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Evaluación de la actividad antifúngica y antibacteriana de dos moléculas aisladas de calea prunifolia.

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Academic year: 2020

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Y ANTIBACTERIANA DE

DOS MOLÉCULAS AISLADAS DE CALEA PRUNIFOLIA.

LISSETH DAMARIS MONTOYA DÍAZ

KAREN TATIANA TORRES MEZA

ANGIE DANIELA ZAMBRANO ARGUELLO

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

BUCARAMANGA

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Y ANTIBACTERIANA DE

DOS MOLÉCULAS AISLADAS DE CALEA PRUNIFOLIA

LISSETH DAMARIS MONTOYA DÍAZ

KAREN TATIANA TORRES MEZA

ANGIE DANIELA ZAMBRANO ARGUELLO

Trabajo de tesis

SERGIO YEBRAIL GÓMEZ RANGEL

JUANITA TREJOS SUAREZ

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

BUCARAMANGA

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DEDICATORIA

La presente tesis está dedicada a nuestros padres, gracias por su apoyo, confianza y amor para lograr este sueño.

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AGRADECIMIENTOS

Gracias, de corazón, a nuestros profesores, Sergio Yebrail Gómez Rangel y Juanita Trejos Suarez por su paciencia, motivación y dedicación en este proyecto. Ha sido un privilegio contar con su guía y ayuda.

Gracias a la Universidad de Santander por hacernos parte de ella, brindarnos las herramientas necesarias para abrirnos las puertas hacia un mundo lleno de conocimiento, así mismo a todos los docentes que brindaron sus conocimientos y apoyos para lograrlo.

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ... 15

INTRODUCCIÓN ... 17

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 20

2. JUSTIFICACIÓN ... 25

3. OBJETIVOS ... 26

3.1. OBJETIVO GENERAL... 26

3.2. OBJETIVOS Específicos ... 26

4. ESTADO DEL ARTE ... 27

5. MARCO CONCEPTUAL ... 33

5.1. Género Calea ... 33

5.2. Citotoxicidad en modelos in vitro ... 36

5.3. Microorganismos ... 38

5.4. MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ... 45

5.5. Resistencia antimicrobiana ... 46

6. METODOLOGÍA ... 500

6.1. Diseño de estudio ... 500

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6.3. Hipótesis ... 50

6.4. Materiales ... 500

6.5. Procedimientos ... 53

6.5.4. Ensayos antibacterianos y antifúngicos. ... 55

7. RESULTADOS ... 57

7.1 Ensayos de toxicidad en células de mamífero ... 57

7.2 Ensayo de toxicidad en glóbulos rojos ... 59

7.3 Ensayos antimicrobianos... 600

8. ANÁLISIS DE RESULTADOS ... 62

9. DISCUSIÓN ... 63

10. CONCLUSIONES ... 67

11. RECOMENDACIONES ... 68

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LISTA DE TABLAS

Pág.

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LISTA DE GRÁFICAS

Pág.

Gráfica 1. Porcentaje de viabilidad vs diferentes concentraciones de la molécula 1. 56

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LISTA DE IMÁGENES

Pág.

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RESUMEN

Título: Evaluación de la actividad antifúngica y antibacteriana de dos moléculas aisladas de Calea prunifolia.

Autores: Lisseth Damaris Montoya Diaz Karen Tatiana Torres Meza

Angie Daniela Zambrano Arguello

Palabras clave: Calea prunifolia, potencial inhibitorio, compuestos, potencial toxico, hemólisis.

El estudio de moléculas aisladas de material vegetal, es de gran importancia para obtener nuevos compuestos con potencial bioactivo y corroborar información de conocimiento popular que se atribuyen a algunas plantas como propiedades farmacológicas. En el presente trabajo se evaluó la actividad inhibitoria de dos moléculas extraídas de Calea plunifloria sobre bacterias y hongos de interés clínico, y su efecto citotóxico en células de mamífero y glóbulos rojos humanos.Las moléculas mostraron mayor actividad contra Candida albicans y Candida glabrata con una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de 1.56 ug/ml. Sin embargo, al estudiar la inhibición contra bacterias solo se encontró actividad contra Streptococcus pneumoniae con CMI de 12.5 ug/ml. Además del potencial inhibitorio, se encontró bajo potencial tóxico líneas celulares epiteliales Vero con Concentraciones Citotóxicas 50% (CC50) de 228.9 ug/ml y 241.4 ug/ml para la molécula 1 y 2 respectivamente; teniendo en cuenta estos valores y la CMI reportada, se puede inferir un índice de selectividad de 146.7 y 154.7 para cada molécula. En ensayos de Glóbulos rojos humanos no se evidenció toxicidad asociada a hemólisis en ninguna de las concentraciones estudiadas.

