Dra. Leticia I. Llarrull
Lic. en Biotecnología
Asignatura: BIOFISICA – 2020
BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
PARTE 1
Involucradas en:
• Señalización a través de membranas celulares
• Transporte de moléculas no permeables a través de membranas
• Comunicación célula-célula
• Reconocimiento celular
• Adhesión celular, entre otros
Muchas son blancos de drogas: el blanco de mas del 50% de todas las drogas en el mercado son proteínas de membrana.
Dificultades en la obtención de cristales de buena calidad Sub-representadas en bases de datos estructurales (solo el
1% de las estructuras depositadas en el PDB)
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
Las proteínas de membrana son difíciles de cristalizar
• Tienen regiones hidrofóbicas e hidrofílicas en sus superficies
• Mucho más difíciles de aislar que las proteínas solubles en agua, ya que deben ser solubilizadas de membrana (reemplazo de los lípidos por detergente) sin provocar desnaturalización.
• A pesar de los considerables esfuerzos realizados, relativamente pocas proteínas TM han producido cristales que difractan con alta resolución.
• Proteínas TM - aproximadamente 30% de un proteoma
• En las bases de datos estructurales: comprenden sólo alrededor de 1%
del total de estructuras depositadas
Esto podría mejorar en el futuro, con tecnologías avanzadas:
• Es posible determinar estructuras de rayos X de cristales de proteína cada vez más pequeños;
• Combinado con métodos novedosos de cristalización, tales como el
uso de anticuerpos para solubilizar
Las proteínas de membrana son difíciles de cristalizar
PROTEINAS PERIFERICAS LABILMENTE ASOCIADAS:
Solubilización a partir de preparaciones de membrana
con tratamiento con KCl PROTEINAS PERIFERICAS ASOCIADAS POR FUERTES
INTERACCIONES ELECTROSTATICAS:
Solubilización a partir de preparaciones de membrana
con tratamiento con Na2CO3
PROTEINAS INTEGRALES:
Solubilización a partir de preparaciones de membrana
con detergentes (a evaluar)
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
PROTEÍNAS PERIFÉRICAS
Interacciones Reversibles de las proteínas periféricas con la
bicapa lipídica
PROTEÍNAS PERIFÉRICAS
Interacciones Reversibles de las proteínas periféricas con la bicapa lipídica
HÉLICES ANFIPÁTICAS
Hidrofóbicos Polares
Cargados
HÉLICES ANFIPÁTICAS
HÉLICES HIDROFÓBICAS
PROTEÍNAS PERIFÉRICAS
Lipid-Anchored Proteins
• Lipid modification gives an opportunity to target proteins to the membrane (and even to specific intracellular membranes in eukaryotes) as well as to stabilize their interactions at the bilayer.
• The lipids can be fatty acids, terpenes, or glycosylphosphatidylinositol (GPI).
Dra. Leticia I. Llarrull
Lic. en Biotecnología
Asignatura: BIOFISICA – 2020
BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
PARTE 2
Clasificadas en dos tipos básicos: α-helicoidales y barriles-β
Proteínas de membrana α-helicoidales:
• Categoría mayoritaria
• Presentes en todos los tipos de membranas biológicas, incluyendo la membrana externa bacteriana
• Consisten en una o mas hélices transmembranas (hasta 20), cada una de las cuales contiene un tramo de aminoácidos hidrófobos, vinculadas por bucles extra-membranosos
• Bucles pueden contener subestructuras:
- Bucles re-entrantes (-hélices cortas que ingresan a la membrana y salen del mismo lado)
- Hélices anfipáticas (se acomodan paralelas a la membrana)
- Dominios globulares
PROTEÍNAS INTEGRALES DE MEMBRANA
Tipo Ia : contienen una secuencia señal escindible
Tipo Ib: no contienen una secuencia señal escindible
Proteínas integrales de membrana α-helicoidales
Tipo IIIa : contienen una secuencia señal escindible Tipo IIIb: tienen su extremo N- terminal expuesto a la superficie exterior de la membrana pero no contienen una secuencia señal escindible
Tipo III. (A) La bacteriorrodopsina de Halobacterium salinarum, un receptor acoplado a proteína G (GPCR) con siete hélices transmembrana, flanqueada por la bicapa lipídica. Actúa como una bomba de protones, utilizando energía de la luz capturada para mover protones a través de la membrana de la célula. código PDB 1py6. Otros GPCRs incluyen halorhodopsina, una bomba de cloruro impulsada por la luz, código PDB 1e12. (B) representación de la topología de la bacteriorrodopsina.
