Modelo matemático para diseño de procesos de separación de proteínas a partir de extracto crudo

separación de proteínas a partir de extracto crudo

Title Modelo matemático para diseño de procesos de separación de proteínas a partir de extracto crudo

Issue Date 2007-12-01

Publisher Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey Item Type Tesis de maestría

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CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

TECNOLÓGICO DE MONTERREY®

MODELO MATEMÁTICO PARA DISEÑO DE PROCESOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE EXTRACTO CRUDO

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS

ESPECIALIDAD EN SISTEMAS AMBIENTALES

POR:

LUCILA LILIANA VÁZQUEZ CANTÚ

MONTERREY, N.L. DICIEMBRE DE 2007

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesis presentado por la Ing. Lucila Liliana Vázquez Cantú sea aceptado como requisito parcial para obtener el grado académico de:

Maestra en Ciencias en Sistemas Ambientales Especialidad en Sistemas de Procesos

Comité de Tesis:

Dr. Joaquín Acevedo Mascarúa Asesor

Dr. Marco A . RITO Palomares Sinodal

Dr. Alejandro J. García Cuéllar Sinodal

Aprobado:

Dr. Francisco Ángel Bello

Director del Programa de Graduados en Ingeniería

Diciembre, 2007

una de las bendiciones que he recibido.

A mis padres,

por su incondicional cariño, por ser un pilar y un gran ejemplo en mi vida.

Los quiero mucho.

Al Dr. Joaquín Acevedo por sus ideas y permanente apoyo. Por haber confiado en mí y por las oportunidades que me brindó.

A mis sinodales: Dr. Marco Rito Palomares y Dr. Alejandro García Cuéllar, por su disposición y sus consejos.

A Armando Treviño por su apoyo e incondicional ayuda. Gracias por su comprensión, por haberme escuchado y dado ánimos.

A mis compañeros y amigos: Ana Yael Vanoye, Ángeles Bolaños, Brenda Alemán y Hugo Aldana. Gracias por su ayuda y sus consejos.

A todas las personas quienes de alguna manera me ayudaron para la realización de este proyecto y me acompañaron en el transcurso de la maestría.

Muchas gracias, Dios los bendiga a todos.

En estudios experimentales, se ha demostrado que a través de ciertas bacterias es posible obtener proteínas con propiedades aprovechables para fines terapéuticos, analíticos e industriales. Su obtención representa un impacto positivo tanto económico como ambiental, al desplazar a productos químicos sintéticos perjudiciales para la salud humana y el medio ambiente.

En muchos casos, los procesos de recuperación de proteínas resultan complicados por los múltiples pasos de cromatografía necesarios para la purificación. Para reducir estos pasos, se ha sugerido el uso alternativas de recuperación como los sistemas de dos fases acuosas (ATPS, por sus siglas en inglés). Los ATPS son una técnica de recuperación primaria que presenta ventajas, como su facilidad de escalamiento, capacidad de manejo de grandes volúmenes y bajo costos de instalación y equipos, sobre otros métodos como por ejemplo, la cromatografía de un paso utilizando precipitación con sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico.

En este proyecto se presenta un modelo matemático para diseño de procesos de separación de proteínas a partir de extracto crudo, utilizando sistemas de dos fases acuosas basados en polietilenglicol y sales inorgánicas como agentes separadores. Para integrar el modelo, se propuso una metología que permite el empleo de deducciones y modelos de estudios existentes en materia de modelación de sistemas de separación.

Se aplicó la metodología para desarrollar el modelo matemático para el diseño de la separación ATPS de la proteína colorante b-ficoeritrina producida por Porphyridium cruentum, que puede ser utilizada en comestibles, cosméticos, genética molecular y detergentes.

El modelo matemático desarrollado tiene la ventaja de ser un modelo flexible, que puede ser adaptado para diferentes condiciones del sistema, por lo que se recomienda como herramienta de predicción, que permite reducir la experimentación necesaria para determinar condiciones de procesos ATPS para la separación de proteínas.

Se realizó un análisis de influencia de variables importantes como la relación geométrica H/D, la

línea de corte (TLL) de operación y la relación de volumen de las fases Vr, encontrándose que

todas estas variables presentan influencia sobre los tiempos de separación final. Ante un aumento

en alguna de las variables, se presenta un incremento en el tiempo de separación. Por otra parte,

se encontró que el pH del sistema tiene un efecto importante en la partición de la proteína, en

donde ante una disminución del mismo, disminuye la concentración de BPE en la fase superior .

CAPÍTULO 1: Introducción

1.1 Introducción ... 1

1.2 Objetivos 1.2.1 Objetivo general ... 3

1.2.2 Objetivos Particulares ... 3

1.3 Descripción de la tesis ... 3

CAPÍTULO 2: Antecedentes 2.1 Sistema de dos fases acuosas ... 5

2.2 Estudios previos de modelación ... 6

2.3 Modelos matemáticos 2.3.1 Modelo de balance de materia ... 9

2.3.2 Modelo de equilibrio termodinámico ... 10

2.3.3 Modelos termodinámicos para la estimación de propiedades ... 18

2.3.4 Modelo de separación de fases ... 20

2.3.5 Modelo para el dimensionamiento de equipos de separación ATPS ... 24

CAPÍTULO 3: Metodología y desarrollo del modelo matemático 3.1 Metodología ... 26

3.2 Desarrollo del modelo ... 29

3.2.1 Balance de materia ... 30

3.2.2 Equilibrio termodinámico ... 31

3.2.3 Propiedades fisicoquímicas relevantes ... 31

3.2.4 Separación de fases ... 32

3.2.5 Dimensionamiento ... 32

3.3 Desarrollo experimental ... 32

4.1 Análisis de resultados experimentales ... 38

4.2 Modelo de separación de fases para ATPS con proteína ... 39

4.3 Análisis de resultados del modelo matemático general ... 42

CAPÍTULO 5: Conclusiones y Recomendaciones ... 50

BIBLIOGRAFÍA ... 53

APÉNDICES Apéndice A: Parámetros utilizados por el modelo base ... 58

Apéndice B: Altura de dispersión en función del tiempo para un sistema PEG-sal- agua sin extracto crudo ... 59

