UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA
TESIS DOCTORAL
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Mª Esperanza Gómez-Lucia Duato
Madrid, 2015
© Mª Esperanza Gómez-Lucia Duato, 1988
Sintesis de enteroxinas estafilococicas en los alimentos de tipo de elevado consumo
Departmento de Patologia ANimal I
i v
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
Facultad de Veterinaria ,
Departamento de Patologia Animal I
* 5 3 0 9 8 7 4 9 1 0
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
SINTESIS DE ENTEROTOXINAS
ESTAFILOCOCICAS EN ALIMENTOS TIRO DE ELEVADO CONSUMO
M.’ Esperanza Gômez-Lucia y DuÜtO^
Madrid, 1988
3 L : O T C C A
Colecciôn Tesis Doctorales. N.® 100/88
@ M. Esperanza Gômez-Lucia y Duato Edita e Imprime la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid. Servicio de Reprografia Noviciado, 3 - 28015 Madrid
Madrid, 1988 Ricoh 3700
Depôsito Legal: M-4071-1988
UNIVERSIDAD OÛMPLOTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA
SINTESIS DE ENTEROTOXINAS ESTAFUJDOOCICAS EN
ALIMENTOS TIPO DE ELEVADO OONSÜMO
Ma ESPERANZA GOMEZ-LUCIA Y DUATO
M enoria presentada para o p ta r a l grado de D octor en V e t e r in a r ia .
Madrid 1985
UNIVCRSIOAO COMPLUTENSE OE MADRID
F A C U L T A D D E V E T E R IN A R IA
DON GUILLERMO SUAREZ FERNANDEZ, CATEDRATICO DE M IC R O B IO LO G IA
DE LA FACULTAD DE V E T E R IN A R IA DE LA U N IV E R S ID A D COMPLUTENSE
DE M A D R ID ,
C E R T IF IC A ; Que l a T e s i s D o c t o r a l q u e l l e v a p o r t i t u l o
" S IN T E S IS DE ENTEROTOXINAS E STAFILO CO C ICA S
EN ALIM ENTOS T IP O DE ELEVADO CONSUMO", de l a
q u e e s a u t o r a l a L i c e n c i a d a e n V e t e r i n a r i a
Da Ma ESPERANZA G O M EZ-LU C IA Y DUATO, se ha
r e a l i z a d o en l o s l a b o r a t o r i o s d e l D e p a r t a m e n t o
d e M i c r o b i o l o g i e d e e s t a F a c u l t a d b a j o n u e s t r a
d i r e c c i ô n , d e s t a c a n d o su e l e v a d a d e n s id a d
e x p e r i m e n t a l y l a c o n t r i b u c i ô n p o s i t i v a d e l
p l a n t e a m i e n t o p r o p u e s t o , t a l y como se r e f l e j a
en l a s c o n c l u s i o n e s a l c a n z a d a s .
Y p a r a q u e c o n s t e a l o s e f e c t o s o p o r t u n o s , f i r m o
e l p r é s e n t e c e r t i f i c a d o en M a d r id a v e i n t i o c h o
d e A g o s to d e m i l n o v e c i e n t o s o c h e n t a y c i n c o .
A mi M a d re
A R a f a e l
A P e p e
A l a m em o ri a d e mi P a d r e
E l a l ma e n t r a n c e d e a b s t r a e r y d e q u i n t a e s e n c i a r , c o n c i e n c l a c i e n t i f i c a d o l o r o s a , 1 i b r a d a a l o s i n t e r e s e s 1n d u c t i v o s s i e m p r e i m p e r f e c t o s , j u g a n d o e l p e l i g r o s o j u e g o d e l p e n s a m i e n t o s i n s o p o r t e e x p e r i m e n t a l e s t a b l e ; p o n i e n d o i n c e s a n t e m e n t e e n d u d a u n d e r e c h o p a r t i c u l a r a l a a b s t r a c c i â n , p e r o i c u 4 n s e g u r a d e q u e l a a b s t r a c c i d n e s u n d e b e r , e l d e b e r c i e n t i f i c o , y l a p o s e s i 6 n f i n a l m e n t e d e p u r a d a d e l p e n s a m i e n t o d e l m u n d o l
G a s t o n B a c h e l a r d
L a f o r m a c i d n d e l e s p i r i t u c i e n t f f1c o
IN D IC E
CAPITULO I ; GENERAL ID A D E S ... 1
A . R E V IS IO N B IB L IO G R A F IC A ... 2
A . l , P E R S P EC TIV A H IS T O R IC A ... 2
A . 2 . C A R A C TE R ISTIC A S B IQ Q U IM IC A S ... 3
A . 2 . 1 . S IM IL IT U D E S Y D I FERENCIA S ENTRE LAS ENTEROTOXINAS... 3
A . 2 . 2 . L O C A L IZ ACIO N MOLECULAR DEL CARACTER DE ENTEROTO X IG E N IC ID A D ... 14
A . 2 . 3 . EFECTO DE LAS MODIF IC A C IG N E S D U IM IC A S 15 A. 3 . S IN T E S IS DE LAS ENTERO TO XINA S ... 19
A . 3 . 1 . G ENETICA Y MECANISMO DE S IN T E S IS 19 A . 3 . 2 . L Ü C A L IZ A C IQ N CELULAR DE LA S IN T E S IS Y TRANSPORTE EXTRACELULAR... 24
A . 3 . 3 . FASE DE C R E C IM IE N T O ... 2 8 A . 3 . 4 . FACTORES QUE AFECTAN A LA S IN T E S IS DE LAS E N TER O TO XIN AS ... . 29
A . 3 . 4 . a . S USTANCIAS EN S O LU C IO N ... 29
A . 3 . 4 . b . TEMPERATüRA... 34
A . 3 . 4 . C . T IE M P D ... 36
A . 3 . 4 . d . ATMOSFERA Y EMPAQUETADO 37 A . 3 . 4 . S . VALOR p H ... 4 0 A . 3 . 4 . f . A C T IV ID A D DE AGUA... 4 0 A . 3 . 4 . g . CLORURO S O D IC O ... 40
A . 3 . 4 . h . NITR A TO S Y N IT R IT O S ... 41
A . 3 . 4 . X . FLORA COMPETIDORA... 4 3
A . 3 , 5 . D I FERENCIA S ENTRE LA S IN T E S IS DE LAS
ENTEROTOXINAS... 47
A . 4 . P ATOGENIA... 4 8
A . 4 . 1 . SINTO M AS... 4 9
A . 4 . 2 . DOS IS TO XIC A M IN IM A ... 5û
A . 4 . 3 . EX P E R I MENT AC ION A N IM A L... 51
A . 4 . 4 . MECANISMO DE A C C IO N ... 5 2
A. 4 . 5 . EFECTOS IN D U C ID O S ... 5 4
I A . 4 . 5 . a . EFECTOS G AS TR IC O S ... 5 4
A . 4 . 5 . 0 . EFECTOS P IR O G E N IC O S ... 5 7
; A . 4 . 5 . C . OTROS EFECTOS... 5 7
A . 4 . 6 . EFECTOS SOBRE C U LTIV O S T IS ü L A R E S 6 0
A . 5 . A N A L IS IS DE ENTEROTOXINA EN M EDIOS A R T I F I C I A -
LES Y EN ALIM EN TO S ... 61
A. 5 . 1 . METODOS B IO L O G IC O S ...: ... 6 3
A . 5 . 2 . METODOS INMUNOLOGICOS... 64
A . 5 . 2 . 1 . REACCIONES DE IN M U N O D IFUS IO N
EN G E L... 6 6
A . S . 2 . 2 . HEMAGLUTINACIO N Y TE CN ICA S
A F IN E S ... 69
