DEVELOPMENT OF NEW METHODOLOGIES BASED ON ICP TECHNIQUES FOR THE ELEMENTAL AND ISOTOPIC ANALYSIS OF BIOETHANOL AND RELATED

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Development of new methodologies based on ICP techniques for the elemental and isotopic analysis of bioethanol and related samples

Carlos Sánchez Rodríguez

(2)

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD DE ALICANTE

DEVELOPMENT OF NEW METHODOLOGIES BASED ON ICP TECHNIQUES FOR THE ELEMENTAL AND ISOTOPIC ANALYSIS OF BIOETHANOL AND RELATED

SAMPLES

CARLOS SÁNCHEZ RODRÍGUEZ

Tesis presentada para aspirar al grado de DOCTOR POR LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE

MENCIÓN DE DOCTOR INTERNACIONAL PD CIENCIAS EXPERIMENTALES Y BIOSANITARIAS

Dirigida por:

Prof. Dr. JOSÉ LUIS TODOLÍ TORRÓ Dr. CHARLES PHILIPPE LIENEMANN

La presente Tesis Doctoral ha sido financiada por el centro de investigación IFP Energies Nouvelles (Lyon, France) y una ayuda para la Formación del Profesorado Universitario

(FPU13/01438) concedida por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte.

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Dra. DOÑA MARÍA SOLEDAD PRATS MOYA, directora del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Alicante

Certifica que,

D. CARLOS SÁNCHEZ RODRÍGUEZ ha realizado, bajo la dirección del profesor Dr. D. JOSÉ LUIS TODOLÍ TORRÓ (Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología. Universidad de Alicante, Alicante, España) y del Dr.

D. CHARLES PHILIPPE LIENEMANN (IFP Energies Nouvelles, Lyon, Francia), el trabajo correspondiente a la obtención del Grado de Doctor en Ciencias Experimentales y Biosanitarias (Mención de Doctor Internacional) titulado DEVELOPMENT OF NEW METHODOLOGIES BASED ON ICP TECHNIQUES FOR THE ELEMENTAL AND ISOTOPIC ANALYSIS OF BIOETHANOL AND RELATED SAMPLES

Alicante, marzo de 2018

Fdo. Dra. María Soledad Prats Moya

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El profesor Dr. D. JOSÉ LUIS TODOLÍ TORRÓ (Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología. Universidad de Alicante, Alicante, España) y el Dr. D. CHARLES PHILIPPE LIENEMANN (IFP Energies Nouvelles, Lyon, Francia), en calidad de directores de la Tesis Doctoral presentada por D. CARLOS SÁNCHEZ RODRÍGUEZ, conducente a la obtención del Grado de Doctor en Ciencias Experimentales y Biosanitarias (Mención de Doctor I te a io al titulada: DEVELOPMENT OF NEW METHODOLOGIES BASED ON ICP TECHNIQUES FOR THE ELEMENTAL AND ISOTOPIC ANALYSIS OF BIOETHANOL AND RELATED SAMPLES

Certifican que,

la citada Tesis Doctoral se ha realizado en los laboratorios del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Alicante, del centro de investigación IFP Energies Nouvelles y del Departamento de Química de la Universidad de Gante, y que, a su juicio, reúne los requisitos necesarios y exigidos en este tipo de trabajos.

Alicante, marzo de 2018

Fdo. Prof. Dr. José Luis Todolí Torró Fdo. Dr. Charles Philippe Lienemann

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A mi familia

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AGRADECIMIENTOS / ACKNOWLEDGEMENTS

El simple hecho de estar escribiendo estas palabras indica que mi Tesis Doctoral está llegando a su fin, o visto de otro modo, que comienzo una nueva etapa como Doctor que afronto con tanta ilusión como esta que está a punto de acabar. Este es uno de esos momentos en los que uno no tiene claro si sentirse feliz, por estar cerca de conseguir algo por lo que tanto ha trabajado, o triste, porque esta fascinante etapa de mi vida se acaba.

Sin embargo, por encima esa dualidad felicidad-tristeza, destaca otro sentimiento del que no tengo la menor duda: el agradecimiento. Durante este largo e intenso viaje, he tenido la suerte de conocer muchas personas sin las que esto no habría sido posible, además de aquellas que ya conocía mucho antes de encontrarme con la investigación, y que son las responsables de que hoy esté escribiendo estas palabras. Tengo muy claro que unas cuantas frases no son suficientes para agradecer tantas cosas como me gustaría y estas personas merecen, pero permitidme intentarlo.

Me gustaría empezar recordando ese momento, ahora ya lejano, en el que todo comenzó.

Siempre recordaré el día en que un profesor del Departamento de Química Analítica me preguntó si me interesaba empezar a colaborar en tareas de investigación en mis ratos li es, pa a e si e at aía este u do . Ese p ofeso , u os años ás ta de, se o i tió en mi Director de Tesis, al que hoy debo todo lo que se sobre investigación. Muchas gracias José Luis, no solo por tu constante ayuda, tu inestimable apoyo y tus consejos, sino por darme la oportunidad de descubrir la investigación. Sin embargo, no solo quisiera darte las gracias por ser un gran Director de Tesis, sino también por ser un gran compañero, por haber sido capaz de formarme como científico sin renunciar a pasarlo bien y reírnos juntos. De ti me llevo un mentor y un amigo, ¡gracias!

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During this period, I have also been fortunate to work with Charles Philippe Lienemann.

Thank you, Charles Philippe, for your contribution to this PhD, for transferring me your knowledge and also for the amazing scientific discussions that we have enjoyed. But I do ’t a t to a k o ledge o ly fo you a ade i help, si e afte so e of y Tha ks, Cha les Philippe you told e it’s y o k, I’ just doi g y o k . Ho e e , it as ot your work our bike rides, badminton matches and other nice moments that we have shared. Thanks for being, in addition to a great PhD advisor, a great colleague.

I would like to express again my gratitude to my supervisors. José Luis and Charles Philippe, thank you for giving me the opportunity to be part of this wonderful team where I always felt that I was one more. For me, you will always be a model to follow to become a great researcher. It has been a pleasure working with you and I hope to continue doing it in the future.

Gracias a todos los profesores y profesoras del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Alicante, especialmente a Sole, Raquel y Salva por vuestro apoyo y por compartir esos cafés y comidas que dan fuerza para continuar el día. Muchas gracias a todos mis compañeros y compañeras del departamento con las que he compartido tantas cosas estos años. Gracias también a todos los estudiantes que de un modo u otro me habéis enseñado cosas y especialmente, Sergio, Borja, Paula y Claudia, con quien he tenido el placer de trabajar más de cerca.

Me gustaría dar las gracias especialmente a aquellas personas que, además de compañeros y compañeras de trabajo, se han convertido en amigos y amigas. Phanie, Águeda, Ángela (y Vicen), Juan Pedro (y Sara), Silvia (y Josemi), gracias por aguantarme día a día, con lo complicado que eso puede resultar en ciertas ocasiones.

Gracias al resto de amigos y amigas dispersos por el resto de departamentos de Química, especialmente a Manu, con quien tengo la suerte de compartir vivencias y cafés desde hace unos 15 años, y a los que me habéis sacado del laboratorio para llevarme de cena, comida o a una pista de pádel o futbol sala. Gracias también a Mayte y Clemente, por ayudarme en el ICP-MS y el ICP-OES siempre que lo he necesitado y por permitir que los

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Agradecimientos/Acknowledgements

SSTTI sean mi segunda casa. Gracias a Diego por el placer de compartir contigo congresos y otras experiencias, espero que sean los primeros de muchos.

Y finalmente, para acabar con los amigos que la (bio)Química me ha dado, muchas gracias a Boby y Aída por esas cenas, que se pasan volando hablando de todo y riéndonos de todos. Parece ser que las próximas cenas serán en Umeå, pero podéis contar conmigo.

