descrito que la vitamina D podría atenuarla mediante su interferencia con la ruta profibrogénica regulada por TGFβ y los factores de transcripción SMADs. Sin embargo, no se conoce muy bien la función de la vitamina D en la fibrosis pulmonar. En un trabajo inicial de Zhang el al. (2015), la suplementación con vitamina D parecía inhibir la fibrosis en un modelo murino cuando ésta se administraba junto al agente inductor de la fibrosis. Su función potencial terapéutica, sin embargo, no se ha evaluado en este tipo de modelos fibróticos.
En este trabajo hemos estudiado la función de la vitamina D en la expresión de daño genómico y senescencia celular, inducidas por el antibiótico bleomicina, en miofibroblastos primarios humanos y en células alveolares tipo II (A549). Nuestros resultados indican que el tratamiento de células A549 con vitamina D aumenta los niveles de daño genómico y senescencia celular inducidas mediante el tratamiento con bleomicina. Sin embargo, en miofibroblastos, la bleomicina induce la activación fibrogénica de los mismos y la vitamina D no aumenta significativamente los niveles de daño genómico y de senescencia celular alcanzados con la bleomicina. El daño observado en todos los casos corresponde a roturas de cadena doble en el ADN y no es inducido por un aumento en los niveles intracelulares de las especies reactivas de oxígeno (ROS).
De acuerdo con los resultados obtenidos con los sistemas celulares, en un modelo murino de fibrosis pulmonar idiopática basado en la bleomicina, la vitamina D aumentó
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la expresión de daño genómico sobre todo en las células epiteliales y en áreas de re- epitelización aberrante. El tratamiento con vitamina D, además, se pudo asociar a un aumento de los niveles de fibrosis y con la severidad de la patología pulmonar observada.
En resumen, nuestros resultados indican que la suplementación “terapéutica” de vitamina D tiene unos efectos perjudiciales en un modelo murino de fibrosis pulmonar idiopática basado en el antibiótico bleomicina. Estos efectos se han podido relacionar con un aumento en los niveles de marcadores de daño genómico y de senescencia celular en células epiteliales pulmonares. Los resultados obtenidos en ambos modelos de estudio ilustran una nueva actividad de la vitamina D en presencia de daño genómico y desaconsejarían el uso terapéutico de la misma en pacientes con fibrosis pulmonar idiopática.
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ABSTRACT
Vitamin D is a secoesteroid known principally by its function in the regulation of the mineral metabolism and in the immunitary system. In addition, it can influence the cellular proliferation and redox status. Some experimental evidences and the accumulation of epidemiological information suggest that vitamin D can favor the repair of some lesions in DNA and that it might act as antioxidant and antiaging agents. The majority of the actions of the vitamin D are genomic and exerted by its binding to the vitamin D receptor (VDR) that belongs to the superfamily of nuclear hormone receptors.
The pleiotropic effects of vitamin D can influence many chronic diseases such as those characterized by fibrosis. In the case of liver fibrosis, for instance, it has been reported that vitamin D could attenuate it by interfering with the profibrogenic TGFβ pathway and the SMADs transcription factors. However, the role of vitamin D in pulmonary fibrosis is not well understood. In an initial paper by Zhang et al. (2015), vitamin D supplementation seemed to inhibit pulmonary fibrosis in a murine model when it was administered together with the fibrosis-inducing agent. Its potential therapeutic function, however, has not yet been evaluated in this type of fibrotic models.
In this work we have studied the role of vitamin D in the expression of DNA damage and cellular senescence, induced by the antibiotic bleomycin, in human primary myofibroblasts and in alveolar epithelial cells type II (A549). Our results indicate that the treatment of A549 cells with vitamin D increases the levels of DNA damage and cellular senescence induced by treatment with bleomycin. However, in myofibroblasts, bleomycin induces their fibrogenic activation of myofibroblasts and vitamin D does not significantly increase the levels of DNA damage and cellular senescence reached by bleomycin. In all cases the DNA damage observed corresponds to double-strand DNA breaks and is not induced by an increase in the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS).
In agreement with the results from the cellular systems, vitamin D increased the expression of DNA damage in a murine model of pulmonary idiopathic fibrosis based on bleomycin, especially in epithelial cells and in areas of aberrant reepithelization. The
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treatment with vitamin D could also be associated with an increase in the overall fibrosis levels and with the severity of the pulmonary pathology observed.
In summary, our results indicate that a "therapeutic" vitamin D supplementation has a detrimental effect in a murine model of idiopathic pulmonary fibrosis based on the antibiotic bleomycin. These effects are associated to an increase in the levels of markers of DNA damage and cellular senescence particularly in lung epithelial cells. The results obtained in both study models illustrate a new activity of vitamin D in the presence of DNA damage and would discourage the therapeutic use of vitamin D supplementation in patients with idiopathic pulmonary fibrosis.
AGRADECIMIENTOS ... 9
RESUMEN ... 13
ABSTRACT ... 15
ABREVIATURAS ... 23
INTRODUCCIÓN ... 29
1. La vitamina D ... 29
1.1. Metabolismo de la vitamina D ... 29
1.2. Funciones de la vitamina D ... 31
1.3. Funciones de la vitamina D en el pulmón... 34
1.4. El receptor de la vitamina D (VDR) ... 35
1.5. Mecanismos de regulación de la expresión génica por el VDR ... 37
2. Daño genómico y senescencia celular. ... 40
2.1. Especies reactivas de oxígeno (ROS)... 40
2.2. Respuesta al daño genómico y su reparación. ... 42
2.3 Definición y características de la senescencia celular. ... 43
2.4. Senescencia celular y reparación/remodelación tisular. ... 46
3. Fibrosis Pulmonar Idiopática. ... 49
3.1. Definición, epidemiología y tratamiento. ... 49
3.2. Etiología de la FPI. ... 51
3.3 Patogénesis de la FPI. ... 52
3.4 Bleomicina como modelo de fibrosis pulmonar. ... 54
OBJETIVOS ... 59
MATERIALESYMÉTODOS ... 63
1. Líneas celulares ... 63
2. Tratamientos con bleomicina y vitamina D ... 64
3. Reactivos, kits y anticuerpos ... 64
4. Inmunotransferencia (Western-Blot) ... 67
5. Inmunofluorescencia indirecta de células. ... 68
6. Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)... 69
7. Ensayo de la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia celular (SA-βGAL) ... 70
8. Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ... 71
9. Medición de las especies reactivas de oxígeno (ROS) ... 72
10. Irradiación de células con rayos gamma (γ) ... 73
11. Experimentos con animales ... 73
12. Inmunohistoquímica ... 74
13. Análisis estadístico ... 75
RESULTADOS ... 79
1. Efecto de la vitamina D y de la bleomicina en células A549 y miofibroblastos humanos ... 79
1.1 Efectos de la vitamina D en células A549 (alveolares tipo II: ATII) ... 79
1.2 Efectos de la vitamina D en miofibroblastos primarios pulmonares humanos ... 83
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3. El aumento en los niveles de CDKN2A inducidos por la vitamina D en presencia de
bleomicina está mediado por un mecanismo postranscripcional ... 91
4. La Vitamina D exacerba la inducción de fibrosis pulmonar mediada por la bleomicina, incrementando la expresión de daño genómico ... 94
DISCUSIÓN ... 103
CONCLUSIONES ... 113
BIBLIOGRAFÍA ... 117
ANEXOS………139
23
ABREVIATURAS
·O2-: anión superóxido.