A . 5 . 2 . 3 . TE CNICA S CON REACTIVO S MARCA-
DOS... 7 3
A . 5 . 2 . 3 . a . INMUNOFLUORESCENCIA 7 3
A . 5 . 2 . 3 . b . A A D I0 IN M U N O A N A L IS IS 7 3
A . 5 . 2 . 3 . C . METODO EL IS A ... 7 8
A. 6 . E S T A B IL ID A D DE LAS E N TE RO TO XINA S... 8 2
A . 6 . 1 . EFECTO DEL CALOR... 8 3
A . 6 . 2 . EFECTO DEL p H ... 8 6
A . 6 . 3 . EFECTO DE LAS PROTEASAS... 8 7
A . 6 . 4 . EFECTO DEL ALMACENAMIENTO... 8 8
A . 7 . E P ID E M I0 L 0 3 IA ... 8 8
A . 7 . 1 . FUENTES DE LOS E STAFILOCOCOS... 8 8
A . 7 . 2 . A LIM ENTOS IM P L IC A D O S ... 9 0
A . 7 . 3 . BROTES HABIDOS EN ESPAÇA EN LOS U L T I -
MOS ANOS... 9 6
B. M A T E R IALES Y METODOS... 9 7
B . l . LUGAR DE TRABAJO... 97
B . 2 . MATER I A LE S ... 97
B . 2 . 1 . M A TER IA L DE LABORATORIO... 9 7
B . 2 . 2 . MUESTRAS DE A LIM E N T O S ... 9 8
B. 2 . 2 . a . Q u e s o t i p o m a n c h e g o ... 9 9
B . 2 . 2 . b . M a y o n e s a ... 1 0 5
B . 2 . 2 . C . L e c h e c o n d e n s a d a ... 1 0 7
B . 2 . 3 . CEPAS DE S ^ a u r e u s ... 10 7
B. 2 . 3 . a . Cep a s e m p le a d a s ... 10 7
B . 2 . 3 . b . M a t e r i a l p a r a v e r i f i c a r l a
p r o d u c c i dh d e e n t e r o t o x i n a s . 107
B . 2 . 4 . M ATERIA L PARA EL RECUENTO DE MICROOR-
GANISMOS... 11 0
B . 2 . 4 . a . M é d ia s d e c u l t i v a ... 1 1 0
B . 2 . 4 . P . D i l u y e n t e ... 11 3
B . 2 . 5 . M ATERIAL PARA LA PRODUCEIO N DE A N T I-
SUEROS E S P E C IF IC O S ... 11 4
B . 2 . 5 . a . A n im a le s d e e x p e r i m e n t a c i d h . 1 1 5
B . 2 . 5 . b . E x t r a c c i d h d e s a n g r e y o b t e n -
c i o h d e l s u e r o ... 11 7
B . 2 . 5 . c . T i t u l a c l d h d e l s u e r o ... 1 1 7
B . 2 . S . d . P u r i f i c a c i d h d e l s u e r o ... 12 0
B . 2 . 5 . e . M a r c a d o d e 1 a s i n m u n o g lo b u -
l i n a s co n p e r o x i d a s a ... 12 3
B . 2 . 6 . M ATERIA L PARA LA EXTRACCIO N DE ENTERO
TO XIN A S A P A R T IR DE LOS A LIM EN TO S 1 2 5
B . 2 . 7 . M A TER IAL PARA EL A N A L IS IS DE ENTERO
T O X IN A S ... 12 7
B . 2 . 7 . a . T d c n i c a d e l a d o b l e d i f u s i d h
e n g e l d e a g a r en m i c r o p o r t a 12 7
B . 2 . 7 . P . T d c n i c a d e d o b l e d i f u s i d h en
g e l d e a g a r d e s e n s i b i 1 id a d
d p t1ma en p l a ç a s ( O . S . P . ) . . . 128
B . 2 . 7 . C . M é t o d o E . L . I . S . A ... 1 3 1
B . 2 . 8 . DETECCION DE RIBONUCLEASAS (DNAsa Y
T N A s a )... 13 4
B . 3 . M ETO DO S ' ... 1 3 5
B . 3 . 1 . PREPARACIÜN DE LAS MUESTRAS DE A L I
MENTOS... 13 5
B . 3 . 1 . a . Q u e s o t i p o m a n c h e g o ... 13 5
B . 3 . 1. b . M a y o n e s a ... 14 0
B . 3 . 1 . c . 'L e c h e c o n d e n s a d a . . ... 14 3
B . 3 . 2 . IN CU B A C IO N Y E S T U D IO ... 14 4
B. 3 . 2 . a . I n o c u l a c i d n ... 14 4
B . 3 . 2 . b . P a r « (m é tro s d e i n c u b a c i d h . . . . 14 5
**v-»
B . 3 . 2 . c . Tom# d e m u e e t r a s y t d c n i c a
d e r e c u e n t o ' . ... 14 5
B . 3 . 3 . IN D U C C IO N A LA PRODUCCION DE ENTERO
T O X IN A S ... 14 9
B . 3 . 4 . METODO DE EXTRACCIO N DE ENTEROTOXINAS
A P A R T IR DE LOS A LIM E N T O S ... 151
B . 3 . 4 . a . P r i m e r a f a s e ... 151
B. 3 . 4 . b . S e g u n d a f a s e ... 15 3
B . 3 . 5 . METODOS DE PRODUCCION DE R E A C T IV E S PA
RA SU EMPLEO EN E L IS A ... 15 8
B . 3 . 5 . a . I n m u n i z a c i 6 n d e c o n e j o s 15 8
B . 3 . 5 . b . E x t r a c c i d n d e l a s a n g r e y o b -
t e n c i d h d e l s u e r o ... 160
B . 3 . 5 . C . T i t u l a c i d n d e l n i v e l d e a n t i -
c u e r p o s e s p e c f f i c o s ... 16 2
B. 3 . 5 . d . P u r i f i c a c i dn d e l s u e r o ... 164
B . 3 . 5 . e . M a r c a d o co n p e r o x i d a s a ... 167
B . 3 . 6 . METODOS PARA EL A N A L IS IS DE ENTEROTO
X IN A S ... 16 8
B . 3 . 6 . a . T d c n i c a d e l d o b l e d i- f u s id 'n en
g e l d e a g a r en m i c r o p o r t a . . . 16 8
B . 3 . 6 . b . M e to d o en p l a ç a d e d o b l e d i -
f u s i d h c o n s e n s i b i l i d a d d p t i -
m a .'... 17 2
B . 3 . 6 . C . M e to d o d e e n r i m o inm un oand’-
l i s i s ( E L I S A ) ... 17 3
B .T 3 .7 . METODO DE DETECCIO N DE NUCLEASAS 177
B . 3 . B . METODOS E S T A D IS T IC O S ... 1 7 8
- V I —
c . INTERES Y OBJ ET I VOS DEL TRABAJO... 18 0
C A PITULO I I : QUESO T IP O MANCHEGO... 18 7
A . IN IB Q D U Ç Q IQ N ... 18 8
A . l . QUESO MANCHEGO... 1 8 8
A . 2 . BROTES EN LOS QUE D IS T IN T O S QUESOS HAN S ID O
INCULPADOS COMO CAUSANTES DE IN T O X IC A C IO N
E S T A F IL O C O C IC A ... 19 0
A. 3 . ORIGEN DE LA C O N TA M INAC IO N ... 1 9 2
A . 4 . FACTORES QUE CDNTROLAN EL C R E C IM IE N T O DE -
ESTAFILOCOCOS EN LOS QUESOS... 1 9 6
A . 4". 1 . C u l t i v a i n i c i a d o r ... 1 9 6
A . 4 . 2 . V a l o r p H ... 2 0 0
A . 4 . 3 . A c t i v i d a d d e a g u a ... 2 0 0
A. 4 . 4 . C l o r u r o s d d i c o ... 2 0 0
A. 4 . 5 . O t r o s ... 201
A . 5 . IN F L U E N C IA DE LAS C O N D IC IO N E S TECNOLOGICAS
DE ELABORACION DEL QUESO EN EL DESARROLLO DE
LOS ESTAFILOCOCOS Y EN LA PRODUCCION DE ENTE
R O TO XIN AS... 2 0 2
A. 6 . EVOLUCION DE LOS ESTAFILOCOCOS DURANTE EL
P E R I0 0 0 DE MADURACION DE LOS QUESOS... 2 0 5
B. RESULTADOS ... 2 0 8
B . l . ETAPA DE FA B R IC A C lO N DEL QUESO... 2 0 9
B . 2 . V A R IA C IONES EN EL pH EN EL PROCESO DE F A B R I- .