Proteínas integrales de membrana α-helicoidales
Una proteína Barril-
canónica, la porina OmpF (monomérica) de
Escherichia coli. Las porinas son proteínas transmembrana con centros huecos a través del cual las moléculas pequeñas pueden
difundir. Código PDB 2f1c.
• Presentes en membranas externas de bacterias Gram-negativas, en la pared celular de bacterias Gram-positivas, y en las membranas externas de las mitocondrias y los cloroplastos.
• Se componen de una serie de hebras anti-paralelas embebidas en la membrana, cada una de las cuales está unida mediante puentes de hidrógeno a las hebras inmediatamente antes y después en la secuencia primaria, conectadas por bucles extra-membranosos
Proteínas integrales de membrana Barril-β
• Todas las proteínas transmembrana Barriles- tienen una topología de hebras antiparalelas que puede reflejar su origen evolutivo común y mecanismos de plegado similares.
• Forman comúnmente porinas, de 16-18 hebras, que se ensamblan para formar canales llenos de agua que permiten la difusión pasiva de
nutrientes y productos de desecho a través de la membrana exterior.
• Compuestos potencialmente tóxicos más grandes: impedimento de ingreso en la célula por el tamaño del canal.
Proteínas de membrana Barril-β
• Hebras : contienen alternadamente aminoácidos polares e hidrofóbicos de manera que los residuos hidrofóbicos están orientados hacia el exterior, donde se ponen en contacto con los lípidos que rodean a la proteína, y los residuos hidrofílicos están orientados hacia el interior de los poros.
Proteínas de membrana Barril-β
Translocón Sec Insertasa YidC Sistema Tat
• bacterias
• algunas arqueo bacterias
• membranas del retículo endoplasmático en células eucariotas
• Cloroplastos
• AUSENTE en mitocondrias
• bacterias
• algunas arqueo bacterias
• mitocondrias
• cloroplastos
• presente en la mayoría de las bacterias y arqueo bacterias
• presente en cloroplastos
• AUSENTE en
mitocondrias
FUNCIONES • Transportar proteínas secretorias a través de la membrana interna
• Insertar proteínas de
membrana en la
membrana interna
• Insertar proteínas de
membrana en la
membrana interna
• Coopera con el translocón Sec en algunos casos
• Transportar proteínas secretorias a través de la membrana interna
• Insertar proteínas de
membrana en la
membrana interna
• Sustratos: generalmente proteínas con cofactores, la inserción de los cuales está generalmente restringida al citosol.
ESPECÍFICO PARA
PROTEINAS DESPLEGADAS PROTEINAS DESPLEGADAS PROTEINAS PLEGADAS (transporta proteínas plegadas a través de la membrana)
Sistemas de Translocación de Proteínas
SRP: signal recognition particle TF: trigger factor
SA: Sequence/Signal Anchor
SS: Signal Sequence of a soluble protein RNC: ribosome-associated nascent chain FtsY: membrane-anchored SRP receptor RR: Signal Sequence of the Tat System, with a Twin Arginine Motif
Proteínas de membrana auto-integrativas
Colicins:
• Bacteriocins, a class of toxins synthesized and released by bacteria to kill competing microorganisms.
More than a third of E. coli strains produce colicins.
• These bacteria harbor plasmids that encode specific colicins, along with specific immunity proteins, which are membrane proteins that ensure their own protection from the lethal action of the colicins.
• They enter their target cells utilizing outer membrane receptors and either the Tol or Ton intermembrane translocation systems.
• Those in the channel-forming subfamily then insert into the cytoplasmic membrane to form voltage-gated channels that leak ions at a very great rate (> 106 ions channel-1 sec-1), depolarizing the membrane and eventually killing the cell.
