UNIVERSIDAD DE OVIEDO Departamento de Biología Funcional
Área de Genética
TESIS DOCTORAL
INFLUENCIA DE Wolbachia EN EL AISLAMIENTO SEXUAL DE Drosophila
Ialah Gazla Oviedo, 2010
AGRADECIMIENTOS
Son muchas las personas a las que les estoy agradecida. He tenido la buena fortuna de contar con el apoyo, el impulso y la influencia de muchos en esta etapa de mi vida.
Agradecer hoy y siempre a mis Padres, porque a pesar de no estar presentes físicamente, si no fuese por su esfuerzo mis estudios no hubiesen sido posibles, ya que a pesar de la distancia, el ánimo, apoyo y la alegría que brindan me dan la fortaleza necesaria para seguir adelante.
A Haydar Gazla, hermano, sin ti no hubiera venido a España para hacer de mi sueño una realidad. Gracias por darme todo tu apoyo, económico y personal, durante todos estos años, lo eres todo para mí, un padre, un hermano, un amigo. Te quiero.
A María Arias Cabal, ojala todo el mundo tuviera tu corazón, tu forma de ser y entender las cosas. Tus consejos y apoyo en todo momento me hizo fuerte para seguir adelante, mi vida es otra cosa desde el momento que nos conocimos en Jordania, eres mi hermana y mejor amiga, (sweet lady) mil gracias por todo.
De igual manera, mi más sincero agradecimiento a la directora de la tesis, Dra.
Maria del Carmen Carracedo Cabanas, por su calidez, sugerencias y confianza. Por ser una persona con la que puedo contar siempre, momentos en los que más que una profesora ha sido como una amiga.
Un agradecimiento especial al Dr. Rafael Piñeiro Belloso por su colaboración y apoyo, sobre todo por escucharme y aconsejarme siempre.
A mi familia de Asturias, D. Sabino Arias, Dña. Maita Cabal, personas que desde el primer momento me dieron y dan todo el apoyo, colaboración y cariño desinteresadamente. Hoy por hoy puedo afirmar que a pesar de haber venido sola jamás me he sentido así, porque ellos han estado a mi lado. Gracias.
A mis hermanos Shosho, Mazin, Najla y Hayfa, la distancia nunca ha sido un impedimento para sentiros cerca de mí, vuestro amor me da fuerzas para seguir adelante día a día. Shosho, gracias por esas largas charlas en el Messenger que no me dejaron escribir lo que tenía que hacer, tus chistes e historias para no dormir me han alegrado los días y las noches. A Álvaro Arias Cabal, por su apoyo y consejos, a Carmen Varela Suárez, prima, gracias por la amistad, el cariño y por las comidas de los domingos, eres la mejor medico y tus fabadas son las mejores de Asturias.
A mis amigos, a Sergio por tu apoyo, ánimo y cariño, los últimos meses compartiste conmigo muchos momentos tanto alegres como tristes, y a tus pequeños, Tigre y Niebla, por esos largos paseos en la playa. A Yvonne Rückert por escucharme, por darme cariño y amistad desde el día en que me conociste, tus consejos e ideas mientras tomábamos un Rivera me han aportado mucho en una sociedad completamente desconocida para mí. A Cristina, Patricia, Susana, Carlos y José Valdeón por su apoyo incondicional, tras tantas horas de café y cenas que me han hecho sentir una más de vuestro grupo. Ada, mi alma gemela, has sido mi mejor amiga, te iré a visitar a Polonia en cuanto acabe el doctorado, y estate tranquila, no se me olvida la cena que tenemos pendiente.
En general quisiera agradecer a todas y cada una de las personas que han vivido conmigo todos los buenos y malos momentos durante la realización de esta tesis doctoral, con las dificultades que ello conlleva.
INDICE
RESUMEN ...1
INTRODUCCIÓN ...4
1. Especies y Especiación ...4
2. Aislamiento reproductivo ...5
3. Wolbachia pipientis...6
4. Factores que influyen en la Incompatibilidad Citoplasmática ...13
5. Eliminación de la infección ...14
6. Importancia de Wolbachia en estudios poblacionales ...16
7. Efecto de Wolbachia en Drosophila...17
8. Objetivos del trabajo ...18
MATERIAL ...20
1. Material biológico (Especies) ...20
2. Medio de cultivo...22
2.1 Medio A de mantenimiento y cría ...22
2.2 Medio B con antibiótico para eliminar la bacteria ...22
3. Viales...23
3.1 Mantenimiento y multiplicación...23
3.2 Estimación del aislamiento sexual...23
4. Aislamiento del ADN...24
4.1 Extracción y amplificación del ADN ...24
4.2 Protocolo ...24
5. Comprobación de la presencia de Wolbachia ...25
MÉTODOS ...28
1. Pruebas preliminares...28
1.1 Receptividad de las hembras ...28
1.2 Efecto de la mutación en la cópula...29
2. Estimación del aislamiento sexual ...29
2.1 Aislamiento intraespecífico ...29
2.1.1 Elección de hembras ...29
2.1.2 Elección de macho ...30
2.1.3 Efecto de la edad ...31
2.1.4 Test de elección de hembra de D.melanogaster mutantes ...33
( rdgB Y OlfD ) ...33
2.2 Aislamiento interespecífico ...34
RESULTADOS ...36
1. Pruebas preliminares...36
1.1 Receptividad de las hembras ...36
1.2 Efecto de la mutación en la cópula...37
2. Aislamiento intraespecífico ...38
2.1.2 Eleccion de machos: ...39
2.2 Drosophila simulans ...41
2.2.1 Elección de hembras: ...41
2.2.2 Elección de machos: ...42
2.3 Efecto de la edad...44
2.4 Incompatibilidad citoplasmática ...45
2.5 Elección de hembras mutantes (rdgB, OlfD) ...45
2.5.1 Elección de hembras rdgB: ...45
2.5.2 Elección de hembras OlfD:...46
3. Aislamiento interespecífico ...46
DISCUSIÓN ...47
CONCLUSIÓNES...53
BIBLIOGRAFIA ...54
ANEXO I...65
ANEXO II...78
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Cruzamientos realizados para crear la cepa con fenotipo white en D.
simulans ...20 Figura 2. Cruzamientos realizados para crear la cepa con fenotipo white en D.
melanogaster...21 Figura 3. A- Fotografía del gel de Drosophila melanogaster. ...27 Figura 3. B- Fotografía del gel de Drosophila simulans...27 Figura 4. Fotografía del gel de hembras de Drosophila melanogaster y Drosophila simulans de diez días de edad. ...32 Figura 5. Porcentaje de machos elegidos por las hembras con o sin infección en los distintos cruzamientos. El color rojo corresponde a machos infectados y el azul a machos curados. ...39 Figura 6. Porcentaje de hembras elegido por los machos con o sin infección en los distintos cruzamientos. El color rojo corresponde a hembras infectadas y el azul a hembras curadas………..40 Figura 7. Porcentaje de machos elegido por las hembras con o sin infección en los distintos cruzamientos, El color rojo corresponde a machos infectados y el azul a machos curados………..42 Figura 8. Porcentaje de hembras elegidas por los machos con o sin infección en los distintos cruzamientos. El color rojo corresponde a hembras infectadas y el azul a hembras curadas………..43
INDICE DE TABLAS
Tabla1. Cruzamientos realizados en cada especie en la prueba de elección de hembra con individuos de diferente edad...31 Tabla 2. Tiempo medio hasta el apareamiento, en segundos, error standard y
número de parejas analizadas (entre paréntesis) en individuos infectados y curados de D. melanogaster y D. simulans. En la parte inferior se presenta el resultado del análisis de varianza. ...36 Tabla 3. Número de cópulas entre individuos infectados con diferente fenotipo en D.