C A C IO N ... 2 1 6
B . 3 . V A R IA C IONES E XP E R IM E N TADAS EN LOS QUESOS CON
pH M O D IF IC A D O ... 2 1 9
B.4. VALORES DE D NAsa Y TNAsa O B T E N I D O S ... 220 B . 5 . E V O L U C IO N DE L O S M IC R O O R G A N IS M O S A LO LARGO
D E L P E R IO D O DE M A D U R A C IO N ... 2 2 5 B . 5 , 1 . S A L A D O EN S A L M U E R A ... 2 2 5 B . 5 . 2 . P E R IO D O DE M A D U R A C IO N ... 2 2 6 B . 6 . S I N T E S I S DE E N T E R O T O X IN A S A LO LARGO D E L P E
R IO D O DE M A D U R A C IO N ... 2 4 3 C . D IS C U S I ON ... 2 4 5
C . l . D E S A R R O L L O DE E S T A F IL O C O C O S EN E L P E R IO D O .
DE M A D U R A C IO N ... 2 5 1 C . 2 . D E S A R R O L L O DE F L O R A NO E S T A F IL O C O C IC A EN E L
PROCESO DE E L A B O R A C IO N ... 2 5 7 C . 3 . E V O L U C IO N DE L O S V A L O R E S DE p H ... 2 6 0 C . 4 , V A L O R E S DE D N A s a Y T N A s a O B T E N ID O S ... 2 6 2 C . 5 . PER D I DAS DE E S T A F IL O C O C O S EN E L S U E R O ... 2 7 0 C . 6 . D IF E R E N C IA S DE R EC U EN TO EN L A S P R IM E R A S 2 4
HORAS (S A L A Z O N A D O ) ... 2 7 1 C . 7 . P E R IO D O DE M A D U R A C IO N ... 2 7 6 C . 7 . 1 . E V O L U C IO N DE LO S E S T A F IL O C O C O S ... 2 7 6 C . 7 . 2 . E V O L U C IO N D E L p r i ... 2 7 7 C . 7 . 3 . S I N T E S I S DE E N T E R O T O X IN A S ... 2 7 8
C A P IT U L O I I I : M A Y O N E S A ... 2 8 4 A . IN T R O D y C C ig N ... 2 3 5 A . l . M A Y O N E S A ... 2 8 5
A , 2 . BR O TE S EN L O S QUE HAN S I DO IN C U L P A D O S
^ A L IM E N T O S CON M A Y O N E S A ... 2 5 6
A . 3 . OR I GEN DE LA CONTAM INACION... 2 8 7
A . 4 . F A C T O R E S QUE CON TR OLAN E L C R E C IM IE N T O ... 2 6 8 B . R E S U L T A D O S ... 3 3 o E . l . IN F L U E N C IA D E L pH DE L A M AYO N ESA... 3 4 1
& . 2 . IN F L U E N C IA DE L A TEM PER ATU R A DE IN C U B A C IO N .. 3 4 5 B . 3 . IN F L U E N C IA D E L T I P O DE A C E ITE U T I L I 2 A D Q EN
L A P R 2 P A R A C I ON DE L A S M A Y 0 N E 5 A S ... 3 4 9 B . 4 . IN F L U E N C IA D E L IN O C U LO I N I C I A L ... 3 5 0 B . 5 . E V O L U C IO N D E L D E S A R R O LLO DE L A S D 1 S T IN T A S
C E P A S ... 3 5 1
B . 6 . VAR I AC I ONES D EL pH DE L A S M U E S TR A S ... 3 5 3 B . 7 . R E L A C IÜ N E N TR E E L C R E C IM IE N T O DE S ^ a u r e u s Y
L A P R O D U C C IO N DE DESOX IR R IB Q N U C L E A S A T E R M Ü -
E S T A B L E ... 3 5 6 0 . D IS C U S IO N ... 3 5 8 C . l . IN F L U E N C IA D E L p H ... 3 6 1 C . 2 . IN F L U E N C IA D E L IN O C U L O ... 3 6 7 C . 3 . IN F L U E N C IA DE lA T E M P E R A T U R A ... 3 6 8
C . 4 . IN F L U E N C IA D E L AC E I T E ... 3 7 0 C . 5 . E V O L U C IO N DE L A S I N T E S I S DE E N T E R O T O X IN A S
CON R E S P E C T O A L T IE M P Q ... 3 7 0 C . 6 . E V O L U C IO N DE LO S V A L O R E S DE p H ... 3 7 2 C . - ' . R E L A C IO N E N TR E E L C R E C IM IE N T O Y L A P R O D U C -
C IO N DE DESOX I RR I B Q N U C L E A S A ... 3 7 3 C . e . M AYONESAS C Q M E R C IAlE S ... 3 7 5
C A P IT u L O I V : LE C H E C O N D E N S A D A ... 3 7 7
-IX-
A. INTRgBUÇG lO N ... 3 7 8
A . l . LECHE CONDENSADA... 3 7 8
A . 2 . EFECTOS DE LA aw EN M EDIOS LABORATO RYALES.. . 38 1
A . 3 . EFECTO DE LA aw SOBRE LA S IN T E S IS DE ENTERO
T O X IN A S ... 3 8 2
A . 4 . EFECTO DE LA aw SOBRE EL C R EC IM IE NTO DE ES
TAFILOCOCOS Y LA S IN T E S IS DE ENTEROTOXINA EN
A LIM E N T O S ... 3 8 4
A , 5 . EFECTO DEL HUMECTANTE EMPLEADO... 3 8 6
A. 6 . R E S IS T E N C IA A LA IN A C T IV A C IO N ... 3 8 7
B. RESULIA DD S ... 4 2 2
B . l . EVOLUCION DEL DESARROLLO DE LAS D IS T IN T A S
CEPAS... 4 2 2
B . 2 . IN F L U E N C IA DE LA MARCA... .... . . 4 2 4
B . 3 . IN F L U E N C IA DEL INOCULO SOBRE EL DESARROLLO
DE i î . a u r t u s ... 4 2 5
B . 4 . IN F L U E N C IA DE LA TEMPERATURA DE IN C U B A C IO N .. 4 2 8
C . D IS C U S I ON ... 4 3 2
C . l . EFECTO DEL AZUCAR... 4 3 4 C . 2 . EFECTO DE LA TEMPERATURA... 4 3 6
C . 3 . EFECTO DEL INOCULO... 4 3 8
C . 4 . EFECTO DE LA MARCA DE LECHE CONDENSADA
EMPLEADA... 4 3 9
CAPITULO V: CONCLUSIONES Y RESUMEN. ... 4 4 0
CONCLUSIONES... 44 1
RESUMEN... 4 4 6
AG RAD EC IM IEN TG S... 4 5 9
B IB L IQ G R A F IA ... 4 6 2
C A P I T U L O I:
G E N E R A L I D A D E S
- •2—
A . R E V IS IO N B IB L IO G R A F IC A
A . l . P E R S P EC TIV A H IS T O R IC A
L a s i n t o x i c a c i o n e s e s t a f i 1 o c é c i c a s h i c i e r o n su e n t r a d a en I a
h i s t o r i a c i e n t i f i c a e s c r i t a como un b r o t e q u e a d q u i r i d
a l a r m a n t e s p r o p o r c i o n e s , a - fe c t a n d o a 3 0 0 i n d i v i d u o s en e l
e s t a d o d e M ic h i g a n (E E .U LD en e l aMo 1 8 8 4 . A1 e s t u d i a r l a s
m u e s t r a s d e q u e s o d e t i p o C h e d d a r VAUGHN ( 1 8 8 4 ) o b s e r v d u n o s
m ic r o o r g a n is m o s r e d o n d e a d o s , s u g i r i e n d o q u e s e c r e t a b a n u n a
s u s t a n c i a q u f m ic a c a p a z d e p r o v o c a r e l s f n d r o m e . E s e mism o
aA o ROSENBACH e s t a b l e c i d l a s c a r a c t e r i s t i c a s d e l g é n e r o
§ iâ E tiy l_ o ç g g .ç u S i P o s t e r i o r men t e , DENYS ( 1 8 9 4 ) o b s e r v d un
s fn d r o m e s i m i l a r e n B e l g i c a , y OWEN ( 1 9 0 7 ) en E E .U U . En o t r a
z o n a d e l m u n d o , en P i l i p i n a s , BARBER ( 1 9 1 4 ) a i s i o' un o s
mi c r o o r g a n i smos p r o b a b l e m e n te e s t a - f i 1 o c o c o s a p a r t i r d e le c h e
m a m f t ic a y e s t a b l e c i d u n a r e l a c i d n e n t r e e s t a s e c r e c iû 'n y l a
e n f e r m e d a d .