·OH: radical hidroxilo.
A549: Células A549. Células alveolares humanas tipo II.
ATCC: American Type Culture Collection.
ACTA2: actina α del músculo liso.
ACTB: actina beta.
ANOVA: análisis de la varianza.
8-OH-dG: 8-hidroxy deoxyguanosina.
ADN: ácido desoxirribonucleico.
ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario.
ARN: ácido ribonucleico.
ARNm: ácido ribonucleico mensajero.
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated kinase
ATP: adenosín trifosfato.
ATR: ataxia telangiectasia related kinase.
BCA: ácido bibinconínico.
BER: base escisión repair.
bp: pares de bases.
BrdU: bromodeoxiuridina.
BSA: albúmina de suero bovina.
CDK: quinasa dependiente de ciclinas.
CDKN1A: P21 [inhibidor 1A de quinasas dependientes de ciclinas]
CDKN2A: P16 [inhibidor 2A de quinasas dependientes de ciclinas]
ChIP: Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina
COL1A1: colágeno tipo 1.
COL3A1: colágeno tipo 3.
CYP24A1: citocromo P450, familia 24, subfamilia A, miembro 1.
DBD: dominio de unión a ADN.
DBP: Vitamin D binding protein DD foci: DNA damage foci.
DDR: DNA damage response.
DMEM: medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco.
DMSO: dimetilsulfóxido.
DNAse I: deoxirribonucleasa I.
DRs: repeticiones directas.
DSB: double-strand DNA breaks. Roturas de doble cadena en el ADN.
E2F: factor de transcripción E2F.
ECL: Enhanced chemiluminiscence.
ETOH: etanol.
FDG: Focos de daño genómico.
Fig.: figura.
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FITC: fluoresceína.
Foci: del latín, focos.
GSH: glutatión reducido.
Gy: gray. 1 julio de energía absorbida por kg de material irradiado.
h: horas
H2AFX: histona de la familia H2A miembro X.
H2DCFDA: 2’, 7’ diclorofluoresceína diacetato.
H3K927-3me: histona 3 trimetilada en la lisina 27.
IF: inmunofluorescencia.
IgG: inmunoglobulinas de la subclase G.
IHC: inmunohistoquímica.
IMR90: fibroblastos humanos diploides (ATCC: CCL-186).
mAb: anticuerpo monoclonal.
MAPKs: proteínas quinasas activadas por mitógenos.
mg: miligramo.
mg/kg b.d. mg por cada kg de peso corporal
min: minuto.
mL: mililitro.
MMEJ: Micro homology-mediated end joining.
MMR: DNA Mismatch Repair.
MW: Multiwell.
NAC: N-acetil-cisteína.
NADH: forma reducida del NAD+
(nicotinamida adenina dinucleótido).
NCBI: National Center for Biotechnology Information.
NHEJ: Non-homologous end joining.
NER: Nucleotide excision repair.
nm: nanómetro.
NRs: receptores nucleares.
ns: estadísticamente no significativo.
O2: oxígeno molecular.
ºC: grados centígrados.
ON: overnight.
PBS: tampón fosfato salino pH 7, 5.
PCR: reacción en cadena de la polimerasa.
PDLs: population doublings levels PFA: paraformaldehído.
PMSF: fenil-metil-sulfonil-fluoruro.
PTK2: quinasa de adhesión focal (FAK) R: reverso.
r.p.m.: revoluciones por minuto.
RNAse A: ribonucleasa A.
RNS: especies reactivas de nitrógeno.
ROS: especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxigen Species).
RT-qPCR: RT-PCR cuantitativa o en tiempo real.
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RT: temperatura ambiente.
RXR: Retinoid X receptor.
s: segundo.
s.d.: desviación estándar.
SA-β-Gal: actividad β-galactosidasa asociada a senescencia.
SAHF: focos de heterocromatina asociados a senescencia celular.
SASP: fenotipo secretor asociado a células senescentes.
SC: senescencia celular.
SDS-PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS.
SDS: dodecil sulfato sódico.
SFB: suero fetal bovino.
SSB: single-strand DNA breaks.
TBP: TATA box binding protein.
TGFB: Tumor growth factor β.
TP53BP1: TP53 binding protein 1.
TUBA1A: tubulina α 1a u.a.: unidades arbitrarias.
UV: ultravioleta.
VDR: receptor de vitamina D.
VIM: vimentina.
WB: western blot.
wt: wild type (fenotipo normal).
Xgal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β- D3galactopiranósido
µg: microgramo.
µM: micromolar.
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INTRODUCCIÓN
1. La vitamina D
La vitamina D es un secoesteroide hidrofóbico involucrado en la homeostasis de calcio, magnesio, hierro, fosfato y zinc. La forma biológica de la vitamina D (1α, 25- dihidroxivitamina D3, a partir de ahora vitamina D) ejerce su actividad a través de la unión al receptor de vitamina D (VDR), un miembro de la superfamilia de los receptores nucleares, que actúa como un factor de transcripción dependiente de ligando (1-3).
Además de su función en el metabolismo mineral, la vitamina D regula multitud de procesos fisiológicos como el crecimiento, la diferenciación y la morfogénesis de los organismos superiores (4). Estas actividades tan importantes permiten a la vitamina D ser determinante en algunas enfermedades crónicas incluyendo enfermedades autoinmunes (213), cardiovasculares (161), respiratorias (214-218) y fibróticas (112,212- 123).
Figura 1. Estructura química del es 1α, 25-dihidroxivitamina D3 o calcitriol. (Sigma-Aldrich, 2016).
1.1. Metabolismo de la vitamina D
La vitamina D3 o colecalciferol se obtiene principalmente de dos fuentes: la dieta (10%) y de la producción endógena a través de la conversión fotoquímica (90%) (106,107). Esta síntesis endógena se induce por la exposición de la piel a la luz ultravioleta B (UVB) (290 a 315 nm), que genera la conversión de 7-dehidrocolesterol a pro-vitamina D3, lo cual es seguido por una isomerización no enzimática a vitamina D3 (108,109) (Figura 2).