melanogaster y D. simulans. ...37 Tabla 4. Número de machos elegidos por las hembras con o sin infección en los distintos cruzamientos. ...38 Tabla 5. Número de hembras elegido por los machos con o sin infección en los distintos cruzamientos. ...40 Tabla 6. Número de machos elegido por las hembras con o sin infección en los distintos cruzamientos. ...41 Tabla 7. Número de hembras elegidas por los machos con o sin infección en los distintos cruzamientos. ...43 Tabla 8. Número de machos elegidos por las hembras para aparear con diferentes edades, en las dos especies. ...44 Tabla 9. Incompatibilidad citoplasmática en cruces entre hembras de D.
melanogaster de diez días y machos infectados de tres días. ...45 Tabla 10. Elección de hembras mutantes rdgB con machos normales y white
infectados o curados de D. melanogaster. ...45 Tabla 11. Elección de hembras mutantes cepa OlfD con machos normales y white infectados o curados. ...46 Tabla 12. Número de machos D. simulans que aparean con hembras de D.
melanogaster infectadas en cruzamientos interespecíficos. ...46
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RESUMEN
Wolbachia es una bacteria intracelular que Infecta a un gran número de artrópodos y nematodos. Se localiza en el citoplasma de las células del huésped, se transmite por vía materna y altera el sistema reproductivo del mismo.
El efecto principal se denomina incompatibilidad citoplasmática (CI) y causa disminución de la eficacia biológica en cruces entre machos infectados y hembras libres de la infección o entre machos y hembras infectados con distintas cepas bacterianas. La intensidad de la incompatibilidad es variable, dependiendo de las cepas bacterianas y de la interacción entre los genomas del parásito y el huésped.
En las especies utilizadas en este trabajo, Drosophila melanogaster y D.
simulans, la incompatibilidad se manifiesta como una disminución de la productividad en cruzamientos incompatibles.
Este hecho puede considerarse como responsable de aislamiento reproductivo entre individuos infectados o no y ser considerado como un primer estadio de especiación. Sin embargo no existen datos sobre la posibilidad de un posible aislamiento sexual generado por la bacteria, que completaría el proceso de separación entre individuos infectados o no al favorecer cruces compatibles.
El objetivo de este trabajo es demostrar si Wolbachia está implicada, en el aislamiento sexual entre individuos con o sin la infección. Para lograrlo se han realizado tests de elección de pareja en ambas especies, considerando los posibles tipos de combinaciones de individuos infectados o no, utilizando diferentes edades y mutantes.
Los resultados del trabajo demuestran que las hembras jóvenes de las dos especies detectan la presencia de la bacteria en el otro sexo y aparean preferentemente con machos que tienen su mismo estado de infección (apareamiento selectivo o assortative mating), mientras que no hay diferencias en la frecuencia del apareamiento entre los machos con ambos tipos de hembras,
indicando que son incapaces de detectar la presencia de Wolbachia en las hembras y aparean al azar.
La bacteria puede ser eliminada con antibiótico, método que se ha utilizado en la “curación” de hembras jóvenes, o por causas naturales como la edad. Cuando los individuos tienen más de 10 días pierden la infección, y en los tests de elección sólo se detectó discriminación en cruces entre hembras de diez días y machos de tres.
Este resultado implica que aunque las hembras han perdido la infección con la edad eligen a machos infectados para aparearse y además no muestran disminución en la productividad debido a la CI, lo que sugiere que, aunque estos cruces deberían ser considerados como incompatibles, la bacteria expresa en el citoplasma del huésped su capacidad de rescatar el esperma de machos infectados y el efecto continúa activo a pesar de que Wolbachia ya no esté presente.
La capacidad de elección también se manifiesta en las hembras de esta edad
“curadas” y aparean preferentemente con machos sin la bacteria. Sin embargo en este caso existe una drástica disminución de la productividad en cruzamientos entre estas hembras y machos infectados detectándose CI.
Por el contrario, las hembras de tres días aparean al azar con machos de diez.
Este resultado se debe a que los machos “viejos” han perdido la infección y las hembras no pueden detectar la presencia de Wolbachia para discriminar en el apareo.
La posibilidad de que las hembras puedan detectar la presencia de la bacteria en los machos, y por lo tanto realizar elección de apareo, también aparece en hembras mutantes para respuestas a estímulos visuales u olfativos.
Este hecho sugiere que estos sentidos no están directamente involucrados en la discriminación que ejercen las hembras en el reconocimiento de machos infectados o no.
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Por último, no existe apareamiento selectivo en cruzamientos interespecíficos entre hembras de D. melanogaster y machos de D. simulans infectados o no. Esta situación puede ser debida a que las dos especies están infectadas por diferentes cepas de Wolbachia y pueden tener diferentes sistemas de modificación del esperma y rescate del mismo que sean compatibles entre sí, o a que la hibridación es un suceso poco frecuente en la naturaleza y no se han desarrollado las “llaves”
que intervienen en la discriminación.
En conclusión, Wolbachia puede actuar como un factor que genera aislamiento sexual en Drosophila, y tener un papel importante en el proceso de especiación, separando a individuos infectados y no infectados en las poblaciones.
I I N N T T R R O O D D U U C C C C I I Ó Ó N N
INTRODUCCIÓN
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INTRODUCCIÓN
1. Especies y Especiación
Según el concepto biológico, la especie se define como uno o más grupos de individuos que se cruzan entre sí, real o potencialmente, y que su descendencia es fértil, mientras que en la naturaleza están aislados reproductivamente de otros organismos (Dobzhansky, 1937; Mayr, 1942). Por lo tanto, los individuos de una especie comparten un acerbo común de genes, diferente al de otras.
La formación de las especies en organismos con reproducción sexual se basa en el proceso de especiación, que divide a un conjunto de individuos en dos o más subunidades que quedan incapacitadas para reproducirse entre sí.
Esta situación conduce a la escisión de una población genéticamente homogénea en dos o más poblaciones, que pueden modificar cada una de forma diferente su composición genética, por mutación, deriva o selección natural. Estos cambios pueden impedir la armonía genética entre las sub- poblaciones e impedir el flujo genético entre las mismas.
Los modelos de especiación más aceptados corresponden a tres categorías:
a) Especiación alopátrida ó geográfica Las poblaciones quedan aisladas geográficamente y por diversos procesos modifican su composición genética. Esta diversificación puede llegar a evitar el flujo genético entre las mismas cuando vuelvan a encontrarse en el mismo hábitat.
b) Especiación simpátrida Consiste en la formación de especies a partir de poblaciones que viven en la misma extensión geográfica. En este
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modelo el primer paso es la aparición de un fenotipo distinto (causado por mutación) que genera un desplazamiento del mismo hacia un nuevo nicho o ambiente. Esta situación puede que sea responsable del aislamiento reproductivo entre las sub-poblaciones, ya que no comparten el mismo hábitat y/o a que la descendencia tiene inferior eficacia biológica.
c) Especiación parapátrida Según este concepto, una alteración cromosómica (por ejemplo translocación o inversión) surge por azar en algunos individuos de la población, de forma que los heterocigotos tienen una eficacia biológica menor que la de los homocigotos y la selección natural favorecería los cruzamientos entre estos últimos, iniciando un proceso de aislamiento.