L a h i p d t e s i s q u e VAUGHN h a b i a s u g e r i d o en l o s a n o s en q u e se
d e s c u b r i d l a n a t u r a l e z a t o x f n i c a d e l t é t a n o s , l a d i f t e r i a y
e l b o t u l i smo f u e v e r i f i c a d a p o r DACK e t a l . ( 1 9 3 0 ) c a s i 50
a n o s d e s p u é s . E s t o s d e m o s t r a r o n que l o s f i l t r a d o s a c e l u l a r e s
d e e s t a f i 1 o c o c o s d o r a d o s p r o c e d e n t e s d e p a s t e l e s d e N a v id a d
r e l l e n o s d e c re m a y s o s p e c h o s o s d e h a b e r p r o d u c id o
i n t o x i c a c i dn r e p r o d u c i a n e l s f n d r o m e a l s e r i n o c u l a d o s a
i n d i v i d u o s v o l u n t a r i e s . Se p r o p u s o e n t o n c e s e l n o m b re de
- 3 -
e n t e r o t o x i n a p o r qu e eu i n g e s t i o 'n d e t e r m i n a b a vdm i t o s y
d i a r r e a .
En 1 9 5 3 s e d e m o s t r d d e f o r m a c o n c l u y e n t e l a e x i s t e n c i a d e mas
d e un t i p o in m u n o lo g ic o d e e n t e r o t o x i n a e s t a f i l o c d c i c a
(SURGALLA e t a l . , 1 9 5 3 ) e s t a b l e c ié n d o s e en e l 6 2 n d C o n g r e s s
o f t h e A m e r ic a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y ( K a n s a s , 1 9 6 2 ) que
1 a s e n t e r o t o x i n a s d e o r i g e n e s t a f i l o c 6 c i c o s e g u i r i a n u n a
n o m e n c l a t u r a a l f a b é t i c a , c o n fo r m e a l o r d e n c r o n o l d g i c o d e su
d e s c u b r i m i e n t o . S i g u ie n d o e s t e c r i t e r i o , CASMAN e t a l . ,
( 1 9 6 3 ) p r o p u s i e r o n q u e l o s t i p o s q u e h a b ia n s i do
t e n t a t i v a m e n t e deno m i n a d o s " F " ( f o o d ) y "E " ( e n t e r i t i s )
a d o p t a r a n en 1 o s u c e s i v o e l n o m b re d e e n t e r o t o x i n a A y
e n t e r o t o x i n a B , r e s p e c t i v a m e n t e , s i e n d o s u s e s p e c i es
p r o t o t i p o l a " 1 9 6 E " y l a " 2 4 3 " .
A . 2 . C A R A C T E R IS T IC A S B IQ Q U IM IC A S
A . 2 . 1 . S IM IL IT U D E S Y D I FERENCIA S ENTRE LAS ENTEROTOXINAS
A . 2 . 2 . LO C A L IZ A C IO N MOLECULAR DEL CARACTER DE
E N T E R O T O X IG E N IC ID A D
A . 2 . 3 . EFECTO DE LAS M O D IF I C A C IONES Q U IM IC A S
A . 2 . 1 . S IM IL IT U D E S Y D I FERENCIA S ENTRE LAS ENTEROTOXINAS.
L a s e n t e r o t o x1 n a s e s t a f i 1 o c 6 c i c a s son e x o p r o t e i n a s s im p l e s
q u e c o n t i e n e n a m in o a c id o s d e fo r m a e x c l u s i v e , c o m p u e s ta s p o r
u n a u n i c a c a d e n a p o l i p e p t f d i c a d e p e s o m o l e c u l a r e n t r e 2 6 . 0 0 0
y 3 0 . 0 0 0 d a l t o n . P o s e e n p r o p i e d a d e s h i g r o s c D p i c a s y son muy
s o l u b l e s en a g u a y en s o l u c i o n e s s a l i n a s . Su c a r d e t e r
p r o t e i C O q u e d d co m p l e t a m e n t e c o n -fir m a d o a l s e r p r o d u c i d a s en
g r a n d e s c a n t i d a d e s , p u r i - f i c a d a s y e s t u d i a d a s s u s p r o p ie d a d e s
f f s i c o - q u f m i c a s .
Se h a n i d e n t i f i c a d o h a s t a l a f e c h a o c h o e n t e r o t o x i n a s
d i f e r e n t e s , u t i l i z a n d o como c a r d e t e r d i f e r e n c i a l e l r e s u l t a d o
o b t e n i do en d i s t i n t a s r e a c c i o n e s i n m u n o l d g i c a s i e n t e r o t o x i n a
A (CASMAN, 1 9 6 0 ) , B (BERGDOLL e t a l . , 1 9 5 9 ) , C l y C2
(BERGDOLL e t a l . , 1 9 6 5 ) , C3 (BERGDOLL e t a l . , 1 9 7 9 ) , D
(CASMAN, 1 9 6 7 ) , E (BERGDOLL e t a l . , 1 9 7 1 ) y F (BERGDOLL e t
a l . , 1 9 8 1 ) . L a i d e n t i f i c a c i d n d e l a s e n t e r o t o x i n a s s e b a s a en
l a d e m o s t r a c i dn de l a s r e a c c i o n e s v i s i b l e s co n l o s
a n t i c u e r p o s e s p e c f f i c o s r e s p e c t i v e s ; en e l c a s o d e l o s
d i s t i n t o s t i p o s d e e n t e r o t o x i n a C , t o d a s r e a c c i o n a n c o n e l
m ism o a n t i c u e r p o p r i n c i p a l , m o s t r a n d o a s i m ism o a n t i c u e r p o s
s e c u n d a r i o s p r o p i o s (LEE e t a l . , 1 9 8 0 ) , 1 o q u e p o n e d e
m a n i f i e s t o qu e l a s e s t r u c t u r a s so n d i f e r e n t e s . En l a
p r à c t i c a , l a s d i f e r e n c i a s e n t r e l a E E C l y l a EEC2 t i e n e n
e s c a s a i m p o r t a n c i a , y a que am bas t o x i n a s s e e v i d e n c i a n p o r e l
m ism o a n t i c u e r p o .
I n i c i a l m e n t e , l a i d e n t i f i c a c i d n d e u n a e n t e r o t o x i n a s e b a s a b a
en e l d e s e n c a d e n a m ie n to d e e m e s is en l o s m onos c u a n d o s e
admi n i s t r a b a p o r v i a i n t r a g d s t r i c a a 1 o s a n i m a l e s e l 1 f q u i do
s o b r e n a d a n t e d e l c u l t i v o d e u n a c e p a . S e s a b e que t o d a v i a
- 5 -
e x i S t en e n t e r o t o x i n a s no i d e n t i f i c a d ^ s y a q u e in d u c e n e l
vdmi t o en monos s e g u n 1 o e x p u e s t o , p e r o s e d e s c o n o c e q u é
p o r c e n t a j e p o d r f a n r e p r e s e n t a r , a u n q u e e l a n a l i s i s d e 1 a s
c e p a s i m p l i c a d a s en i n t o x i c a c i o n e s a l i m e n t a r i a s i n d i c a que
a l r e d e d o r d e l 5% d e l o s b r o t e s p u d i e r a n s e r c o n s e c u e n c i a de
e n t e r o t o x i n a s n o i d e n t i f i c a d a s . P o r 1 o g e n e r a l , d s t a s son
p r o d u c i d a s en p e q u e n a s c a n t i d a d e s y s o n d i f i c i l e s d e
p u r i f i c a r , r a d i c a n d o en e s t e f a c t o r e l r e t r a s o en su
c a r a c t e r i z a c i d n .