Apéndice C: Mediciones de propiedades fisicoquímicas ... 60

VITA ... 61

Figura 2.1 Secuencia de separación ATPS propuesta ... 9 Figura 2.2 Perfil de separación de fases por Golob and Modic (1977) ... 21 Figura 2.3 Perfil de separación en un ATPS ... 22 Figura 3.1 Diagrama de bloques de las áreas de las que se compone el modelo

matemático ... 29 Figura 3.2 Diagrama de fases para sistemas PEG 1000-K

₂

HPO

₄

@ 25° C,

pH =8.0 ... 34 Figura 3.3 (a) Sistema de separación en fases acuosas por gravedad. (b) Sistema

de separación de BPE en fases acuosas centrifugado ... 37 Figura 4.1 Etapas de separación de fases en ATPS en sistemas con extracto

crudo ... 38 Figura 4.2 Regresión lineal para obtener la velocidad de separación dh/dt ... 40 Figura 4.3 Tiempo de separación final en función de la relación geométrica H/D ... 47 Figura 4.4 Tiempo de separación final en función de la línea de corte (TLL)... 48 Figura 4.5 Tiempo de separación final en función de la relación de volumen de

las fases Vr ... 48 Figura B.1 Altura de dispersión en función del tiempo para sistemas PEG 1000-

K

₂

HPO

₄

/ KH

₂

PO

₄

@ 25° C, pH =8.0, variando la relación geométrica H/D ... 59

Tabla 3.1 Composiciones de los puntos experimentales PEG 1000 - K

₂

HPO

₄

,

@ pH = 8.0 y 25 °C ... 34 Tabla 4.1 Parámetros requeridos por el modelo matemático general ... 43 Tabla 4.2 Resumen de resultados de la modelación de diferentes escenarios de

operación en sistemas ATPS ... 45 Tabla C.1 Resultados de las mediciones realizadas a cada uno de los puntos

experimentales ... 60 Tabla C.2 Comparación entre las propiedades fisicoquímicas de sistemas de

separación de fases acuosas por gravedad y por centrifugación ... 60

A Constante de Debye-Hückel (3.7)

B Parámetro que refleja el tamaño infinito de los iones (3.7) B Coeficiente de la interacción soluto-solvente (3.44) d Densidad de la fase superior e inferior

D Constante dieléctrica del agua

f Fugacidad

g

E

Energía libre de Gibbs G Parámetro de interacción

h

f

Altura final a la que se completó la separación de fases H Altura total de la mezcla (3.56)

H Número de moléculas de solvente solvatando al soluto (3.45) H/D Relación geométrica altura/diámetro

I Fuerza iónica de la mezcla en escala de molalidad (3.11) I Constante que depende del tipo de impulsor (3.61) K

_p

Coeficiente de partición de la proteína

K

_o

Valor del coeficiente de partición en el punto isoeléctrico m

^agua

Corriente másica de entrada de agua

m

^alim

Corrientes de alimentación de i

m

^extracto

Corriente másica de entrada de extracto crudo

m

^m

Corriente másica de la mezcla m

^PEG

Corriente másica de entrada de PEG

m

^sal

Corriente másica de entrada de sal m Molalidad (3.10)

M Peso molecular N Velocidad del impulsor

q Número efectivo del segmento r Número de segmentos

T Temperatura absoluta

TLL Línea de corte

d

v

rel

Viscosidad relativa (3.43)

V

ATPS

Volumen mínimo requerido por el separador Vr Relación de volúmenes de fases

w Fracción másica x Fracción mol

X Fracción hipotética efectiva de segmento del polímero z Carga neta

 Velocidad de separación de fases

 Facto no aleatorio (3.14)



 Diferencia del potenciál eléctrico de las fases



 Diferencia de densidades entre las fases W

A

 Diferencia entre las concentraciones de PEG entre las dos fases W

B

 Diferencia entre las concentraciones de sal entre las dos fases

 Coeficiente de actividad



*

Coeficiente de actividad normalizado

 Fracción volumétrica

 Viscosidad absoluta



C

Viscosidad de la fase contínua



D

Viscosidad de la fase dispersa

 _Densidad

 Tensión interfacial

 Parámetro de interacción

 Fracción de segmento efectiva Superíndices

m Mezcla

’ Fase superior

” Fase inferior

a Anión alim Entrada

ca Catión

C Fase contínua (3.50) CA Corto alcance comb Combinatorial

D Fase dispersa (3.50) f Fase superior, fase inferior

i Componentes: PEG, agua, sal i Electrolito (3.12)

j Iones: catión, anión

k Componentes: PEG, agua, sal, extracto k Ión de referencia (3.35)

LA Largo alcance m Mezcla (3.42)

M Especie neutral (3.21) ref Referencia

s Componentes: PEG, agua, sal, proteína

w Agua

Cada vez es mayor el interés del ser humano por investigar y aprovechar las oportunidades que brinda la naturaleza a través de procesos que ocurren en su entorno, obteniendo beneficios con alto impacto positivo tanto económico como ambiental, al desplazar a productos químicos sintéticos perjudiciales para la salud humana y el medio ambiente.

El uso de algunos colorantes químicos aplicados en alimentos (Francis, 1999), se ha prohibido en diversos países debido a los problemas a la salud que pueden ocasionar, tales como problemas de hiperactividad en niños, alteraciones en los cromosomas y defectos embrionarios, e incluso cáncer, con base en estudios experimentales en animales. Por otra parte, la industria de fabricación de colorantes, es considerada fuente potencial de impacto ambiental, debido a que en las etapas del proceso que comprende (preparación de materia prima, secado, molido, filtración y lavado), se emiten a la atmósfera sustancias contaminantes como vapores de compuestos organico volátiles (VOCs) y gases de combustión, así como también se descargan residuos de pigmentos orgánicos e inorgánicos y polvos minerales o de otros materiales, que dañan el ambiente acuático debido a sus características de bioacumulación y biodegradabilidad (Brown, 1987).

Se han realizado estudios experimentales, en los que se demostró que a través de ciertas bacterias es posible obtener proteínas con propiedades aprovechables para fines terapéuticos, analíticos e industriales.