2. Aislamiento reproductivo
Este tipo de aislamiento implica la imposibilidad de mantener el flujo genético entre poblaciones, debido a divergencias genéticas acumuladas en los diferentes procesos de especiación. Los mecanismos implicados en este aislamiento pueden ser de dos tipos, no excluyentes entre si:
a) Mecanismos precigóticos o precopulatorios Impiden o dificultan el apareamiento evitando la fecundación y la formación de cigotos (también denominado aislamiento sexual). Este mecanismo está principalmente causado por la modificación de sistemas genéticos implicados en el reconocimiento entre machos y hembras de la misma especie, que repercuten en diferentes conductas sexuales exhibidas por ambos sexos (Paterson, 1985).
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b) Mecanismos postcigóticos o postcopulatorios Son los que aunque tenga lugar la fecundación, los cigotos no son viables o los descendientes son débiles y/o estériles. En un gran número de especies, estos mecanismos son considerados como los más eficaces para mantener el aislamiento reproductivo (Coyne, 1985; Coyne, 1992; Orr, 1993), ya que desde un punto de vista funcional, el desarrollo desde la fase de cigoto hasta el adulto conlleva muchas interacciones entre genes y el ambiente. Cualquier cambio en el proceso normal, causado por la existencia de mutaciones diferentes puede alterar el desarrollo, y provocar el derrumbamiento de la progenie, y por lo tanto del flujo genético entre poblaciones.
Además de los cambios citados cambio genéticos acumulados en las poblaciones durante la evolución, en los últimos años se han propuesto otros factores, que podrían considerarse como ambientales, capaces de inducir aislamiento reproductivo sin necesidad de modificar el acerbo genético de los individuos.
Este es el caso de la infección de ciertos microorganismos, endoparásitos o simbiontes, que causan incompatibilidad en ciertos cruzamientos afectando al desarrollo de la descendencia en individuos de la misma especie. Uno de los fenómenos de este efecto más estudiados es el producido por la infección de Wolbachia en varias especies de artrópodos y nematodos (O´Neill et al., 1997;
Bandi et al., 1998).
3. Wolbachia pipientis
Pertenece a las proteobacterias y se localiza en el citoplasma del huésped (Wright et al. 1978; Tram et al. 2003), por lo que su transmisión es básicamente materna. Se observó por primera vez en el mosquito Culex pipiens (Hertig &
Wolbach, 1924) y se denominó Wolbachia pipientis. Fue descrita formalmente por Hertig en 1936.
INTRODUCCIÓN
Existe la hipótesis de que las actuales mitocondrias, las famosas
“centrales energéticas” de las células eucariotas proceden de las proteobacterias, que serían las reliquias de una antiquísima infección que ocurrió alrededor de hace 500 millones de años. Esta potencial asociación entre diferentes organismos se consolidaría a lo largo de la evolución, dando lugar a orgánulos citoplasmáticos indispensables en la actualidad para un correcto funcionamiento celular.
El principal efecto de la infección bacteriana en la mayor parte de las especies parasitadas es el denominado “incompatibilidad citoplasmática” (C.I.), que se produce en cruzamientos entre machos infectados y hembras libres de la infección. En este tipo de cruces se producen una serie de efectos negativos que afectan a la descendencia, como feminización de embriones, cambios en la proporción de sexos (“male-killing”), disminución de la productividad y partenogénesis (Yen and Barr 1971; O´Neill et al., 1997; Stouthamer et al., 1999).
Este fenómeno fue observado por primera vez por Laven en 1957 al cruzar dos poblaciones de Culex pipiens. Uno de los cruces no dejaba descendencia viable mientras que en el recíproco la descendencia era normal. Posteriormente esta misma situación ha sido detectada por otros autores entre diversas especies de invertebrados, demostrando la asociación de la presencia Wolbachia (o bacterias endoparásitas similares) en los tejidos reproductores de una de las poblaciones con la incompatibilidad de los cruzamientos.
Perrot Minnot et al., (1996) descubrieron un curioso efecto de Wolbachia en Nasonia vitripennis. Esta avispa presenta una diferenciación sexual haplo- diploide, y la infección de Wolbachia provoca una variación en la expresión de la C.I: Los apareamientos de machos infectados con hembras no infectadas producen descendencia, pero la progenie está compuesta exclusivamente por machos (haploides), con dotación materna, mientras que las hembras diploides
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En poblaciones insulares del zigoptero Ischnura hastata de las Azores sólo hay hembras partenogenéticas. Mediante técnicas moleculares se ha detectado en estas poblaciones DNA de un tipo de endosimbionte similar a Wolbachia, comprobando que el tratamiento con antibióticos o altas temperaturas inhiben este efecto, permitiendo el nacimiento de machos (Cordero Rivera, 2005).
La bacteria repercute en la reproducción de su hospedador para favorecer su propia supervivencia y expansión. Al tratarse de un parásito citoplasmático se transmite a través del óvulo, es decir por vía materna, ya que aunque está presente en los órganos reproductores de los machos, no lo está en los espermatozoides maduros, pues éstos pierden el citoplasma antes de la fecundación (Bennington & Hoffmann, 1989; Bressac & Rousset, 1993). En este sentido un macho podría considerarse como un callejón sin salida en el que la bacteria se encuentra atrapada para conseguir la expansión.
Para solucionar este problema la bacteria ha desarrollado varias estrategias durante la evolución, puede en algunos casos actuar de un modo sutil, transformando a los machos en hembras, provocando un cambio en la razón sexual de los hospedadores. En algunas especies de cochinillas, la determinación del sexo tiene lugar mediante un producto glandular, de forma que si éste no se activa, el macho se desarrolla como hembra aunque mantiene su dotación cromosómica. Wolbachia actúa evitando la activación de dicho producto, por lo que las hembras infectadas sólo producen hembras normales y hembras transexuales, que a su vez unicamente generan hembras del mismo tipo (o pseudohermafroditas). En estas condiciones, la población de hembras normales tiende a cero y el sexo de la especie queda determinado por el parásito.
Por otra parte, existen grandes diferencias entre las especies e incluso entre poblaciones en la intensidad de la incompatibilidad. En algunos casos puede ser total (inviabilidad de la progenie) o parcial (disminución de la eficacia biológica de la descendencia). Este fenómeno puede ser debido a
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interacciones entre los genotipos del huésped y la bacteria y/o a la combinación de efectos ambientales y fisiológicos que determinan las consecuencias positivas o negativas de la infección y explicarían la coexistencia de individuos infectados o no, tanto en poblaciones naturales como en laboratorio (Reynolds et al., 2003; Dean, 2006; Dowling et al., 2007; Iturbe-Ormaetxe y O´Neill, 2007;
Yamada et al., 2007; Xi et al., 2008).
La incompatibilidad citoplasmática puede aparecer al cruzar hembras sin la infección con machos infectados de la misma especie (incompatibilidad unidireccional), como se ha comentado, pero también puede aparecer cuando se cruzan poblaciones de la misma especie infectadas con diferentes cepas de Wolbachia (incompatibilidad bidireccional) Stevens et al., 2001. Werren et al., (1986) demostraron que avispas infectadas por Wolbachia no apareaban o no dejaban descendencia, con individuos de especies próximas, e incluso de la misma especie, con una cepa diferente de la bacteria.
El mecanismo que desencadena la CI. permanece desconocido. Estudios citogenéticas realizados en Nasonia vitripennis y en Drosophila simulans indican que está causada por condensación anormal y fragmentación de los cromosomas paternos en la primera división mitótica de huevos fertilizados (Ryans y Saul, 1968; Breeuwer y Werren, 1990; Reed y Werren, 1995; Callaini et al., 1997; Presgraves, 2000).
