Marco R. Arones Jara
Unidad de Investigación e Innovación de Ciencias de la Salud
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) PARA LA
DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES TOTALES EN EL
“ROMERO”. AYACUCHO – 2016
E-mail: aronesmarco@gmail.com
El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo validar la metodología para la cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado de Calceolaria rupestris Molau “romero” por cromatografía líquida de alta resolución. Se evaluó los parámetros fisicoquímicos y se realizó la identificación de flavonoides por pruebas de coloración y cromatografía en capa fina (CCF). La cuantificación se realizó por cromatografía líquida de alta performance (HPLC) y se determinó el test de linealidad y precisión. El extracto es altamente soluble en etanol al 50%; posee un 10,01 ± 0,94% de cenizas totales; 1,17 ± 0,054% de humedad y un pH de 6,23. El extracto contiene flavonas, flavonoles, flavanonas y derivados de catecoles. El valor de Rf fue 0,50 con señales a 199,2; 291,4 y 330,0 nm. El sistema cromatográfico por HPLC tuvo una fase móvil de agua metanol 35:65; longitud de onda 370 nm; 5 uL de volumen de inyección; flujo de 0,7 mL/min y tiempo de retención de 2,58 min. Del Test de Linealidad, el valor de la intersección fue de 2,058 (p > 0,05), la pendiente 137,81 (p < 0,05) y el coeficiente de correlación de Pearson de 0,9979 (p < 0,05). El Test de precisión resultó significativo con un valor de coeficiente de variación 1,5% y un valor promedio 1,5 ± 0,2 % de flavonoides equivalentes de rutina. Se concluye que el método analítico por HPLC para la determinación y cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado de las hojas de Calceolaria rupestris Molau “romero”, es válido.
RESUMEN
EXTRACTO ATOMIZADO DE LAS HOJAS DE
Calceolaria rupestris Molau
Palabras clave: Extracto atomizado; Calceolaria rupestris Molau “romero”, validación.
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF THE ANALYTICAL METHOD BY
HIGH-RESOLUTION LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) FOR THE DETERMINATION AND
QUANTIFICATION OF TOTAL FLAVONOIDS IN THE ATOMIZED EXTRACT OF THE
LEAVES OF Calceolaria rupestris Molau "ROMERO". AYACUCHO - 2016
ABSTRACT
Keywords: atomized extract; Calceolaria rupestris Molau "rosemary", validity.
The objective of this research was to validate the methodology for the quantification of total flavonoids in the atomized extract of Calceolaria rupestris Molau "rosemary" by high performance liquid chromatography. The physicochemical parameters were evaluated and the identification of flavonoids was carried out by dyeing tests and thin layer chromatography (TLC). The quantification was performed by high performance liquid chromatography (HPLC) and the linearity and precision test was determined. The extract is highly soluble in 50% ethanol; possesses 10.01 ± 0.94% of total ash; 1.17 ± 0.054% humidity and a pH of 6.23. The extract contains flavones, flavonols, flavanones and catechol derivatives. The value of Rf was 0.50 with signals at 199.2; 291.4 and 330.0 nm. The HPLC chromatographic system had a 35:65 methanol water mobile phase; wavelength 370 nm; 5 uL of injection volume; flow of 0.7 mL / min and retention time of 2.58 min. From the Linearity Test, the intersection value was 2.058 (p> 0.05), the slope was 137.81 (p <0.05) and the Pearson correlation coefficient was 0.9979 (p <0.05). ). The precision test was significant with a coefficient of variation of 1.5% and an average value of 1.5 ± 0.2% of routine equivalent flavonoids. It is concluded that the analytical method by HPLC for the determination and quantification of total flavonoids in the atomized extract of the leaves of Calceolaria rupestris Molau "rosemary", is valid.
El presente trabajo de investigación se llevará a cabo en el Centro de Desarrollo, Análisis y Control de Calidad de Medicamentos de la Escuela de Formación Profesional de Farmacia y Bioquímica y estará orientado a desarrollar y validar el método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la determinación y cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado de las hojas de
Calceolaria rupestri Molau “romero”.