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ABSTRACT

Title: Evaluation of the antifungal and antibacterial activity of two molecules isolated from Calea prunifolia.

Authors: Lisseth Damaris Montoya Diaz Karen Tatiana Torres Meza

Angie Daniela Zambrano Arguello

Key words: Calea prunifolia, inhibitory potential, compounds, toxic potential, hemolysis

The study of isolated molecules of plant material is of great importance to obtain new compounds with bioactive potential and corroborate popular knowledge information that is attributed to some plants as pharmacological properties. In the present work, the inhibitory activity of two molecules extracted from Calea plunifloria was evaluated on bacteria and fungi of clinical interest, and their cytotoxic effect on mammalian cells and human red blood cells.

The molecules showed higher activity against Candida albicans and Candida glabrata with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) 1.56. However, when studying the inhibition against bacteria, only activity against Streptococcus pneumoniae with CMI of 12.5 was found. In addition to the inhibitory potential, low toxic potential was found with 50% Cytotoxic Concentrations of 228.9 ug / ml and 241.4 ug / ml for molecule 1 and 2 respectively; taking into account these values and the reported MIC, a selectivity index of 146.7 and 154.7 can be inferred for each molecule. In tests of human red blood cells, no toxicity associated with hemolysis was evidenced in any of the concentrations studied.

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INTRODUCCIÓN

Las infecciones bacterianas continúan siendo un problema de gran importancia en salud pública. Escherichia coli (15,9%) es el patógeno más importante en la infección nosocomial, seguido de Staphylococcus aureus (15,9%) y Enterococcus spp (9,6%)1. En Colombia, para el primer semestre del 2018 el SIVIGILA reporta

63.687 casos de enfermedad diarreica aguda y 1.075 casos de infección respiratoria aguda grave de los cuales 100 casos son de mortalidad por EDA y 441 casos de mortalidad por IRA2.

En la actualidad se encuentran disponibles varios antimicrobianos para el tratamiento de estas infecciones. No obstante, durante los últimos años la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha manifestado la gran preocupación que ha surgido al observar la pérdida de eficacia de los antibióticos utilizados para su tratamiento3.

La resistencia a los antimicrobianos en un problema de salud pública mundial. Datos publicados por la Organización Mundial de la Salud sobre la vigilancia de la resistencia a los antibióticos indican altos niveles de resistencia en infecciones bacterianas graves tanto en países de ingresos altos como en los de ingresos bajos. Entre las bacterias con mayor resistencia se encuentran Escherichia coli, Klebsiella

1 CANTÓN, Rafael y RUIZ, Patricia. Infecciones causadas por bacterias grampositivas multirresistentes (Staphylococcus aureus y Enterococcus spp) En: Enferm Infecc Microbiol Clin. 2013. vol. 31, no. 8, p. 543–551.

2 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD. “Morbilidad por Enfermedad Diarreica Aguda”. Disponible en:

http://www.ins.gov.co/buscador-eventos/BoletinEpidemiologico/2018%20Bolet%C3%ADn%20epidemiol%C3%B3gico%20semana %2035.pdf

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pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Salmonella spp4.

Este fenómeno se ha asociado con el uso indiscriminado, irracional e incompleto de estos fármacos, y ha permitido el crecimiento de microorganismos multirresistentes, los cuales pueden causar fallo o prolongación de los tratamientos, complicaciones clínicas, e incluso podrían resultar en la muerte del paciente. Esto ratifica la necesidad manifiesta de la OMS para la búsqueda de nuevas estrategias de tratamiento de las enfermedades causadas por microorganismos resistentes3.