Una teoría reciente para explicar el mecanismo de la CI ha sido propuesta por Clark et al., (2003). Estos autores, comparando huevos infectados y no infectados de Drosophila, observaron que Wolbachia se asocia a proteínas específicas. Una de dichas proteínas se localiza normalmente próxima al núcleo del óvulo pero en los infectados se concentra en varios puntos del citoplasma. Aunque estas proteínas no son necesarias en estadios previos a la fecundación, en el esperma juegan un papel crucial en la coordinación del apareamiento de los cromosomas paternos y maternos. Este fenómeno podría
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desprovisto de la proteína por Wolbachia, tengan problemas para aparearse correctamente con los de las hembras no infectadas.
Por otra parte, cuando se cruzan hembras y machos infectados, las proteínas presentes en el óvulo son capaces de reestablecer el apareamiento normal entre ambas dotaciones cromosómicas y dando lugar una producción normal de descendencia (Starr y Cline, 2002; Veneti et al., 2003).
Considerando la dinámica de la invasión de Wolbachia en más detalle, análisis teóricos (Caspari y Watson, 1959; Fine, 1978; Hoffmann et al., 1990) junto con datos empíricos (Turelli y Hoffmann, 1995), puntualizan la importancia de tres parámetros principales: I) Nivel de la CI (porcentaje de embriones inviables en cruces incompatibles II) Efecto de la infección en la eficacia biológica (independientemente de la CI) y III) Eficacia de la transmisión de la bacteria de madres a hijos.
Estos estudios han postulado que si la incompatibilidad es fuerte, no existe ningún efecto negativo en la eficacia biológica debida a la presencia del parásito, y la transmisión de madres a hijos es total, la frecuencia de individuos infectados alcanza un equilibrio.
Sin embargo, un equilibrio estable, en el que coexistan individuos infectados o no en la misma población, sólo es posible si la transmisión materna es incompleta, dando lugar a un número residual de individuos no infectados en cada población. En estas condiciones, existiría un segundo equilibro, pero inestable, que correspondería a un umbral donde la CI compensa la transmisión materna incompleta, así como cualquier efecto deletéreo de la hembra hospedadora. Si la frecuencia de la infección está por encima del umbral, entonces crecería hasta alcanzar un equilibrio polimórfico estable más alto. Por otro lado, la infección se perdería si su frecuencia cae por debajo del umbral.
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Esta hipótesis implica que, cuando se empieza por la primera hembra infectada, el umbral requiere un fenómeno de deriva o efecto fundador (Rousset y Raymond, 1991), a no ser que se produzca la llegada de individuos emigrantes de una población próxima infectada (Turelli y Hoffmann, 1991).
Otro aspecto ampliamente estudiado es el efecto de la infección en los individuos portadores del parásito pero los datos no con concluyentes. En algunas poblaciones la bacteria parece actuar como simbionte o mutualista (aumentando la productividad, la frecuencia de apareamientos e incluso la longevidad), lo que indudablemente puede favorecer un proceso de selección natural a favor de su presencia y expansión (Vavre et al., 1999; Dedeine et al., 2001; Crespigny et al., 2006).
Sin embargo, la mayoría de los estudios indican un efecto neutral (Poinsont y Merçot, 1997; Harcome y Hoffmann, 2004) e incluso negativo en varios parámetros de eficacia biológica (Hoffmann et al., 1990; Clancy y Hoffmann, 1997; Min y Benzer, 1997; Mcgraw et al., 2002).
De nuevo, la disparidad de resultados apoya la existencia de una fuerte interacción entre los genomas bacterianos y del huésped, que incluye un nuevo factor a tener en cuenta para explicar la existencia de polimorfismo de individuos infectados y no infectados, tanto en las poblaciones naturales como en las cepas de laboratorio.
Para explicar la inducción de la CI se propone un modelo denominado mod-resc, Werren (1997) postula la existencia de dos funciones bacterianas mod (por modificación) y resc (por rescate). La función mod actúa en la línea germinal de los machos, antes de que Wolbachia sea eliminada del esperma maduro (Pregraves 2000) mientras que resc actuaría en el óvulo, eliminando el efecto negativo de mod Si el esperma está afectado por mod, el desarrollo del cigoto fallaría, a no ser que se exprese resc. Las funciones mod y resc están
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producidas por sistemas genéticos diferentes o al menos con diferentes dominios.
Esta hipótesis también intenta explicar la existencia de incompatibilidad bidireccional, que aparece entre poblaciones infectadas con diferentes cepas bacterianas (O´Neill y Karr, 1990). Según estos autores el modelo mod-resc interactúa de una manera específica, por lo que dos cepas de Wolbachia sólo serían compatibles si compartiesen el mismo tipo de compatibilidad. Sin embargo existen pruebas experimentales que demuestran compatibilidad entre diferentes cepas, puesto que algunas cepas de Wolbachia que no inducen CI.
son capaces de rescatar el efecto de otras cepas que si lo hacen (Bourtzis et al.
1998; Merçot y Poinsot, 1998; Poinsot y Merçot, 1999).
Se proponen dos hipótesis para explicar la existencia de diferentes tipos de incompatibilidad/compatibilidad:
Primero, la CI podría haber emergido muchas veces de forma independiente, dando lugar a diferentes parejas mod-resc, que se pondrían de manifiesto según las necesidades de las interacciones entre las diferentes cepas existentes.
Segundo, y alternativamente, los diferentes sistemas de CI que existen hoy podrían derivar de uno o pocos tipos ancestrales que se han fijado en las poblaciones y especies a través de la evolución.
Charlat et al., (2001) apoyan esta segunda posibilidad. Según estos autores, los nuevos tipos de compatibilidad evolucionan a partir de dos etapas.
En primer lugar podrían aparecer nuevas variantes mod por mutación y expandirse por deriva genética. Esta posibilidad se basa en que mod se expresa en los machos, mientras que Wolbachia se transmite por las madres a su descendencia. Posteriormente, cuando la nueva variante mod alcanza cierta frecuencia, puede crear condiciones para la invasión determinística de una nueva variante resc, dando lugar a una nueva combinación mod-resc.
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4. Factores que influyen en la Incompatibilidad Citoplasmática
En primer lugar, y como ya se ha comentado, influye el genoma de la cepa de Wolbachia. Hay cepas que inducen Incompatibilidad y otras que no. Algunas producen una incompatibilidad total y otras parcial o nula.
La identificación de diferentes cepas de Wolbachia, se realizó estudiando y secuenciando un pequeño número de genes de la bacteria en distintos huéspedes, entre los que destaca el gen 16S rRNA (O´Neill et al., 1992).
Posteriormente, el genoma de diferentes tipos de Wolbachia ha sido secuenciado, identificados los genes presentes en el mismo y construidos árboles filogenéticos entre las bacterias presentes en distintos géneros de artrópodos y nemátodos (Sun et al., 2001).
Algunos autores achacan la intensidad de la incompatibilidad a la densidad de los microorganismos (Caspari y Watson, 1959; Fine, 1978; Hoffmann et al., 1990; Turelli y Hoffmann, 1991, 1994; Prout, 1994; Turelli, 1994) o a la presencia de distintas cepas bacterianas en la misma población, aunque este punto no ha sido demostrado de forma definitiva (McGraw et al., 2001).
También se ha demostrado un diferente efecto de CI en condiciones naturales en relación con estudios de laboratorio. Hoffmann et al. (1990) y Turelli y Hoffmann (1995), observaron que la severidad de la incompatibilidad es mayor en el laboratorio que en la naturaleza. Otra diferencia entre ambas condiciones es el éxito de la transmisión, ya que mientras en condiciones controladas es prácticamente perfecta, en la naturaleza es imperfecta. Estas diferencias pueden ser consecuencia de densidades más bajas de los parásitos en la naturaleza (Boyle et al., 1993; Bressac y Rousset, 1993; Breeuwer y Yerren, 1993), probablemente debidas a efectos ambientales, como por ejemplo diferentes temperaturas durante el ciclo de vida, y/o a la presencia de antibióticos en las fuentes de alimentación de los huéspedes, que pueden
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modificar la intensidad de la infección (Stevens y Wicklow 1992, Reynolds et al 2003).