Un ejemplo de lo anterior, es la proteína colorante b-ficoeritrina producida por la bacteria Porphyridium cruentum, que puede ser utilizada en comestibles, cosméticos, genética molecular y detergentes (Hernández-Mireles and Rito-Palomares, 2006), que representa un producto de alto valor comercial e industrial y de sustitución de colorantes químicos (Bermejo et al., 2002).

1 Introducción

Los protocolos para la recuperación de las proteínas en mucho de los casos son complicados, debido a la necesidad de múltiples pasos de cromatografía para obtener proteínas altamente purificadas, por lo que su potencial escalamiento resulta no viable económicamente (Benavides and Rito-Palomares, 2006).

Para la reducción de los pasos de cromatografía, se ha sugerido el uso de técnicas alternativas de recuperación tales como los sistemas de dos fases acuosas (ATPS, por sus siglas en inglés) (Benavides and Rito-Palomares, 2005) . Los ATPS son una atractiva técnica de recuperación primaria que presenta ventajas sobre otros métodos, como por ejemplo la cromatografía de un paso utilizando precipitación con sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico (Liu et al., 2005), por su facilidad de escalamiento, capacidad de manejo de grandes volúmenes y bajo costos de instalación y equipos (Huenupi et.al. 1999).

Una forma de evaluar la interacción de los parámetros relacionados a los fenómenos de absorción y separación en ATPS es a través de modelos matemáticos, que permiten la simulación del proceso y facilitan su escalamiento a través de la manipulación adecuada de los parámetros.

Para el diseño de un proceso de extracción de proteínas se requiere de información acerca de las propiedades de los componentes del sistema ATPS, así como de modelos termodinámicos y de transferencia de masa.

En el presente trabajo, se formula un modelo matemático para diseño de procesos de

separación de proteínas a partir de extracto crudo, en el que se toman en cuenta los

modelos termodinámicos y de transporte involucrados en el sistema de extracción. Con

esto, se pretende obtener una herramienta de estimación y predicción que ayude a

seleccionar las mejores condiciones de las variables de interacción en el proceso de

separación de proteínas.

1. 2 Objetivos

1.2.1 Objetivo General

Desarrollar un modelo matemático para diseño de procesos de separación de proteínas a partir de extracto crudo, utilizando sistemas de dos fases acuosas basados en polietilenglicol (PEG) y sales inorgánicas como agentes separadores.

1.2.2 Objetivos Particulares

1. Acoplar estudios existentes en materia de modelación de sistemas de separación, empleando deducciones, ecuaciones y modelos termodinámicos, de estimación de propiedades y de dimensionamiento de equipos para formar un sistema integral para diseño de procesos de separación de proteínas.

2. Aplicar el modelo matemático para el diseño del proceso de separación ATPS de la proteína colorante b-ficoeritrina producida por Porphyridium cruentum.

1.3 Descripción de la tesis

Este proyecto consta de 5 capítulos.

En el Capítulo 1 se plantea la importancia de la obtención de las proteínas, que lleva a la necesidad de desarrollar modelos matemáticos para diseñar procesos escalables de separación, así también, se delimitan los objetivos a realizar en el presente proyecto.

En el Capítulo 2 se define el concepto de sistemas de dos fases acuosas como técnica de

recuperación primaria para la obtención de proteínas. Posteriormente, se presentan los

estudios previos en modelación de procesos para la obtención de proteínas con sus

respectivas suposiciones y hallazgos. Finalmente, se presentan los modelos de los que se

compone un modelo matemático de procesos, adaptados para sistemas de dos fases

acuosas.

En el Capítulo 3 se presenta la metodología que se siguió y el algoritmo de solución para el desarrollo del modelo matemático. Adicionalmente, se presenta el trabajo experimental que se realizó como parte del desarrollo del modelo.

En el Capítulo 4 se muestran dos tipos de resultados: los que se derivan del trabajo experimental y aquellos que resultan de la validación del modelo matemático. La validación del modelo matemático se realizó a través del planteamiento de diferentes escenarios seguido de un análisis de deducciones.

Finalmente, en el Capítulo 5 se presentan las conclusiones derivadas del desarrollo del modelo matemático y el trabajo experimental realizado. Así también, se describen las recomendaciones y/o líneas de investigación para el desarrollo de trabajos futuros de modelación matemática de procesos de separación ATPS de proteínas.

.

2.1 Sistemas de dos fases acuosas (ATPS)

Los procesos de recuperación de proteínas comprenden una etapa de ruptura celular mecánica o química para la liberación del producto, seguida de una etapa de filtración o centrifugación a alta velocidad para remover los fragmentos celulares. No obstante, la implementación de la filtración o centrifugación en procesos a gran escala puede ser complicada, por lo que a fin de minimizar dichas dificultades se utiliizan procesos de extracción con sistemas de dos fases acuosas (Cisneros-Ruiz and Rito-Palomares, 2005).

Los ATPS se conforman de dos fases líquidas viscosas e inmiscibles resultantes de utilizar ya sea dos polímeros, o un polímero y una sal inorgánica, disueltos en agua (Cabezas et al., 1996). De manera que cuando al sistema se le introduce una solución con la(s) proteína(s) de interés, éstas prefieren una u otra de las fases existentes y de esta manera se lleva a cabo el proceso de separación (Madeira et al., 2005).

Los ATPS más utilizados para la bioseparación de las proteínas son los formados de soluciones acuosas de polietilenglicol (PEG) y una sal inorgánica, debido a su bajo costo, no toxicidad, no inflamabilidad y fácil manejo (Graber et al., 2004), además de que presentan un amplio rango de diferencias de hidrofobicidad entre los sistemas de dos fases, lo que favorece a la partición selectiva de las proteínas, especialmente de características hidrofóbicas (Li and Bai, 2001).

Johansson (1985) definió que los ATPS podían tener más de una etapa. Normalmente, la primera etapa se utiliza para remover los restos celulares y la mayoría de los contaminantes y las siguientes etapas se utilizan para fraccionar la proteína de interés a fin de obtener su máxima purificación (Minami and Vahan, 1998).