L a p u r i f i c a c i d n s e h a c e i n d i s p e n s a b l e p a r a e l e s t u d i o
b i o q u f m ic o d e e s t a s s u s t a n c i a s . L o s p r o c e d i m i e n t o s u t i l i z a d o s
h a n s i d o d e s c r i t o s en l a 1 i t e r a t u r a d e m a n e r a e x h a u s t i v e
(BERGDOLL e t a l . , 1 9 5 9 ; CHU e t a l . , 1 9 6 6 ; AVENA y BERGDOLL,
1 9 6 7 ; BORJA y BERGDOLL, 1 9 6 7 ; BORJA e t a l . , 1 9 7 2 ; CHANG y
BERGDOLL, 1 9 7 9 ; R E IS E R y BERGDOLL, 1 9 7 9 ; R E IS E R e t a l . ,
1 9 8 3 ) . L o s m é to d o s a c t u a l e s d e p u r i f i c a c i d n i n c l u y e n r é s i n a s
d e i n t e r c a m b i o i d n i c o , t a i e s como CG-SO (u n a r é s i n a d e t i p o
c a r b o x f l i c o ) , c a r b o x i m e t i 1 - c e l u l o s a y l a gama d e S e p h a d e x
( p o r e x c l u s i d n m o l e c u l a r ) .
A lg u n a s d e l a s p r o p i e d a d e s f i s i c a s y q u i mi c a s s e e x p o n e n en
l a t a b l a I I . P a r e c e h a b e r c i e r t a s d i f e r e n c i a s e n t r e l a s d o s i s
e m é t i c a s p a r a l o s m o n o s, p e r o é s t o e s en c i e r t a m e d id a
e x p l i c a b l e p o r t r a t a r s e d e e x p e r i m e n t o s " i n v i v o " en l o s que
e s d i f i c i l c o n t r o l a r t o d a s l a s v a r i a b l e s y d o n d e l a r e s p u e s t a
i n d i v i d u a l a d q u i e r e u n a s d i m e n s i o n e s p r o p i a s , p o r 1 o q u e l o s
r e s u l t a d o s i n d i c a d o s p u e d e n no r e f l s j a r l a t o x i c i d a d
“ 6—
v e r d a d e r a d e c a d a e n t e r o t o x i n a en c o n c r e t o .
L a u n i c a e n t e r o t o x i n a c u y o p e s o m o l e c u l a r s e c o n o c e co n
e x a c t ! t u d e s l a EEB ( 2 8 . 3 6 6 d a l t o n ) , y a q u e s e h a p o d id o
e s t a b l e c e r s u s e c u e n c i a a m i n o a c i d i c a p o r t e c n i c a s d e
o x i d a c i d n , r e d u c c i d n , e l e c t r o f o r e s i s y c r o m a t o g r a f i a ( HUANG y
BERGDOLL, 1 9 7 0 a , 1 9 7 0 b , 1 9 7 0 c ) . L o s p e s o s m o l e c u l a r e s q u e s e
b a r a j a r o n a l p r i n c i p i o p a r a 1 a s E E A , EEC y EEB o s c i l a b a n
a l r e d e d o r d e 3 5 . 0 0 0 , a u n q u e p o s t e r i o r m e n t e l o s e s t u d i c s
p a r e c e n i n d i c a r qu e s e a p r o x im e n mas a l o s v a l o r e s s e n a la d o s
en l a t a b l a I I (BERGDOLL, 1 9 8 3 ) . S e h a d e t e r m i n a d o q u e e l
p e s o m o l e c u l a r d e EEF e s a p r o x im a d a m e n te 2 4 . 0 0 0 .
E x i s t e n d i f e r e n c i a s e n t r e l o s p u n t o s i s o e l e c t r i c o s r e s e n a d o s
p a r a l a s d i f e r e n t e s e n t e r o t o x i n a s , y a q u e s e o b t i e n e mas d e
un p i C O c o n u n a d i f e r e n c i a e n t r e e l 1 o s d e a p r o x i m a d a m e n te 0 . 4
u n i d a d e s d e p H . En un p r i n c i p i o , CHU e t a l . ( 1 9 6 6 )
d e t e r m i n a r o n p o r c r o m a t o g r a f f a d e p a p e l q u e e l p u n t o
i s o e l é c t r i c o d e l a EEA e r a 6 . 8 , p e r o p o r e n f o q u e i s o e l é c t r i c o
s e h a n r e v e l a d o c u a t r o p i c o s c o n pH d e 8 . 1 4 , 7 . 6 8 , 7 . 2 6 y
6 . 6 4 , p o r l o q u e e l p I e s s u p e r i o r a l o r i g i n a l , mi e n t r a s q u e
ROBERN e t a l . ( 1 9 7 4 ) co n l a m ism a t é c n i c a o b t u v i e r o n
f r a c c i o n e s c o n pH d e 8 . 6 0 , 8 . 1 0 , 7 . 6 0 , 7 , 2 1 y 6 . 7 . CHANG y
D IC K IE ( 1 9 7 1 ) l o c a l i z a r o n mas d e un c o m p o n e n ts e n l a
e n t e r o t o x i n a B m e d ia n t e e n f o q u e i s o e l é c t r i c o y s u g i r i e r o n q u e
l a d i f e r e n c i a d e f r a c c i o n e s p u d i e r a s e r d e b i d a a h i d r d l i s i s
p a r c i a l d e l o s g r u p o s ami d o s d e l a g l u t a m i n a y l a a s p a r a g i n a
en l a p r o t e f n a en e l t r a n s c u r s o d e l a t é c n i c a . S eg u n SPERO e t
-7-
â l . ( 1 9 7 4 ) 1 o s e s t a f i 1 o c o c o s s i n t e t i z an s o l o u n o d e l e s
c o m p o n e n t e s , q u e s e c o n v i e r t e d e u n a -fo rm a a o t r a p o r un
e n z im a t a l como l a a m i d o l i i d r o l a s a . M edi a n t e l a e x p o s ic ic jn d e
l a t o x i n a a pH 9 . 0 a 37 C p u d i e r o n e l i m i n a r 1 o s g r u p o s am i d o ,
co n 1 o q u e s e d e m o s tr o l a - f a c i l i d a d co n qu e e s t a s e p r o d u c i a
en a lg u n o s d e e s t o s g r u p o s , s i g u i e n d o e l m o d e lo d e l a s
r e a c c i o n e s d e p r i m e r o r d e n . L a e n t e r o t o x i n a C l s e
t r a n s f o r m a b a en m o l e c u l a s m enos b ^ s i c a s p o r e l t r a t a m i e n t o
c o n a l c a l i s , p e r o n o a l c a n z a b a e l e s t a d o d e E E C 2 , a u n q u e e l
p u n t o i s o e l é c t r i c o o b t e n i d o e r a s i m i l a r a l d e e s t a u l t i m a
(METZGER e t a l . , 1 9 7 5 ) . Aun c u a n d o e s t a s d o s e n t e r o t o x i n a s
c o m p a r t en d é t e r m i n a n t e s a n t i g é n i c o s p r i n c i p a l e s , t a m b ie n
g o z a n d e o t r o s s e c u n d a r i o s q u e l e s so n p r o p i o s y q u e n o sa
t r a n s f o r m a n p o r l a s c o n v e r s i o n e s (L E E e t a l . , 1 9 8 0 ) ; l a
e n t e r o t o x i n a C2 e s m ucho mas r e s i s t e n t e a l a c o n v e r s i d ir ,,
S Ie n d o ë s t a s 6 l o p o s i b l e m edi a n t e e l t r a t a m i e n t o p r o l o n g a d o
co n A l c a l i s . METZGER e t a l . ( 1 9 7 2 ) p u r i f i c a r o n EEB co n un p i
d e 9 . 4 , i n d i c a n d o q u e a e s t e p I e s a l q u e l a b a c t e r i a
s i n t e t i z a d i c h a t o x i n a . Se p u e d e c o n c l u i r q u e 1 o s p u n t o s
i s o e l d c t r i c o s d e l a s e n t e r o t o x i n a s c u a n d o s e s i n t e t i z a n
1 n i C la l m e n t e p u e d e n no c o i n c i d i r con e l d e p u r i f i c a c i d n ; ne o b s t a n t e , e s t o no i m p l i c a r i a r e p e r c u s i o n e s , y a q u e a l
a i s i a r s e • 1 a s f r a c c i o n e s no p a r e c e n e x i s t i r d i f e r e n c i as en
1 a s a c t i v i d a d e s t a n t o t d x i c a s como i nm u n o l o'g i c a s (CHANG v D IC K IE , 1 9 7 1 ) .