En condiciones de laboratorio, existe una gran variabilidad en la respuesta individual de las hembras no infectadas en cruces incompatibles. Estudios realizados con líneas endogámicas o isomaternas, infectadas o no, muestran diferentes niveles de respuesta en los cruces incompatibles de las mismas, que abarcan desde incompatibilidad total, parcial o nula (Aleksandrov et al., 2007;
Rodríguez 1998; Gazla y Carracedo, 2009).
Esta situación nuevamente indica que existen genes en el huésped que influyen en la manifestación de una mayor o menor gravedad de la incompatibilidad, independientemente de los genes del parásito (ya que las hembras no están infectadas) (McGraw y O´Neill, 2004, Dowling et al., 2007).
Otro factor relacionado con la CI es la edad de los individuos (Singh et al., 1976; Hoffmann et al., 1986; Giordano et al., 1995; Reynolds y Hoffmann, 2002). El promedio de células espermáticas infectadas disminuye con la edad, e incluso puede llegar a desaparecer. Este fenómeno hace que disminuya la incompatibilidad e incluso sea eliminada (Clark et al., 2002).
Por otra parte, el apareamiento repetido de machos infectados disminuye la densidad de la bacteria, y por lo tanto su efecto negativo en cruces incompatibles (Rigaud Moreau 2004; Crespigny et al. 2006).
Estas circunstancias también deberían tenerse en cuenta en la elaboración de modelos teóricos para explicar la proliferación de la bacteria y la existencia de individuos con y sin la infección en condiciones naturales
5. Eliminación de la infección
La bacteria puede ser eliminada por tratamientos físicos (como altas temperaturas) o químicos (antibióticos) Kyei-Poku et al. 2003. El antibiótico más
INTRODUCCIÓN
utilizado para eliminar a Wolbachia de diferentes organismos infectados es la tetraciclina. Habitualmente se introduce en el alimento en el que se desarrollan los individuos, procediendo a aumentar la concentración en generaciones sucesivas. En general, después de tres generaciones los individuos están libres de la infección, y si se crían en ambientes aislados no recurre la misma.
La tetraciclina es un agente bacteriostático que pertenece a un grupo de antibióticos naturales semisintéticos que actúan inhibiendo la síntesis de las oleínas, que actúan frente a una gran variedad de microorganismos.
El mecanismo de acción del antibiótico es atravesar la membrana externa de la bacteria por difusión pasiva y llegar al citoplasma por un mecanismo dependiente de energía. Dentro del citoplasma se unen al ribosoma inhibiendo la síntesis de las proteínas bacterianas, ya que evita la unión del lugar aminoacil del RNA de transferencia (aminoacil ARN-transfer) a la subunidad 30S ribosomal. La asociación es reversible, lo cual explicaría su efecto bacteriostático. Ejerce su acción antibacteriana y antiprotozoaria por desestructuración del DNA. Tras ingresar en la bacteria, el antibiótico es reducido por proteínas del metabolismo anaerobio (proteínas de transporte de electrones de bajo potencial redox). Estas proteínas son exclusivas de algunos parásitos, de bacterias anaerobias y algunas microaerofilas.
El metronidazol reducido produce perdida de la estructura helicoidal del DNA, rotura de la cadena e inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos, generando compuesto que son tóxicos y provocando la muerte celular (Klein y Cunha, 1995; Pérez e Iglesias, 2003).
La eliminación de Wolbachia por el antibiótico puede ser demostrada por pruebas de amplificación del DNA bacteriano rRNA 16S por PCR y posterior detección del mismo en gel de agarosa (O’neill et al., 1992).
INTRODUCCIÓN
16
descendencia (Aleksandrov et al., 2007), después de varias generaciones de desarrollo en condiciones sin antibiótico. En estas condiciones no existe un posible efecto negativo en la eficacia biológica de los individuos curados con antibiótico.
6. Importancia de Wolbachia en estudios poblacionales
La respuesta innata de los insectos a la presencia de bacterias patógenas incluye la transcripción de genes de péptidos antimicrobianos, (Hetru et al., 2003). Sin embargo, la infección de Wolbachia no parece activar la respuesta inmune durante ninguna fase del ciclo vital del huésped. Una posible explicación para esta situación es la localización intracelular del parásito (Khush y Lemaitre, 2000; McGraw y O¨Neill, 2003), que requiere un alto nivel de integración dentro de las actividades de las células del huésped.
Por lo tanto, Wolbachia podría coordinar varias de sus funciones con sistemas genéticos de su huésped, incluyendo movimiento cromosómico durante la división celular, adquisición de nutrientes, evitar la detección inmunológica, la eliminación de productos de desecho y la regulación de su replicación (McGraw y O’neill, 2004).
La incompatibilidad citoplasmática, produce efectos negativos en la eficacia biológica de cruzamientos incompatibles y puede tener importantes aplicaciones sociales en la manipulación de artrópodos, tales como el control de plagas de insectos que afectan a la agricultura y apicultura (Stouthamer et al., 1993; Turelli y Hoffmann, 1999), a tratar problemas de esterilidad en el ganado debido a infecciones bacterianas o en la posible prevención de enfermedades, sobre todo tropicales como la malaria, en las que están implicados insectos y nematodos en la transmisión de microorganismos tanto a personas como a mamíferos (Werren et al.,1986; Karr, 1994; Zabalou et al., 2004; Xi et al., 2005).
INTRODUCCIÓN
Otro aspecto del efecto de la bacteria, es su posible papel en la especiación (Telschow et al. 2005, Telschow 2007). La CI causa aislamiento reproductivo, ya que influye en la viabilidad y/o esterilidad, entre otros efectos ya descritos, de la descendencia en cruces incompatibles. La disminución de la eficacia biológica de la descendencia, como se ha comentado, es uno de los mecanismos que impiden el flujo genético entre las poblaciones.
En esta circunstancia, no hay necesidad de barreras geográficas promotoras del aislamiento físico entre poblaciones que promuevan cambios genéticos, responsables de la falta de armonía entre los genomas si las poblaciones vuelven a ponerse en contacto (teorías clásicas de la especiación).
Sólo depende de la presencia del endoparásito/simbionte dentro de las poblaciones, a la existencia de individuos infectados o no, y a la interacción de los genotipos del microorganismo y el huésped (Dean, 2006; Xi Z, 2008).
7. Efecto de Wolbachia en Drosophila
En Drosophila, organismo que se ha utilizado en el presente trabajo, también se ha descrito la CI, aunque su efecto depende de la especie. Según Hoffman y Clancy (1994), los niveles de CI en D. melanogaster, D. simulans, D.
sechellia y D. mauritiana son variables y están determinados por la interacción entre los genomas del huésped y de la bacteria. El mayor efecto negativo se produce en D. simulans, mientras que en otras especies la incompatibilidad es incompleta (D. melanogaster) e incluso nula en mauritiana y sechellia (Giordano et al. 1995).
Las especies más estudiadas son D. melanogaster y D. simulans. En D.
melanogaster sólo se ha detectado una cepa de Wolbachia, denominada wMel, mientras que en D. simulans se han descrito al menos cinco variantes de la bacteria en diferentes poblaciones, asociadas a diferentes sistemas de CI (Merçot et al. 1995; Hoffmann et al., 1996). La más frecuente es wRi, que se
INTRODUCCIÓN
18
encuentra en poblaciones de todo el mundo, e induce el mayor efecto de CI denominado tipo R (Hoffmann et al., 1986).