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Para ejercer sus efectos fisiológicos, la vitamina D tiene que convertirse en su forma activa. Para ello es transportada por una proteína que interacciona con vitamina D (DBP) a través del torrente circulatorio hasta el hígado donde sufre un proceso de hidroxilación en el carbono 25, dando lugar a 25-hidroxivitamina D3 (25OHD), también conocida como calcidiol o hidroxicolecalciferol (106, 110). Esta 25OHD es transportada por la DBP hasta el riñón, para completar su proceso de activación en el túbulo proximal donde es hidroxilada por la 1α-hidroxilasa en el carbono 1 para convertirse en la forma activa de la vitamina D3, denominada 1,25-dihidroxivitamina D3 o calcitriol, que actúa sobre el intestino para estimular la absorción de calcio, sobre los túbulos renales para estimular la reabsorción de calcio y directa, o indirectamente, sobre las paratiroides para suprimir la secreción de la hormona paratiroidea (PTH) (10). Esta forma biológicamente activa es la que hemos empleado en el presente estudio y es denominada vitamina D a lo largo del mismo.
Figura 2. Síntesis y metabolismo de la vitamina D3. Durante la exposición a la luz UBV, el 7- dehidrocolesterol que se encuentra en la piel es convertido a pro-vitamina D3, y ésta, a su vez, es inmediatamente convertida en vitamina D3 por la radiación UV. La vitamina D3 es transportada al hígado por la DBP, donde es convertida en 25-hidroxivitamina D3. La etapa de activación final, la 1α hidroxilación, ocurre en el riñón donde se forma la 1α,25-dihidroxivitamina D3, la forma biológicamente más activa de la vitamina D. El catabolismo se lleva a cabo por una enzima llamada 24-hidroxilasa, que cataliza una serie de etapas de oxidación que tienen como resultado la escisión de una cadena lateral. (Adaptado de Espinosa Z et al. 2011)
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El riñón también puede producir 24,25-dihidroxivitamin D3, que es un metabolito relativamente inactivo comparado con la 1,25-dihidroxivitamina D3. La enzima 24- hidroxilasa, puede hidroxilar tanto la 25-hidroxivitamina D3 como la 1,25- dihidroxivitamina D3, siendo esta última, el sustrato preferido. La vitamina D regula su propia síntesis al estimular la expresión del factor de crecimiento FGF23, que es secretado por los osteocitos en respuesta a niveles altos de calcitriol. FGF23 inhibe la producción renal de 1,25-dihidroxivitamina D3, mediante la limitación de la actividad 1α-hidroxilasa en el túbulo proximal renal y por aumento de la expresión simultánea de 24α-hidroxilasa (113). Específicamente, la 24-hidroxilasa limita la cantidad de 1,25- dihidroxivitamina D3 en los tejidos, acelerando su catabolismo a 1,24,25- trihidroxivitamina D3, y luego a ácido calcitroico (forma inactiva), que se excreta por la orina. También puede hidroxilar la 25-hidroxivitamina D3 para formar 24,25- dihidroxivitamina D3, con lo que se disminuye la cantidad de 25-hidroxivitamina D3
disponible para la 1α-hidroxilasa (Figura 2) (106, 108).
1.2. Funciones de la vitamina D
La función principal de la vitamina D es la regulación del metabolismo mineral. La vitamina D induce la absorción de minerales y la mineralización de los huesos mediante su acción sobre células epiteliales intestinales, renales, osteoblastos y osteoclastos. La vitamina D es fundamental para el mantenimiento de la integridad estructural y función del sistema musculoesquelético (141). Dentro de los principales genes diana regulados por la vitamina D en estos tejidos se encuentran transportadores de calcio y fosfato, bombas iónicas en intestino y riñón, y el factor de diferenciación osteoclastogénica sintetizado por los osteoblastos, que estimula la actividad de los osteoclastos y la formación de nuevo tejido (4). La deficiencia de vitamina D se ha relacionado con debilidad muscular proximal, parestesias y molestias en los músculos (142-145). El análisis histológico de músculo esquelético de adultos con deficiencia de vitamina D revela grandes espacios interfibrilares, infiltración de grasa, presencia de gránulos de glucógeno, fibrosis y atrofia de las fibras musculares tipo II (relacionadas con la contracción rápida) (146-149). Se cree que esto puede ser debido a la capacidad de la
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vitamina D para actuar sobre la composición de la fibra muscular y, por lo tanto, la estructura del músculo esquelético (146,148).
La vitamina D también regula múltiples mecanismos muy importantes del sistema inmune innato y adaptativo (113). En los macrófagos estimula la diferenciación de los precursores monocíticos hacía macrófagos maduros; además, estas células son capaces de sintetizar vitamina D si se las estimula con interferón γ (IFNγ) (133). También tiene efecto sobre las células dendríticas y su función de presentación de antígenos; inhibe la maduración de las células dendríticas derivadas de los monocitos, suprimiendo así su capacidad para presentar antígenos (134). En cuanto a la inmunidad adaptativa, la vitamina D suprime la proliferación, diferenciación y producción de inmunoglobulinas por parte de los linfocitos B. En cuanto a los linfocitos T, modula la proliferación y producción de citoquinas. En este sentido inhibe la expresión de citoquinas Th1 (IL-2, IFNγ) e induce la expresión de citoquinas Th2 (IL-4, IL5-, IL-10) (135). Además, la vitamina D, induce la generación de linfocitos T reguladores (Treg), productores de IL-10, que promueven la tolerancia a autoantígenos (135).
La vitamina D y su receptor (VDR) también tienen una serie de efectos sobre la homeostasis cutánea (150). Se ha demostrado que la vitamina D inhibe la proliferación de queratinocitos, y estimula la diferenciación de estas células, ya que induce la expresión del receptor sensible al calcio (CaSR) que es fundamental para la regulación de la diferenciación de los queratinocitos (152). Los análogos de la vitamina D también se han usado clínicamente para tratar la psoriasis, un trastorno cutáneo asociado con anormalidades en la proliferación y diferenciación de los queratinocitos. Además de sus efectos sobre la diferenciación epidérmica, el VDR ha demostrado ser esencial para la integridad del folículo piloso (151). El VDR se expresa en las dos principales poblaciones de células que componen el folículo piloso: las células de la papila dérmica mesodérmica y los queratinocitos epidérmicos. La expresión de VDR en el folículo piloso aumenta durante las dos últimas etapas del crecimiento folicular (catágena, en la que el pelo se separa de la papila que lo alimenta y deja de crecer y telógena, en la que el pelo finalmente cae y ya no vuelve a crecer), lo que se correlaciona con una proliferación disminuida y una mayor diferenciación de los queratinocitos (136).