A p a r t i r d e l à e c u a c i d n d e S c h e r a g e y M a n d e l K e r n , B ER3D0LL e t
a l . ( 1 9 7 4 ) s u p u s i e r o n q u e l a s e n t e r o t o x i n a s e r a n m o lë c u la =
T a b l a 12: C o n p o s i c i ô n a m i n o a c î d i c a de las e n t e r o t o x i n a s (g/100 g de prote i n a ) . (Tornado de 3 E R G D 0 L L ; 1 9 S 3 ) .
Amino acid A B c , Cy C.t D E F
Lysine 11-25 I4-S5 14-41 11-99 11-71 12-91 10X3 J2I6
Hisiidinc à 15 2 14 2-91 2 87 2-96 2-(i6 1-(W 2-69
Arginine 4-02 2-59 1-71 175 1 52 1-3S 4 50 2 811
Aspartic acid 15-5.1 IS -11 17-S5 IS-19 IX-27 16 57 15-10 12-92
Threonine 5 95 4-50 5-31 5 SO 6-07 4-51 6-36 9-TO
Serine 2-99 4-05 4-5S 4 S I 5-64 5-09 4 72 8-71
Glutamic acid 12-.15 9 45 S 95 X 91 7-S6 11-15 12-15 10-15
Proline 115 2-11 2-15 2-21 2-10 1-41 1-93 4 55
Glycine 2-95 1-7S 2 99 2 90 1.14 2-69 4 10 3-50
Alanine 194 112 1-S5 161 1-74 2 (Ml 2-.IS 1-25
1 l;ilf-cystinc 0 55 U-5S 0 79 0-74 U 52 0-74 0 XI U-7II
Valine 4 91 5-55 6-50 5X7 5 61 4 11 4 16 2-46
Methionine 0-95 1-52 1 20 1 60 1-72 1-07 0-45 1-16
Isolcucine 4-11 15 1 4(19 4-02 3-18 6-(Kl 4-10 7 52
Leucine 9-7S 6-S5 6 54 6-11 6-58 9 25 10 (IX 6 22
Tyrosine 10-51 I I 50 9 SO 10-27 10-14 7-21 9 79 6-77
Phenyi.ihinine 4-11 5-21 5 15 5-25 5-40 4 75 4 47 4 /ft
Tryptophan 145 0-95 0-99 0X4 — 0 ()2 151 2 -no
Amide N IL 1 -SO 1 -56 171 152 1 12 1-71 1-66 0 74
Los v a l c r e s e x p r e s a d o s c o r r e s p o n d e n a los s i g u i e n t e s autores:
EEA: 3 C H A N T 2 et al., 1972; EEB, B E B G C O L L et al.. 1955; EEC l y EEC2: H U A N G et al., 1967; EEC3: R E I S E R et al., 1921; EED: C H A N G y B E R G D C L L , 1979; EEE : B O R J A et al. 1972; ES.-: R E I S E R et al. . 1931 .
- 9 -
e l i p s o i d a l e s . L a e s t r u c t u r a p a r e c e s e r a s e n c i a l p a r a l a
a c t i v i d a d b i o l d g i c a y l a p ë r d i d a d * t o x i c i d a d * s t 4
in t i m a m e n t e r e l a c i o n a d a c o n l a r e a c c i d h a n t f ^ g e n o - a n t i c u e r p o .
L a p ^ r d i d a d e 1 o s g r u p o s a t f p i c o s o c u l t o s in d u c e n u n a
a l t e r a c i d n e n l a c o n -f o r m a c id n d e l a m o l é c u l a .
En l a t a b l a 1 2 s a o f r e c e l a c o m p o s i c i dn a m i n o a c f d i c a d e l a s
e n t e r o t o x i n a s . L a s d i f e r e n c i a s , t a n t o c u a l i t a t i v a s como
c u a n t i t a t i v a s , e n t r e l o s a m in o d fc id o s s e m a n i f i e s t a en l a s
v a r i a c i o n e s e n t r e l o s p u n t o s i s o e l d c t r i c o s y e n t r e l o s
c e n t r o s a n t i g é n i c o s (BERGDOLL e t a l . , 1 9 7 4 ) , d e s c o n o c ié h d o s e
s i é s t a s p o s e e n a lg u h s i g n i f i c a d o a p a r t é d e r e p r é s e n t e r
d é t e r m i n a n t e s a n t i g é n i c o s d i f e r e n t e s . C o n t ie n e n c a n t i d a d e s
r e l a t i v a m e n t e e l e v a d a s d e l i s i n a , a c i d o s a s p é r t i c o y
g l u t â m i c o y t i r o s i n a , p e r o , p o r e l c o n t r a r i o , e l c o n t e n i d o en
t r i p t d f a n o e s b a j o . Un h e c h o r e p e t i t i v o e s q u e p o s e e n s 6 l o
d o s r e s t a s d e c i s t e i ' n a , e n t r e l o s q u e s e e s t a b l e c e un p u e n t e
d i s u l f u r o .
L a c o m p o s ic id n a m i n o a c î d i c a e s muy s i m i l a r e n t r e l a EEA y l a
EEE p o r un l a d o , y l a EEB y l a s EECs p o r o t r o . E l c o n t e n i d o
en m e t i o n i n a (u n a a d o s m o l é c u l a s en e l p r i m e r c a s o y o c h o o
n u e v e en e l s e g u n d o ) e s e l q u e h a p e r m i t i d o e s t a b l e c e r e s t o s
d o s g r u p o s ; p e r o am bos s e d i f e r e n c i an t a m b ié n en l a c a n t i d a d
d e l i s i n a , é c i d o s a s p é r t i c o y g l u t a 'm i c o , l e u c i n a y
t r i p t d f a n o . BERGDOLL e t a l . ( 1 9 7 3 ) o p in a n q u e ta m b ié n p a r e c e n
a p r e c i a r s e d i f e r e n c i a s en e l c o m p o r ta m i e n t o f ^ s i c o , y a q u e l a
a c t i v i d a d d e 1 a s EEB o EEC s q u e d a n d i s m i n u i d a s o a n u la d a s p o r
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—11—
d i v e r s e s f a c t o r e s t a l c s como s a l e s p o t d s i c a s , a c r i - f l a v i n a ,
s u i f a t o d e e s t r e p t o m i c i n a y c l o r a n f e n i c o l , e n t r e o t r o s . A l
p a r e c e r , l a EED n o p u e d e i n t e g r a r s e en n in g u n o d e l o s d o s
g r u p o s , fo r m a n d o o t r o a p a r t é .
E s i n t e r e s a n t e r e m a r c a r q u e e l r e s t o N - t e r m i n a l e n t o d a s l a s
e n t e r o t o x i n a s e s b i e n s e r i n a o b i e n i c i d o g l u t i m i c o ( t a b l a
1 3 ) , s i e n d o l a s e r i n a e l s e g u n d o r e s t o e n e s t e ü l t i m o c a s o .
S 6 l o s e p u e d e n p r o p o n e r h i p c S t e s is en e s t e t e r r e n o : BERKELEY
e t a l . ( 1 9 7 8 ) h a n s u g e r i d o q u e l a s e c r e c i d n d e e n t e r o t o x i n a
p u d i e r a 1 l e v a r s e a c a b o a t r a v é s d e un s i s t e m a i n t e r m e d i a r i o
l i p i d i c o / e x o p r o t e f n a , en e l c u a l l a s e r i n a j u g a r i a un p a p e l
c r u c i a l .