Thanks also to the research center IFPEN. First, for the financial support; and, second, because during my stays in its laboratories I met amazing people. Thanks to all the technician of the Physics and Analysis Division for helping me. I would like to thank also Sylvain Carbonneaux for his support and Fabien Chainet for a lot of good times that we enjoyed together and your help in Lyon.

I would like to thank also Prof. Frank Vanhaecke and the A&MS research group (Ghent University) for allowing me to discover other labs, other ways of working and doing science and for giving me the opportunity of discovering the wonderful world of isotopic analysis, particularly my office mates (Sara and Lieve) and the Spanish team. Charo, Marta, Ana y Edu, muchas gracias por la ayuda que, desde el primer día, me brindasteis. Gracias por la compañía en las largas noches de Neptune, los cafés en el S12 y los grandes ratos fue a de él. “ois g a des i estigado es, pe o toda ía sois ejo es a igos… y yo te go la suerte de conocer ambas cosas.

Pero si estoy cerca de ser doctor, no se debe únicamente a los últimos años. Es por ello, que quiero agradecer a mi familia la inestimable ayuda que me han dado en estos 28 años.

Aunque lo he pensado mucho últimamente, no sé si seré capaz de plasmar en unas simples palabras todo lo que tengo que agradecer a mis padres, Herminio y Juana. Muchas gracias a los dos por darme todo sin pedir nada a cambio, por apoyarme en todas mis decisiones sin cuestionarlas en ningún momento y por haberme formado como persona.

Gracias a mis hermanos, Hermi y Javi, y cuñadas, Mari Carmen y Mayte, por estar siempre a mi lado disfrutando de los buenos momentos y, sobre todo, pasando los no tan buenos, por escucharme cuando lo he necesitado. Gracias a todos y todas, simplemente por ser mi familia. Dicen que la familia no se escoge; y yo digo que, si pudiera escogerla, escogería exactamente la que tengo.

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Puede parecer que me olvido de parte de mi familia, pero en realidad quería guardarles un párrafo propio. Gracias a mis sobrinos y sobrinas, Javier, Jaime, Carla y Natalia. Sin saberlo, habéis sido un pilar fundamental de esta Tesis. Gracias a los cuatro por hacerme sonreír en los malos momentos, por darme esa alegría que lleváis dentro. Vuestras llamadas por Skype y esos audios de WhatsApp durante las estancias dan ilusión y fuerzas para seguir adelante.

Y mención especial, y por eso le he reservado el último agradecimiento de mi Tesis, merece una persona con la que me siento formando un tándem perfecto y me comprende, en ocasiones sin que diga ni una sola palabra. Gracias Ainhoa, por tu apoyo incondicional, por apoyarme en todas las decisiones que he tomado durante esta Tesis, incluso cuando algunas implican estar lejos de ti mucho tiempo. Simplemente, gracias por estar conmigo siempre. Como tú bien sabes, todo llega.

Por todos estos motivos, y aunque sé que estas palabras no son suficientes para expresar lo ue ha éis o t i uido a esta Tesis… GRACIAS

For all these reasons, although I know that these words are not enough to express your o t i utio to this PhD…THANK“

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List of contents

i

List of contents

List of acronyms and abbreviatures ... vii

List of bioethanol samples ... xiii

List of figures ... xv

List of tables ... xix

RESUMEN ... 1

ABSTRACT ... 15

1 Inductively coupled plasma instrumentation ... 27

1.1 Sample introduction systems ... 29

1.1.1 Nebulizers ... 29

1.1.2 Spray chambers ... 32

1.1.3 Special sample introduction systems ... 36

1.2 Plasma source... 39

1.3 ICP-OES Perkin Elmer Optima 4300DV. ... 41

1.3.1 Transfer optics ... 42

1.3.2 Wavelength dispersive device ... 43

1.3.3 Detector ... 44

1.4 ICP-mass spectrometry (ICP-MS). General points... 45

1.4.1 Interface ... 46

1.4.2 Ion focusing system ... 46

1.4.3 Mass spectrometer ... 47

1.5 ICP-QMS Agilent 7700x ... 48

1.5.1 Collision cell. ... 50

1.5.2 Quadrupole filter ... 53

1.5.3 Detector ... 55

(15)

ii

1.6 MC-ICP-MS Thermo Neptune. ... 56

1.6.1 Double-focusing mass spectrometer ... 57

1.6.2 Detector ... 60

1.6.3 Removal of interferences in MC-ICP-MS ... 60

1.6.4 Correction for instrumental mass discrimination ... 61

1.7 References ... 64

PUBLISHED WORKS / TRABAJOS PUBLICADOS ... 73

2 Metal and metalloids determination in biodiesel and bioethanol ... 75

2.1 Abstract ... 79

2.2 General Introduction ... 80

2.3 Fundamental studies ... 83

2.3.1 Aerosol generation ... 83

2.3.2 Aerosol transport ... 86

2.3.3 Plasma effects. ... 88

2.3.4 Spectral interferences ... 91

2.4 Biodiesel ... 93

2.4.1 Synthesis and presence of metals. Importance of their determination. .... 94

2.4.2 Analysis by ICP techniques ... 96

2.4.3 Analysis by additional techniques ... 103

2.4.4 Comparison among techniques ... 121

2.4.5 Standards for the analysis of biodiesel ... 124

2.5 Bioethanol ... 126

2.5.1 Synthesis and presence of metals. Importance of their determination. .. 126

2.5.2 Analysis by ICP techniques ... 128

2.5.3 Analysis by other techniques ... 133

2.5.4 Speciation ... 135

(16)

List of contents

iii

2.5.5 Comparison among techniques. ... 150

2.5.6 Standards for the analysis of bioethanol ... 151

2.6 Conclusions... 154

2.7 Acknowledgements ... 156

3 Metal and metalloid determination in bioethanol through inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy ... 183

3.1 Abstract ... 187

3.2 Introduction... 188

3.3 Experimental ... 189

3.3.1 Solutions and samples ... 189

3.3.2 Instrumentation ... 191

3.4 Results and discussion ... 192

3.4.1 Drop size distribution ... 192

3.4.2 Effect of the sample pre-treatment ... 193

3.4.3 Effect of hTISIS temperature on sensitivity and matrix effects in segmented flow injection ... 194

3.4.4 Effect of hTISIS temperature on sensitivity and matrix effects in continuous aspiration mode ... 199

3.4.5 Limits of detection ... 199

3.5 Recovery tests ... 201

3.6 Analysis of real samples ... 201

3.6.1 hTISIS-ICP-OES-segmented injection ... 201

3.6.2 hTISIS-ICP-OES-continuous injection ... 203

3.6.3 Comparison between continuous and segmented flow injection... 203

(17)

iv

4 Analysis of bioethanol samples through Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry with a total sample consumption system ... 213

4.3.1 Solutions and samples ... 219

4.3.2 Instrumentation ... 220

4.4 Results and Discussion ... 222

4.4.1 Analyte transport efficiency... 222

4.4.2 Analytical figures of merit ... 224

4.4.3 Matrix effects caused by ethanol ... 228

4.4.4 Recovery tests ... 236

4.4.5 Analysis of bioethanol real samples ... 239

5 Evolution of the metal and metalloid content along the bioethanol production process ... 247

5.3.1 Reagents and standards ... 254

5.3.2 Bioethanol production process and samples ... 255

5.3.3 Samples preparation. ... 256

(18)

List of contents

v

5.3.4 Instrumentation. ... 257

5.3.5 Method validation and samples analysis. ... 259

5.4 Results and discussion. ... 259

5.4.1 Evaluation of the four sample preparation methods. ... 259

5.4.2 Analytical figures of merit. ... 263

5.4.3 Recovery test. ... 264

5.4.4 Analysis of real samples. Fate of metals and metalloids along the production process. ... 265

6 Direct lead isotopic analysis of bioethanol by means of multi-collector ICP-mass spectrometry with a total consumption sample introduction system ... 279