Como búsqueda de una solución a la resistencia antimicrobiana se ha reconocido la medicina tradicional como un gran bloque de conocimiento para la atención primaria en salud; el hecho de que un gran número de la población sigue acudiendo a ella, propone la necesidad continuar y potenciar la tendencia en la investigación de nuevos fármacos a partir de productos naturales, dado que aún los productos naturales siguen aportando nuevos principios activos. Colombia posee una gran biodiversidad entre las cuales se destaca la diversidad floral, donde un gran número de especies de plantas han sido utilizadas tradicionalmente con fines medicinales. Un ejemplo de esto es la Calea prunifolia, una planta ampliamente distribuida en Colombia, con la cual otro autores han demostrado actividad biológica como anti-inflamatorio en modelos animales5,6.Además, otras especies del género Calea spp

4 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. “Datos recientes revelan los altos niveles de resistencia a los antibióticos en todo el mundo”. Internet: https://www.who.int/mediacentre/news/releases/2018/antibiotic-resistance-found/es

5 GÓMEZ, Milton y GIL, Juan. Topical Anti-Inflammatory Activity of Calea prunifolia HBK (Asteraceae) in the TPA Model of Mouse Ear Inflammation. En: J. Braz. Chem. Soc. 2011. vol. 22, no. 12, p. 2391-2395.

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han demostrado su potencial como antimicrobiano7, acaricida8, leishmanicida9,

antifúngico y tripanicida10, entre otros. Este trabajo pretende determinar la

capacidad inhibitoria de moléculas obtenidas a partir de la planta Calea prunifolia sobre bacterias y hongos de interés clínico en humanos.

7 MENDES DO NASCIMENTO, Andrea. et al. Antimicrobial activity of extracts and some compounds from Calea platylepis. En: Fitoterapia. 2004. vol. 75, p. 514–519.

8 SARDÁ RIBEIRO, Vera. et al. Effect of Calea serrata Less. n-hexane extract on acetylcholinesterase of larvae ticks and brain Wistar rats. En: Veterinary Parasitology. 2012. vol. 189, p. 322– 326.

9 LIMA, Tamires. et al. Chromenes from leaves of Calea pinnatifida and evaluation of their leishmanicidal activity. En: Revista Brasileira de Farmacognosia. 2015. vol. 25, p. 7–10.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las infecciones microbianas constituyen una de las principales formas de enfermedad en humanos. Se estima que alrededor 90% de las enfermedades infecciosas humanas críticas son causadas por Acinecthobater baumanni, Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli, Sthapylococcus aureus, Salmonella spp y Steptococcus pneumonie11. En Colombia, anualmente se reportan al sistema de

salud una gran cantidad de casos asociados a infecciones microbianas. A cierre del año 2016 se reportaron: 429 casos de meningitis bacteriana: en donde el 35,2% fueron ocasionadas por Streptococcus pneumoniae, 120 719 registros de consultas externas y urgencias por infección respiratoria aguda, 76.915 casos de enfermedad diarreica aguda y 51.467 casos de enfermedades transmitidas por alimentos12.

Para el año 2017, la OMS comparte la lista de “Patógenos prioritarios” resistentes a los antibióticos, las denominadas “12 familias de bacterias más peligrosas para la salud humana”. La lista se divide en tres categorías teniendo en cuenta la patogenicidad en humanos y la alta resistencia ante los antibióticos usados de rutina. Sobre este criterio la OMS ha solicitado trabajos de investigación en búsqueda de nuevos antibióticos. Bajo esta clasificación las bacterias se dividen en prioridad crítica: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, familia Enterobacteriaceae; elevada: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, Salmonellae, Neisseria gonorrhoeae y media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Shigella spp13.

11 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. La OMS publica la lista de las bacterias para las que se necesitan urgentemente nuevos antibióticos [comunicado de prensa en línea] (2017-02-27). Disponible en Internet: http://www.who.int/es/news-room/detail/27-02-2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgently-needed.

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En el año 2018, los datos publicados por la misma Organización sobre la vigilancia de la resistencia a los antibióticos indican que los niveles de resistencia a algunas infecciones bacterianas graves son elevados tanto en los países de ingresos altos como en los de ingresos bajos. Entre las bacterias con mayor Resistencia se encuentran: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae, seguidas de Salmonella spp4.