T a b l a 1 3 : Ami n o d e i d o s t e r m i n a l e s d e l a s e n t e r o t o x i n a s .
EET N - t e r m i n a l C - t e r m i n a l A u t o r !
A S e r i na S e r i n a SCHANTZ e t a l . , 1 9 7 2 j
B A c id o g l u t i m i c o L i s i n a
1 BERGDOLL e t a l . , 1 9 6 5 j
C l A c i d o g l u t i m i c o G1 i c i n a HUANG e t a l . , 1 9 6 7 ;
C2 A c id o g l u t i m i c o G1 i c i n a HUANG e t a l . , 1 9 6 7 ;
C3 S e r i n a - R E IS E R e t a l . , 1 9 7 9
D S e r i na L i s i n a CHANG y BERGDOLL, 1 9 7 9
E S e r i n a T r e o n i n a BORJA e t a l . , 1 9 7 2
L a s e c u e n c i a d e l a e n t e r o t o x i n a B r é v é l a q u e l o s d o s r e s t o s
*—12»
d e c i s t e i n a s e l o c a l i z a n en l a s p o s i c i o n e s 9 2 y 1 1 2 ; en l a
m o l é c u l a a c t i v a s e p r e s e n t a n en f o r m a d e c i s t i n a ,
e s t a b l a c i é n d o s e un p u e n t e d i s u i f u r o e n t r e ambos y f o r m i n d o s e
a s T un l a z o ( " l a z o d e l a c i s t i n a " ) que e n g l o b a 2 0 a m i n o i e i d o s
y q u e l e c o n f i e r e u n a e s t r u c t u r a muy e s t a b l e , f o r m a n d o un
e n r o l 1 a m i e n t o ( f i g u r a I I ) . M a c i e n d o u s o d e t r a t a m i e n t o s
t r i p t i c o s s u a v e s s e p u e d e f r a g m e n t e r e s t e l a z o e n t r e l o s
a m i n o â c i d o s L y s y T h r q u e o c u p an l a s p o s i c i o n e s 9 7 y 9 8
( SPERO e t a l . , 1 9 7 3 ) . I n c l u s o p o r l a r e d u c c i d n d e l p u e n t e
d i s u i f u r o , l o s d o s f r a g m e n t o s p e p t i d i c o s p e r m a n e c ^ a n j u n t o s
como u n a e n t i d a d m o l e c u l a r d n i c a , u n i d o s m e d i a n t e
i n t e r a c c i o n e s no c o v a l e n t e s . En a p a r i e n c i a , no h u b o
d i s m i n u c i6n d e l a a c t i v i d a d t a n t o t û x i c a como i n m u n o l ô g i c a .
E r a d i f l ' a i l o b t e n e r l a s d o s p a r t e s como d o s e n t i d a d e s
i n d e p e n d i e n t e s , y c u a n d o s e c o n s i g u i ô , m ed i a n t e c r o m a t o g r a f T a
c o n C M - c e l u l o s a en u r e a 8M, s e c o m p r o b d q u e en e s a f o r m a e r a n
muy i n e s t â b l e s . C ad a f r a g m e n t e p e p t f d i c o , p e r o e s p e c i a l m e n t e
e l e x t r e m e N - t e r m i n a l , r e a c c i o n a b a co n e l a n t i c u e r p o
e s p e c i ^ f i c o p a r a EEB. E l p é p t i d o C - t e r m i n a l i n h i b i ' a l a
p r e c i p i t a c i dh d e l a EEB c o n s u a n t i c u e r p o e s p e c i T f i c o p e r o
g e n e r a l m e n t e n o d a b a u n a 1f n e a d e p r e c i p i t a c i d n an l a s
p r u e b a s d e d i f u s i d n en g e l , l e qu e f u n d a m e n t a b a qu e l o s
d é t e r m i n a n t e s p r i n c i p a l e s p u d i e r a n e s t a r r e l a c i o n a d o s co n e l
e x t r e m e N - t e r m i n a l . E x i s t i a c i e r t a e v i d e n c i a d e qu e e l
p é p t i d o C - t e r m i n a l p u d i e r a s e r t d x i c o , a u n q u e a n i v e l k s muy
b a j o s , p o s i b l e m e n t e a c a u s a d e l a f a c i1 d e s n a t u r a l i z c c i d n de
l o s c o m p o n e n t e s s e p a r a d o s . En c u s e n c i a d e l a g e n t e
d e s n a t u r a l i z a d o r , s e r e s t a c ? e c i a l a u n i dn e n t r e ambos
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f r a g m e n t o s , r e c o b r a n d o l a t o t a l i d a d d e l a a c t i v i d a d t a n t o
t d x i c a como i n m u n o l d g i c a (SPERO e t a l . , 1 9 7 5 ) .
A . 2 . 2 . L O C A L I Z A C I O N MOLECULAR DEL CARACTER DE
E N T E R O T O X I S E N I C I D A D .
P a r e c e s e r q u e e l l a z o d e l a c i s t i n a e s u n a e s t r u c t u r a
c o m p a r t i d a p o r t o d a s l a s e n t e r o t o x i n a s , y a qu e c a d a u n a
c o n t i e n e t a n s6l o d o s r e s i d u e s d e c i s t e f n a . S i n e m b a r g o , l a
s e c u e n c i a a m i n o a c i d i c a d e d i c h o l a r o p u e d e s e r d i f e r e n t e p a r a
c a d a e n t e r o t o x i n a , como s e h a e n t r e v i s t o a p a r t i r d e l a
s e c u e n c i a c i d n p r o v i s i o n a l d e l mismo en l a EEA. E l l a z o de
c i s t i n a en l a E E C l p u e d e f r a g m e n t a r s e d e i g u a l m a n e r a q u e en
l a E E B , p e r o l a EEA e s a b s o l u t a m e n t e r e s i s t e n t e a e s t a
p r é i c t i c a (SPERO e t a l . , 1 9 7 3 ) , 1 o qu e s u g i e r e qu e no e s
n e c e s a r i a l a e s c i s i d h p a r a q u e e j e r z a s u a c c i dn t d x i c a .
A l p a r e c e r , e l l a z o d e c i s t i n a en l a s EEB y E E C l son
s i mi 1 a r e s p e r o n o i d é n t i c o s , y a q u e en e s t a u l t i m a e l e n l a c e
qu e s e e s c i n d i é c o r r e s p o n d r a a L y s - V a l y en EEB no s e ha
e v i d e n c i a d o n i n g u n p a r q u e i n c l u y a e s t o s d o s a m i n o é ' c i d o s .
H a s t a l a f e c h a , l o s d a t o s r e c o g i d o s p e r m i t e n e n u n c i a r l a
s e c u e n c i a d e l l a z o d e l a c i s t i n a en EEA y E E B , a n a l i z a n d o
a q u e l 1 a s p o r c i o n e s q u e s e a n i d é n t i c a s (BERGDOLL, 1 9 8 3 ) .
- 1 5 -
EEA:
- T h r — A l a-( c y s - M e t - T y r - G l y - G l y - V a l - T h r - } -Leu-}-Hi s-j-Asp- A s n - A a n - j- Arg -
}Leu-}-T h r —G1 u —G1 u —L y s —
EEB:
- L y s - T h r - j c y s - M e t - T y r — G1 y —G1 y - V a l —T h r - -G1 y 4 H i s -f Gl y -| A s n —A«n-}G1 u-
lU eu ^A s p - L y s - T y r — Tyr—
HUANG e t a l . ( 1 9 7 5 ) h a n p r o p u e s t o é s t e como c e n t r o t d x i c o y a
q u e e s l a d n i c a z o n a d e l a m o l é c u l a i d é n t i c a en ambas
e n t e r o t o x i n a s .