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La vitamina D es un agente antiinflamatorio natural muy potente. Regula, junto con GABPA (NRF2), un factor de trascripción sensible al estado redox, la expresión de γ- glutamilcisteina sintasa (γGCSh), que contribuye a la síntesis de glutatión reducido (GSH), un antioxidante endógeno muy potente (137), reduciendo así la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (118). También disminuye los niveles de NAPDH oxidasa (NOX), encargada de producir ROS (138), mientras que aumenta los niveles de la enzima superóxido dismutasa (SOD) que convierte el anión superóxido (.O2-) en H2O2 (139).. La vitamina D también mejora la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), de la glutamato cisteína ligasa (GCLC) y de la glutatión reductasa (GR) para aumentar la formación de GSH (140), y aumenta la expresión de glutatión peroxidasa (Gpx) que conduce a la conversión del H2O2 en agua (139).
La vitamina D tiene funciones en el envejecimiento relacionadas con la supresión de la vía de señalización Wnt/β-catenina (120,159) y con el gen anti-envejecimiento KLOTHO, el cual está regulado por la vitamina D (119), y es capaz de inhibir las vías de señalización Wnt, que regula positivamente la renovación de células troncales y progenitoras, retardando así el inicio de cambios relacionados con el envejecimiento (158) y la vía de señalización insulina/IGF1, que está relacionada con el proceso de envejecimiento y cuya reducción se ha visto que frena el envejecimiento en varios organismo, incluidos los humanos (153-157). También es importante en el control del ciclo celular (112), inhibiendo la proliferación celular por disminución de la expresión de ciclina D y promoviendo la expresión de inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas (CDKs) como P21 (CDKN1A) y P27 (CDKN1B) (114,115) o por la inhibición de la vía de señalización PI3K/Akt/mtor (116,117). A través de estas acciones sobre el ciclo celular la vitamina D puede tener actividad antitumorigénica (27); se ha sugerido que la vitamina D podría inhibir la progresión de varios tipos de cáncer (109, 163, 181,273).
La vitamina D está implicada en varias patologías crónicas como la obesidad, ya que su déficit favorece la lipogénesis (162); la enfermedad cardiovascular, debido a una acción directa sobre los cardiomiocitos o por inhibir el sistema renina-angiotensina- aldosterona (RAS) disminuyendo así la tensión arterial (161). La vitamina D también posee un efecto neuroprotector; su deficiencia está relacionada con Parkinson, esquizofrenia y
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esclerosis múltiple (163), por un aumento en la señalización redox y la señalización intracelular del Ca2+ (164,165).
Finalmente, se ha descrito que la vitamina D y sus análogos también participan en la regulación de varios tipos de fibrosis como la fibrosis renal, cardíaca, hepática o pulmonar (112,121-123). El ejemplo más claro se ha descrito en el contexto de la fibrosis hepática, donde el VDR es capaz de interferir transcripcionalmente con la ruta de TGFβ1- SMADs e inhibir, por tanto, la activación de la respuesta profibrótica tras el daño hepático (5). Esto también se ha descrito en la fibrosis renal, donde la inhibición de la vía TGFβ- SMAD por VDR atenúa la progresión de la enfermedad (160).
1.3. Funciones de la vitamina D en el pulmón
Aunque el receptor de la vitamina D se expresa en pulmón abundantemente (175) no se conoce la función de la vitamina D en la función pulmonar. Unos estudios epidemiológicos recientes han sugerido que la vitamina D podría tener una función importante en diversas enfermedades respiratorias. De hecho, la deficiencia de vitamina D parece ser un elemento común en algunas enfermedades respiratorias (10,11), como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la neumonía y la fibrosis quística (FC) (12-14). Un elemento común a la mayoría de las enfermedades pulmonares crónicas es la inflamación y la desregulación inmune asociada. Un aumento de los niveles basales de marcadores proinflamatorios se ha asociado a menudo con un peor estado de la enfermedad (167). El efecto beneficioso de la vitamina D sobre estas enfermedades podría estar relacionado con su función antiinflamatoria e inmunomoduladora (167). La vitamina D induce el cambio a una respuesta Th-1, menos pro-inflamatoria, a través de la producción de IL-10 (171), una citoquina con propiedades antiinflamatorias. En relación con enfermedades respiratorias infecciosas, se ha descrito una asociación entre la deficiencia de vitamina D y las infecciones por Pseudomonas aeruginosa o Mycobacterium tuberculosis (15), así como un incremento en la incidencia de las exacerbaciones pulmonares.
En cuanto a la fibrosis pulmonar, varias evidencias vinculan la vitamina D y la inhibición de la proliferación de fibroblastos (168), reduciendo así la síntesis y secreción
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de componentes de la matriz extracelular en respuesta a estímulos inflamatorios (19).
Por otra parte, se ha descrito que la vitamina D regula negativamente las metaloproteinasas, que son capaces de degradar el colágeno (16), pudiendo ser un factor importante en la remodelación pulmonar de las enfermedades pulmonares crónicas.
La vitamina D inhibe la respuesta de remodelación tisular mediada por TGFβ en cultivos de fibroblastos primarios y bloquea la transformación de fibroblastos en miofibroblastos por TGFβ1 (20-26). Estas células son productoras de colágeno, citoquinas, factores de crecimiento, quimioquinas y mediadores de inflamación, por lo que estimulan a los linfocitos y neutrófilos (220) intensificando y prolongando la inflamación asociada a la fibrosis (221). También la vitamina D puede inhibir la transición epitelio-mesenquima (EMT) inducida por TGFβ, proceso mediante el cual las células epiteliales se transforman en miofibroblastos (166). Otro mecanismo adicional por el cual la vitamina D puede inhibir la fibrosis está relacionado con el sistema renina-angiotensina (RAS) (224). La deficiencia de vitamina D estimula la activación del RAS (19) y esta activación crónica parece promover la fibrosis pulmonar, causando un incremento en la expresión de proteínas de la matriz extracelular y factores fibrogénicos (17,18).
En un trabajo experimental, la suplementación preventiva de vitamina D inhibió la fibrosis pulmonar inducida en ratones por el antibiótico bleomicina, probablemente debido a sus efectos antiinflamatorios (8). Sin embargo, la potencial función
"terapéutica" de la administración de vitamina D no se ha evaluado hasta ahora en el contexto de la fibrosis pulmonar.
1.4. El receptor de la vitamina D (VDR)
La superfamilia de receptores nucleares (NRs) incluye a los receptores de hormonas tiroideas y esteroideas, retinoides, vitamina D, etc., así como receptores
“huérfanos” cuyos ligandos se desconocen desconocido (Tabla 1). Los receptores nucleares se consideran en general como factores de transcripción dependientes de ligando.