Proteínas de membrana auto-integrativas
Fusiones de Mistic a proteínas de membrana: ayuda a la sobreexpresión
de proteínas de membrana en sistemas recombinantes
Dra. Leticia I. Llarrull
Lic. en Biotecnología
Asignatura: BIOFISICA – 2020
BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
PARTE 3
Proteínas de membrana auto-integrativas
Colicins:
• Bacteriocins, a class of toxins synthesized and released by bacteria to kill competing microorganisms.
More than a third of E. coli strains produce colicins.
• These bacteria harbor plasmids that encode specific colicins, along with specific immunity proteins, which are membrane proteins that ensure their own protection from the lethal action of the colicins.
• They enter their target cells utilizing outer membrane receptors and either the Tol or Ton intermembrane translocation systems.
• Those in the channel-forming subfamily then insert into the cytoplasmic membrane to form voltage-gated channels that leak ions at a very great rate (> 106 ions channel-1 sec-1), depolarizing the membrane and eventually killing the cell.
Antibacterial Peptides Colicins
Plegamiento de proteínas de membrana auto-integrativas
Plegamiento de Proteínas de Membrana α-helicoidales
A. The two-stage model for folding helical membrane proteins consists of : (I) helix insertion
The stability of individual helices is postulated to allow them to insert as stable domains in the
lipid bilayer.
(II) helix interaction.
Side-to-side helix association results in a folded and functional protein.
A third stage for some proteins involves additional folding steps:
➢ (top) such as loop rearrangement,
➢ addition of prosthetic groups (P).
Plegamiento de Proteínas de Membrana α-helicoidales
Empaquetamiento "Knobs-in to-holes“: observado en interacciones hélice-hélice en muchas proteínas de membrana
La Glicoforina A dimeriza cuando las hélices TM de dos moléculas se asocian, de manera tal que cadenas laterales de aminoácidos ramificados que protruyen de una hélice se acomodan en “huecos o agujeros" de la otra hélice debido a los residuos de glicina. Visto desde la parte superior, el estrecho contacto entre pares de residuos de valina y glicina son evidentes. Visto desde el lateral, la proximidad de tales pares permite que las dos hélices puedan interactuar fuertemente. El tercer dibujo muestra las distancias interatómicas entre las dos regiones TM.
Motivo cierre de serinas en interacciones hélice-hélice
Polar clamp hydrogen bonding (‘Abrazadera’ Polar) Involucra la cadena lateral de un aminoácido en una posición dada i que es capaz de formar al menos dos enlaces puente de hidrógeno (es decir, E, K N, Q, R, S, T) con otros dos residuos, uno en la misma hélice (en la posición i + 1 o i + 4) y uno en la otra hélice.
Estudios de Plegamiento de Proteínas de Membrana Barril-
Proteínas -hélice: cada hélice puede ser formada independientemente mediante puentes de hidrogeno a lo largo del eje de la hélice.
Proteínas Barriles-:
• presentan puentes de hidrogeno entre hebras vecinas, aun con hebras cercanas a los extremos N y C-terminal;
• una hebra- aislada no es una estructura estable: se requiere de la formación de al menos 3-5 hebras para estabilizar una estructura , incluyendo los de dominios de proteínas solubles;
• se esperaría que todas las hebras del barril- se formen simultáneamente.
Estudios de Plegamiento de Proteínas de Membrana Barril-
OmpA: Las ubicación de los residuos de Trp durante el proceso de plegado se siguió con un conjunto de “reglas espectroscópicas”: lípidos que llevan un átomo de bromo como quencher de la fluorescencia en diferentes posiciones de sus cadenas carbonadas.
Dra. Leticia I. Llarrull
Lic. en Biotecnología
Asignatura: BIOFISICA – 2020
BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
PARTE 4
Métodos Biofísicos para el estudio de proteínas de membrana
• Fluorescencia – determinación de la topología y del mecanismo de plegamiento
• Estudios en SUVs: CD/IR/Absorción/Fluorescencia
• Estudios en nanodiscos: fluorescencia/CD/Intercambio de deuterio-MS
• Difracción de rayos X
• RMN
• Crio-microscopia electrónica
• EPR (fuera de los alcances del curso)
• BIOINFORMATICA
• Modelado molecular
• predicciones de la proteína en relación con la membrana basada en la minimización de la energía de transferencia de agua-lípido
• Análisis de hidrofobicidad/característica estructural
• simulaciones de dinámica molecular de grano grueso
• The detergent concentration must be kept above its CMC to maintain the mixed micelles.