INTRODUCCIÓN
Las preparaciones herbarias son la base de los productos acabados y pueden componerse de materiales herbarios triturados o pulverizados, o extractos, tinturas y aceites
En la actualidad, la EP. de Farmacia y Bioquímica, a través del Laboratorio de Tecnología de Productos Naturales del Centro de Desarrollo, Análisis y Control de Calidad de Medicamentos y Fitomedicamentos, viene elaborando preparados herbarios como extractos atomizados, así como productos herbarios como cremas, tabletas, jarabes a base de preparaciones herbarias.
En esa perspectiva se plantea el presente trabajo de investigación que es consecución de trabajos de investigación previos realizados en el CEDACMEF, con la intención de desarrollar formulaciones a base de plantas medicinales eficaces, seguros y de calidad.
La salud es considerada un derecho fundamental de las personas. El acceso al cuidado de la salud incluye el acceso a productos farmacéuticos y dispositivos médicos. Constituye un requisito para lograr este derecho tener el producto disponible y asequible en el lugar y momento en que sea requerido. Acceso a productos farmacéuticos de calidad, eficaces y seguros.
Proteger la salud es una función del estado, que involucra responsabilidad a los gobiernos y a la sociedad vinculada a la responsabilidad social de atender y transformar la salud desde la perspectiva del interés colectivo de la población y la Universidad no debe ser ajeno a esta, investigando y desarrollando medicamentos. Los medicamentos son En ese sentido, el presente trabajo de investigación está orientado a desarrollar y validar un método analítico por cromatografía líquida de alta performance para para la determinación y cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado de las hojas de Calceolaria rupestris
Molau “romero”.
El Art. 12 de la Ley 29459, Ley de Productos Farmacéuticos, productos sanitarios y dispositivos médicos, refiere que la comercialización de medicamentos herbarios, sus preparados obtenidos en forma de extractos, liofilizados, destilados, tinturas, cocimientos o cualquier otra preparación galénica con finalidad terapéutica, en la condición de fórmulas magistrales, preparados oficinales o medicamentos se sujeta a los requisitos y condiciones que establece el Reglamento respectivo. Así mismo, en su Art. 18, prescribe que el control de calidad de los productos farmacéuticos, dispositivos médicos y productos sanitarios es obligatorio, integral y permanente y en el caso de productos farmacéuticos, la calidad involucra todos los aspectos del proceso de fabricación, desde las materias primas empleadas hasta los productos terminados, así como los procesos de almacenamiento, distribución, dispensación y expendio. Aparte de otras exigencias de calidad que se exige para los medicamentos la Ley N° 29459, Ley de Productos Farmacéuticos, Dispositivos Médicos y Productos Sanitarios, en el Artículo 85°, de los requisitos para la inscripción y reinscripción de medicamentos herbarios de uso medicinal, ya sea Productos Herbarios de Uso Tradicional o Recursos Herbarios de Uso Tradicional, exigen la información general de la(s) planta(s) medicinal(es) que intervienen en la composición; las especificaciones y técnica analítica de las sustancias activas, excipientes y producto terminado, así como la validación de las técnicas analíticas propias del producto terminado; además menciona que se utilizan como referencia las siguientes farmacopeas vigentes: Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP); Farmacopea británica; Farmacopea europea (Unión Europea); Farmacopea japonesa; Farmacopea OMS; Farmacopea alemana; Farmacopea brasilera; Farmacopea helvética; Farmacopea belga.
descripción de la preparación, identificación, pureza y valoración, para lo cual se requiere desarrollar y validar métodos analíticos para su control de calidad.
En ese sentido se planteó el objetivo general de desarrollar y validar el método analítico para la identificación y cuantificación de flavonoides totales de Calceolaria rupestri
Molau “romero” por cromatografía líquida de alta resolución.
La muestra está constituida por el extracto atomizado elaborado a partir de las hojas de Calceolaria rupestri Molau “romero”, del centro poblado de Waraca anexo Anchac – Huasi, provincia de Vinchos del departamento de Ayacucho, preparado por el Laboratorio de Tecnología de Productos indispensables para el cuidado de la salud de la población y constituye un bien social.