Otro grupo microbiano de interés en salud pública además de las bacterias son los hongos causantes de micosis superficiales, cutáneas y subcutáneas. Las micosis han mostrado cambios epidemiológicos debido a las modificaciones en las condiciones ambientales, la distribución de los agentes etiológicos, el envejecimiento de la población, el aumento de las terapias inmunosupresoras y de enfermedades como el VIH. La forma más frecuente de infección por hongos en humano son las micosis superficiales siendo la onicomicosis la patología más prevalente en humanos14. En las últimas décadas se ha producido un crecimiento

global de infecciones fúngicas nosocomiales las cuales van en aumento en consecuencia de avances en la medicina con tratamientos más eficaces pero muy agresivos. En consecuencia el resultado de las Enfermedades Fúngicas Invasoras (EFIs) se presentan como un conjunto afecciones causantes de una morbimortalidad de gran impacto en la medicina actual. La lista de los microorganismos causantes de EFIs aumenta diariamente, sin embargo, Candida spp, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii y Aspergillus spp son los patógenos mayormente implicados. Para el género Candida el 95-97% de todas las EFI producidas por levaduras de este género están causadas por solo 5 especies: Candida albicans, C. glabrata,C. parapsilosis, C. tropicalis y C. krusei15. Estudios

epidemiológicos realizados a nivel nacional han demostrado agentes causales de

14 MEJÍA ARANGO, María. et al. Estudio etiológico y epidemiológico de las micosis cutáneas en un laboratorio de referencia – Antioquia – Colombia. En: CES Medicina. Enero-Junio, 2013. vol. 27, no. 1.

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onicomicosis hubo un predominio de levaduras (40,7 %), principalmente especies de Candida. En el 38 % se aislaron dermatofitos y en 14 % mohos no dermatofitos (31) en Cali y en otro estudio realizado en Medellín se encontró predominio del compromiso en uñas de pies, siendo en estos más frecuentes el T. rubrum (17,5 %), Candida parapsilosis (16,7 %), Fusarium spp. (13,8 %), T. mentagrophytes (11,5 %) y Scytalydium dimidiatum (Natrassia spp.) (10,1 %). Mientras que en las manos los principales agentes fueron especies de Candida, con predominio de C. albicans (23,4 %), seguidos de C. parapsilosis (20,8 %), C. tropicalis (7,5 %), C. guilliermondii (4,8%) y otras especies no determinadas de Candida (12,4 %)16.

En las últimas décadas se han logrado avances significativos para obtener sustancias químicas o biológicas con potencial antimicrobiano que sean menos tóxicas para el ambiente y el hombre. Esto ha despertado gran interés en la obtención de productos de origen natural que contribuyan al desarrollo de nuevos fármacos. En la actualidad se encuentran disponibles varios antimicrobianos para el tratamiento de estas infecciones. No obstante, durante los últimos años la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha manifestado la gran preocupación que ha surgido al observar la pérdida de eficacia de los antibióticos utilizados para su tratamiento. Este fenómeno se ha asociado con el uso indiscriminado, irracional e incompleto de estos fármacos, y ha permitido el crecimiento de microorganismos multirresistentes, los cuales pueden causar fallo o prolongación de los tratamientos, complicaciones clínicas, e incluso podrían resultar en la muerte del paciente17.

El panorama actual nos muestra como resultado medicamentos ineficaces, infecciones persistentes en el organismo, riesgo alto de propagación a otras personas, y cambios en la epidemiología de estas enfermedades. Desde hace varios años se ha descrito que los mecanismos de resistencia adquirida y

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transmisible son los más importantes y consisten fundamentalmente en la producción de enzimas bacterianas o fúngicas que inactivan los antibióticos o en la aparición de modificaciones que impiden la llegada del fármaco al punto diana o en la alteración del propio punto diana18. Esto ratifica la necesidad manifiesta de la

OMS para la búsqueda de nuevas estrategias de tratamiento de las enfermedades causadas por microorganismos resistentes19.

La OMS ha reconocido la medicina tradicional como un gran bloque de conocimiento para la atención primaria en salud y el hecho de que un gran número de la población sigue acudiendo a ella. Es necesario continuar y potenciar la tendencia en la investigación de nuevos fármacos a partir de productos naturales, dado que aun los productos naturales siguen aportando nuevos principios activos. Se estima que solo un 10% de las 250,000 plantas identificadas a escala mundial han sido examinadas para explotar su potencial médico y económico20.