6.3.1 Aqueous standards and certified reference materials ... 287

6.3.2 Ethanol-water standards and bioethanol samples ... 288

6.3.3 Instrumentation and measurements ... 289

6.4 Results and discussion ... 292

6.4.1 Effect of sample introduction system and skimmer type on the sensitivity ... ... 292

6.4.2 Effect of sample introduction system and skimmer type on the isotope ratio precision and accuracy ... 294

6.4.3 Effect of sample introduction system and skimmer type on the mass bias correction. ... 297

6.4.4 Effect of hTISIS temperature on the mass bias correction ... 300

(19)

vi

6.4.5 Robustness of the method to real matrices ... 302

6.4.6 Lead isotope ratios in bioethanol ... 303

UNPUBLISHED WORKS / TRABAJOS NO PUBLICADOS ... 313

7 Determination of volatile organic compounds in bioethanol by means of GC-FID and GC-MS ... 315

7.2.1 Gas Chromatography-Flame Ionization Detector (GC-FID) ... 319

7.2.2 Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) ... 319

7.2.3 Standards and samples. ... 320

7.3 Results ... 321

7.3.1 Quantification of major volatile compounds in bioethanol real samples by means of GC-FID ... 321

7.3.2 Semi-quantitative determination of major, minor and trace volatile compounds by means of GC-MS ... 330

GENERAL CONCLUSIONS ... 355

CONCLUSIONES GENERALES ... 361

FUTURE STUDIES ... 367

SCIENTIFIC IMPACT ... 371

(20)

List of acronyms and abbreviatures

vii

List of a ro y s a d a re iatures

α Significance level

AC Alternating current

ASI Air - segmented injection

AAS Atomic absorption spectrometry

AFE Anhydrous fuel ethanol

ANP National Agency of Petroleum

ASTM American Society for Testing and Materials ASV Anodic stripping voltammetry

BEC Background equivalent concentration

b.p. Boiling point

BTEX Benzene, toluene, ethylbenzene and xylene

CCD Charge - coupled device

CDA Chelidamic acid

CID Charge - injection device CRI Collision - reaction interface CRC Collision - reaction cell CRM Certified reference material CSA Continuous sample aspiration CTD Charge - transfer device

CV-AFS Cold vapor - atomic fluorescence spectroscopy

(21)

viii

ETAAS Electrothermal atomic absorption spectroscopy

D3,2 Sauter mean diameter

D50 Median of aerosol volume drop size distribution

DC Direct current

DCC Dynamic collision cell

DPA Diphenylamine

DRC Dynamic reaction cell

εⁿ Analyte transport efficiency Ei First ionization energy

ETAAS Electrothermal atomic absorption spectroscopy

EtOH Ethanol

ETV Electrothermal vaporization

FAAS Flame atomic absorption spectrometry FAEE Fatty acid ethyl esters

FAES Flame atomic emission spectrometry FAME Fatty acid methyl esters

GC Gas chromatography

GC-FID Gas chromatography - flame ionization detector GC-MS Gas chromatography - mass spectrometry

GHG Greenhouse gas

HDPE High-density polyethylene

HFE Hydrated fuel ethanol

HMI High matrix introduction system/device

(22)

ix HPLC High - performance liquid chromatography

HR High resolution

HR-CS-AAS High resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry

hTISIS High temperature torch integrated sample introduction system

IC Ion chromatography

ICP Inductively coupled plasma

ICP-MS Inductively coupled plasma - mass spectrometry

ICP-MS/MS Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry ICP-OES Inductively coupled plasma - optical emission spectroscopy ICP-QMS Inductively coupled plasma - quadrupole mass spectrometry ICP-QQQ Inductively coupled plasma - triple quadrupole

ICP-SFMS Inductively coupled plasma - sector field mass spectrometry ICP-TOF-MS Inductively coupled plasma - time of flight - mass spectrometry

ID Isotope dilution

IFPEN Institute Français du Pétrole Energies Nouvelles

IH In - house standard

Ir or Irel Relative intensity

KED Kinetic energy discrimination

LA Laser ablation

LHR Solid lignin hydrolysate residue

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantification

(23)

x

LR Low resolution

m/z Mass to charge ratio

MC-IPC-MS Multi-collector - inductively coupled plasma - mass spectrometry MCN Microconcentric nebulizer

MDL Method detection limit

MIP-OES Microwave induced plasma - optical emission spectroscopy

MR Medium resolution

MTEB Methyl tert-butyl ether

MW Microwave

N or n Number of replicants

ne Electron number density

NAZ Normal analytical zone

NIST National institute for standards and technology ORS Octopole reaction system

PAR 4-(2-pyridazo)resorcinol

PDA Photodiode array

PFA Perfluoroalkoxy

PP Polypropilene

Ppb Parts per billion

ppm Parts per million

PPN Parallel - path nebulizer PTFE Polytetrafluoroethylene

QC Quality control

(24)

xi Qg Nebulizer gas flow rate

R Resistivity

R Resolution

Rexp Measured isotope ratio

Rtrue True isotope ratio

RF Radio – frequency

RSD Relative standard deviation

RT Room temperature

Sb or sb Blank standard deviation SD or s Standard deviation

SF-ICP-MS Sector field - inductively coupled plasma - mass spectrometry SSB Sample - standard bracketing approach

SSF Simultaneous saccharification and fermentation

T Temperature

TEA Triethylamine

THGA Transversely heated graphite atomizer

TIC Total ions current

TIMS Thermal ionization mass spectrometry

TMAH Tetramethylammonium hydroxide

UNGDA Union Nationale de Groupements de Distillateurs d'Alcool USN Ultrasonic nebulizer

USN-MD-ICPOES Ultrasonic nebulizer and membrane desolvator inductively coupled plasma optical emission

(25)

xii

v/v volume/volume dilution

VOCs Volatile organic compounds w/w weight/weight dilution

w/v Weight/volume dilution

Wtot Mass of analyte transported

WCAES Tungsten coil atomic emission spectrometry

(26)

List of bioethanol samples

xiii

List of ioetha ol sa ples

Code Sample Description

B1 Wheat Bioethanol from wheat, non-hydrated

B2 Wheat 90% Bioethanol from wheat using Tereos process, 10% water B3 Additivated Bioethanol additivated, non-hydrated

B4 Sugar cane 1 Bioethanol from sugar cane, hydrated

B5 Wheat 70% Bioethanol from wheat using Tereos process, 30% water

B6 Wheat 96% Bioethanol from wheat, 4% water

B7 Wheat + Beet Bioethanol from mixture of wheat and beet, non-hydrated B8 Sugar cane 2 Bioethanol from sugar cane, 40% water

B9 Fraction 1 Fraction of distillation 1, sample B29 B10 Fraction 2 Fraction of distillation 2, sample B29 B11 Fraction 3 Fraction of distillation 3, sample B29 B12 Fraction 4 Fraction of distillation 4, sample B29 B13 Fraction 5 Fraction of distillation 5, sample B29 B14 Fraction 6 Fraction of distillation 6, sample B29 B15 Fraction 7 Fraction of distillation 7, sample B29 B16 Fraction 8 Fraction of distillation 8, sample B29

B17 Wheat 1 Bioethanol non-hydrated from wheat

B18 Wine residue 2 Bioethanol from winemaking residues

B19 Beet 3 Bioethanol from beet 3

(27)

xiv

Code Sample Description

B24 Unknown Not available

B27 Sugar cane 3 Bioethanol from sugar cane

B28 Second generation Lignocellulosic bioethanol (2^nd generation) B29 Distilled sample Sample resulting from distillation (B9-B16) B30 Wine residue Bioethanol from winemaking residues