MATERIAL Y MÉTODOS Lugar de ejecución
El trabajo de investigación se realizará en el laboratorio del Centro de Desarrollo, Análisis y Control de Calidad de Medicamentos y Fitomedicamentos (CEDACMEF) de la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga.
En la actualidad se comercializan los medicamentos herbarios, sus preparados obtenidos en forma de extractos, liofilizados, destilados, tintura, cocimiento o cualquier otra preparación galénica con finalidad terapéutica, en la condición de fórmulas magistrales, preparados oficinales o medicamentos, que tiene como materia prima la flora y fauna de nos proporciona la naturaleza. El Perú, es un país megadiverso y Ayacucho posee una riqueza enorme de flora y fauna, que debe ser aprovecha en toda su dimensión, no sólo debe ser abastecedor de esa materia primar, sino se le debe dar ese valor agregado, o sea materia prima transformada en medicamento herbario eficaz, seguro y de calidad. Para ello, se debe realizar investigaciones y desarrollar conocimiento en esta perspectiva, para de esta manera proveer a nuestra población de ese bien social que es el medicamento.
Definición de la muestra
Determinación del contenido de humedad a. Parámetros fisicoquímicos
Solubilidad en alcohol:En un tubo de ensayo añadir 1 mL de alcohol etílico a 1 g del extracto atomizado, agitando fuertemente (en caso de no disolverse aumentar el disolvente a 10 mL agitar y observar así sucesivamente para 0,03 L; 0,1 L; 1 L y más de 10 L.).
Procedimiento experimental
Solubilidad en agua: En un tubo de ensayo añadir 1 mL de agua destilada a 1 g del extracto atomizado, agitar fuertemente, en caso de no disolverse aumentar el disolvente a 10 mL agitar y observar, así sucesivamente para 0,03.L; 0,1 L; 1 L y más de 10 L.
Determinación de pH
Se midió el pH con un potenciómetro.
Para obtener la masa constante los intervalos entre calentamiento y pesada son de 30 min. Si el residuo presenta trazas de carbón, se le añaden unas gotas de solución, ácido nítrico al 10% m/v y se calienta hasta evaporar los solventes. Al enfriar el crisol el residuo es de
19 color blanco o casi blanco .
Pesar no menos de 2,0 g ni más de 3,0 g del extracto atomizado, con una desviación permisible de 0,5 mg en un crisol de porcelana o platino previamente tarado. Calentar suavemente la muestra de ensayo aumentando la temperatura hasta carbonizar y posteriormente se incinera en una mufla a una temperatura de 700 a 750ºC, si no se señala otra temperatura en la norma específica, durante 2 horas. Enfriar el crisol en una desecadora y pesar, repitiéndose el proceso hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en más de 0,5 mg (masa constante). seguidamente se desecará a 105ºC durante 3 horas. La cápsula se coloca en la desecadora donde se deja enfriar a temperatura ambiente y se pesa, colocándose nuevamente en la estufa durante 1 hora, volviéndose a
9 pesar, hasta obtener una masa constante Determinación de cenizas totales
b. Desarrollo del método analítico
Prerapar una solución del extracto atomizado en metanol. Realizar las pruebas para identificación de flavonoides: Identificación de flavonoides por pruebas de
coloración
Identificación de flavonoides mediante la técnica cromatografía en capa fina
Se varió las condiciones cromatográficas como de la fase móvil, sistema isocrático, en gradiente, volumen de inyección, longitud de onda, estándares (tiempo de retención) y tamaño de columna.
c. Validación del método analítico para cuantificación de flavonoides por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
Prueba de Shinoda, reacción frente a FeCl , NaOH y 3 H SO (Loock, 1994).2 4
• Fase móvil: Butanol: ácido acético glacial : agua (4 : 1 : 5)
• Fase estacionaria: Placa cromatográfica Sílica Gel
• Volumen de muestra: 2,5, 5 y 7,5 uL
• Revelador: Longitud de onda: 254 y 366 nm y vapores de amoníaco.