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Tabla 1. . Esquema de la superafamilia de receptores nucleares. M (Monómero); D (Homodímero); H (Heterodímero); DR (Repetición directa); Pal (Palíndrome); IP (Palíndorme invertido). (Aranda A, Pascual A 200131)
El VDR, como la mayoría de los NRs, es una proteína modular con tres dominios principales (29) (Figura 3)los cuales son funcionalmente autónomos y además presentan la capacidad de ser intercambiables con los de otros NRs relacionados, sin perder su capacidad funcional (30).
Figura 3. Receptor de la vitamina D (VDR). La región A/B incluye el dominio de transactivación independiente de ligando AF1; la región C incluye el dominio de unión al ADN (DBD). La región D es un dominio bisagra y la región E/F contiene los dominios de unión al ligando (LBD), de dimerización y de transactivación dependiente de ligando (AF-2). (Adaptado de Aranda A, Pascual A 200131)
El amino terminal (también conocido como región A / B) contiene un dominio de transactivación (AF-1), que es de longitud y secuencia variables en los diferentes
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miembros de la familia, y es reconocido por co-activadores y otros factores de transcripción. La región C o el dominio central de unión al ADN (DBD) está compuesta por dos “dedos de zinc”, siendo el dominio más conservado entre los NRs y cuya función principal consiste en el reconocimiento de secuencias específicas de las regiones reguladoras de los genes diana. La región D, o región bisagra, es una región flexible que conecta los dominios LBD y DBD y presenta señales de localización nuclear y secuencias que median la unión a correpresores (30). La región E o dominio de unión a ligando (LBD), con función de activación inducida por ligando (conocida como AF-2) es responsable de la unión de ligando y de la transactivación dependiente de ligando, mediada esta última por el dominio AF-2, y además media la homo- y hetero-dimerización de los receptores (31). El LDB está compuesto por 12 hélices α que forman una estructura compacta que comprende el bolsillo de unión al ligando (32). La unión del ligando conlleva un importante cambio conformacional en la estructura del receptor que conduce a la formación de una estructura más compacta en la que destaca la recolocación de la hélice 12 hacia una posición que cierra la cavidad en la que se encuentra el ligando.
1.5. Mecanismos de regulación de la expresión génica por el VDR
Los RNs actúan uniéndose a través de su dominio de unión a DNA a los elementos de respuesta a hormona (HREs), que son cortas secuencias de DNA formadas por palíndromes, palíndromes invertidos o repeticiones directas de las secuencias consenso AGGTCA o AGGACA espaciadas por un número variable de nucleótidos. Las separaciones óptimas de estos hemisitios son 0, 4 ó 6 nucleótidos, respectivamente. Estos elementos están localizados en las regiones reguladoras de los genes diana, aunque datos recientes indican que estos elementos pueden encontrarse en regiones intragénicas alejadas del sitio de inicio de transcripción (28).
Aunque los NRs pueden reconocer estos motivos en forma de monómeros, la mayoría, incluyendo el VDR, se unen al DNA en forma de dímeros; homodímeros (en el caso de los receptores de esteroides) y heterodímeros. En el caso de los receptores heterodiméricos, la pareja de elección para todos ellos es el denominado Retinoid X Receptor o RXR (28) que otorga al complejo una mayor capacidad de unión al DNA (Tabla 1).
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Los efectos transcripcionales del VDR están mediados por el reclutamiento de coactivadores y correpresores (31). En ausencia el VDR actúa como represor transcripcional, debido a su asociación con correpresores como NCOR y NCOR2 (SMRT) que sirven como elementos de “docking” para complejos transcripcionales que contienen desacetilasas de histonas (HDACs) cuya actividad causa la compactación de la cromatina y, por tanto, la represión transcripcional. Tras la unión del ligando, el VDR sufre un cambio conformacional que produce la liberación de los correpresores y permite el reclutamiento secuencial de diferentes complejos de coactivadores (33).Este cambio conformacional implica un replegamiento de la α-hélice 12 que contiene el dominio AF- 2 que, junto con residuos localizados en las hélices 3 y 4 forma un surco hidrofóbico que acomoda el dominio de interacción de los coactivadores con el receptor (125-127). Entre los coactivadores se encuentran complejos remodeladores de la cromatina dependientes de ATP y complejos que contienen acetiltransferasas de histonas que causan la descompactación de la cromatina permitiendo la unión de la maquinaria basal de transcripción, así como complejos que causan el reclutamiento de la RNA polimerasa II al promotor permitiendo la transcripción del gen diana (Figura 4).
Tanto los receptores como los coactivadores y correpresores sufren diversas modificaciones postraduccionales en respuesta a diferentes estímulos externos (fosforilación, acetilación, ubiquitinación, sumoilación etc.) que afectan a su actividad, niveles o localización subcelular, modulando así la expresión génica dependiente del receptor.
39 Figura 4. Los receptores nucleares regulan la transcripción uniéndose a elementos de respuesta (HREs).
Su actividad está regulada por un intercambio de corepresores (CoR) y coactivadores (CoA). Tanto los receptores como estos coreguladores son dianas de fosforilación (P) por vías de señalización iniciadas en la membrana celular y de otras modificaciones como acetilación (Ac), metilación (Me), ubiquitinación (Ub) o sumoilación (Su) que alteran su actividad. Una subpoblación baja de receptores localizada fuera del núcleo puede inducir efectos no-genómicos. (Aranda A, 200929)
El VDR también puede reprimir la expresión génica de forma dependiente de ligando. En algunos casos, esta represión se debe a una inhibición pasiva debido a la competición con otros transactivadores por los sitios de unión del ADN o bien por la formación de heterodímeros transcripcionalmente inactivos. En otros casos esta represión requiere la unión del receptor a un HRE “negativo” (nHRE) y median una represión activa en presencia de ligando. Aunque las propiedades de estos elementos aún no son bien conocidas, los correpresores y desacetilasas parecen estar implicadas en la regulación negativa dependiente de ligando. Habitualmente, los nHRE negativos se localizan muy próximos al sitio de inicio de transcripción, algunos se sitúan por debajo de la caja TATA (30, 128) y en algunas ocasiones, incluso están presentes en la región 3’ no traducida del gen (23). El VDR puede también modular la expresión de genes que no contienen HREs a través de la interferencia con la actividad de otros factores de transcripción y otras vías de señalización. Por ejemplo, puede reprimir la expresión de genes que contienen sitios NF-κB, AP-1 o CRE (6). Por otro lado, múltiples quinasas activadas por señales extracelulares como las PKA o caseína quinasas afectan a la
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actividad del VDR (129), o de corrrepresores y coactivadores, como, por ejemplo, a través de la fosforilación de NCOR2 por tirosina quinasas que causa su disociación del receptor (30).