2

En lo que respecta a la cinética de la fase de separación, se ha observado (Blab et al., 1992) que cuando ocurre la mezcla entre las fases en un sistema de dos fases acuosas PEG-sal, se forman pequeñas gotas de diferentes formas y tamaños, las cuales después de coalescer forman gotas de mayor tamaño fuera de la interfase, y que gradualmente se mueven hacia la interfase para coalescer con ella. La dispersión no homogénea de las gotas ocurre en un ATPS durante la fase de separación después del mezclado. Se dice entonces que la fase de separación puede ocurrir por dos mecanismos: sedimentación y coalición de las gotas. El conocimiento y entendimiento del mecanismo de separación de fases (sedimentación y coalescencia de las gotas) es importante ya que puede llegar a ser una limitante del uso de ATPS a gran escala (Huenupi et al., 1999).

Mistry et al. (1996) proponen que la separación después de completado el equilibrio entre las fases depende del tiempo del proceso, de manera que se hace necesario considerar la sedimentación en todo lo alto de la columna de extracción en incrementos de altura respecto al tiempo, como función de la diferencia de densidad, la tensión superficial entre las fases, la viscosidad de cada una de las mismas y el diámetro de las gotas.

Analizando los trabajos de diferentes autores (Albertsson, 1986, Mistry et al., 1994, 1996;

Solano-Castillo and Rito-Palomares, 2000) se puede constar que los principales factores de influencia en los procesos de separación de proteínas en ATPS que son convenientes a analizar y considerar son:

 El peso molecular del PEG

 El pH de operación

 La carga, hidrofobicidad y tamaño de la proteína a separarse.

 El flujo y la composición de la corriente de entrada al sistema que contiene la proteína a separar.

2.2 Estudios previos de modelación de procesos para la obtención de proteínas

Los modelos matemáticos son una gran herramienta de ayuda para situaciones en las

que se desea diseñar un proceso, ya que dan paso a la implementación a gran escala del

proceso, facilitando la caracterización y dominio de los fenómenos involucrados.

Se han llevado a cabo estudios de modelación de los procesos biológicos en cuanto a la separación de fases y equilibrio (Mistry et al., 1993). Sin embargo, aún existe la carencia de un modelo que considere tanto los modelos termodinámicos como los modelos de transporte involucrados para la bioseparación de las proteínas. Mistry et al. (1996) mencionan que el modelo que se tenía (Mistry et al., 1993), presentaba algunas deficiencias como la falta de representatividad de la curva de equilibrio (curva binodal) y los coeficientes de partición constantes.

Huenupi et al. (1999) buscaron optimizar un proceso de separación ATPS, a través de un modelo que describe la operación continua y en estado estacionario de un sistema de dos fases acuosas para la extracción de la proteína  - amilasa mediante un sistema PEG/fosfato. Para el modelo se plantearon las ecuaciones de balance de materia, relacionando los flujos de entrada y salida con las composiciones de fosfato, PEG, NaCl y las concentraciones de la proteína de interés en cada una de las fases. Se consideró el equilibrio entre las fases, para lo cual se obtuvieron curvas binodales para diferentes concentraciones de NaCl añadidas al sistema, con sus líneas de corte (TLL, por sus siglas en inglés) respectivas. Se consideraron los coeficientes de partición tanto para la proteína como para los contaminantes.

Tiempo después, se realizaron modelaciones de sistemas de dos fases acuosas (Simon and Gautam, 2004), en las que se utilizó la ecuación de continuidad suponiendo una aproximación cuasi estado estacionario. Se despreció el efecto de las composiciones y la temperatura sobre las densidades, y se consideró aproximadamente iguales a las densidades de la mezcla de entrada, en la fase salina y la fase rica en PEG. Sin embargo, Simon and Gautam (2004) señalaron que a pesar de tal consideración, para la separación se requiere que exista una diferencia entre las densidades entre la fase salina y la fase PEG en un rango entre 40-100 kg/m

³

.

Supusieron constante el coeficiente de partición de proteínas, diferente a lo que ocurre en

la práctica, en donde dicho coeficiente es una función de las composiciones del sistema,

la temperatura y el pH. Sin embargo, esta consideración se pudo realizar bajo el supuesto

de que las perturbaciones en las concentraciones del sistema eran relativamente

pequeñas y por tanto el sistema siempre opera cerca de la misma región en la línea de

corte en un diagrama de equilibrio. Los comportamientos de la fase al equilibrio se

definieron a través de la curva binodal que generalmente se presenta en forma exponencial.

Mistry et al. (1996) realizaron una modelación matemática de un proceso de extracción continuo utilizando ATPS. Observaron cómo el coeficiente de partición puede ser alterado a través de parámetros como el peso molecular del polímero de separación a utilizar, el tipo de iones involucrados en el sistema, la fuerza iónica, entre otros.

Su modelo, al igual que el de Huenupi et al. (1999), utilizó datos experimentales de la fase de equilibrio para realizar un ajuste a las ecuaciones de modelación. Se hizo mención de dos puntos importantes: el efecto que tiene la concentración de NaCl sobre el coeficiente de partición en el sistema al equilibrio y cómo el coeficiente de partición de la proteína en un sistema ATPS puede ser constante sobre un rango de concentración de proteína tan grande como dicha concentración esté bajo su rango de saturación, mientras que el coeficiente de partición del contaminante puede ser constante cuando se opera en un rango lineal para las proteínas individuales.

Además de los estudios de modelación y simulación antes mencionados, autores como Li

et al. (2001) han presentado trabajos de optimización de las condiciones de extracción de

ATPS utilizando como herramienta el diseño de experimentos estadísticos. No obstante,

se considera que un diseño de experimentos simple puede resultar insuficiente para lograr

la optimización del proceso, sin embargo, podría resultar una opción viable en el caso que

se pudieran incluir más variables, así como modelos termodinámicos y de equilibrio que

permitan describir mejor la separación.

2.3 Modelos matemáticos

2. 3.1 Modelo de balance de materia

En la separación de proteínas en ATPS se deben considerar 4 entradas principales:

 1ra. entrada: solución (extracto) que contiene la proteína de interés acompañada de otras proteínas.