Se evaluó el Test de linealidad, precisión y exactitud. Desarrollo del método analítico por HPLC
Para la elaboración de la curva de calibración pesar 25 mg de rutina, llevar a una fiola de 25 mL, agregar 10.mL de metanol, disolver, seguidamente agregar 10 mL de agua destilada, finalmente aforar con metanol al 50%. Para la preparación de la curva de calibración extraer las siguientes alícuotas. Se prepararon tres curvas de calibración con dos repeticiones.
Concentración de rutina (mg/mL)
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Solución stock (mL) 2,0 4,0 6,0 8,0 Solución stock
Metanol c.s.p. (mL) 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Ensayo Observación Resultado
Prueba de Shinoda Color amarillo Flavonas y flavonoles
Prueba frente a NaOH 5% Color amarillo a naranja Flavononas y flavonoles
Prueba frente a H2SO4 (c) Color amarillo Flavonas y flavonoles
Prueba frente a FeCl31% Color verde Derivados de catecoles
Para la preparación de la muestra problema, pesar 100 mg del extracto atomizado de hojas de romero, llevar a una fiola de 10 mL, agregar 4 mL de alcohol 50%, disolver y finalmente aforar con metanol 50%. Se prepararon tres muestras con dos repeticiones.
Para la precisión, se ensayó la repetitividad: Para determinar si el método que se va utilizar es preciso en condiciones de repetitividad, se sometieron a diferentes concentraciones de Para el Test de linealidad, se utilizará una curva de calibración de Rutina, considerando los siguientes puntos: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1,0 mg/ml. Donde cada uno de ellos se inyecta por triplicado. Se obtuvo entonces, el coeficiente de correlación, el de determinación y la ecuación de la recta. Posteriormente se comprobara la linealidad del método, utilizando un test estadístico.
estándares al método analítico completo. Para ello se utilizaran estándares de Rutina en tres diferentes concentraciones de 0,2; 0,4, 0,6; 0,8 y 1,0 mg/ml. Cada uno de ellos se someterá a repeticiones al método analítico completo, durante el mismo día. Posteriormente se calcula el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación.
Análisis de datos
Los datos que se obtendrán de la evaluación de los estudios se procesaron por Microsoft Excel. Se consideró significativo un p menor que 0,05.
Los resultados se expresan como promedio, la diferencia significativa existente entre los tratamientos se evaluó a través de la prueba de t-student, con un nivel de significación estadística de 0,05.
Tratamiento Rf
Extracto atomizado 2,5 uL 0,49 199,2; 219,4; 330,7
Extracto atomizado 7,5 uL 0,50 199,2; 219,4; 330,7
Tabla 2. Resultados de la identificación por cromatografía en capa fina de flavonoides en el extracto atomizado de hojas de
Calceolaria rupestris Molau.
Tabla 3. Resultados de la evaluación de parámetros fisicoquímicos del extracto atomizado de hojas de Calceolaria rupestris
Molau.
Extracto atomizado 2,5 uL 0,50 199,2; 219,4; 330,7
Estándar de rutina 0,48 209,4; 258,2; 358,2
Tratamiento Valor
Solubilidad
Agua (+) Metanol (++) Etanol 70% (++) Etanol 50% (++++)
Cenizas 10,015 ± 0,94 %
Humedad 1,17 ± 0,054 %
pH 6,23
Condiciones Valores
Fase móvil Agua : Metanol (35:65)
Longitud de onda 370 nm
Volumen de inyección: 5 uL
Flujo 0,7 mL/min
Columna C18
Tiempo retención del extracto 2,580 min
Tiempo de retención de rutina 2,973 min
y = 137.81x + 2.058 R² = 0.9996
0.0 30.0 60.0 90.0 120.0 150.0
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
A
U
C
Concentración [mg/mL]
+: baja solubilidad++ : poco soluble+++: ligeramente soluble++++: altamente soluble
Tabla 4. Condiciones cromatográficas para del análisis por HPLC del extracto atomizado de hojas de Calceolaria rupestris Molau.