Por último, el VDR puede causar efectos rápidos denominados “no genómicos”, independientes de transcripción, que podrían estar mediados por una fracción de receptores asociada a la membrana celular y que podrían producir la activación de kinasas o inducir la movilización de calcio provocando así diversos efectos biológicos (Figura 4).
2. Daño genómico y senescencia celular.
Las lesiones que diversos agentes químicos y físicos pueden inducir en el ADN pueden cambiar su estructura y comprometer una replicación fidedigna y precisa del genoma (176). Estas lesiones pueden producirse por procesos endógenos e incluyen, entre otras, la oxidación, alquilación (generalmente metilación) e hidrólisis de bases, o el desapareamiento de bases durante la replicación del ADN. Los agentes externos, como luz ultravioleta, radiación ionizante y químicos genotóxicos, pueden inducir entre otras lesiones la formación de dímeros de pirimidina, la generación de aductos en el ADN y roturas en el ADN tanto de cadena simple (SSBs, single-strand DNA breaks) como de doble cadena (DSBs, double-strand DNA breaks) (177). En presencia de daño genómico la célula pone en marcha una respuesta al mismo (DDR, DNA damage response) cuyos objetivos son iniciar los mecanismos enzimáticos implicados en la reparación del daño y la inducción de una parada proliferativa para evitar así su propagación (176-179).
2.1. Especies reactivas de oxígeno (ROS)
Las ROS son compuestos que se derivan de la molécula de oxígeno (02) que o bien son radicales libres o pueden formarlos con facilidad (34). Son generalmente moléculas muy pequeñas altamente reactivas debido a la presencia de electrones de valencia no apareados. Las ROS radicales más comunes en los sistemas biológicos son el anión
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superóxido (·O2-), óxido nítrico (·NO) y radicales hidroxilo (·OH). Los ROS no radicales son el H2O2, ozono, peroxinitrato e hidróxido entre otros.
Todas las ROS son producidas como consecuencia del metabolismo, en la mitocondria, por la “fuga” de electrones de la cadena transportadora de electrones (35- 36) o también pueden producirse como productos secundarios en ciertas reacciones bioquímicas como la β-oxidación de ácidos grasos en peroxisomas, la síntesis de prostaglandinas y reacciones detoxificantes que implican al citocromo P450. Las ROS son esenciales para la producción de energía, la síntesis de compuestos esenciales y la fagocitosis. También son importantes en la transducción de señales implicadas en crecimiento y diferenciación y ayudan a eliminar patógenos y partículas extrañas (37-39).
Las ROS radicales son moléculas altamente reactivas, debido a que suelen captar un electrón de moléculas estables para de esta forma alcanzar su estabilidad electroquímica. Si esto se produce, la molécula que cede el electrón pasa a ser un nuevo radical libre, lo que inicia una reacción en cadena (130,131). De este modo las ROS pueden producir oxidación de proteínas y de ácido nucleicos y peroxidación lipídica. Así, las ROS producen la modificación oxidativa de moléculas como ADN, proteínas o lípidos.
Un aumento en los niveles de ROS puede estimular la proliferación celular o incluso provocar apoptosis o senescencia celular. Sin embargo, un gran incremento en los niveles de ROS puede causar un daño oxidativo irreversible y necrosis (40). La regulación de la homeotasis redox, por tanto, es un proceso vital en la célula.
Las células han desarrollado sistemas de protección para limitar la producción de ROS y su acumulación en compartimentos celulares, como la mitocondria, la membrana plasmática, el citosol o los peroxisomas. El mecanismo de acción de estos sistemas es la conversión de ROS en moléculas menos reactivas a través de un proceso conocido como scavenging o por mecanismos que impiden la reacción de ROS con otras moléculas para generar especies más reactivas (25). Estos sistemas incluyen las enzimas superóxido dismutasas (SOD) (35, 25,42-44), catalasa (CAT), peroxirredoxinas, tiorredoxinas (TRX), el sistema glutatión y las proteínas desacoplantes (UCPs). La célula tiene también moléculas orgánicas que ayudan a este proceso de detoxificación como el ascorbato, el piruvato, los flavonoides y los carotinoides.
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2.2. Respuesta al daño genómico y su reparación.
Según estimaciones, una célula está sometida a 1 millón de lesiones por día (48).
Las lesiones producidas en el ADN pueden tener origen endógeno dando oxidación, alquilación, hidrólisis de bases o desapareamiento de bases durante la replicación del ADN o exógeno que lleva a formación de dímeros de pirimidina, la generación de aductos en el ADN y roturas en el ADN tanto de cadena simple (SSBs) como de doble cadena (DSBs) (48).
Para mantener la integridad del genoma, las células tienen mecanismos que detectan y reparan el daño en el ADN. En estos mecanismos intervienen multitud de proteínas, que constituyen una compleja red que se pone en marcha cuando se produce un daño en el ADN. Dentro de esta red de respuesta al daño en el ADN se encuentran las vías de reparación del daño, así como los puntos de control del ciclo celular y los mecanismos de tolerancia al daño (45-47).
En los SSBs, la cadena no dañada puede servir como molde para su reparación.
Hay tres mecanismos encargados de reparar este tipo de lesiones. El BER (Base Excision Repair) se encarga de la reparación de la base afectada por oxidación, alquilación, hidrólisis y desaminación, e implica actividades como ADN glicosilasa, endonucleasa, polimerasa y ligasa. El NER (Nucleotide Excision Repair) reconoce lesiones que distorsionan la hélice y el MMR (DNA Mismatch Repair) que repara errores de desapareamiento durante la replicación o recombinación (48)
Los DSBs son muy peligrosos y pueden llevar a reorganizaciones genómicas.
Existen tres mecanismos implicados en la reparación de DSBs (48). El NHEJ (Non- Homologous End Joining), en el que una ligasa especializada une los dos extremos. Este mecanismo se basa en secuencias cortas homólogas presentes en las extensiones de ADN de cadena simple. Si estos extremos son compatibles la reparación es correcta, pero a veces este mecanismo puede introducir mutaciones. El MMEJ (Microhomology-Mediated End Joining) y la recombinación homóloga que requiere una secuencia idéntica o casi idéntica cercana para servir como molde en la reparación. Esta ruta permite la reparación del cromosoma dañado usando una cromátida hermana o un cromosoma homólogo como molde.
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Cuando ocurre un daño en el ADN, los puntos de control (checkpoints) del ciclo celular se activan induciendo una pausa en el ciclo celular para corregir las lesiones producidas antes de continuar la división celular. Estos puntos de control tienen lugar en G1/S y G2/M principalmente, aunque existe otro punto de control en la fase S (intra-S checkpoint). Estos puntos de control están controlados por dos quinasas fundamentales:
ATM (Ataxia telangiectasia mutated kinase) y ATR (Ataxia telangiectasia related kinase).