• Sometimes adding still higher concentrations displaces the lipid completely, producing detergent-protein complexes Free of lipid.
Solubilización de proteínas de membrana
Estudios de proteínas de membrana en SUVs
Protocolo 1
Estudios de proteínas de membrana en SUVs
Protocolo 2 – Cell-free Síntesis con inserción in situ en liposomas
Molde + Extracto Celular + SUVs = Síntesis Proteica en SUVs
Limitación: proteínas con dominios que tienen que ser translocados a través de la membrana, para lo cual se requiere de las proteínas del sistema Sec, ausentes en los liposomas.
Estudios de proteínas de membrana en Nanodiscos
Estudios de proteínas de membrana en SUVs
Ejemplo Protocolo 2 – Cell-free Synthesis of a Seven Helix Membrane Protein:
In situ Insertion of Bacteriorhodopsin into Liposomes
Estudios de proteínas de membrana en SUVs
Ejemplo Protocolo 2 – Cell-free Synthesis of a Seven Helix Membrane Protein:
In situ Insertion of Bacteriorhodopsin into Liposomes
Estudios de proteínas de membrana en SUVs
Estudios de proteínas de membrana en Nanodiscos
Nativos
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Lic. en Biotecnología
Asignatura: BIOFISICA – 2020
BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
PARTE 5
Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales
SignalP; TargetP
Predicción de péptidos señal
BIOINFORMATICA
Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales
Gráficos de hidropatía
Los primeros métodos de predicción por Kyte y Doolittle (1982) y Engelman et al. (1986), y más tarde por Wiley and White (1996), se basaron en índices de hidropatía determinados experimentalmente, para crear un gráfico de hidropatía para una proteína.
Este gráfico de hidropatía se genera considerando una ventana de 19-21 residuos que se deslizada a lo largo de la secuencia de la proteína y promediando la puntuación. En cada posición, el índice hidrofóbico medio de los aminoácidos dentro de la ventana se calcula y ese valor se representa como el punto medio de la ventana.
BIOINFORMATICA
Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales
Gráficos de hidropatía
BIOINFORMATICA
COEFICIENTE DE PARTICION
MEDICION DE LA HIDROFOBICIDAD DE UNA SUSTANCIA
Gtr= cambio en energía libre al transferir la sustancia desde el agua a un solvente apolar (heptano, por ejemplo).
Las regiones de alta hidrofobicidad corresponderían a -hélices
TM hidrofóbicas (pueden aparecer algunas anfipáticas…).
Datos topológicos de proteínas de membrana interna en E. coli +
Datos de topología de proteínas de los centros de reacción fotosintéticos
• Análisis estadístico de los aminoácidos de los bucles internos y externos revelaron una prevalencia de residuos básicos en los bucles citoplasmáticos,
• Residuos aromáticos (Trp y Tyr) tienden a agruparse cerca del final de los segmentos transmembrana (Wallin et al. 1997 ): buffers físicos para estabilizar las hélices TM en la bicapa lipídica,
• Aparición de motivos de secuencia, como ser el motivo GxxxG (Senes et al.
2000), dentro de las hélices TM,
• Identificación de motivos periódicos implicados en el empaquetado hélice-hélice y en la estructura 3D (Samatey et al. 1995).
Predicción de la topología de proteínas de
membrana α-helicoidales
The von Heijne Positive-Inside Rule
En general, los bucles no translocados de proteínas de membrana presentan dos a cuatro veces más residuos de Lys y Arg que los que se encuentran en
dominios/bucles translocados.
Predecir la orientación de las hélices TM de las secuencias de aminoácidos: TopPred (Claros and von Heijne 1994).
Específicamente, un bucle con varios residuos básicos dentro de los 30 residuos desde el extremo de una hélice TM será un bucle interno.