Figura 1. Curva de calibración de rutina para la cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado de hojas de
Prueba Hipótesis Ttablas Texperimental Resultado
1. Significancia de la pendiente
Ho : b = 0
Ha : b ≠ 0 3,18 91,95 Significativo
2. Significancia de la intersección:
Ho : a = 0
Ha : a ≠ 0 3,18 2,060 Significativo
3. Significancia del coeficiente de regresión lineal
Ho : r = 0
Ha : r ≠ 0 5,84 91,65 Significativo
Estándares (mg/mL) AUC Factor de
calibración AUC Cmp (mg/ml) %F rutina
0,20 29,21 0,01 58,99 39,33 3,93
0,40 57,12 0,01 56,87 40,23 4,02
0,60 85,07 0,01 56,49 40,52 4,05
0,80 113,48 0,01
1,00 138,84 0,01
X 0,01 57,45 40,03 4,00
S 0,0070 1,350 0,62 0,062
%CV 1,8 2,4 1,5 1,5
g.l. 2,0 2,0
tt 4,30 4,30
alfa 0.05 0,05
+/- 1,5 0,2
LI 38,5 3,8
LS 41,6 4,2
Tabla 5. Resultados del Test de linealidad para la cuantificación de rutina por HPLC.
Tabla 6. Test de precisión para la validación de la cuantificación de flavonoides totales del extracto atomizado de hojas de
Calceolaria rupestris Molau.
DISCUSIÓN
En la Tabla 2, se presenta los resultados de la identificación cromatográfica donde se muestra que el valor de Rf es 0,50 y presenta señales al espectro ultravioleta a 199,2; 219,7 y 330,7 nm. Según Lock (1994), la cromatografía de papel es la técnica más antigua, y aún usada desde su introducción en 1948, y se utilizan sistemas de solventes como el BAW (n-buOH: HOAc: H2O, 4:1:5, fase superior). Refiere, que una generalidad puede asumirse al utilizarse sistemas con solventes alcohólicos para las agliconas flavonoides, que para una misma clase el valor de Rf es más bajo cuanto mayor En la Tabla 1, se presenta los resultados de la identificación de flavonoindes en el extracto atomizado, en el cual se determinó la presencia de flavonas, flavonoles, flavanonas y derivados de catecoles. Según Lock (1994), la reacción más usual para la detección de los flavonoides en un extracto de planta es la reacción de Shinoda, en el cual el desarrollo inmediato de coloración es indicativo de la presencia de: flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo), isoflavonas, chalconas y auronas no dan coloración. Al reaccionar con álcalis dan coloración amarillo a naranja en presencia de flavononas y flavonoles; y cuando reaccionan con ácidos fuertes indican la presencia de flavonas y flavonoles. Así mismo, refiere que con FeCl dan 3 color verde todo compuesto fenólico derivado de catecol.
En el presente trabajo, si bien es cierto se corrobora la presencia de flavonoides en el extracto atomizado; sin embargo, los valores de Rf no se corresponden al valor que la rutina, lo que nos indica que se trata de otro flavonoide. Esto se corrobora con los resultados del barrido espectral que dan picos en diferentes longitudes de onda.
Fauli (1993), refiere que en un estudio debe ir precedido del conocimiento de determinadas propiedades físicas, químicas y biofarmacéuticas del principio activo.
Miranda y Cuéllar (2000), mencionan que mediante el empleo de los métodos físico-químicos de análisis puede determinarse la calidad de una droga, así como completar su identificación. Se denominan cenizas totales al residuo que se obtiene al incinerar una droga, fundamentalmente en su determinación gravimétrica. La presencia de exceso de agua en las drogas vegetales, puede promover el crecimiento de hongos y la hidrólisis de constituyentes que pueden provocar es el número de grupos hidroxilo, y son en la mayoría de los casos más altos que los correspondientes glicósidos.
el deterioro de la droga. En este caso, los extractos atomizados, son sustancias muy higroscópicas, lo cual podría conllevar a la degradación de sus constituyentes químicos.