B31 Cereal Bioethanol from cereal

B32 Beet Bioethanol from beet

B33 A-Glass Bioethanol sample A stored in glass

B34 A-Nalgene® Bioethanol sample A stored in Nalgene®

B35 A-HDPE Bioethanol sample A stored in HDPE

B36 A-PTFE Bioethanol sample A stored in PTFE

B37 B-Glass Bioethanol sample B stored in Glass

B38 B-Nalgene® Bioethanol sample B stored in Nalgene®

B39 B-HDPE Bioethanol sample B stored in HDPE

B40 B-PTFE Bioethanol sample B stored in PTFE

B41 Biobutanol Biobutanol sample

B42 Fraction 10 Fraction of distillation 10, sample B29 B43 Fraction 9 Fraction of distillation 9, sample B29

(28)

List of figures

xv

List of figures

Figure 1.1. Schemes of the most used pneumatic nebulization devices ... 30 Figure 1.2. Detailed scheme of a concentric nebulizer. ... 31 Figure 1.3. Scheme of the aerosol transport phenomena in a sample introduction system consisting of a concentric nebulizer in combination with a double-pass spray chamber (Scott) ... 33 Figure 1.4.Conventional spray chamber designs ... 35 Figure 1.5. Schematic description of two commercially available desolvation systems ... 37 Figure 1.6. Scheme (a) and picture (b) of the hTISIS sample introduction system. ... 38 Figure 1.7. (a) Scheme the of torch, coil and plasma and (b) picture of the plasma generated in an ICP-MS Agilent 7700x spectrometer. ... 40 Figure 1.8. Scheme of the optic and detection systems of the ICP-OES Perkin Elmer 4300DV. ... 42 Figure 1.9. Plasma viewing modes. (a) Radial or side-on viewing and (b) axial or end-on viewing. ... 43 Figure 1.10. Scheme of the operation principle of a CCD detector ... 44 Figure 1.11. General scheme of an ICP-MS instrument... 45 Figure 1.12. Sampler cone and skimmer ... 46 Figure 1.13. Detailed scheme of the ICP-MS Agilent 7700x used in chapters 4 and 5 ... 49 Figure 1.14. Collision-cell operation principle ... 53 Figure 1.15. Operation principle of a quadrupole mass filter ... 53 Figure 1.16. The combination of the high-mass (a) and low mass (b) filters resulting the bandpass filter (c) ... 55 Figure 1.17. Scheme of the MC-ICP-MS Thermo Neptune used in chapter 6. ... 57 Figure 1.18. Operation principle of magnetic (a) and electrostatic (b) sectors ... 58 Figure 1.19. Nier-Johnson double-focusing setup ... 60 Figure 2.1. Sauter mean diameter (D3,2) for primary aerosols generated by a conventional pneumatic concentric nebulizer working with 19 different bioethanol samples (A-S). .... 86

(29)

xvi

Figure 2.2. Spectral survey of the visible emission from de ICP loaded with methanol for several observations heights. Cyanide radical (410-430 nm) and diatomic carbon (450-520 nm) ... 92 Figure 2.3. Techniques employed for the determination of several metals in biodiesel samples and number of studies dealing with the determination of each one of the elements ... 123 Figure 2.4. General flow chart of bioethanol production process from lignocelulosic biomass (second generation) ... 127 Figure 2.5. Techniques employed for the determination of several metals in bioethanol samples and number of studies dealing with the determination of each one of the elements ... 151 Figure 2.6. Main elements found in real biodiesel and ethanol fuel samples ... 155 Figure 3.1. D50 of primary aerosols for solutions containing different percentage in ethanol ... 193 Figure 3.2. Peaks for Mn 257.610 and Ar 420.069 and magnesium ratio in the maximum of the peak for several water-ethanol mixtures at: (a) room temperature; (b) 200°C; (c) 350°C and (d) 400°C ... 196 Figure 3.3. Relative intensity under discrete sample injection versus the hTISIS temperature ... 198 Figure 4.1. Analyte mass leaving the spray chamber per unit of time (Wtot) normalized with respect to that measured when the ethanol concentration is 50% versus hTISIS temperature. ... 223 Figure 4.2. Effect of the sample introduction system and hTISIS temperature on the signal.

(a) ⁵⁵Mn; (b) ¹¹¹Cd. ... 225 Figure 4.3. Relative intensity variation (taking the 50% ethanol solution as reference) versus the hTISIS temperature for two different matrices under the air-segmented injection mode ... 229 Figure 4.4. Doubly charged ion (a) and oxide ratios (b) for the two sample introduction systems and several hTISIS temperatures. Air segmented mode. ... 230 Figure 4.5. Effect of the chamber walls temperature on the extent of matrix effects. .. 232 Figure 4.6. ICP-MS radial plasma profiles obtained for two different temperatures and three different solutions ... 234

(30)

List of figures

xvii Figure 4.7. ICP-MS axial plasma profiles obtained for two different temperatures and three different solutions ... 236 Figure 4.8. Recoveries found for four real bioetanol spiked samples ... 237 Figure 4.9. Elemental concentrations found for several bioethanol samples following five different procedures ... 238 Figure 5.1. Scheme of bioethanol production process studied in the present work. ... 256 Figure 5.2. Recoveries obtained for twelve spiked samples ... 264 Figure 5.3. Evolution of metals along bioethanol production process from the beginning until the end of the sampling campaign. Sugar factory 1 ... 268 Figure 5.4. Evolution of major metals along bioethanol production process from the beginning until the end of the sampling campaign of Sugar factory 2... 272 Figure 5.5. Evolution of minor metals along bioethanol production process from the beginning until the end of the sampling campaign of Sugar factory 2... 273 Figure 6.1. Effect of ICP-MS interface (a) and introduction system (b) on the sensitivity293 Figure 6.2. Effect of lead concentration on accuracy and precision (H-type skimmer) .. 296 Figure 6.3. Effect of the matrix composition on the effectiveness of mass bias correction via a combination of internal correction (based on admixed Tl) and external correction using a Pb standard solution in 75% ethanol for the different skimmer types and sample introduction systems under optimum conditions ... 299 Figure 6.4. Effect of hTISIS temperature on the effectiveness of mass bias correction . 301 Figure 6.5. ²⁰⁸Pb/²⁰⁶Pb ratio obtained for spiked bioethanol and ethanol samples with 5 µg L^-1 of IH-Pb ... 303 Figure 6.6. Three-isotopes plot for bioethanol samples coming from different raw materials ... 305 Figure 7.1. Chromatogram obtained under optimum conditions for the standard containing 2,000 mg L^-1 of ten analytes in ethanol ... 322 Figure 7.2. Recoveries for three samples spiked with 200 mg L^-1 of each analyte ... 324 Figure 7.3. Effect of the distillation step. Chromatograms obtained for the different distillation fractions. ... 327 Figure 7.4. Scheme of the samples analyzed and compounds identified by means of GC- MS. ... 331

(31)

xviii

Figure 7.5. Reactions that take place in bioethanol. (a) generation of FAEE from TAG and ethanol; (b) production of FAEE from fatty acids and ethanol; (c) generation of 1,1- diethoxyethane from ethanol and acetaldehyde. ... 333 Figure 7.6. Frequency of identification of each analyte when n 3. ... 344 Figure 7.7. Number of compounds found in the samples by GC-MS. ... 347 Figure 7.8. Chromatograms obtained for distillation fractions ... 348 Figure 7.9. Chromatograms obtained for different raw materials ... 349 Figure A.1. Scheme of future studies……….. 6

(32)