ATM responde a DSBs y a alteraciones en la estructura de la cromatina (49), mientras que ATR actúa principalmente en las horquillas de replicación colapsadas (50). Estas quinasas fosforilan una serie de dianas en una cascada de transducción de señales, dando lugar, eventualmente, a un bloqueo en el ciclo celular.Algunas de las proteínas mediadoras encargadas de transmitir la señal de activación a otras proteínas que actúan por debajo de estas quinasas son BRCA1, MDC1, TP53 y TP53BP1 (132). Los dos sustratos clave relacionados con puntos de control, CHK1 y CHK2, se fosforilan por ATR o ATM, respectivamente (51); esta fosforilación da como resultado un bloqueo de la replicación del ADN y se activa la reparación del daño producido (52).
Un intermediario clave de los sensores es la variante H2AFX de la histona H2A, (53), que se fosforila tras un daño en el ADN, preferentemente tras la aparición de DSBs.
A los pocos segundos de haberse producido el daño, miles de moléculas de H2AFX son fosforiladas (γH2AFX), y se incorporan en los sitios de las roturas, formándose los focos de daño al ADN (54). Hay otros componentes de la respuesta de daño al ADN, como son T53BP1 y MCD1 que colocalizan en estos focos junto a γH2AFX (55-57).
2.3 Definición y características de la senescencia celular.
Una respuesta celular al daño genómico consiste en la entrada en un proceso denominado senescencia celular (SC). La SC es un estado fisiológico caracterizado principalmente por una parada proliferativa irreversible que ocurre cuando las células están sometidas a algún tipo de estrés, como la disfunción telomérica, el estrés oxidativo, el daño genómico y diferentes drogas quimioterapéuticas (58). Además, recientemente, se ha reconocido a la SC como un mecanismo fisiológico que puede ocurrir en ausencia de daño, ligado a la remodelación de tejidos y que puede ser beneficiosa o perjudicial dependiendo del contexto donde tenga lugar (58). La función principal de la SC es la
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prevención de la proliferación de células dañadas. Además de la ausencia de proliferación, las células senescentes exhiben otras características cuyo agregado define el fenotipo senescente. Entre otras características está la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-gal); se cree que esta actividad deriva de la enzima lisosomal β-galactosidasa y refleja un incremento en la biogénesis lisosomal, hecho que se produce de forma característica en células senescentes (59), pero no de forma exclusiva. Además, estas células senescentes expresan el gen supresor de tumores P16ink4a (CDKN2A) (60-62), (que regula negativamente la proliferación celular a través de la inhibición de la quinasa CDK4A), presentan lesiones en el ADN (daño genómico) y son muy activas secretando factores de crecimiento, citoquinas proinflamatorias y proteasas con actividad auto y paracrina, que determinan el denominado fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP) (58,63). Además, presentan dominios nucleares de heterocromatina enriquecidos en modificaciones de histonas como H3K9-3me (SAHF, focos de heterocromatina asociados a senescencia).
La SC se puede dividir en dos subtipos: senescencia replicativa y senescencia prematura inducida por estrés.
La senescencia replicativa es consecuencia del acortamiento de los telómeros causado por las repetidas replicaciones del ADN en ausencia de telomerasa. El acortamiento de los telómeros produce una DDR persistente que tiene la capacidad de iniciar y mantener el bloqueo de crecimiento en senescencia (64,65). Como consecuencia, se produce la activación del gen supresor de tumores TP53 que es un importante mediador de la senescencia inducida por el acortamiento de telómeros (66,67). Este tipo de senescencia contribuye de forma fundamental a la limitación de la proliferación, confiriendo una capacidad replicativa limitada in vitro (64,65)
La senescencia prematura inducida por estrés se activa de forma rápida en respuesta a diferentes tipos de estrés extrínseco como daño en el ADN, daño en la estructura de la cromatina, estrés oxidativo o sobreexpresión de oncogenes (64, 65, 68).
La senescencia se establece y se mantiene a través de dos vías principales de supresión tumoral, la vía CDKN2D/TP53 y la vía CDKN2A/RB1 (Figura 5). Estas dos vías pueden interaccionar, pero también pueden detener el ciclo celular de forma
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independiente. Se ha propuesto que según el tipo de estrés se activaría una vía o la otra, e incluso se ha observado que existen diferencias entre especies y tipos celulares a la hora de activar la senescencia (62-65, 68). La proteína CDKN1A (P21) es una diana transcripcional de la ruta controlada por TP53 y también un mediador de la senescencia dependiente, que inhibe la progresión del ciclo celular. La ruta dependiente de CDKN2A/RB1 se activa normalmente de forma secundaria, después de TP53. Diferentes tipos de estrés como los oncogenes son capaces de inducir la expresión de CDKN2A, el que regula positivamente a RB1. Cuando RB1 se activa (estado hipofosforilado), reprime la transcripción de genes dependientes del factor E2F, muchos de los cuales promueven la proliferación celular.
Figura 5. Control de la senescencia por las vías CDKN2D/TP53 y CDKN2A/RB1. La vía dependiente de TP53 se activa en respuesta a daño en el ADN, disfunción telomérica y estrés genotóxico como el inducido por ROS. La transcripción de genes dependientes de TP53 como CDKN1A (P21) produce la parada del ciclo celular. La ruta dependiente de P16/RB1 (CDKN2A/RB1) se activa por oncogenes y otros tipos de estrés.
La activación de esta vía induce la represión de genes diana de E2F. Adaptado de Campisi, J. y d'Adda di Fagagna, F. 200763
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2.4. Senescencia celular y reparación/remodelación tisular.
El término "reparación" cuando se usa en el contexto de la curación de tejido dañado, implica la restauración de la arquitectura y funcionamiento del tejido después de una lesión. Abarca dos procesos separados: regeneración y sustitución. La regeneración se refiere a un tipo de curación en el que un nuevo crecimiento restaura por completo partes del tejido dañado a su estado normal. La sustitución se refiere a un tipo de curación en el cual los tejidos severamente dañados se reparan mediante la deposición de tejido conectivo, un proceso comúnmente conocido como cicatrización. La reparación tisular puede restaurar algunas de las estructuras originales del tejido dañado (como las capas epiteliales), pero también puede dar lugar a anomalías estructurales que afectan la función del órgano (como la cicatriz formada en la curación de un infarto de miocardio) (180).