El uso de compuestos naturales ha sido una tradición milenaria en la humanidad. Los seres humanos utilizan infusiones, o extracto de planta para curar molestias, como los dolores estomacales, cefaleas, gripes, entre otros. Aún en la actualidad, las plantas naturales continúan siendo el “remedio para todo” de muchas familias21.

Colombia posee una gran biodiversidad entre las cuales se destaca la diversidad floral, donde un gran número de especies de plantas han sido utilizadas tradicionalmente con fines medicinales. Un ejemplo de esto es la Calea prunifolia, de la cual se ha demostrado actividad biológica como anti-inflamatoria y antidrenergico-vasodiltador. Además, otras especies del género Calea spp han

18 DAZA PÉREZ, R. Resistencia bacteriana a antimicrobianos: su importancia en la toma de decisiones en la práctica diaria. En: Inf Ter Sist Nac Salud. 1998. vol. 22, no. 3, p. 57-67.

19 GIRALDO QUINTERO, Sara. et al. Descripción del uso tradicional de plantas medicinales en mercados populares de Bogotá, D.C. En: Nova. Mayo, 2015. vol. 13, no. 23, p. 73-80.

20 PUERTAS, Miguel, TOBON, Julián y ARANGO Victor. Kalanchoe daigremontiana Raym.-Hamet. & H. y su potencial uso como fuente de antioxidantes y colorantes naturales. En: Revista Cubana de Plantas Medicinales. 2014. vol. 19, no.1, p. 61-68.

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demostrado su potencial como antimicrobianos7, acaricidas8, leishmanicida9,

antifúngico y tripanicida10, entre otros.

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2. JUSTIFICACIÓN

La búsqueda de nuevos medicamentos es una necesidad hoy en día en el mundo. La OMS solicita que esta línea de investigación se active en todos los grupos alrededor del mundo para contrarrestar las actuales dificultades del tratamiento contra microorganismos.

Este trabajo pretende investigar si moléculas de origen natural pueden abrir la puerta hacia un nuevo modelo de tratamiento de las enfermedades infecciosas. Esta fuente de compuestos supone las siguientes ventajas: mayor accesibilidad al medicamento, bajo el supuesto que siendo una planta colombiana, esta podría ser cultivada fácilmente y estar a mayor alcance para la población en el país; la baja toxicidad, por ser compuesto natural se esperaría que por su naturaleza tengan más afinidad con modelos biológicos, y en consecuencia fueran mucho más efectivos sin el riesgo de efectos secundarios en el organismo; menor costo para los pacientes, dado que sería probable que debido a su amplia distribución fuese mucho más fácil su obtención y distribución lo que aminoraría los costos.

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3. OBJETIVOS

3.1.OBJETIVOGENERAL

● Evaluar la actividad antifúngica y antibacteriana de dos moléculas aisladas de Calea prunifolia.

3.2.OBJETIVOSESPECÍFICOS

● Determinar la citotoxicidad producida por la moléculas de Calea prunifolia en una línea celular epitelial, y en glóbulos rojos.

● Determinar la actividad antifúngica de las moléculas aisladas sobre cepas de Candida albicans y Candida glabrata.

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4. ESTADO DEL ARTE

Asteraceae es una de las familias donde se encuentran algunas de las plantas medicinales más empleadas ya que poseen propiedades antiparasitarias, antiinflamatorios, antigripales, diuréticas, antipiréticas, espasmolíticas, cicatrizantes, acciones antibióticas entre otras para el tratamiento de enfermedades. Además, posee una amplia distribución en el continente americano desde México hasta el Brasil, su diversidad puede atribuirse a sus excelentes mecanismos de dispersión y a su capacidad para adaptarse a diferentes condiciones ecológicas22.

Uno de los géneros dentro de esta familia es Calea donde se reportan aproximadamente 262 especies ampliamente distribuidas a nivel territorial creciendo en diferentes climas y zonas tropicales del continente americano23. Entre

este género se encuentran varias especies como: Calea uniflora,C. prunifolia, C. patylepis, C.peruviana,C. clematidia, C pinnatifida, C. americana, entre otras. Con grandes y variados usos por las diferentes actividades farmacológicas que poseen como: antiinflamatorias, antimicrobianas, antiulcerantes, antitripanosómicas, antiamebianas2425 26.