A . 2 . 3 . EFECTOS DE LAS M Q D IF IC A C ID N E S Q U IM I C A S
N u m e r o s o s a u t o r e s h a n d e s t a c a d o l a e s t a b i l i d a d d e l a m o l é c u l a
d e EEB (SCHANTZ e t a l . , 1 9 6 5 ; DA LIDQ WIC Z e t a l . , 1 9 6 6 ; CHU e t
a l . , 1 9 6 9 ; SPERO e t a l . , 1 9 7 1 ) , q u i e n e s e n s a y a r o n e l
t r a t a m i e n t o c o n v a r i a s s u s t a n c i a s q u i m i c a s , a s i como l a
d e s n a t u r a l i z a c i à n p r o t e i c a y l a r e a c t i v a c i d n . S e ha n
r e a l i z a d o e s t u d i o s p a r a s u s t i t u i r r c s t o s e n l a e n t e r o t o x i n a A
en e l a r e a d e l a s e c u e n c i a c o m d n , a f i n d e d e m o s t r a r qu e é s t a
e s l a r e s p o n s a b l e d e l a a c c i dn t d x i c a . En un p r i n c i p i o s e
c o n c e n t r a r o n l o s e s f u e r z o s e n l a s u s t i t u c i d n d e l o s r e s t e s de
m e t i o n i n a , p e r o r e s u l t a r o n i n f r u c t u o s o s , p r o b a b l e m e n t e p o r
s e r i n a c c e s i b l e s . P o s t e r i o r m e n t e s e i n t e n t d c o n l a h i s t i d i n a .
o b s e r v ^ n d o s e q u e l a s u s t i t u c i d n d e c i n c o o s e i s d e l o s s i c t €
r e s t e s i n a c t i v e l a e n t e r o t o x i n a , a u n q u e s e p u e d a n r c e m p l a z a -
- 1 6 -
a l m enos t r è s d e e l 1 o s s i n p e r j u i c i o p a r a l a t o x i c i d a d ;
d e s a f o r t u n a d a m e n t e , no h a s i do p o s i b l e d e t e r m i n a r c u a l d e l o s
r e s t o s e s t a b a i m p l i c a d o en l a a c t i v i d a d t d x i c a .
L a a c e t i 1 a c i dn d e l a s e n t e r o t o x i n a s B y C c o n a c e t i l - i m i d a z o l
y e l t r a t a m i e n t o n i t r i f i c a n t e c o n t e t r a n i t r o m e t a n o r e v e l d l a
p r e s e n c i a d e c i n c o o s e i s r e s t o s t i r o s i l i c o s " l i b r e s " (CHU,
1 9 6 8 ; BORJA, 1 9 6 9 ; BORJA y BERGDOLL, 1 9 6 9 ) . E s t a s
m o d i f i e a c i o n e s a p e n a s r e p e r c u t e n s o b r e l a s p r o p i e d a d e s
i n m u n o l d g i c a s o t û x i c a s d e l a m o l é c u l a d e e n t e r o t o x i n a . Al
u t i l i z a r u r e a 8M , e l r e s u l t a d o f u e l a a c e t i1a c i dn d e d i ez
r e s i d u e s d e t i r o s i n a , i n h i b i é n d o s e l a r e a c c i dn
a n t i g e n o - a n t i c u e r p o a p r o x i m a d a m e n t e en un 20 %. A l s e r
s o m e t i d a s a c l o r h i d r a t o d e g u a n i d i n a 5M 1 a s e n t e r o t o x i n a s
e x p e r i m e n t a b a n un d e s d o b l a m i e n t o m a r c a d o , s i e n d o e x p r e s a d o en
un c a m b i o en l a v i s c o s i d a d i n t r i n s e c a y e n l a a c e t i1a c i dn de
l e s r e s t o s d e t i r o s i n a , qu e c u a n d o ë ' s t a e s c o m p l é t a s e p i e r d e
l a t o x i c i d a d c a s i en s u t o t a l i d a d . L o s g r u p o s t i r o s i l i c o s
" a n o r m a l e s " p u e d e n j u g a r un p a p e l i m p o r t a n t e en l a s
c a r a c t e r f s t i c a s e s t r u c t u r a l e s d e l a t o x i n a , t a i e s como l a
i n t e r a c c i d n c o n o t r a s c a d e n a s l a t é r a l e s co n e l o b j e t o de
f o r m a r un n u c l e o i n t e r n e p a r a m a n t e n e r l a e s t r u c t u r a r i g i d a ,
y a q u e s e o b s e r v a r o n c a m b i o s c o n f o r m a c i o n a l e s a pH 1 1 . 5 , pH
a l q u e l a d i s o c i a c i dn d e l a t i r o s i n a e s d e p e n d i e n t e d e l
t i e m p o . P o r 1 o t a n t o , e l h e c h o de qu e l a c o n f o r m a c i dn
o r i g i n a l s e a l t é r é c o n d e t r i m e n t o de l a a c t i v i d a d b i o l d g i c a
v i e n e a d e m o s t r a r q u e , a l i g u a l qu e o t r a s p r o t e i n a s , l a
e s t r u c t u r a t e r c i a r i a d e b e s e r f u n d a m e n t a l p a r a que es té "
- 1 7 -
a c t i v a . *
L a m o d i f i c a c i d n d e l o s r e s t o s d e m e t i o n i n a d e l a EEB c o n
a c i do i o d o a c ë t i c o y H3JO&. (CHU y BERGDOLL, 1 9 6 9 ) r e v e l d q u e
c u a t r o d e l o s o c h o r e s t o s r e a c c i o n a b a n a u n a v e l o c i d a d
s u p e r i o r qu e l o s r e s t a n t e s . L o s a n à l i s i s i n m u n o q u ^ m i c o s y
f l u o r o m é t r i c o s d e l a t o x i n a m o d i f i c a d a i n d i c a b a n un c a m b i o en
l a c o n f o r m a c i d n c u a n d o s e v a r i a b a n més d e s e i s r e s f d u o s d e
m e t i o n i n a . L a a c t i v i d a d e m é t i c a d e l a t o x i n a s e p e r d i a
i g u a l m e n t e c u a n d o r e a c c i o n a b a n s e i s d e e s t o s r e s t o s .
CHU y CRARY ( 1 9 6 9 ) m e d i a n t e g l i c i n a m e t i l é s t e r en p r e s e n c i a
d e c a r b o d i i m i d a y d e c l o r h i d r a t o d e g u a n i d i n a 6M c o n s i g u i e r o n
l a m o d i f i c a c i d n d e l o s 3 3 g r u p o s c a r b o x1 1i c o s d e EE B.
O b s e r v a r o n qu e l a p é r d i d a d e a c t i v i d a d e m é t i c a s6l o e r a
e f e c t i v a c u a n d o s e m o d i f i c a b a n 3 0 d* més g r u p o s , q u e i m p l i c a b a
a s T mismo l a e x p a n s i o n d e l a m o l é c u l a . C u a n d o l a m o d i f i c a c i d n
s e e f e c t u a b a e n 21 d 2 4 r e s t o s s o l o s e o b s e r v a b a u n a 1 i g é r a
d i smi n u c i dn d e l a r e a c c i dn a n t l ' g e n o - a n t i c u e r p o y d e 1 a s
p r o p i e d a d e s f l u o r e s c e n t e s .
L a g u a n i d a c i é n d e l o s g r u p o s d ^ a m i n o y d e l 30% d e l o s r e s t o s
N - t e r m i n a l e s l i b r e s no s u p u s o n i n g u n c a m b i o i m p o r t a n t e e n l a
c o n f o r m a c i d n o en l a a c t i v i d a d b i o l d g i c a , a u n q u e l a
s o l u b i 1 i d a d d e l a e n t e r o t o x i n a EEB d i s m i n u y d r a d i c a l m e n t e .
SPERO e t a l . ( 1 9 7 1 ) c o n c l u y e r o n qu e l o s r e s t o s d e l i s i n a n o
e s t a b a n i m p l i c a d o s n i en l o s c e n t r o s a n t i g é n i c o s n i e n 1 o s
t d x i c o s . E s t o s mi sm os a u t o r e s , a l i g u a l q u e CHU e t a l . ( 1 9 6 9 )