 2da. Entrada: solución PEG

 3ra. Entrada: solución con sales inorgánicas

 4ta. Entrada: Agua

Para que el sistema de separación se pueda llevar a cabo se consideran dos pasos dentro del proceso. En el primer paso se mezclan las entradas y en el segundo se lleva a cabo la separación de fases. En la Figura 2.1 se esquematiza la secuencia de separación propuesta.

Figura 2.1. Secuencia de separación ATPS propuesta

m’

w

_s^'

m ^m

m

w

s

Mezclado m ^extracto

extracto proteina

w

extracto

w agua

m ^PEG

PEG

w

PEG PEG

w

agua

m”

w

^"_s

Separación

donde subíndice s = PEG, proteína, sal y agua superíndice ’ y ” = fase superior y fase inferior m = Corriente másica total superíndice m = mezlca

m ^agua m ^sal

sal

w

sal sal

w

agua

E CA E LA

E

g g

g  

2.3.2 Modelo de equilibrio termodinámico

Los criterios para el equilibrio líquido líquido están basados en la uniformidad de temperatura, presión y fugacidad para cada especie química en ambas fases. Para un sistema de N especies a temperatura y presión uniformes se utiliza el criterio:

(3.1) donde ’ y ” representan a cada una de las fases líquidas.

Considerando los coeficientes de actividad y que cada especie pura puede existir como líquido a la temperatura del sistema, f

_i^'

 f

_i^"

 f

_i^

, la relación que establece el equilibrio líquido líquido para cada especie queda:

(3.2) donde i = 1, 2,...,N especies.

El caso modificado de la ecuación de Wilson incorpora los modelos semiempíricos formulados para sistemas de electrolíticos concentrados. Estos modelos corrigen la teoría de Debye-Hückel a través de términos adicionales que toman en cuenta las interacciones ion-ion y la disociación incompleta a altas concentraciones.

En estos modelos semiempíricos, se suele suponer que la energía Gibbs molar de exceso de las disoluciones de electrolito es la suma de dos contribuciones, una procedente de las fuerzas culombianas de largo alcance (LA) y la otra de las fuerzas de corto alcance (CA).

(3.3) Las fuerzas de largo alcance entre iones dominan a concentraciones diluidas de electrolito, mientras que las de corto alcance dominan entre todas las especies a concentraciones altas.

La ecuación de Wilson modificada también incluye un término de contribución el cual es llamado combinatorial. Este término toma en cuenta los cambios de energía Gibbs de exceso debido al tamaño y la forma de las moléculas, resultando la siguiente ecuación:

^

"

^ '

i

i

f

f 

"

"

' '

i i i

i

x

x   

E comb E

CA E LA

E

g g g

g   

Comb i CA i LA i

i

ln

,

ln

,

ln

,

ln       

 ¹ 

ln ln

ln 

_i^*

 

_i

 

_i^ref

j 

  _{ }

















 



 

 











²

1

2 1 2

1

3

2 ln 1

1 1 1

10

ln 2 BI

BI B BI

AM

_agua

agua LA



 

^0.5

5 .

359696

0

. 6

DT B  d

(3.4)

De la ecuación (3.4) se puede escribir la expresión para el coeficiente de actividad:

(3.5)

Los coeficientes de actividad son normalizados al estado de referencia a dilución infinita, (3.6)

resultando los coeficientes de actividad normalizados al estado de referencia a dilución infinita, en donde se toma como referencia x

_agua

=1 y para toda x

_j≠agua

=0.

El cálculo de la contribución de largo alcance, g

^ELA

; considera a los electrolitos y al agua debido a que en los sistemas ATPS estos compuestos tienen la capacidad de interaccionar de esta forma.

La contribución de las fuerzas de largo alcance para el coeficiente de actividad del agua es calculado de acuerdo a (Haghtalab and Mokhtarani 2001):

(3.7)

en donde A es la constante de Debye-Hückel, M

_agua

es el peso molecular del agua, B es un parámetro que refleja el tamaño finito de los iones e I es la fuerza iónica de la mezcla en escala de molalidad.

El valor de la constante B se calcula según lo mostrado por Wu et al. (1998):

(3.8)

donde d representa la densidad de la fase superior o inferior, D es la constante dieléctrica

del agua con un valor de 78.41 y T la temperatura absoluta.

    



 



 







 T T 273 T . 15

95788 . 58 15 . 273 0007875695

. 0 15 . 273 6820223

.

0

^{2 2}







i i i

z m molkg

I

^{1 2}

2 ) 1 (

 

2 1 2 1 2

1 ln

BI I Az

_j

j LA





 

 

 ^M

agua

^v

c

^v

a

^m 

x ca m

ca

 ln  ln 1  0 . 001 

ln 

_,



_,



ca



i

 v

c c

v

a a



v  

 1 ln ln

ln  

El valor de A puede ser obtenido en función de la temperatura absoluta (Chen et al., 1982).

(3.9)

Y la fuerza iónica de la mezcla se puede calcular de acuerdo a la siguiente ecuación:

(3.10)

en donde m representa la molalidad de la especie i en la fase y z

_i

la carga de la especie i.

Para el cálculo del coeficiente de actividad de un ion j (Haghtalab and Mokhtarani 2001) se utiliza la ecuación (3.11).

(3.11)

Debido a que los electrolitos en las mezclas de sistemas ATPS son considerados fuertes (disociación completa), se utiliza la expresión para el coeficiente de actividad iónico medio γ

_ca

, para el electrolito i.

(3.12)

donde γ

_c

y γ

_a

son los coeficientes de actividad del catión y el anión respectivamente y v es igual a la suma de v

_c

y v

_a

, v = v

_c

+ v

_a

.

Es necesario convertir las contribuciones de largo alcance de escala molal a molar, por lo que se utiliza la ecuación (3.13).

(3.13)

donde las γ

_ca

representan los coeficientes de actividad medios iónicos en escala molal (m)

 

 



 

 

 



 



 



  

 

 



  

 183 . 5379 ln 273 . 15

15 . 273

15 . exp 273

864468 .