Otras variantes están localizadas en zonas geográficas muy puntuales, como wMa en Madagascar (Nigro, 1991) y produce una incompatibilidad, muy ligera, denominada de tipo M. La incompatibilidad de tipo S está asociada a dos variantes de Wolbachia (wHa y wNo) que coexisten en poblaciones de las Islas Seychelles y de Nueva Caledonia (Merçot et al., 1995; Rousset y Solignac, 1995). La incompatibilidad tipo H está asociada a poblaciones procedentes de Hawaii y la Polinesia Francesa, monoinfectadas por la variante wHa (O´Neill et al., 1992; Rousset et al., 1992; Rousset y Solignac, 1995). Por último, Hoffmann et al., (1996) describieron una nueva cepa de Wolbachia en moscas procedentes de Australia (tipo A), que no causa incompatibilidad citoplasmática.
Estas variantes están relacionadas con diferente tipos de DNA mitocondrial, lo que sugiere una evolución independiente de cada una de las variantes, en poblaciones geográficamente aisladas (Merçot et al., 1995;
Hoffmann y Clancy, 1996).
8. Objetivos del trabajo
Drosophila melanogaster y D. simulans son especies gemelas, cosmopolitas, muy parecidas morfológicamente que comparten una gran parte de sus hábitats naturales.
En cada una de estas especies existe CI producida por la infección de Wolbachia, que se manifiesta en la inviabilidad de la progenie, disminuyendo drásticamente la productividad en cruces incompatibles. La falta de eficacia biológica de estos cruzamientos puede considerarse como la manifestación de un mecanismo de aislamiento reproductivo entre hembras sin infección y machos infectados. Por lo tanto, la infección actúa como una barrera
INTRODUCCIÓN
reproductiva no genética entre individuos de la misma especie, siendo la causa de la aparición de aislamiento reproductivo entre individuos infectados y no infectados.
Sin embargo para que se produzca la falta de flujo genético, responsable de un proceso de especiación, deben existir mecanismos que impidan o dificulten la cópula entre individuos incompatibles (aislamiento precopulatorio).
Hasta el momento no existen datos concluyentes de la existencia de aislamiento sexual generado por la bacteria, que completaría el proceso de especiación al favorecer cruces compatibles.
El primer objetivo de este trabajo es demostrar si Wolbachia está implicada en este tipo de aislamiento. Para ello se han realizado en cada una de las especies, pruebas de elección de macho y de hembra, considerando todos los posibles tipos de combinaciones entre individuos infectados o no.
En segundo lugar se ha comprobado la influencia de la edad en la eliminación de la bacteria, la intensidad de la incompatibilidad citoplasmática causada por el envejecimiento de ambos sexos y la posibilidad de elección de pareja en individuos portadores o no de la bacteria.
En tercer lugar se ha estimado la elección de hembras de D. melanogaster mutantes defectivas para la visión y el olfato, para determinar si alguno de estos sentidos está relacionado con la discriminación de las hembras entre machos infectados o no.
Y por último, se ha considerado la posible discriminación entre individuos infectados o no en cruces interespecíficos entre hembras de D.melanogaster y machos D.simulans.
MA M A T T E E R R I I A A L L
MATERIAL
MATERIAL
1. Material biológico (Especies)
a) Drosophila simulans:
• Una población procedente de Sanabria (Zamora) capturada en el año 2003, infectada por la cepa wRi de Wolbachia.
• Una cepa mutante white cuyo fenotipo es ojo blanco (w, X, 1.5). En la población anterior aparecieron de forma espontánea varios machos con este fenotipo. A partir de estos machos se construyó una cepa con el mismo fondo genético que la población original. Los cruzamientos realizados para obtenerla aparecen en la figura 1.
Figura 1. Cruzamientos realizados para crear la cepa con fenotipo white en D. simulans.
Rojo= fenotipo Normal Blanco= fenotipo White 3 ciclos
MATERIAL
21 b) Drosophila melanogaster:
• Una población capturada en San Claudio (Asturias) en 1999, infectada por la cepa wMel de Wolbachia.
• Una cepa mutante white (w, X, 1.5), construida a partir de un mutante de laboratorio. Se realizaron cruzamientos para obtener una cepa con la mutación y el mismo fondo genético de la población original. Los cruzamientos realizados se presentan en la figura 2.
Figura 2. Cruzamientos realizados para crear la cepa con fenotipo white en D.
melanogaster.
7 ciclos
Rojo= fenotipo Normal Blanco= fenotipo White
MATERIAL
• Una cepa mutante rdgB: (X-42.7), cuyos individuos son ciegos por degeneración del receptor II (Hotta y Benzer 1970). Los fotorreceptores en cada faceta del ojo muestran degeneración inducida por la luz.
• Una cepa mutante Sbl smell blind, sinómino (olfD) (Rodriguez y Siddiqi 1978): (X-54), que responde débilmente a los compuestos volátiles, por lo que genera un defecto olfativo.
Ambos mutantes están infectados por la cepa wMel de Wolbachia y fueron proporcionadas por la Dra. Alcorta del Área de Genética de la Universidad de Oviedo.
2. Medio de cultivo
Se han utilizado dos tipos de medios de cultivo con los siguientes ingredientes por litro de agua
2.1 Medio A de mantenimiento y cría
• Agar 10 gr.
• Sal 1 cucharada pequeña
• Azúcar 100 gr.
• Levadura de pan100 gr.
• Ácido propiónico 5 c.c.
2.2 Medio B con antibiótico para eliminar la bacteria
Los ingredientes son los mismos del medio anterior, excepto la incorporación de tetraciclina en tres concentraciones crecientes en generaciones sucesivas (comenzando por la más diluida hasta la más concentrada), este proceso tiene por objeto la adaptación de las moscas (tanto en estado adulto como pre-adulto) a la presencia del antibiótico en el medio .La tetraciclina se incorporó a la papilla a una temperatura de 38º C.
MATERIAL
23 Las concentraciones fueron las siguientes:
• Tetraciclina 0,25 g. /litro
• Tetraciclina 0,80 g. /litro
• Tetraciclina 1 g./ litro
Después de este tratamiento inicial las moscas se desarrollaron durante tres generaciones en un medio de cultivo con la mayor concentración de tetraciclina.
Finalizado este periodo, se realizó una PCR para comprobar la eficacia de antibiótico para eliminar la bacteria. Posteriormente se criaron en medio normal durante más de tres generaciones antes del comienzo de las pruebas.
3. Viales
Se utilizaron dos tipos de viales:
3.1 Mantenimiento y multiplicación
Botellas de vidrio de 250 c.c. de capacidad con 50 c.c. de alimento. La densidad de desarrollo se controló introduciendo alrededor de 20 parejas por vial durante 10 días. Finalizado este tiempo los adultos se eliminaron y con los individuos de la nueva generación se realizaron los tests de aislamiento sexual. Esta metodología se utilizó durante las generaciones necesarias para realizar las diferentes pruebas.
3.2 Estimación del aislamiento sexual
• Tubos de 60 c.c. de capacidad con medio de cultivo, para el envejecimiento de los individuos vírgenes.
• Tubos de 20 c.c de capacidad sin medio de cultivo, para estimar la receptividad y el aislamiento sexual.
MATERIAL
El mantenimiento y multiplicación de los individuos se llevo a cabo en dos cámaras climáticas (una para los individuos curados y otra para los infectados) a 21+ 0,5º C y ciclos de 12 horas luz – oscuridad.