En Colombia este género se encuentra ampliamente distribuido gracias a los diferentes pisos térmicos en el país, lo cual es de gran alcance y fácil manejo para la realización de estudios con esta planta. En los últimos años se han demostrado

22 ARANGUREN, Anairamiz. MORILLO, Gilberto y FARIÑAS, Mario. Distribución geográfica y clave de las especies del género oritrophium (Kunth) cuatrec. (asteraceae). En: Acta Botánica Venezuelica. 2008. vol. 31, no. 1.

23 GÓMEZ BARRERA, Milton. Determinación de actividad anti-inflamatoria de sesquiterpenlactonas aisladas de Calea peruviana y Calea prunifolia. Tesis de maestría en Farmacología. Bogotá D.C.: Universidad Nacional de Colombia. 2010.

24 BORGES DEL CASTILLO, J. et al. Salvadorian compositae. II. Juanislamin and lactones from

Calea urticifolia 2,3-epoxy-juanislamin, two new sesquiterpenic. En: Journals of natural products. 1998. vol. 44, no. 3, p. 348- 350.

25 STEINBECK, Cristoph. et al. Identification of Two Chromenes from Calea serrata by Semiautomatic Structure Elucidation. En: J. Nat. Prod. 1997. vol. 60, p. 627-628.

26 OBER, Alfonso. URBATSCH, Lowell y FISCHER, Nikolaus. Guaianolides and chromenes from

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algunas de estas investigaciones con diferentes géneros de Calea entre estos Calea prunifolia las cuales han demostrado que posee propiedades

vasodilatadoras-antidrenergicas, antiinflamatorias, entre otras.

Los primeros estudios realizados con la planta se reportaron en tres especies de Calea; C. berteriuna, C. soliduginea y C. prunifolia. Encontraron compuestos

conocidos como: flavonoide acacetina, heliangolide modificado calbertolide C, un nuevo guaianolide y desacyl- & tiglylsubcordatolide A, este estudio solo estuvo limitado a la búsqueda de compuestos químicos en las plantas para posteriores trabajos con estos27.

Flach y colaboradores evaluaron la actividad antifúngica de Calea clematidea en cepas de Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Epidermophytom flocosum, Mycrosporum gypseum, Microsporum canis y Microsporum nanum, con extractos oleicos de las hojas de la planta mostrando moderada actividad antifúngica con un (MIC > 3.57 mg/mL) con el derivado del aceite el clemateol de (MIC > 1.52 mg/dL) y alcohol (MIC > 2.82 mg/dL)28. El mismo

potencial fue demostrado por Mendes y colaboradores evaluando la actividad antimicrobiana de extractos de diclorometano de hojas, flores, raíces y compuestos aislados de Calea patylepis demostrando que los extractos de diclorometano mostraron actividad antimicrobiana, los compuestos aislados como: -4α, 7b-aromadendranediol, benzofurans euparin, caleprunin B y euparone demostraron un espectro de acción más amplio que inhibe el crecimiento de diversas cepas de microorganismos tanto bacterianos como fúngicos, por otro lado el compuesto sesquiterpeno no mostró inhibición contra todos los microorganismos y el compuesto caleprunin A mostraron actividad antifúngica contra las cepas de

27 FERREIRA, Zenaide. et al. Structural clarification of germacranolides from Calea species. En: Phymchemisay. 1980. vol. 19, p. 1481-1484.

28 FLACH, Adriana. Chemical Analysis and Antifungal Activity of the Essencial Oil of Calea

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dermatofitos. La mayoría de los compuestos mostraron valores de MIC de 500 µg/mL. Durante este año, los mismos autores evaluaron la actividad tripanocida y antinfúngica de extractos de diclorometano obtenidos de Calea uniflora, estos extractos mostraron una mayor actividad tripanocida, lisando el 99% de los parásitos y solo mostró una zona de inhibición para dos dermatofitos (Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes)7.