15 2 . 273

15 . exp 273

4453 . 61

2

T

T

A T

 

 

 





 



   





 



 

 

 







 



 





^m

j

m

j

j j

i i j

i i i

j i j i

i

i

q r

r X q

q q X q x

X

1 1

1 ln

1 ln

ln  

i i

i

C

X  

r i i

i

n

r

 n

 





^m

k k k

r

n r

n

1

q i i

i

n

q

 n

 





^m

k k k

q

n q

n

1

 

 



 



 



 





i i

i

r r

q 1

1 1 

'

1

' ,



   ^X

^c

 ^X

^a

^G

^maca

Para el cálculo del coeficiente de actividad para la contribución combinatorial se utiliza la ecuación (3.14).

(3.14)

donde

(3.15) (3.16)

(3.17) (3.18)

(3.19)

α representa el factor no aleatorio, n

_i

es el número de moles de las especies, Φ

_i

y x

_i

son la fracción volumétrica y la fracción mol respectivamente, r

_i

es el número de segmentos, θ

_i

es la fracción de segmento efectiva y q

_i

significa el número efectivo de segmento y X

_i

es la fracción hipotética efectiva de segmento del polímero, que a su vez se representa mediante la ecuación (3.20).

(3.20)

donde C

_i

=Z

_i

si i = ión, de otra manera se utiliza C

_i

= 1.

Finalmente, para el cálculo de la contribución de corto alcance, g

^E_CA

se considera la expresión de la contribución de corto alcance de la energía Gibbs de exceso extendida del caso de soluciones binarias de polímeros (Xu et al., 2003), y a partir de ella se obtuvieron los coeficientes de actividad presentados en la ecuaciones (3.21) a (3.23).

(3.21)

   _ ^   ^   



 



 



c a

j

c a jc j

c a mc c

a a a

m

j

jm j mm m

j

jm CA j

m

m

X G

G X X X G

X X G G

q X

_{' , '}

' ,

"

"

'

'

'

ln

'

ln 





ij ij



G

ij

 exp   



jiki jiki



ki

G

ji_,

 exp  

_,



_,

T

T a

_ij

ij



0

 T

T a

_ji

ji



0







 

^{a c}

 ^{X X}  ^{X X G G z}

j

a c ja j

a c ca a

c c

c

1

' ,'

' ,

"

"

'





 

^{c a}

 ^{X X}  ^{X X G G z}

j

c a jc j

c a ac c

a a

a

1

' , '

' ,

"

"

'

m ca cm

am

 

,

  

ca m ca ma ac

mc,



,



,

  

m ca cm

am

 

,

  

ca m ca ma ac

mc,



,



,

  

(3.22)

(3.23)

(3.24)

(3.25)

(3.26)

(3.27) donde los subíndices m, c (o c’,c”) y a (o a’,a”) representan a las especies neutrales, cationes y aniones respectivamente. X representa la fracción hipotética efectiva de segmento, α es el factor no aleatorio y G y  son parámetros de interacción representados por las siguientes relaciones.

(3.28) (3.29)

(3.30)

(3.31)

     ^  ^  



 

 



 m

j

jm j cm m

j

c a jc j a

a a a c CA

G X X G G

X X X

z

_' ^{, '}

"

"

'

ln

ln 



     ^  ^  

 



 



 m

j

jm j am m

j

a c ja j c

c c c a CA

G X X G G

X X X

z

' ^,'

"

"

'

ln

ln 



p o

p

K z

K  ln   ln

Para cada especie en cada fase, le corresponde un coeficiente de actividad. Con el modelo termodinámico anterior es posible definir las interacciones moleculares entre el sistema PEG-agua-sal. Ahora bien, es necesario incluir en el modelo termodinámico el coeficiente de partición de la proteína K

_p

.

Se debe de tomar en cuenta que la partición de biomoléculas en ATPS tiene un grado de complejidad mayor debido a su compleja estructura molecular, principalmente las de mayor interés comercial (proteínas, enzimas, ácidos nucleicos, etc.). Entre más compleja sea la estructura de una molécula, mayor es la cantidad de interacciones que puede tener (Zaslavky, 1995).

Los posibles efectos de influencia en la partición de biomoléculas son:

 La composición del polímero en las fases (Albertsson 1986; D.Fisher and Sutherland 1989).

 La adición de aditivos electrolíticos y no electrolíticos de bajo peso molecular.

 Cambios en el pH.

 La estructura y peso molecular de las biomoléculas.

La dependencia del coeficiente de partición de las proteínas respecto al pH generalmente es tratada en términos de una aparente diferencia de potencial electrostático entre las fases coexistentes en donde, debido a la influencia de esa diferencia, las proteínas cargadas se particionan. La dependencia del coeficiente de partición se desarrolló mediante una relación empírica (Johansson 1985) entre el coeficiente de partición, K

_p

, y la carga neta de la proteína, z

_p

, resultando la expresión presentada en la ecuación (3.32).

(3.32)

donde K

_o

corresponde al valor del coeficiente de partición en el punto isoeléctrico, K

_p

y z

_p

son el coeficiente de partición de la proteína y la carga neta de la proteína respectivamente y γ es definido como un factor que depende de la composición del polímero en el sistema, la sal usada como aditivo y la temperatura.

La carga neta de una proteína se considera como una carga global, esto debido a que las

 

  

 RT

F

K z

^p

p p

p '

"

ln ln

  _{ }

 

 

 





 

 

 





 

 





 

 





 







a c

z z

c c a a

a

c

z F

z RT

'

"

'

"

'

"

ln















 

 







^{' '}

"

ln ln

ln

ln

^p

z

^p

m

^{k k}

K  

cuales pueden estar cargados tanto positiva como negativamente, por lo que la carga neta sería la sumatoria de todos estos grupos individuales (Buentello, 2007).

Después que Johansson obtuviera dicha relación empírica, Albertsson (1986), Haynes et al. (1993) y Grossmann and Maurer (1995), derivaron una similar, las cuales son actualmente utilizadas para cálculos de predicción de proteínas.

Según lo desarrollado por Haynes et al. (1993), la partición de biomoléculas se puede calcular de acuerdo a la ecuación (3.33).

(3.33)

en donde los coeficientes de actividad, γ

_p

, que aparecen; pertenecen a la proteína.