List of tables

xix

List of ta les

Table 1.1. Comparison of the three types of mass spectrometers used in ICP-MS ... 48 Table 1.2. Examples of typical interferences in ICP-MS classified by categories.. ... 51 Table 2.1. Standard specifications and maximum allowable levels of metals and metalloids... 81 Table 2.2. Biodiesel and bioethanol based products CRMs. ... 82 Table 2.3. Density, viscosity and surface tension at 20°C for the different samples. ... 84 Table 2.4. Summary of the limits of detection and found concentrations obtained in biodiesel samples by several authors. ... 109 Table 2.5. List of standards for the elemental determination of biodiesel samples. ... 125 Table 2.6. Summary of the limits of detection and found concentrations obtained in fuel ethanol samples by several authors ... 136 Table 2.7. Standards for the elemental determination in ethanol employed for fuel applications. ... 152 Table 3.1. Physical properties for a series of samples with different ethanol content... 190 Table 3.2. ICP-OES operating conditions. ... 192 Table 3.3. Limits of detection (ng mL^-1) obtained in both Injection methodologies. ... 200 Table 3.4. Found concentrations (in ng mL^-1) in bioethanol real samples through hTISIS- ICP-OES in segmented flow injection.. ... 202 Table 3.5. Found concentrations (in ng mL^-1) in bioethanol real samples through hTISIS- ICP-OES in continuous injection. ... 204 Table 4.1. ICP-MS Agilent 7700x operating conditions. ... 221 Table 4.2. Limits of detection for 50% ethanol/water mixtures and different sample introduction systems in air-segmented injection mode. ... 226 Table 4.3. Found concentrations (in ng mL^-1) in real bioethanol samples by means of the hTISIS-ICP-MS in continuous aspiration ... 240 Table 5.1. ICP-MS operating conditions. ... 258 Table 5.2. Main elements concentration (mg kg^-1) determined for the CRM DC73349 by using the four acid assisted digestion protocols evaluated ... 261

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xx

Table 5.3. Main elements concentration (mg kg^-1) for the CRM SRM 1575a by using the four acid assisted digestion protocols evaluated ... 262 Table 5.4. Limits of detection (in mg kg^-1) obtained for real samples. ... 263 Table 6.1. Conditions used for isotope ratio measurements ... 291 Table 6.2. Internal and external precision ... 295 Table 7.1. GC-FID operating conditions and column characteristics. ... 319 Table 7.2. GC-MS operating conditions and column characteristics. ... 320 Table 7.3. Interday and intraday precisions for a multi-compound standard. ... 323 Table 7.4. Summary of the analytes found in bioethanol real samples ... 325 Table 7.5. Concentrations (in mg L^-1) of organic pollutants found in different distillation fraction ... 326 Table 7.6. Concentrations (in mg L^-1) of organic pollutants found in samples obtained from different raw materials ... 329 Table 7.7. Concentrations (in mg L^-1) of organic pollutants found in samples obtained from different raw materials with different water content, second generation bioethanol and biobutanol ... 330 Table 7.8. Alcohols found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 335 Table 7.9. Aldehydes and ketones found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 336 Table 7.10. Esters found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 337 Table 7.11. Ethers found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 338 Table 7.12. Hydrocarbons found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 339 Table 7.13. Aromatic hydrocarbons found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 340 Table 7.14. Nitrogen compounds found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 341 Table 7.15. Organic acids found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 341 Table 7.16. Furane derivates found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 342 Table 7.17. Other organic compounds found by GC-MS in the bioethanol samples. ... 342

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RESUMEN

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Resumen

3 La presente Tesis Doctoral, desarrollada en el Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Alicante, en colaboración con el centro de investigación francés IFP Energies Nouvelles (IFPEN), se centra en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el análisis elemental (cuantificación de metales) y el análisis isotópico de muestras de bioetanol, así como de muestras relacionadas con la producción y obtención de bioetanol.

Se conoce como bioetanol al etanol que ha sido obtenido a través de la fermentación de azúcares extraídos de diversas fuentes vegetales mediante el uso de microorganismos.

Este bioetanol es empleado mayoritariamente como combustible, y se enmarcaría dentro del grupo de fuentes de energía renovables. La fuente de dichos azúcares, empleados para llevar a cabo la fermentación, puede ser muy variada. Existen dos generaciones de bioetanol en función de la materia prima empleada. Para la producción de bioetanol de primera generación, se emplean materias ricas en azúcares fácilmente extraíbles, como cereales, remolacha, caña de azúcar, etc. Aunque el proceso industrial empleado para la producción de este tipo de bioetanol es favorable, tanto energéticamente como económicamente, el bioetanol de primera generación presenta un importante problema relacionado con la competencia generada entre la producción de bioetanol y la producción de alimentos para consumo humano. De hecho, algunos autores llegan a cuestionar el bioetanol como fuente de energía renovable. Como consecuencia, surge el bioetanol de segunda generación (también conocido como bioetanol lignocelulósico), que emplea como materia prima residuos de alimentos o partes de vegetales no comestibles, solucionando de este modo el problema previamente mencionado. Sin embargo, este proceso proporciona un menor rendimiento, ya que requiere una hidrólisis química y/o enzimática para transformar azúcares complejos en azúcares simples que puedan transformarse en etanol durante la fermentación microbiana. Existe una tercera generación de biocombustibles, que emplea como materia prima algas y otros residuos del fondo marino. Sin embargo, se trata de una tecnología emergente en vías de desarrollo que, todavía, no ha sido implementada a escala industrial y, por tanto, el bioetanol de tercera generación no se encuentra comercialmente disponible.

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El bioetanol puede ser empleado como combustible directamente (en motores FlexiFuel modificados para tal fin) o mezclado con gasolina en diferentes proporciones. En este último caso, el bioetanol se emplea como sustituto de otros compuestos químicos, más tóxicos que el etanol (por ejemplo, sustituto del etil tert- util éte ETBE , e pleados para aumentar el contenido en oxígeno de la gasolina y, de este modo, favorecer una combustión de más eficiente. Cabe desatacar que un motor de combustión no modificado puede usar hasta E15 (gasolina con un 15% de bioetanol), sin que ello suponga una alteración de su funcionamiento.

Este biocombustible, junto a otras formas de energía renovables, es considerado un potencial candidato para sustituir a los combustibles fósiles debido a que su uso conduce a la emisión de una menor proporción de gases de efecto invernadero. Así, en el caso de bioetanol de primera generación, se puede reducir dicha emisión hasta en un 66%. Por tanto, el consumo de bioetanol puede dar solución a corto plazo a otros problemas medioambientales y de salud, que podrían estar relacionados con el uso masivo de combustibles derivados del petróleo. Estos motivos, junto a la disminución de reservas de petróleo en el planeta (algunos estudios indican que las existencias de petróleo pueden agotarse en un plazo de unos 50 años), han propiciado que el uso y producción de bioetanol haya aumentado de forma muy notable durante los últimos 20 años, así como el número de investigaciones dedicadas al desarrollo de métodos de producción de bioetanol usando nuevas materias primas y/o nuevos microorganismos.

Obviamente, los desarrollos mencionados deben estar ligados al diseño e implementación de nuevos métodos de análisis para llevar a cabo el control de calidad de estos biocombustibles. Sin embargo, al contrario que en el caso de los combustibles fósiles, los métodos de análisis oficiales recogidos en la legislación europea están limitados a la evaluación de ciertos parámetros globales (por ejemplo, contenido en agua, pH, acidez total o conductividad). No obstante, el bioetanol puede contener tanto compuestos orgánicos como inorgánicos que alteren su calidad y, por tanto, su uso como combustible.

En el caso de contaminantes orgánicos, destacan los compuestos volátiles por su efecto negativo en el medio ambiente cuando son emitidos a la atmósfera. Entre los compuestos inorgánicos destacan metales y metaloides, que son de especial interés ya que algunos de estos elementos pueden tener efectos perjudiciales para el medioambiente, así como la

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Resumen

5 salud humana, incluso en muy bajas concentraciones (niveles inferiores a las partes por billón). Además, algunos metales y metaloides pueden dañar los motores de combustión.

Adicionalmente, cabe destacar que el análisis isotópico de bioetanol podría proporcionar información útil sobre el tipo de materia prima empleada para su producción, así como el origen geográfico del mismo. Hasta el momento no se conoce ningún intento por efectuar este tipo de análisis en bioetanol.