Yamada y colaboradores utilizaron las hojas de Calea urticifolia (170 g) las cuales se extrajeron con acetona para obtener un extracto bruto (9,8 g). Demostraron que las hojas de Calea urticifolia posee diversas propiedades biológicas, tales como actividades citotóxicas, antibacterianas y antifúngicas. Se aislaron cinco heiangólidos, ocho derivados de isoeugenol y un derivado de floroglucinol de la planta. Dicha actividad citotóxica se evaluó frente a células de leucemia humana las cuales se mantuvieron con medio RPMI que contenía suero bovino fetal al 10% a 37ºC en CO2 al 5%. La citotoxicidad se evaluó mediante el método MTT lo cual dio como resultado una viabilidad en concentración del 50% además el componente 4 de Calea lactona C y 2,3-epoxijuanisulamina revelaron una actividad citotóxica más potente que la partenolida. Los compuestos 5, 6 y 7 se identificaron como Calea D y el compuesto 3 como Calealactona B. Concluyeron que estos compuestos tienen un uso potencial para el tratamiento gástrico (úlceras)29. Onzaga

y colaboradores demostraron mecanismos de acción inducidos por el extracto etanólico y la fracción flavonoide acetilada de C. prunifolia la cual disminuyo en función de la dosis (5-75 mg/kg iv) sin afectar la frecuencia cardiaca de las ratas Wistar, el extracto de la fracción flovoide relajaron los anillos de la aorta contraídos con KCl (80nM) y fenilefrina (1µM) con valores de CI 50 de 35 y 67 µg/mL, y 34 y 66 µg/mL30. Dos años más tarde con Calea zacatechichi una planta utilizada por los

29 YAMADA, Masashi. Et al. Germacranolides from Calea urticifolia. En: Phytochemistry. 2004. vol. 65, p. 3107–3111.

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indígenas Chontales del estado mexicano de Oaxaca para la oniromancia. Wu y colaboradores tomaron las partes secas y en polvo de C. zacatechichi (1,4 kg) a temperatura ambiente con metanol por percolación con el fin de aislar varias lactonas sesquiterpénicas conocidas de esta especie las cuales fueron: Calaxin y ciliarin, los germacranólidos, 1β-acetoxyzacatechinolide, l-oxozacatechinolide, caleocromos A y B y las caleicinas I y II. Los compuestos se identificaron por sus estructuras químicas y la literatura. Los compuestos 2-6 eran lactonas sesquiterpénicas conocidas y se determinaron sus fórmulas moleculares por HRESIMS el compuesto 1, denominado calealactona D, que se obtuvo en forma de cristales incoloros y el compuesto 2 (calealactona C) demostraba citotoxicidad contra las células U937 de la leucemia humana (IC50 1.0 μM). Además, mostró una actividad antibacteriana débil contra Mycobacterium (IC50 44,0 μM), mientras que los compuestos 1-6 no mostraron actividad antifúngica y antibacteriana. Finalmente, se dedujo que la hierba se emplea contra desórdenes gastrointestinales31.

Seguido Gómez y colaboradores estudiaron la actividad anti-inflamatoria de metabolitos secundarios de Calea prunifolia y C.peruviana a partir de un extracto etanólico de sus hojas, las serquiterpenlactonas presentes en estos extractos donde el compuesto 1 (3.3 mg) arroja un 58% de inhibición similar a la indometacina, lo cual lo propone como un nuevo modelo biológico de investigación con capacidad anti-inflamatoria32. Puebla y colaboradores realizaron estudios, evaluando el efecto

de compuestos en Calea prunifolia, para desempeñar un papel como anti-adrenérgico. Como resultado se obtuvo gran desempeño anti-adrenérgico por parte del compuesto glucósido diterpenoide de la planta6. En este año se evaluó la

actividad antiinflamatoria tópica de la planta donde 2 moléculas derivados de p-hidroxiacetofenona mostraron modulación de las enzimas COX y LOX implicadas en la síntesis de prostaglandinas, dando como resultado el evento inflamatorio

31 WU, Hankui. Et al. Antileishmanial Germacranolides from Calea zacatechichi. En: Planta Med. 2011. vol. 77, p. 749–753.

