TÉCNICAS DE ESTUDIO EN CIENCIAS
Son muchos los métodos de estudio de la vida: desde las imágenes de microscopía electrónica y las filmaciones mediante endoscopia, hasta los estudios de comportamiento animal y de migraciones mediante investigaciones de campo. Los procedimientos más usuales que nos permiten conocer las características físicas y químicas de la materia viva que podemos reunirlos en dos grandes grupos: Examen visual y análisis de sus elementos.Examen visual. Engloba todos los métodos ópticos y electrónicos que permiten obtener imágenes de la materia viva. Se puede realizar de dos formas:
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Macroscópicamente.
Se realiza sin instrumentos ópticos ni electrónicos, es decir, a simple vista. Tiene mucha importancia porque así es como habitualmenteobservamos la realidad.
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Microscópicamente.
Se realiza utilizando distintos aparatos que aumentan la imagen del objeto observado, desde una simple lupa, hasta elmicroscopio más potente. Cuando el instrumento es un microscopio electrónico, la descripción que se hace se denomina ultraestructural.
MICROSCOPIOS ÓPTICOS
Características de los microscopios ópticos
El Aumento de un microscopio es la relación entre una dimensión lineal de la imagen que vemos y la dimensión del objeto real. Se calcula multiplicando los aumentos del ocular por los del objetivo.
La apertura numérica del objetivo (AN) es un parámetro que permite calcular el poder de resolución y el tamaño mínimo observable. Viene dada por la expresión AN= n sen u , siendo n el índice de refracción del medio existente entre el objeto y la lente frontal del objetivo, y u el semiángulo de apertura del objetivo.
El poder de resolución o poder separador (PR) es la propiedad más
importante en un microscopio, ya que de ella depende la nitidez con que se perciben los detalles. Se calcula mediante la expresión: PR = AN/landa, siendo landa ( λ ) la longitud de onda de la radiación utilizada.
El tamaño mínimo observable o límite de resolución (D) es la distancia mínima a la que tienen que estar dos puntos de la muestra para que puedan verse.
D = 1/ PR
El límite de resolución de un microscopio óptico está en 0,2 micras y en uno electrónico en 2. 10-4 micras.
Tipos de microscopios ópticos
a) Microscopio óptico compuesto.
Podemos diferenciar dentro de este tipo de microscopio los siguientes
- El microscopio estereoscópico o lupa binocular
b) Microscopio de campo brillante o campo claro.
Es el más utilizado y la luz pasa por el condensador e ilumina esta con un cono de luz brillante que penetra en el objetivo. Adecuado para muestras de alto contraste como tejidos teñidos.
c) Microscopio de campo oscuro.
Solo llegan a la muestra los rayos de luz que han sido desviados al atravesar el condensador; las células aparecen iluminadas sobre un campo oscuro. Resulta útil para visualizar suspensiones coloidales, como por ejemplo el citoplasma celular.
d) Microscopio de contraste de fase.
Con este microscopio se convierten las diferencias en el índice de refracción de las partes de la muestra en diferencias de intensidad (brillo y oscuridad) que son visibles por el ojo. Permite observar células y tejidos sin teñir Dos modificaciones de este microscopio es el Microscopio de interferencia y el Microscopio de interferencia diferencial o de Nomarski. Este último proporciona una imagen aparentemente tridimensional por lo que es útil para estudiar las propiedades de superficie celular y otros elementos biológicos.
e) Microscopio de fluorescencia o de luz ultravioleta.
Permite detectar moléculas que tiene la capacidad de ser
fluorescentes bien naturales o bien inyectados en la célula. La luz ultravioleta tiene una longitud de onda menor, por ello aumenta el poder de resolución.
f) Microscopio de polarización.
MUESTRAS BIOLÓGICAS
Las muestras biológicas deben tener unas características determinadas para poder visualizarse en el microscopio óptico.
Deben de ser de unas micras de grosor, para que los rayos luminosos puedan atravesarlas.
Pueden hacerse dos tipos de preparaciones:
Temporales. No son duraderas y se trata, generalmente, de muestras vivas que suelen ser incoloras y transparentes a la luz. Para la
observación de detalles suele ser necesario teñir las muestras. Hay algunos tipos de microscopios como el de contraste de fase o fondo oscuro que permiten la observación sin necesidad de tinción.
Permanentes. Son preparaciones duraderas y para obtenerlas se debe proceder a técnicas especiales de elaboración de preparaciones microscópicas. Estas técnicas son la fijación, la inclusión, la
deshidratación, el corte, la tinción y el montaje.