Por todos los motivos expuestos anteriormente, la presente Tesis Doctoral tiene como principales objetivos los que se enumeran a continuación:

1. Desarrollo de nuevos métodos de análisis para la determinación de metales en muestras de bioetanol mediante técnicas de plasma acoplado por inducción (ICP, del inglés Inductively Coupled Plasma). Dichos métodos deben proporcionar menores límites de detección que los métodos ya existentes y reducir los efectos de memoria.

Sin embargo, el aspecto más relevante es la obtención de resultados exactos para lo cual se debe proceder a la eliminación de los efectos de matriz causados por diferencias en la composición de muestras de bioetanol.

2. En el caso de que los metales de interés se encuentren en concentraciones cuantificables (> LOQ), establecer la procedencia de dichos metales a través del análisis de muestras tomadas a lo largo del proceso de producción de bioetanol.

3. Desarrollar un nuevo método analítico para llevar a cabo, por primera vez, la determinación de relaciones isotópicas de plomo en bioetanol que proporcionen información acerca del material de partida y origen geográfico de las muestras.

4. Adicionalmente, se establece como objetivo de esta Tesis Doctoral la identificación y cuantificación de compuestos orgánicos volátiles mediante el uso de cromatografía de gases acoplada a diferentes detectores. Por una parte, estos compuestos orgánicos son contaminantes y, por otra, su presencia como parte de la matriz de la muestra condiciona el desarrollo de métodos analíticos basados en ICP para el análisis elemental e isotópico de muestras de bioetanol.

Todos estos objetivos, los métodos experimentales para llevarlos a cabo, así como los resultados y conclusiones más relevantes derivados de cada uno de ellos, se presentan de

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forma detallada en siete capítulos estrechamente relacionados. De estos siete capítulos, los dos primeros consideran aspectos introductorios necesarios para la comprensión del estado de la temática desde un punto de vista analítico, dejando entrever problemáticas de tipo industrial y medioambiental. Los capítulos 3 y 4 se consagran a la consecución del primero de los objetivos propuestos anteriormente. Los capítulos 5 y 6 centran su atención en los objetivos 2 y 3, respectivamente. Finalmente, el cuarto y último objetivo se desarrolla íntegramente en el capítulo 7. Los capítulos comprendidos desde el 2 al 6 han sido publicados en diferentes revistas indexadas en el JCR del primer cuartil del área, mientras que los resultados presentados en el capítulo 7 serán próximamente enviados para su publicación.

CAPÍTULO 1. Espectrometría de Plasma Acoplado por Inducción.

En el capítulo 1 se presenta la instrumentación que, en la actualidad, es frecuentemente utilizada para llevar a cabo el análisis elemental e isotópico de un gran número de muestras. A lo largo del mismo se detallan las diferentes partes de un equipo de espectroscopía de emisión óptica con fuente de plasma acoplado inductivamente (ICP- OES) y espectrometría de masas con fuente de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).

Dentro de este segundo grupo de instrumentos, se hace un análisis detallado de dos tipos de ICP-MS. Estos equipos incorporan, como analizador de masas, un cuadrupolo (ICP- QMS) y un analizador de doble enfoque (sector eléctrico-sector magnético) acoplado a un detector múltiple y simultáneo (MC-ICP-MS).

En primer lugar, se discute de forma pormenorizada aquellos elementos que son comunes a todos los instrumentos basados en ICP. En esta primera parte del capítulo, se hace una revisión de los diferentes sistemas de introducción de muestras líquidas (nebulizador + cámara de nebulización) comúnmente empleados para llevar la muestra líquida, a un caudal constante, hasta el plasma en forma de aerosol fino y monodisperso. Asimismo, se describen los fenómenos de transporte que tienen lugar en dichos sistemas de introducción de muestras. Posteriormente, se detalla cómo se genera el plasma y los procesos que sufre la muestra cuando se introduce en el mismo.

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Resumen

7 En segundo lugar, se discuten los detalles de cada uno de los equipos empleados en cada técnica de forma detallada (ICP-OES, ICP-QMS y MC-ICP-MS). En cada uno de estos apartados se describen los elementos dedicados a separar la radiación (ICP-OES) o a seleccionar las masas de interés (ICP-MS), así como los diferentes detectores utilizados en cada uno de los instrumentos usados en la presente Tesis Doctoral.

CAPÍTULO 2. Determinación de metales y metaloides en bioetanol y biodiesel

El segundo capítulo tiene como principal objetivo hacer una revisión exhaustiva de los métodos desarrollados para la determinación de metales y metaloides en biocombustibles (bioetanol y biodiesel) previos a la presente Tesis Doctoral.

En una primera sección, cuyas conclusiones son aplicables para ambos biocombustibles, se discuten los efectos que una matriz orgánica tiene sobre los fenómenos de transporte que ocurren en el sistema de introducción de muestras y los efectos que la carga de disolvente orgánico tiene sobre el plasma. Entre ellos, se pueden citar: (i) generación de remolinos; (ii) modificaciones de la densidad de electrones, densidad de hidrógeno y temperatura de excitación; (iii) cambios en la geometría del plasma; (iv) emisión molecular de productos de pirólisis del disolvente; y, (v) formación de depósitos de carbonilla en diferentes partes del espectrómetro (principalmente en el inyector, en ICP- OES e ICP-MS, y en los conos de la interfaz, en el caso de ICP-MS). Además, las diferentes interferencias espectrales que pueden ser ocasionadas por la introducción de muestras orgánicas en el plasma son descritas en esta primera parte del capítulo.

Posteriormente, se tratan en detalle los diferentes métodos desarrollados para el análisis de biodiesel y bioetanol. En ambos casos, se menciona la importancia de llevar a cabo la determinación de metales y metaloides en biocombustibles, como parte del control de calidad de los mismos y, a continuación, se hace una revisión exhaustiva de los métodos de análisis existentes basados tanto en ICP como en otras técnicas analíticas, así como los métodos de preparación de muestra y calibrado más empleados en dichas técnicas y métodos.

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Tal y como se ha comentado previamente, la determinación de metales y metaloides en bioetanol es importante debido a los efectos negativos que estos pueden causar sobre la salud, el medio ambiente y el funcionamiento de los motores de combustión. Sin embargo, desde el punto de vista analítico, la determinación de metales y metaloides en matrices orgánicas en general, y en bioetanol en particular, es un reto debido a: (i) los efectos de matriz (interferencias no espectrales) causados por la introducción de matrices orgánicas. Cabe remarcar que, contrariamente a lo que cabría esperar, el bioetanol puede poseer una matriz compleja compuesta por diversos productos orgánicos, así como agua en proporciones significativas; (ii) la introducción de matrices orgánicas puede deteriorar la estabilidad del plasma; (iii) la concentración de algunos metales y metaloides en estos productos puede ser muy baja (niveles del orden o inferiores a los ng mL^-1). A pesar de ello, esas concentraciones son suficientes para causar los efectos negativos previamente descritos; (iv) no existen materiales de referencia con los que validar los métodos desarrollados.

Por todos estos motivos, y tras una revisión de los métodos existentes, se concluye que se requiere un trabajo importante en el desarrollo de nuevos métodos para el análisis elemental de bioetanol, con el principal objetivo de eliminar o mitigar los efectos de matriz y mejorar la sensibilidad de los métodos existentes, lo cual se traduciría en una mejora de los límites de detección (LOD). En este sentido, el estudio de nuevos sistemas de introducción de muestras en ICP se plantea como una opción interesante.

CAPÍTULO 3. Determinación de metales y metaloides en bioetanol mediante ICP-OES.