La senescencia celular puede influir en la reparación tisular mediante los factores que componen el fenotipo secretor o el SASP (factores de crecimiento, proteasas que participan en la remodelación tisular, moléculas atrayentes de células inmunitarias, etc.) Por lo tanto, el SASP puede servir para alertar de la presencia daño tisular o disfunción celular al tejido circundante y estimular su correcta reparación (63). Se ha propuesto recientemente que la función primaria de la senescencia celular es, de hecho, la remodelación tisular (58). En presencia de daño tisular, la senescencia celular inicia el proceso de reparación/remodelación reclutando células inmunitarias a través del SASP Los macrófagos eliminarían las células dañadas y las células progenitoras regenerarían el tejido dañado. Esta secuencia de eventos tiene un principio y un final definido durante el proceso normal de reparación. Sin embargo, esto puede alterarse debido a un daño persistente, distintas patologías, o incluso por el envejecimiento del individuo. En estos casos, las células senescentes no se eliminan completamente y el tejido no se regenera correctamente. Este resultado puede conducir a la acumulación de células senescentes, inflamación crónica y a fibrosis como consecuencia de la producción persistente de matriz extracelular (Figura 6). Desde este punto de vista, y de acuerdo a esta hipótesis, la senescencia celular posee una función preeminente en la fisiología de multitud de enfermedades dependiendo de dónde y cuándo tenga lugar. Así, la senescencia celular puede ser beneficiosa o perjudicial dependiendo del contexto fisiológico (Figura 7) (58).
47 Figura 6. Modelo de senescencia. La senescencia se inicia como un proceso de remodelación tisular al reclutar células inmunes a través del fenotipo de secreción asociado a senescencia (SASP). Los macrófagos eliminan las células senescentes y las células progenitoras regeneran el tejido dañado. Esto puede verse afectada por un daño constante, enfermedades o por el envejecimiento. En estos casos, las células senescentes no se eliminan de manera eficiente y el tejido no se regenera por completo. La resolución del daño en estos casos implica una cicatriz fibrótica con células senescentes, células inflamatorias y tejido fibrótico. (Espín Muñoz, D, Serrano M. 201458)
En el hígado, por ejemplo, (183) durante el daño crónico, las células estrelladas hepáticas (HSC) se activan y proliferan anormalmente como miofibroblastos.
Eventualmente, estos miofibroblastos se vuelven senescentes y producen una cicatriz fibrótica estable con abundante colágeno y otros componentes de la matriz extracelular.
Los hepatocitos dañados producen CCN1, mediador clave de senescencia en HSC, así como IL-22 que induce senescencia en HSC en asociación con la activación de TP53 e incrementa la producción de MMPs (225), lo que parece que ayuda a la eliminación de la cicatrización fibrótica. En este caso, por tanto, la expresión de senescencia celular es beneficiosa. La senescencia celular también está implicada en la reducción de otras patologías fibróticas como la fibrosis oral (184), la fibrosis renal (185) o la fibrosis cardiaca (186), en las cuales se ha visto una expresión elevada de marcadores senescentes como CDKN2A, CDKN1A y actividad SAβGAL, asociada con el daño (58). Por otro lado, se ha descrito que la senescencia puede agravar la fibrosis pulmonar (226-228), debido a la expresión elevada de marcadores senescentes en las lesiones fibróticas, células alveolares y en las células bronquiales que cubren las masas fibróticas. En etapas tardías de la enfermedad, la SC puede tener lugar también en fibroblastos (235-238). Por otro lado, durante la obesidad (229) se ha descrito que los adipocitos senescentes provocan
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esteatosis hepática y la resistencia a la insulina, que constituyen las características del síndrome metabólico. La senescencia celular también se ha observado en la diabetes mellitus tipo 2 (230,231), en las cataratas (232,233) o en la sarcopenia (234).
La SC, por tanto, puede ser una diana terapéutica para las enfermedades que cursan con fibrosis y su inducción o atenuación, depende del contexto (Figura 7), puede brindar oportunidades clínicas para un gran número de enfermedades crónicas (58).
Figura 7. La senescencia celular puede ser beneficiosa o perjudicial según el contexto patológico donde tenga lugar. Enfermedades en las que se ha visto que la senescencia tiene efectos beneficiosos (indicadas en recuadros azules) o perjudiciales (indicadas en recuadros rojos); en otros casos su función aún no se ha esclarecido (indicado en recuadros de color beige). EPOC, enfermedad pulmonar obstructiva crónica;
FPI, fibrosis pulmonar idiopática; OSMF, fibrosis submucosa oral. (Espín Muñoz, D, Serrano M. 201458)
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3. Fibrosis Pulmonar Idiopática.
3.1. Definición, epidemiología y tratamiento.
La Fibrosis pulmonar idiopática (FPI) se define como una forma específica de neumonía intersticial fibrosante, crónica, progresiva y de causa desconocida, que ocurre generalmente en adultos de edad media o avanzada. Está asociada a un patrón radiológico y/o histológico de neumonía intersticial usual (NIU). Se caracteriza por una dificultad respiratoria progresiva y un deterioro en la función pulmonar y se asocia con mal pronóstico y escasas opciones terapéuticas, con una supervivencia media de aproximadamente tres años desde el momento del diagnóstico (72-74).
Aunque las causas de la lesión alveolar al inicio de la FPI no se conocen, clásicamente se ha considerado que la formación de fibrosis en el parénquima pulmonar estaba provocada por una inflamación crónica. Actualmente, esta hipótesis está siendo reemplazada ya que múltiples evidencias indican que los tratamientos antiinflamatorios no son eficaces para el tratamiento de la FPI (219) Una nueva hipótesis plantea que la destrucción del tejido pulmonar y la formación de fibrosis son el resultado de una reparación anómala de las lesiones que dan lugar a una acumulación progresiva de matriz extracelular, una disminución entre el equilibrio fibroblastos-miofibroblastos y la muerte progresiva de las células epiteliales (75). Esta hipótesis se apoya en los resultados que se han obtenido mediante estudios ultraestructurales, donde se ha observado la muerte de las células epiteliales en una fase temprana de la enfermedad (76,77). Cuando se dañan o pierden las células alveolares tipo I (AEC I), las células alveolares tipo II (AEC II) inician una proliferación para cubrir las membranas basales que han quedado expuestas. En condiciones de reparación normal, las AEC II experimentan un proceso de diferenciación para convertirse en AEC I que son las más sensibles al daño. En la fibrosis pulmonar idiopática las células epiteliales alertan inicialmente al sistema inmune y se produce un reclutamiento de células inmunitarias y una proliferación de fibroblastos que inducen la remodelación tisular. La presencia de senescencia celular debido a un daño persistente, sobre todo en las AECII, induce la cicatrización aberrante del tejido haciendo que los pulmones pierdan progresivamente su capacidad de intercambiar gases y transportar oxígeno a la sangre (245).