FIJACIÓN. Consiste en tratar la muestra biológica con unos líquidos denominados fijadores
o conservantes que preservan la morfología de las células, su organización interna y su composición química. Los más utilizados son el alcohol etílico al 70%, el formaldehido y el glutaraldehido.
INCLUSIÓN: Las muestras de los tejidos animales se incluyen en una sustancia para evitar su deformación durante el corte. El medio más utilizado es la Parafina, una sustancia que se vierte fundida, a unos 60ºC, sobre la muestra. La parafina fundida penetra en la muestra y luego se solidifica cuando se enfría.
DESHIDRATACIÓN: Previamente se debe realizar este paso debido a que la parafina es hidrosoluble.
CORTE: Si las muestras biológicas son tan gruesas que no permiten el paso de la luz, deben cortadas en capas muy finas. Se utilizan Microtomos que son aparatos que efectúan cortes extremadamente finos, generalmente entre 6 y 12 micras de grosor.
TINCIÓN: Según las estructuras que se quiera destacar, se utilizan unos colorantes u otros. Los colorantes más utilizados son: el azul de metileno, el carmín, la eosina, la hematoxilina, la orceina, la safranina, el sudán y el verde de metileno.
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los
microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 2 aumentos comparados con los de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".
El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quiénes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.
Un microscopio electrónico, como el de la imagen, funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los
microscopios electrónicos sólo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor
monocromático.
Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido.
Microscopio electrónico de transmisión
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
En el microscopio electrónico de barrido (MEB) la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.
Análisis de sus componentes mediante procedimientos físicos y químicos comprende los diversos métodos que permiten separar los componentes celulares y macromoleculares, y analizar la composición química molecular y elemental de la materia viva.
TERMINOLOGÍA USUAL
Algunos términos de uso frecuente cuando el ser vivo se somete a estudio son:
Anatomía. Estudio de las partes de un organismo mediante disección. Lo que describe la anatomía, tanto a escala macroscópica como microscópica, tiene existencia física y es tangible.
Morfología. Estudio de la forma, tamaño y aspecto externo de las partes o del todo de un organismo. La descripción morfológica de un organismo o de un órgano nos informa del color que tiene, de la textura de superficie, etc.
Fisiología. Estudio del funcionamiento de un organismo. La fisiología estudia procesos dinámicos que suceden en el ser vivo, y de ahí la gran dificultad de su investigación. Muchas veces es necesario deducir lo que ha ocurrido en el organismo vivo a partir de los análisis realizados después de su muerte. Los términos que se expresan en latín se escriben siempre en cursiva:
In vivo. Significa que un procedimiento o experimento se realiza en el propio ser vivo, sin alterar sus condiciones vitales.
In vitro. Significa que un procedimiento se realiza en el laboratorio, fuera del organismo vivo, intentando reproducir, o no, sus condiciones vitales.
ANÁLISIS DE LOS COMPONENTES DE LA MATERIA VIVA
El objetivo principal de estos métodos es conseguir separar los constituyentes celulares sin alterar su estructura.
Las técnicas de cultivo celular permiten realizar análisis in vitro de sistemas simplificados y controlados. Las células en cultivo son un excelente material para estudiar actividades celulares: la
endocitosis, el movimiento celular, la división de la célula, el tráfico a través de la membrana, la síntesis de macromoléculas, el intercambio de iones, etc.
Además, a veces es necesario mantener unas células en un determinado medio de crecimiento para que estas incorporen
nutrientes y compuestos marcados radiactivamente o con sustancias fluorescentes.
Las células no pueden crecer indefinidamente pues tiene un tiempo de vida determinado, pero a veces, aparecen células que se dividen indefinidamente (células cancerígenas) que dan lugar a líneas celulares.
Fraccionamiento celular. Puede realizarse por diversos métodos, como el batido, los ultrasonidos, la plasmólisis o aplastamiento. Podemos así liberar los componentes del interior para su posterior estudio. La separación de esos componentes suele hacerse mediante centrifugación o ultracentrifugación.
Ultracentrifugación. Consiste en someter una mezcla homogeneizada de un tejido a una rotación de elevada velocidad angular en varias etapas, originándose una fuerza centrífuga miles de veces mayor que la de la gravedad. De este modo se consigue que diferentes
componentes sedimentes a tiempo distintos, quedando unas
componentes en el fondo del tubo y otros en el sobrenadante. Para determinar las velocidades de sedimentación se utiliza como unidad el Svedberg (S). Una vez separados los componentes celulares están preparados para ser analizados.