En el capítulo 3 de la presente Tesis Doctoral se presenta el desarrollo de un nuevo método para llevar a cabo la determinación de metales en muestras de bioetanol mediante el uso de un sistema de consumo total de muestra, llamado hTISIS (high temperautre Torch Integrated Sample Introduction System), desarrollado en el grupo de investigación donde se ha realizado la Tesis Doctoral, acoplado a ICP-OES. Este sistema, que consiste en una cámara de paso simple calentada, se ha empleado en sus dos modos de introducción de muestra: (i) aspiración continua a un caudal líquido de 25 µL min^-1; y

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Resumen

9 (ii) inyección segmentada de 5 µL de muestra (ambos descrito en el capítulo 1). Su uso a 400°C y 200°C en inyección segmentada y aspiración continua, respectivamente, permite alcanzar una eficiencia de transporte de analito cercana al 100% para todas las matrices objeto de estudio y, por tanto, eliminar las interferencias provocadas por diferencias de composición de matrices formadas por mezclas de etanol y agua. La validación del método se llevó a cabo mediante la obtención de la recuperación, a través del análisis de cuatro muestras reales dopadas con los analitos de interés, obteniéndose en todos los casos valores entre 80% y 120%. Además, se realizó la comparación de las concentraciones obtenidas mediante este método frente a las obtenidas para las mismas muestras a través de un método basado en la evaporación a sequedad de la muestra seguido de la redisolución de residuo resultante en un pequeño volumen de agua. Ambos métodos suministraron valores concordantes. Tras la optimización del método, se analizaron mediante calibración externa 28 muestras reales de bioetanol con contenido en etanol entre 55% y 100%. El método de cuantificación estuvo basado en el calibrado externo empleando una serie de patrones multielementales preparados en una mezcla de etanol y agua en igual proporción. Los límites de detección (LOD) obtenidos oscilaron entre 3 ng mL^-1 para Mn y 500 ng mL^-1para Ca. Por tanto, haciendo uso de este método pueden cuantificarse, de manera exacta y precisa, aquellos elementos mayoritarios y minoritarios presentes en muestras de bioetanol. Sin embargo, no es posible llevar a cabo la cuantificación de aquellos metales y metaloides presentes en niveles traza. Por ese motivo, se trató de extender el uso de este sistema de introducción de muestras acoplándolo a ICP-MS, ya que es una técnica más sensible que ICP-OES.

CAPÍTULO 4. Análisis de muestras de bioetanol mediante ICP-MS usando un sistema de consumo total de muestra.

Como se ha anticipado, en el capítulo 4, se acopló el sistema de introducción de muestras hTISIS a un ICP-MS para la cuantificación de metales y metaloides en bioetanol, focalizándose el estudio sobre los elementos traza. De igual modo que en el capítulo 3, el primer objetivo era la optimización del método en términos de exactitud y sensibilidad.

Por lo tanto, se buscó eliminar los efectos de matriz causados por la presencia de etanol

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consiguiendo, al mismo tiempo, la mayor sensibilidad posible. En el caso de ICP-MS, las concentraciones de etanol varían desde 0% al 50%, ya que concentraciones de etanol superiores causan la formación de depósitos de carbonilla en los conos de la interfaz. Bajo estas condiciones, se estudió el efecto de la temperatura del sistema hTISIS sobre la sensibilidad y los efectos de matriz, tanto en modo de aspiración continua de la muestra como en modo discontinuo. Se obtuvo un máximo de sensibilidad entre 100°C y 200°C, dependiendo de la matriz. Sin embargo, al contrario de lo observado en ICP-OES, un aumento de la temperatura no fue suficiente para eliminar los efectos de matriz causados por el etanol. Este efecto extra no estuvo ligado a modificaciones en los fenómenos de transporte de aerosol en la cámara, puesto que la eficiencia de transporte de analito fue independiente de la composición de la matriz para temperaturas 300°C. Por contra, se demostró que se producía un cambio de la distribución de iones en el plasma en función de la matriz y la temperatura de la cámara. Por tanto, usando el sistema hTISIS a 300°C, fue necesario modificar en 1 mm la posición relativa de la antorcha con respecto al cono de muestreo de iones (sampling cone) del acoplamiento para eliminar totalmente los efectos de matriz. Bajo estas condiciones, todas las matrices estudiadas proporcionaron la misma sensibilidad. De manera análoga al procedimiento empleado en el capítulo 3, la validación del método se llevó a cabo mediante la obtención de recuperaciones en muestras reales dopadas. Finalmente, utilizando el método de análisis directo optimizado, se analizaron 28 muestras reales de bioetanol tras realizar una dilución 1:1, usando patrones preparados en un 50% de etanol. Los LODs obtenidos oscilaron entre 0.014 ng mL^-1 para Co y 5 ng mL^-1 para Na. Estos LODs mejoraron los obtenidos mediante ICP-OES en un factor promedio próximo a los dos órdenes de magnitud, siendo posible la cuantificación de los metales traza presentes en las muestras.

En los capítulos 3 y 4 se ha llevado a cabo la determinación de metales y metaloides en muestras reales de bioetanol y ha sido posible la cuantificación de 16 elementos en diferentes muestras, en concentraciones entre 1 ng mL^-1 y 2 µg mL^-1. Sin embargo, no existen datos sobre el origen de estos metales. Como posibles fuentes destacan la materia prima, el proceso de producción de bioetanol, así como su almacenamiento y/o transporte.

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Resumen

11 CAPÍTULO 5. Evolución del contenido en metales y metaloides a lo largo del proceso de obtención de bioetanol.

En el capítulo 5 de la presente Tesis Doctoral, se ha llevado a cabo la determinación de metales y metaloides, mediante ICP-MS, en: muestras de bioetanol, los materiales de partida empleados para su obtención y muestras tomadas en diferentes puntos críticos a lo largo del proceso de producción. De este modo, se ha estudiado la evolución del contenido en metales y metaloides a lo largo del proceso de obtención de bioetanol, siendo posible establecer el origen de los elementos cuantificados en el producto final.

Además, se han identificado claramente las etapas del proceso donde estos metales y metaloides son eliminados o incorporados/acumulados en el biocombustible.

Para llevar a cabo este estudio se han comparado 4 tratamientos de muestra diferentes, para lo que se han empleado dos materiales de referencia certificados. Los resultados mostraron que el tratamiento más adecuado es la digestión asistida por microondas usando ácido nítrico ultrapuro. Bajo estas condiciones, las recuperaciones variaron entre el 90% y el 110%. Además, los bajos LODs obtenidos permitieron cuantificar los elementos de interés con una buena precisión tanto a corto como a largo plazo.

Se han estudiado dos líneas de producción diferentes basadas en el empleo de dos materiales de partida provenientes de dos regiones diferentes de la geografía francesa.

Los resultados muestran que hay ligeras diferencias en las concentraciones de elementos minoritarios en función de la biomasa empleada en ambas líneas de producción. Por otra parte, las concentraciones de elementos mayoritarios no difieren significativamente para las dos fuentes de bioetanol. El material de partida, del cual se extraen los azúcares, ha sido identificado como la fuente más importante de metales en el producto final. La etapa de destilación provoca una disminución de entre 1000 y 10000 veces en el contenido de metales y metaloides en el bioetanol final, por lo que la concentración de estos metales es menor del 0.01% de las concentraciones presentes en la biomasa empleada para su producción.

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CAPÍTULO 6. Determinación directa de la relación isotópica de plomo en bioetanol mediante MC-ICP-MS utilizando un sistema de consumo total de muestra.

De acuerdo con los resultados obtenidos en el capítulo 5, la principal fuente de metales presentes en bioetanol es el material empleado para su obtención. Por tanto, el análisis isotópico de metales en muestras de bioetanol puede resultar de especial interés para obtener información sobre el material de partida. Los elementos a considerar son aquellos susceptibles de sufrir fraccionamiento ya que alguno de sus isótopos es radiogénico (por ejemplo, Sr o Pb). Así, este procedimiento puede resultar de gran utilidad para la discriminación entre bioetanol de primera y segunda generación o con objeto de obtener información sobre la localización geográfica de dicho material.