Predicción de la topología de proteínas de
membrana α-helicoidales
The von Heijne Positive-Inside Rule
Predicción de la topología de proteínas de
membrana α-helicoidales
Predicción de la topología de proteínas de
membrana α-helicoidales
Bucles re-entrantes
Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales
doi.org/10.7554/eLife.08928.001 doi:10.1093/nar/gkp1042
Péptidos Señal y Bucles re-entrantes:
La alta similitud entre estas estructuras y el perfil hidrofóbico de una hélice TM conduce con frecuencia a un cruce entre los diferentes tipos de predicciones.
SignalP; TargetP
Identificación de péptidos señal
TOP-MOD; OCTOPUS
Identificación de bucles re-entrantes (debe mejorarse)
Problema: carencia de datos confiables con los cuales entrenar a
la computadora (machine-learning based methods).
Predicción de la topología de proteínas de
membrana α-helicoidales
Dra. Leticia I. Llarrull
Lic. en Biotecnología
Asignatura: BIOFISICA – 2020
BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
PARTE 6
Proteínas -helicoidales - ubicación topológica de una región (bucle)
• Análisis de glicosilación
• Inserción de etiquetas
• estudios con anticuerpos
• construcciones de proteínas de fusión (a fosfatasa alcalina, a eGFP , otras)
Riesgo de alterar la topología natural mediante la alteración de la secuencia de la proteína.
Estudio de la topología de proteínas de membrana
α-helicoidales
Proteínas -helicoidales - ubicación topológica de una región (bucle)
Construcción de proteínas de fusión a eGFP Predicción de la topología de proteínas
transmembrana
BIOINFORMATICA
DISEÑO DE
PROTEINAS
TRUNCADAS
https://doi.org/10.1038/s41598-019-55923-z
Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de
topología de membrana
Homology model from I-
TASSER
EVFOLD residues 133 to 306
Homology modeling with evolutionary
restraints
140 160 180 200 220 240 260 280
140 160 180 200 220 240 260 280
140 160 180 200 220 240 260 280
140 160 180 200 220 240 260 280
RMSD = 6.08 Å
RMSD = 5.22 Å
Refinement and extensions based on
homology model
RMSD = 3.97 Å
Robetta model of the effector domain
Model of PROTEASE
DOMAIN
MecR1 (Pfam)
4 301 335 580
Estructura determinada por
X-Ray
Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de
topología de membrana
PONER A PRUEBA,
EXPERIMENTALMENTE, LA TOPOLOGÍA
Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de
topología de membrana
Thorben et al. Computational and Structural Biotechnology Journal (2012)
eGFP fusionada a un bucle localizado en el CITOPLASMA:
Emisión de fluorescencia
eGFP fusionada a un bucle localizado en el PERIPLASMA:
NO emission de fluorescencia
Wavelength (nm)
500 520 540 560 580 600
Relative Fluorescence (AU)
0 5 10 15 20
MecR F1 MecR F2 MecR F3 MecR F4 MecR F5 MecR F6 MecR F7
citoplasma periplasma
Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de topología de membrana
Ensayos con células de E. coli intactas.
Topología de proteínas transmembrana
Fusiones a EGFP + susceptibilidad a Proteinasa K
citoplasma periplasma
Ensayos con esferoplastos (células de E. coli con la membrana externa permeabilizada), que
exponen los bucles
periplasmaticos a la Proteinasa K agregada a la suspensión,
manteniendo los bucles citoplasmáticos protegidos (membrana interna intacta).
CORREGIR LA TOPOLOGÍA ENSAYOS DE FLUORESCENCIA +
SUSCEPTIBILIDAD A PROTEINASA K
Topología de proteínas transmembrana
Fusiones a EGFP + susceptibilidad a Proteinasa K
X-ray structures of
Sensor domain are
available
INTEGRATIVE MODEL OF FULL-LENGTH MecR1
One of the apo-protein structures of the sensor domain of MecR1 was docked on the model of the protease domain using published NMR data about interactions of the L2 loop with the sensor domain, and under the constrain of the primary structure.
MecR1 (Pfam)
4 301 335 580
Estructura determinada
por X-Ray