Correspondiendo los superíndices “ y ‘, a la fase inferior y superior respectivamente.

Además proponen una relación basada en la teoría de potencial cuasi-electrostático para hacer el cálculo de la diferencia de potencial eléctrico. F,R y T corresponden a la constante de Faraday, la constante universal de los gases y la temperatura absoluta, y Δφ es la diferencia del potencial eléctrico de las fases. Para el cálculo de la diferencia de potencial eléctrico se utiliza la expresión (3.34).

(3.34)

en donde los subíndices c y a corresponden a el catión y el anión respectivamente.

Grossmann and Maurer (1995) hacen un desarrollo similar. Se dieron cuenta que la diferencia de potencial eléctrico puede ser calculada de la energía de Gibbs en exceso de la solución; asumiendo que no existe ningún campo eléctrico externo, que el sistema de dos fases es obtenido mediante la mezcla de componentes neutrales e introduciendo la condición de electroneutralidad para cada una de las fases coexistentes. Aplicando la teoría del potencial cuasi-electrostático, la relación que obtienen para el coeficiente de partición es la siguiente:

(3.35)

   

  



 





 



 



^N

i j

i j i

i j j i i i

x x FO x

1

2

"

*

"

' *

*

min 









 RT F K

_p

z

^p

ln

 

 



 

 ln

_"^'

ln

_"^'

ln

k k

k k

k p

p

m

m z

K z





en donde el subíndice k representa a el ion de referencia y m es la molalidad. De acuerdo a la sugerencia de Buentello (2007), se utilizó como ión de referencia al catión.

Tanto en la ecuación (3.33) como en la (3.35), el primer término se suele igualar a cero debido a que se considera que las biomoléculas en este tipo de sistemas se encuentran muy diluidas, y por lo tanto el segundo término es el que domina totalmente la partición de las biomoléculas en las fases. De esta manera, las ecuaciones se rearreglan como se presenta a continuación.

(3.36)

(3.37)

Una vez obtenido el coeficiente de partición de la biomolécula de interés, se debe utilizar la ecuación (3.35) para determinar la fracción másica de proteína en cada una de las fases.

(3.38)

Para obtener el ajuste de los parámetros necesarios para utilizar el modelo termodinámico de Wilson modificado anteriormente descrito, Buentello (2007) estableció una función de optimización. La función objetivo utilizada se basa en la condición de equilibrio termodinámico o de isoactividad, que se normaliza para obtener mejores resultados en la optimización. La función objetivo queda de la siguiente manera:

(3.39)

en donde γ

i*

representa al coeficiente de actividad normalizado al estado de referencia a dilución infinita, j representa a las especies del sistema y N a los datos experimentales al equilibrio.

"

'

proteina proteina

p

x

K  x

2.3.3 Modelos termodinámicos para la estimación de propiedades

Las propiedades fisicoquímicas del PEG y la(s) sal(es) a diversas concentraciones y temperaturas son necesarias para el entendimiento fundamental de la formación de fases y para el desarrollo de modelos teóricos para la predicción del comportamiento de separación de un sistema de dos fases acuosas (Murugesan and Perumalsamy, 2005), así como también para el diseño de procesos de extracción ATPS en aplicaciones de gran escala (Ninni et al., 2003).

Se requieren métodos empíricos o semiempíricos para modelar las propiedades físicas de los sistemas en cuestión debido a que la medición de los parámetros a todas las condiciones de interés resultaría poco viable (Ninni et al., 2003). Sin embargo, no todas las ecuaciones hasta ahora propuestas por los investigadoras resultan adecuadas de aplicar, ya que algunas de ellas resultan inapropiadas para mezclas multicomponentes o concentradas.

a) Densidad

Ninni et.al. (2003) reportaron parámetros lineales de ajuste para densidades de sistemas binarios PEG-agua a diferentes pesos moleculares, a 25 °C. A través de dichos parámetros aplicados en la ecuación (3.40) que presenta la forma general de estimación, se calcula la densidad en la fase superior, que es donde se encuentra una mayor fracción másica del polímero PEG; mientras que para estimar la densidad en la fase inferior, se utilizan los parámetros de regresión ajustados por Goncalves et.al (2005) para soluciones acuosas salinas a 25 °C.

(3.40) donde el subíndice f representa la fase superior o inferior a estimar su densidad y w

_i

es la fracción másica de PEG o sal (para fase superior e inferior, respectivamente)

Una vez que se estima la densidad para cada fase a la temperatura de referencia (25°C), se realiza un ajuste para obtener la densidad de cada fase a la temperatura de operación, tomando como referencia la densidad del agua a 25 °C. Para esto se utiliza la expresión (3.41) propuesta por Ninni et. al (2003)

i f

 a  bw



(3.41) donde



f

es la densidad de la fase superior o fase inferior



w

es la densidad del agua pura a 25 °C (997.97 kg/m

³

)

Finalmente, para calcular la densidad de la mezcla, se considera la estimación (3.42) para mezclas multicomponentes.

(3.42)

b) Viscosidad

Ninni et al. (2003) proponen una estimación de la viscosidad a partir de la reformulación de la ecuación de Kumar que se utiliza comunmente para calcular viscosidades cinemáticas de soluciones como una función de la concentración del soluto. La ecuación reformulada para sistemas multicomponentes se presenta a continuación:

(3.43)

donde

B es el coeficiente de la interacción soluto-solvente

(3.44) H es el número de moléculas de solvente solvatando al soluto

(3.45)

donde w es la fracción másica de PEG en la fase en cuestión, i representa los solutos en la mezcla multicomponente (PEG y sal), T

_ref

es la temperatura absoluta de referencia (298.15 K) y B

_ref

y H

_ref

son los coeficientes de ajuste dependientes del peso molecular de PEG, reportados por Ninni et al. (2003).