Las técnicas de análisis químico permiten la identificación de
Soxhlet: la identificación de glucosa por el reactivo de Fehling, o la determinación de proteínas mediante la reacción de Biuret.
La obtención de precipitados, la filtración y la decantación son procedimientos usuales para ir separando las sustancias que integran una muestra.
Una dificultad en el análisis de material biológico es la similitud molecular que tienen muchos constituyentes aun siendo diferentes. Para separarlos e identificarlos existen varias técnicas como las siguientes.
Cromatografía:
Reúne una gran variedad de técnicas destinadas a fraccionar una mezcla de componentes disueltos a medida que se desplazan a través de una matriz porosa. La técnica, en general, se basa en la diferente afinidad que tienen las moléculas por un disolvente y por la trama porosa de la matriz a través de la que fluyen.
través de la misma. Como los componentes de la mezcla tienen distinta afinidad por la matriz se separan diferencialmente.
El progreso de la cromatografía ha consistido en encontrar nuevos soportes porosos que faciliten la migración de las sustancias cada vez con mayor resolución. Entre otros tipos se encuentran la cromatografía en capa fina
(gel de sílice sobre vidrio) y en columna (capas de materiales inertes, finamente granulados dispuestas en un cilindro a través del cual fluye el eluyente), la cromatografía de alta resolución (HPLC) es una variedad cromatográfica en columna en la que la velocidad de migración aumenta considerablemente. La mezcla se somete a elevada presión, y se hace pasar a través de la columna de un material granulado en esferas minúsculas, consiguiendo la separación en menor tiempo.
Electroforesis
La electroforesis en gel de poliacrilamida consiste en un soporte de un material de poro fino, como el gel de poliacrilamida o agarosa. Se instala en contacto con una disolución tampón; así todo el gel queda embebido en ella. La disolución tampón se prepara a un pH diferente del punto isoeléctrico de las proteínas, con el fin de que estas mantengan su carga neta.
Cerca de uno de los extremos se aplica una gota de la muestra y se conectan los electrodos. Como las proteínas carecen de color, se revelan las manchas mediante un colorante. La migración de cada porción proteica depende de su tamaño, su forma y afinidad por el disolvente o el soporte poroso, sino también por su carga eléctrica.
DIFRACCIÓN DE RAYOS X
La cristalografía de rayos X es una técnica consistente en hacer pasar un haz de rayos X a través de un cristal de la sustancia sujeta a estudio. El haz se escinde en varias direcciones debido a la simetría de la agrupación de átomos y, por difracción, da lugar a un patrón de intensidades que puede interpretarse según la ubicación de los átomos en el cristal, aplicando la ley de Bragg.
Es una de las técnicas que goza de mayor prestigio entre la comunidad científica para dilucidar estructuras cristalinas, debido a su precisión y a la experiencia acumulada durante décadas, elementos que la hacen muy fiable. Sus mayores limitaciones se deben a la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos, por lo que no es aplicable a disoluciones, a sistemas biológicos in vivo, a sistemas amorfos o a gases.
La cristalografía de rayos X desempeñó un papel esencial en la descripción de la doble hélice de la molécula de ADN (Véase también: Rosalind Franklin, James D. Watson, Francis Crick).
AUTORRADIOGRAFÍA
La radioactividad es capaz de
impresionar una placa fotográfica. De hecho, así fue cómo Becquerel
(fotografía de la izquierda) descubrió este fenómeno en 1896. Esta propiedad nos va a permitir tanto seguir el
destino de un compuesto radioactivo
en el interior de un organismo como cuantificar, ya que la intensidad de la impresión en la placa fotográfica es proporcional a la cantidad de radioactividad presente en la muestra.
El procedimiento para hacer una autorradiografía es el siguiente:
Se coloca la muestra sobre una placa fotográfica protegida de la luz en el interior de un cassette Se espera el tiempo suficiente para que la radioactividad emitida por la muestra impresione la placa Se revela la placa fotográfica según los procedimientos normales
Se obtiene una placa impresionada
La intensidad de la impresión es proporcional a la cantidad de radioactividad presente en la muestra La tabla inferior muestra dos ejemplos que ilustran la utilidad de esta técnica:
Para seguir el rastro de moléculas marcadas radioactivamente por el interior de un organismo
Para identificar una colonia de células son portadoras de una secuencia de DNA capaz de hibridar con una sonda (una molécula de DNA radioactiva y de secuencia conocida)
Para identificar las bandas de un gel de agarosa que contienen una secuencia de DNA complementaria a la sonda (una molécula de DNA radioactiva y de secuencia conocida)