Quattrocchi et al. (1992), menciona que la fase móvil en HPLC cumple un rol fundamental, ya que por sí misma puede modificar completamente la selectividad de las separaciones en fase normal y es, a la vez, el verdadero motor de las separaciones en fase reversa. De hecho, ésta es la principal diferencia que existe con la cromatografía gaseosa (GC). En HPLC es posible lograr un número muy grande de diferentes separaciones con una columna, tan sólo variando la composición de la fase móvil. Es por ese motivo, que en la presente investigación se varió la fase móvil, hasta poder obtener un cromatograma bien diferenciado, así mismo, se varió las condiciones cromatográficas como longitud de onda, volumen de inyección, velocidad de flujo, tipo de columna. Si bien es cierto, que no coincidieron los tiempos de retención con de la rutina, sin embargo, por la cercanía, para esta investigación se decidió cuantificar flavonoides totales en función de rutina, y queda como recomendación seguir investigación para identificar el flavonoide en el tiempo de retención 2,58 min.
Para el proceso de desarrollo y validación del método analítico, se utilizó el estándar de rutina para la cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado. Es así que luego de realizar varias repeticiones se logró construir una curva de calibración con la variación del área bajo la curva (AUC) en función de la concentración de rutina.
Al evaluar la significancia de la intersección se planteó la hipótesis nula que la intersección es igual a cero y al contrastar dicha hipótesis se obtuvo un T de Student experimental de 2,06 cuyo valor es menor al T de Student crítico para un nivel de significancia de 0,05 para una prueba bilateral. En ese sentido, se acepta la hipótesis nula; por lo El primer Test para la validación del método es el test de linealidad, que consta de tres pruebas, la significancia de la pendiente, significancia de la intersección y la significancia del coeficiente de regresión lineal.
En la significancia de la pendiente se planteó la hipótesis nula que la pendiente es igual a cero y al contrastar dicha hipótesis se obtuvo un T de Student experimental de 91,95 cuyo valor es mayor al T de Student crítico para un nivel de significancia de 0,05 para una prueba bilateral. En ese sentido, se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna; por lo tanto la pendiente es significativamente diferente de cero.
En la Tabla 4, se presentan los resultados de las condiciones cromatográficas en cromatografía líquida de alta performance para la cuantificación de flavonoides totales equivalentes a rutina. El sistema cromatográfico por HPLC tuvo una fase móvil de agua metanol 35:65; longitud de onda 370 nm; 5 uL de volumen de inyección; flujo de 0,7 mL/min y tiempo de retención de 2,58 min.
En la Tabla 5, se presentan los resultados de la validación de la metodología de identificación y cuantificación de flavonoides totales equivalentes a rutina. Del Test de Linealidad, el valor de la intersección fue de 2,058 (p > 0,05), la pendiente 137,81 (p < 0,05) y el coeficiente de correlación de Pearson de 0,9979 (p < 0,05).
tanto la intercesión es significativamente similar a cero. De la evaluación de la significancia del coeficientes de correlación lineal (r) se planteó la hipótesis nula que “r” es igual a cero y al contrastar dicha hipótesis se obtuvo un T de Student experimental de 91,65 cuyo valor es mayor al T de Student crítico para un nivel de significancia de 0,05 para una prueba bilateral. En ese sentido, se rechaza la hipótesis nula; por lo tanto la intercesión es significativamente diferente de cero.
Conclusiones:
Se validó del método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la determinación y cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado de las hojas de Calceolaria rupestris Molau “romero”, el método cumple con criterios de linealidad, precisión, exactitud, límite de detección y límite de cuantificación.
Para la evaluación de la precisión del método, se cuantificó flavonoides totales en el extracto atomizado en función a la rutina. Se obtuvo 40,03 ± 1,5 mg/ml de flavonoides totales en función de rutina, con una desviación estándar de 0,62 y coeficiente de variación del 1,5% cuyo valor es muy cercano a cero, por lo que concluimos que el método de cuantificación es preciso.
Se desarrolló el método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la determinación y cuantificación de flavonoides totales en el extracto atomizado de las hojas de Calceolaria rupestris Molau “romero” con una fase móvil de agua: metanol (35:65), 370 nm, volumen de inyección 5.uL y flujo de 0,7 mL/min. En la Tabla 6, se presenta los resultados del Test de precisión, se observa que resultó significativo con un valor de coeficiente de variación 1,5% y un valor promedio 1,5 ± 0,2 % de flavonoides equivalentes de rutina.
En conclusión podemos afirmar que la curva de calibración para la cuantificación de rutina cumple con los parámetros de linealidad.
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