La viscosidad cinématica se relaciona con la viscosidad absoluta a través de la ecuación )

) ( 15 . 298 (

) 15 . 298 ) (

( T

K

T K

_w

w f

f





  

 

 ^





_{w f f w}

mezcla

  



 







 







 

 



i i i

i

rel f

rel

Hw

Bw

v 1 1 1

)

( 

 ^





n

n ref n

ref

B T T

B

B ( )

 ^





n

n ref n

ref

H T T

H

H ( )

(3.46)

donde 

_f

es la densidad para cada fase previamente calculada del modelo de Ninni et. al (2003) y 

_f

es la viscosidad absoluta resultante para cada fase.

c) Tensión interfacial

Wu et al. (1996) ajustaron parámetros a las ecuaciones de Bamberger et. al (1984) y Forciniti et al. (1990), a partir de datos experimentales, logrando representar adecuadamente los sistemas PEG-sal-agua a diferentes pesos moleculares de PEG (1000, 1500, 2000, 4000, 6000 y 20000) y para diversas concentraciones y tipos de sales involucradas en el sistema.

A través de la correlación obtenida, se logró representar la influencia del peso molecular del PEG y su concentración, así como también de la concentración de la sal. La ecuación que lo representa es la (3.47).

(3.47) donde

(3.48)

 representa la tensión interfacial

a

1

y b

1

son parámetros de ajuste del sistema acuoso PEG + sal W

A

 es la diferencia entre las concentraciones de PEG entre las dos fases W

B

 es la diferencia entre las concentraciones de sal entre las dos fases

2.3.4 Modelo de separación de fases

La cinética de la separación de fases en ATPS se ha analizado en función de las propiedades fisicoquímicas de las fases, a través de la medición de la altura de interfase en función del tiempo de separación (Salamanca, et.al 1998). El modelo de separación propuesto fue desarrollado por primera vez por Golob and Modic (1977), en un intento por correlacionar la velocidad de coalescencia en sistemas por lotes con las propiedades fisicoquímicas (densidad, viscosidad y tensión interfacial) de líquidos puros saturados.

f f f

v

rel



  ) (

) log(

log   a

₁

 b

₁

TLL



^{2 2}



^1/2

100 W

_A

W

_B

TLL    

Posteriormente, Asenjo et al. (2002) adaptaron el modelo para separaciones con dos fases acuosas y ajustaron las constantes en base a valores experimentales.

El perfil de separación de fases propuesto por Asenjo et al. (2002), presenta algunas diferencias respecto al perfil de separación de fases presentado por Golob and Modic (1977).

En la Figura 2.2 se ilustra el perfil de separación presentado por Golob and Modic (1977) en el que se aprecia que la velocidad de coalescencia de la fase dispersa, v

_d

, se puede obtener de la medición de la posición del frente de coalescencia en función del tiempo y se define como:

1 2

1 2

t t

H v

_d

H



  (3.49)

en el intervalo donde se considera aproximadamente constante. Se utiliza una deducción similar para obtener la velocidad de sedimentación de la fase contínua. De esto, se puede considerar que la velocidad de separación equivale a la pendiente de los perfiles de sedimentación o de coalescencia.

Frente de coalescencia Frontera de fase

después de sedimentación Frente de sedimentación

Figura 2.3 Perfil de separación de fases (Golob y Modic, 1977) Altura

tiempo

Figura 2.2 Perfil de separación de fases (Golob and Modic, 1977)

En la Figura 2.3 se presenta el perfil de separación propuesto por Asenjo et al. (2002) del que se deduce que a un tiempo t, la altura de la dispersión h

_t

corresponde a la distancia entre el frente de sedimentación y el frente de coalescencia a tiempo t. Esto corresponde al grosor de la banda de dispersión que va cambiando con el tiempo hasta que las fases estén completamente definidas y separadas.

Las propiedades físicas a considerar son aquellas que afectan el tiempo de coalescencia entre gota-interfase y gota-gota (Golob and Modic, 1977) como son la tensión interfacial, la viscosidad de cada fase y la diferencia de densidad entre las fases. Obteniéndose la siguiente expresión matemática:

(3.50)

(3.51)

donde



_c

es la viscosidad de la fase contínua

) , , ,

1

(

C D

dt f

dh       



 





3 2

1

4

H

W H

C H

D c

c

H

dt

dh 



 



 



 



  



 



 

 

 



 



 





















Figura 2.3. Perfil de separación en un ATPS ( Asenjo, 2002) Frente de sedimentación

Altura

tiempo Frente de coalescencia

Frontera de fase

después de

sedimentación



_D

es la viscosidad de la fase dispersa 

_C

es la densidad de la fase contínua

 es la tensión interfacial entre las dos fases



_w

es la tensión superficial de la interfase aire-agua a 20°C (7.28 x 10

^-2

Nm

^-1

)   es la diferencia de densidades entre las fases

H

₁

, H

₂

, H

₃

y H

₄

son constantes a determinar

Subíndices C y D refieren a la fase contínua y dispersa respectivamente

En el proceso de separación por dos fases acuosas se debe tomar en cuenta el fenómeno de coalescencia de las partículas, el cual depende del balance entre las fuerzas principales que actúan sobre las partículas o gotas (Salamanca et.al. 1998). Las tres fuerzas principales involucradas y que determinan la coalescencia son: gravedad, fricción y flotación. La fuerza de gravedad depende de la densidad de las partículas mientras que las fuerzas de fricción y flotación dependen de las propiedades reológicas del sistema (p.ej. viscosidad).

Debido a que en ATPS las densidades de las fases son muy similares entre sí y la relación de viscosidades entre un polímero y la sal puede ser de hasta 50 veces, la fuerza que determina el comportamiento de coalescencia es la fuerza de flotación.

En ATPS se utilizan los términos de fase contínua y fase dispersa para describir el comportamiento de coalescencia entre las partículas. Se dice que cuando las partículas ascienden, la fase rica en sal es la fase contínua, mientras que si descienden implica que la fase contínua es la fase rica en PEG (Salamanca et.al., 1998).

Lo que define la continuidad de una fase u otra es la localidad del punto de composición

inicial del sistema a separar respecto al punto de inversión, que es donde la fase contínua

cambia de una fase a otra. Al moverse fuera del punto de inversión por ambos lados, los

tiempos de separación de fases incrementan (Mistry et.al. 1996). De ahí es de donde

deriva la importancia de considerar la continuidad de las fases para la modelación de la

separación de fases.