Las pruebas de receptividad de las hembras y la estimación del asilamiento (elección de pareja), se realizaron por la mañana en el laboratorio manteniendo controlada la temperatura a 21+ 0,5º C, y con luz artificial.
4. Aislamiento del ADN
4.1 Extracción y amplificación del ADN
Las muestras de DNA se obtuvieron a partir de 1 o 2 individuos por línea y tratamiento, (es decir, con antibiótico o sin él) de las dos especies, analizando alrededor de 40 individuos por línea, empleando el protocolo enviado por la Dra. Amparo de Latorre de la Universidad de Valencia.
4.2 Protocolo
• Añadir a la muestra 160 µl de solución 1 (tris 10 mM, NaCl 60 mM, 5%
sacarosa, EDTA 10 mM, pH 7,8).
• Añadir 200 µl de solución 2 (Tris 300 mM, SDS 1,25 %, Sacarosa 5%, EDTA 10 mM, pH 8.
• Agitar por inversión varias veces e incubar a 65 º C durante 30 minutos.
• Añadir 60 µl de acetato potásico 3mM (pH 5) y agitar por inversión varias veces.
• Incubar a – 20 ºC durante 20 minutos y centrifugar 10 minutos a máxima velocidad.
• Traspasar el sobrenadante a un nuevo tubo y añadir el mismo volumen de isopropanol.
• Agitar por inversión profundamente e incubar la muestra 5 minutos a
MATERIAL
25
• Las últimas fases consisten en centrifugar 10 minutos y desechar el sobrenadante, lavar el precipitado con 500 µl de etanol, EtOH 70 % y centrifugar 3 minutos.
• Posteriormente desechar el sobrenadante y secar al vacío.
Resuspender en 50 100 µl de LTE (Tris HCl 10 mM, 0,11 mM EDT, pH 8).
Los ciclos utilizados fueron:
• ciclo desnaturalización 95º C durante 5 minutos.
• ciclo desnaturalización 94º C durante 15 segundos.
• ciclo anillamiento 56º C durante 30 segundos.
• ciclo extensión 72º C durante 30 segundos.
• ciclo extensión 72º C durante 7 minutos. El volumen total fue de 20 µl, para amplificar DNA 35 ciclos.
5. Comprobación de la presencia de Wolbachia
Para detectar a la bacteria se utilizaron dos oligonucleótidos que permiten la amplificación, mediante PCR, del gen para el ARNr 16S específico de la bacteria. Las secuencias de los “primers” son las siguientes:
• 16swup.- 5´GCCTAACACATGAAGTCGAA 3´
• 16swio.- 5´AGCTTCGAGTGAAACCAATTCCC 3´
Para estimar el tamaño se utilizó 500 ng de Marker III como marcador de peso molecular conocido (0,12-21,2 kbp) tomando el volumen necesario del stock con una concentración de 25 ng/µl, De esta forma puede comprobarse el tamaño de las bandas. Después de la PCR se realizó una electroforesis en gel de agarosa (2.5%) en tampón TBE conteniendo 0.50 µg/ml de bromuro de etidio. Sirviéndolo a una temperatura entre 60-65º C y dejarlo reposar al menos 30 minutos.
MATERIAL
La banda de Wolbachia corresponde a un fragmento entre 947-1584 pares de bases. La presencia o ausencia de la bacteria se comprobó antes de empezar las diferentes pruebas y al finalizar los experimentos.
La calle de la izquierda corresponde al Marker. La figura A corresponde a D. melanogaster, las 5 primeras calles pertenecen a individuos curados y las 5 siguientes a individuos infectados. La figura B corresponde a D.
simulans, las cinco primeras calles corresponden a individuos infectados y el resto a curados. En el gel se observan las bandas del ADN de Wolbachia en los individuos infectados.
MATERIAL
27
A- Fotografía del gel de Drosophila melanogaster.
B- Fotografía del gel de Drosophila simulans.
Figura 3. Fotografias de los geles de D. melanogaster y D. simulans.
MÉ M É T T OD O D OS O S
MÉTODOS
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MÉTODOS
1. Pruebas preliminares
Antes de estudiar el aislamiento reproductivo asociado a Wolbachia se estimaron en las dos especies varios componentes de la eficacia biológica de las poblaciones analizadas, que podrían influir en los resultados de los tests de elección.
1.1 Receptividad de las hembras
Se estimó como tiempo que tarda una hembra virgen de tres días de edad en copular con un macho de su misma edad, especie, mutación y condición de infección. Esta prueba se realizó debido a que diferencias en el tiempo de apareamiento entre hembras de fenotipo normal o white, o infectadas o no, podría inferir en los resultados de los tests de elección ya que las hembras con alta predisposición al apareo (más receptivas) son menos selectivas en sus cópulas que las que necesitan mayor cantidad de cortejo (Casares et al.
1993; Casares et al. 1998).
En esta prueba10 hembras o 10 machos recién emergidos se colocaron en tubos de 60 c.c. con alimento (un tubo para cada sexo) durante 3 días.
Transcurrido este de tiempo se aspiraron (sin anestesiar) un macho y una hembra y se introdujeron en un tubo vacío de 20 c.c cronometrando el tiempo que tardan las parejas en aparear durante un periodo máximo de 30 minutos de observación.
El número de parejas analizadas fue de alrededor de 50 para cada cruzamiento. Se estimó tanto el tiempo hasta la cópula como el número de parejas que no logra el objetivo en este periodo (lo que se denomina fallos).
Esta prueba se realizó con individuos procedentes de la misma generación, siguiendo un protocolo en el que se estimaba diariamente la receptividad de
MÉTODOS
10 cruzamientos para cada especie y tipo de cruzamiento La medida se estimó por la mañana, entre las 11 y 14 horas a temperatura de 21ºC y con luz artificial.
1.2 Efecto de la mutación en la cópula
Para estimar el posible efecto de la mutación en los tests de elección de machos o hembras, se realizó una prueba entre individuos de tres días de edad curados o infectados. El método de extracción y envejecimiento de los individuos fue el mismo que el descrito en el apartado anterior. Se introdujeron una hembra y dos machos de la misma especie y con la misma condición de infección, que diferían en el color de ojos, en un tubo vacío de 20 c.c. Posteriormente se observaron el fenotipo de los individuos que estaban copulando.
El tiempo de observación fue de 40 minutos. El esquema seguido para cada especie fue el siguiente:
a) Hembras normales infectadas con:
Machos infectados (white y normales).
b) Hembras white infectadas con:
Machos infectados (white y normales).
2. Estimación del aislamiento sexual
Se realizaron pruebas de elección de machos y de hembras, por el método de no elección, a nivel intraespecífico e interespecífico.
2.1 Aislamiento intraespecífico
2.1.1 Elección de hembras
La extracción de individuos vírgenes y su mantenimiento hasta los tres días de edad fue la misma que la descrita en los apartados anteriores.
MÉTODOS
30
de envejecimiento y se colocaron en un tubo vacío de 20 c.c. Las parejas se observaron durante 40 minutos para detectar cual de los dos machos elije la hembra para la copular. El esquema de los cruzamientos en las pruebas de elección de hembras fue el siguiente para cada especie:
a) Hembra normal infectada con:
• Macho normal infectado y macho white curado.
• Macho normal curado y macho white infectado.
b) Hembra normal curada con:
• Macho normal infectado y macho white curado.
• Macho normal curado y macho white infectado.
c) Hembra white infectada con:
• Macho normal infectado y macho white curado.
• Macho normal curado y macho white infectado.
d) Hembra white curada con:
• Macho normal infectado o macho white curado.
• Macho normal curado y macho white infectado.