En el capítulo 6 se desarrolla un método para el análisis isotópico de plomo de forma directa, sin preparación previa de la muestra y sin separación del analito y la matriz, en muestras de bioetanol usando el sistema de consumo total de muestra hTISIS acoplado a MC-ICP-MS. Los estudios se han llevado a cabo en el grupo Atomic & Mass Spectrometry de la Universidad de Gante en colaboración con el Profesor Frank Vanhaecke, durante una estancia de 7 meses. Los resultados obtenidos con el sistema hTISIS se compararon con los obtenidos con un sistema de introducción de muestras convencional. Además, se han evaluado dos conos del acoplamiento ICP-MS diferentes: un skimmer tipo H y un skimmer tipo X. La sensibilidad alcanzada por el sistema hTISIS fue entre 3 y 7.5 veces superior a la obtenida con el sistema convencional, mientras que el skimmer tipo X proporcionó los mejores resultados. La combinación hTISIS + skimmer tipo X permitió llevar a cabo la determinación de relaciones de intensidades para los pares de isótopos ²⁰⁸Pb/²⁰⁷Pb y

208Pb/²⁰⁶Pb en concentraciones de hasta 2 ng mL^-1 sin degradar la precisión (0.007% - 0.008% para ambas relaciones isotópicas).

El efecto del contenido en etanol y la temperatura del sistema hTISIS en la discriminación en masa ha sido evaluado para las cuatro combinaciones, sistema de introducción de muestra + skimmer, posibles. Para la corrección de la discriminación en masa, se empleó la corrección interna usando un patrón certificado en la composición isotópica de Tl (NIST 997) seguida de la corrección mediante sample-standard bracketing (SSB) con otro patrón certificado en la composición isotópica de Pb (NIST 981) preparado en una matriz

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Resumen

13 previamente fijada conteniendo un 75% de etanol. En el método de corrección SSB, se mide una secuencia patrón - muestra - patrón, donde la muestra se corrige con el patrón anterior y posterior, para corregir una posible deriva instrumental. A pesar de que las muestras de bioetanol poseían diferente concentración de agua, el método descrito fue adecuado para la corrección de la discriminación en masa para matrices con un contenido en agua de entre un 0% y 40%. Por lo tanto, también fue apta para el análisis isotópico de muestras de bioetanol. Estos estudios se efectuaron empleando el sistema de introducción de muestras hTISIS a 125°C y un skimmer tipo X.

La robustez del método frente a cambios en la matriz fue comprobada mediante el análisis isotópico de muestras de bioetanol dopadas con un patrón de plomo isotópicamente caracterizado. Finalmente, se analizaron 6 muestras reales de bioetanol de diferente procedencia y se obtuvieron diferencias significativas en las relaciones isotópicas de plomo, abriendo una puerta al análisis isotópico directo de muestras de biocombustibles y otras matrices orgánicas.

CAPÍTULO 7. Determinación de compuestos orgánicos en muestras de bioetanol mediante GC-FID y GC-MS.

Como se ha indicado a lo largo del presente resumen, la presente Tesis Doctoral se consagra, principalmente, al análisis elemental e isotópico de muestras de bioetanol y muestras tomadas a lo largo del proceso de producción de bioetanol. Sin embargo, como objetivo paralelo se establece la determinación de compuestos orgánicos volátiles con dos fines: (i) enumerar los compuestos orgánicos presentes en las muestras, que pueden ser contaminantes; y (ii) conocer en detalle las matrices de las muestras de bioetanol, ya que estos componentes orgánicos que forman parte de la matriz pueden tener un efecto en los métodos desarrollados en ICP.

Para llevar a cabo esta determinación se han optimizado dos métodos basados en el uso de cromatografía de gases con detector de ionización en llama (GC-FID) para la identificación de los componentes mayoritarios y acoplamiento GC – espectrometría de masas (GC-MS) para la determinación de componentes minoritarios y trazas. Se han

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identificado un total de 130 compuestos orgánicos diferentes en 41 muestras de bioetanol en concentraciones que varían desde pocos µg L^-1 hasta más de 10 g L^-1.

Además, se ha estudiado el efecto de la etapa de destilación, el material de almacenado y el tipo de biomasa empleada para la producción y la generación de combustible sobre el perfil de contaminantes orgánicos de las muestras.

Estos siete capítulos suponen una actualización de los métodos de análisis de bioetanol y muestras relacionadas, especialmente de aquellos métodos para el análisis elemental e isotópico de este tipo de muestras. Además, se ha llevado a cabo una caracterización exhaustiva de diversas muestras de bioetanol haciendo uso de los métodos desarrollados y optimizados previamente, que hasta la fecha no habían recibido especial atención, a pesar de estar comercialmente disponibles y encontrarse su uso en pleno auge.

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ABSTRACT

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Abstract

17 The present PhD, carried out at the Department of Analytical Chemistry, Nutrition and Food Sciences at University of Alicante, in collaboration with the French research center IFP Energies Nouvelles (IFPEN), is focused on the development of new analytical methods for the elemental analysis, as well as the isotopic analysis of bioethanol and samples related with its production.

Bioethanol corresponds to ethanol obtained through microorganism-based fermentation of sugars extracted from diverse sources. This product is mainly used as a fuel and it is considered as a renewable energy source. There are two generations of bioethanol, depending on the type of raw material: First-generation bioethanol is obtained from foods such as cereals, beet and sugar cane that contain high concentrations of easily extractable sugars. Although the industrial process used for producing first-generation bioethanol is efficient, both economically and energetically, fuel-food competition phenomenon has been claimed to be a drawback of this product. The second-generation bioethanol (also called lignocellulosic bioethanol), produced using biomass corresponding to non-edible food crop production, appears to overcome the fuel-food competition problem. However, its synthesis involves previous chemical and/or enzymatic hydrolysis steps in order to transform complex sugars into mono and disaccharides. There also exists a third generation of biofuels, based on the use of algae as raw material. However, this is still an emerging technology that has not been industrially implemented yet.

Bioethanol can be used in its pure form within modified spark-ignition (Flex-Fuel) engines or blended with petroleum distillates at different ratios. Indeed, it acts as an efficient octane-boosting agent, thereby replacing chemical additives such as methyl tert-butyl ether (MTBE). It should be noted that current non-modified engines are compatible with up to E15 (gasoline containing 15% of ethanol).

This biofuel is considered to be a good candidate to replace the fossil fuels because its combustion lowers the amount of greenhouse gas (GHG) emissions. In the case of first- generation bioethanol, the emission of GHG can be reduced up to a 66% as compared to fossil fuels. Therefore, bioethanol would mitigate some environmental and health problems that can be related with the widespread use of petroleum derivates. These reasons, combined with the fact that, according to some studies, petroleum stocks will be

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depleted in about 50 years, have led to a significant growing of the bioethanol use and production during the last decades. As a result, the number of studies focused on the development of new production processes, using new raw materials and/or new microorganisms, have also increased considerably.

Obviously, the growing demand for bioethanol and emerging production technologies should be linked to the development and implementation of new analytical methods to control the quality of these biofuels. However, the official methods of bioethanol analysis incorporated in the current European legislation are limited to some global parameters (e.g., water content, pH, total acidity or conductivity). It is interesting to mention that bioethanol may contain additional organic as well as inorganic compounds, leading to a deterioration of its quality. Regarding organic pollutants, volatile organic compounds (VOCs) should be monitored, among others, due to the negative impact caused by their emission into the atmosphere. Among the inorganic pollutants, metals and metalloids are of particular interest because some of them cause environmental pollution and risks to the human health, even at very low concentrations (levels below ng mL^-1). Moreover, some metals and metalloids may cause engine damages.

Additionally, isotopic analysis of bioethanol could provide valuable information about the kind and the provenance of the raw materials used for its production. It should be noted that studies related with isotope ratios determination in bioethanol have not been reported to date.

For all the reasons mentioned above, the present PhD has four main objectives:

1. Development of new analytical methods to perform the determination of metals in bioethanol samples through Inductively Coupled Plasma (ICP) techniques. The novel methods should provide lower limits of detection and higher sample throughputs than the existing ones. More importantly, accurate results must be obtained. For this purpose, the removal of matrix effects caused by the different composition of bioethanol samples is of capital importance.