2.1.2 Elección de macho
Para la recolección de individuos vírgenes y su mantenimiento hasta los tres días de edad se utilizó la metodología descrita en los apartados anteriores. Transcurrido este periodo de tiempo se extrajeron por aspiración un macho y dos hembras y se depositaron en un tubo vacío de 20 c.c. El tubo se observó durante 40 minutos y se determinó que tipo de hembra elije el macho para copular. El esquema de las pruebas de elección de machos para cada especie fue el siguiente:
a) Macho normal infectado con:
• Hembra normal infectada y white curada.
• Hembra normal curada y white infectada.
b) Macho normal curado con:
• Hembra normal infectada y white curada.
• Hembra normal curada y white infectada.
MÉTODOS
c) Macho white infectado con:
• Hembra normal infectada y hembra white curada.
• Hembra normal curada y hembra white infectada.
d) Macho white curado con:
• Hembra normal infectada y hembra white curada.
• Hembra normal curada y hembra white infectada.
2.1.3 Efecto de la edad
Esta prueba se realizó por el test de elección de hembras. La extracción de individuos y su mantenimiento hasta el envejecimiento de 10 días fue la misma que la descrita en los apartados anteriores. Los test se realizaron con individuos de distinta edad. Para cada una de las combinaciones este tiempo se depositaron una hembra y dos machos de en un tubo vacío de 20 c.c. Se observó el tubo durante 40 minutos para detectar cual de los machos ha sido elegido por las hembras para copular.
El esquema de las pruebas de la edad en cada especie, se presenta en la Tabla 1.
Tabla1. Cruzamientos realizados en cada especie en la prueba de elección de hembra con individuos de diferente edad. ( I= infectadas, C=
curadas)
Normal I de 10 días Normal I y white C de 3 días Normal C de 10 días Normal I y white C de 3 días Normal I de 3 días Normal I y white C de 10 días Normal C de 3 días Normal I y white C de 10 días
MÉTODOS
32
Antes de realizar la prueba del efecto de la edad se comprobó por PCR la presencia de la bacteria en individuos de ambos sexos de 10 días de edad. El resultado se muestra en la figura 4.
La primera calle corresponde al marker. Las siguientes son de hembras de 10 días, la mitad de cada especie. Resultados idénticos se obtuvieron en el gel de la PCR realizada con machos de ambas especies de esta edad.
Figura 4. Fotografía del gel de hembras de Drosophila melanogaster y Drosophila simulans de diez días de edad.
Además de comprobar la presencia de la bacteria se realizaron cruzamientos entre hembras de 10 días (infectadas, pero que han perdido la infección por la edad) con machos infectados de 3 días de edad, y de hembras de 3 días curadas con machos de 10 días que estuvieron infectados pero que ya no lo están, para comprobar si en estos
MÉTODOS
cruzamientos (en principio considerados como incompatibles) seguía apareciendo el fenómeno de CI, contabilizando la productividad de cada hembra.
El número de parejas para este tipo de cruzamientos fue de alrededor de alrededor de 50 para cada uno de ellos. Los cruzamientos para comprobar la incompatibilidad son los siguientes:
a) Hembras normales procedentes de infectadas (10 días) con:
Machos normales infectados (3 días).
b) Hembras normales curadas (3 días) con:
Machos normales infectados (10 días).
2.1.4 Test de elección de hembra de D.melanogaster mutantes ( rdgB Y OlfD )
La extracción de individuos vírgenes y su mantenimiento hasta los tres días de edad fue la misma que la descrita en los apartados anteriores.
Transcurrido este tiempo se aspiraron de los viales de envejecimiento una hembra y dos machos y se colocaron en un tubo vacío de 20 c.c. Se observó el tubo durante 40 minutos identificándose cual de los machos ha sido elegido para la cópula.
Los cruzamientos fueron los siguientes:
a) Hembras rdgB infectadas con:
• Macho normal infectado y macho white curado
• Macho normal curado y macho white infectado b) Hembras OlfD infectadas con:
• Macho normal infectado y macho white curado
• Macho normal curado y macho white infectado
MÉTODOS
34
2.2 Aislamiento interespecífico
La posible discriminación entre individuos infectados o no se estimó por un test de elección de hembras, únicamente en la dirección hembras white de D. melanogaster x machos D. simulans (white o normales). Este cruzamiento produce exclusivamente hembras, por lo que si las hembras de melanogaster son white, y tienen posibilidad de elegir entre machos de D. simulans, normales o white, se puede determinar con cual de ellos han apareado examinando el fenotipo de la descendencia, ya que si las hembras aparean con machos mutantes producirá hembras híbridas mutantes (white) mientras que si lo hacen con machos normales todas las hembras de la descendencia serán del mismo fenotipo que el padre. Se programaron dos tipos de cruzamientos:
a) Hembras white infectadas con:
Machos white infectados y normales curados.
b) Hembras white infectadas con:
Machos normales infectados y white curados.
Se introdujeron 10 hembras y 20 machos (10 de cada fenotipo) vírgenes en tubos de cultivo con alimento. Transcurridos 5 días los machos se desecharon y cada hembra se colocó en un tubo individual con alimento, para comprobar si dejaban descendencia y de qué fenotipo era el mismo. Para cada cruzamiento se analizaron alrededor de 50 hembras.
R R E E S S U U L L T T A A D D OS O S
RESULTADOS
36
RESULTADOS
1. Pruebas preliminares
1.1 Receptividad de las hembras
El tiempo medio en segundos transcurrido hasta el apareamiento, el error estándar, el número de parejas en el que está basada cada media (entre paréntesis) y el análisis de varianza de dos vías se muestra en la Tabla 2.
No se detectaron diferencias significativas en ninguna de las especies entre los individuos con fenotipo normal o mutante infectados o curados. Por lo tanto, el posible efecto de la presencia de Wolbachia no se verá afectado por la diferente propensidad al apareamiento de ambos sexos.
I= Infectadas, C= Curadas
Tabla 2. Tiempo medio hasta el apareamiento, en segundos, error standard y
número de parejas analizadas (entre paréntesis) en individuos infectados y curados de D. melanogaster y D. simulans. En la parte inferior se presenta el resultado del análisis de varianza.
Normal I
Normal C
White I
White C
simulans 855.07 + 64.66 (43)
694.40 + 57.79 (46)
726.79 + 62.43 (42)
712.79 +67.74 (42)
melanogaster 701.81 + 49.74 (47)
669.60 + 41.29 (43)
780.02 + 73.41 (41)
810.96 +55.00 (45)
D. simulans D. melanogaster
Fuente de
variación g.I M.C F g.I M.C F
Entre cruces 3 229682.74 1.33 3 135669.02 1.01
Error 169 172054.07 172 135205.96
Total 172 175
RESULTADOS
1.2 Efecto de la mutación en la cópula
El número de machos de fenotipo normal o mutante que aparearon con hembras en las dos especies se muestran en la Tabla 3. La comparación se realizó por una prueba de “Chi cuadrado” con un grado de libertad, La hipótesis nula es la igualdad en la frecuencia de apareamientos.
No se detectaron diferencias significativas en la frecuencia de apareamientos de las hembras con machos normales o mutantes, en ninguna de las dos especies.
D. melanogaster Machos Infectados
Normal White
χ ²
Normal 24 22 0,09 NS
Hembras Infectadas
White 23 24 0,02 NS
D. simulans Machos Infectados
Normal White
χ ²
Normal 21 26 0,53 NS
Hembras Infectadas
White 26 24 0,18 NS
(N.S no significativo)
Tabla 3. Número de cópulas entre individuos infectados con diferente fenotipo en D.
melanogaster y D. simulans.