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disminuido. Los autores concluyeron, que los compuestos aislados de Calea prunifolia modificados sintéticamente podrían mejorar la actividad anti-inflamatoria

con el objetivo de lograr un compuesto activo y seguro. Seguido de Gómez, González y colaboradores registraron actividad antiinflamatoria de Calea prunifolia y C. americana los fracciones terpenicas de los extractos de estas plantas mostraron una actividad antinflamatoria significativa en un edema auricular inducido por TPA (acetato de tetradecanoilforbol) 33. Al año siguiente se demostró el potencial

acaricida contra larvas de Rhipicephalusortiz microplus y R.sangineus de extractos n-hexano de Calea serrata, mostrándose una inhibición significativa a una concentración de 3 y 6 mg/mL del compuesto con una reducción de la actividad acetilcolinesterasa (AChE) en áreas homogenizadas del cerebro de ratas Wistar y actividad acaricida del 80 al 100% en larvas Rhipicephalus con concentraciones de 3,12 y 6.25 mg/mL, finalmente los investigadores proponen el enfoque de este compuesto en enfermedades como Alzheimer, Parkinson, Miasteria gravis y acaricidas. Hallazgos como los de Marchetti y colaboradores reportaron actividad anticáncer con extractos de diclorometano crudo (DCE) obtenidos de Calea pinnatifida, donde la actividad anticáncer fue determinada por la reducción relativa de peso y volumen del tumor en las ratas, con concentraciones de 100 mg/kg de DCE el cual fue administrado de forma intra peritoneal como tratamiento cada 48 horas inhibiendo el 66.7% el peso relativo del tumor 32. Avella y colaboradores evaluaron el efecto cardiovascular en ratas y demostraron que la fracción butanólica de las hojas de Calea prunifolia produce efectos vaso relajantes en el músculo liso de la rata y efectos hipotensores en ratas anestesiadas33. Para el año 2015, Lima y

colaboradores se evaluaron la actividad leishmanicida, analizaron una fracción de hojas de C. pinnatifida con el fin de determinar sus componentes químicos y evaluar si estos poseían actividad leishmanicida, lo que resultó en el aislamiento y la caracterización de cuatro cromenos conocidos:

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32

dimetilcromeno (1), 6-acetilmetoxi -2,2-dimetilcromeno (2), 6- (1-hidroxietil) -7-metoxi-2,2-dimetilcromeno (3) y 6- (1-etoxietil) -7--7-metoxi-2,2-dimetilcromeno, demostrando que los compuestos 2 y 3 presentaban actividad leishmanicida moderada9.

Un año más tarde Salaga y colaboradores evaluaron los efectos neurofarmacológicos y efectos antinociceptivos del extracto acuoso de la planta mexicana Calea zacatechichi y sugirieron que dicho extracto tiene efectos neurofarmacológicos insignificantes in vivo y reduce la percepción del dolor abdominal, observaron que el extracto acuosos de la planta no afectó las funciones neurológicas básicas o la ansiedad y el comportamiento exploratorio en ratones después de la administración oral y efecto antinociceptivo significativo en el modelo de dolor abdominal34. Recientemente Rivera y colaboradores, analizaron infusiones

de Calea ternifolia, las cuales demostraron controlar los niveles de glucosa desempeñando actividad anti hiperglutamica efectiva35. En este mismo año Salvan

da Rosa y colaboradores, evaluaron los efectos antiinflamatorios de extractos y compuestos obtenidos a partir de C. uniflora, demostrando que esta planta posee importantes efectos antiinflamatorios, incluyendo la inhibición de la migración de leucocitos y la reducción del grado de exudación. Además sugirieron que estos compuestos tienen el potencial de convertirse en nuevos compuestos para el desarrollo futuro de fármacos antiinflamatorios36.

34 SALAGA, Maciej. et al. Neuropharmacological characterization of the oneirogenic Mexican plant

Calea zacatechichi aqueous extract in mice. En: Metab Brain Dis. Junio, 2016. vol. 31, no.3, p. 631-41.

35 ESCANDÓN RIVERA, Sonia. et al. Anti-Hyperglycemic Activity of Major Compounds from Calea

ternifolia. En: Molecules. 2017. vol. 22, no. 289.

(33)

33

5. MARCO CONCEPTUAL

5.1.GÉNERO CALEA

Calea es un género botánico perteneciente a la familia de las asteráceas, la cual

comprende alrededor de 291 especies descritas. Son plantas ampliamente distribuidas en el mundo, crecen en diferentes pisos climáticos y varias zonas tropicales, desde México hasta Brasil, hace tiempo estos países han considerado estas plantas como promisorias y de amplio uso debido al gran potencial bioactivo donde se les atribuyen como: antiinflamatorias, antimicrobianas entre otras37.

5.1.1. Calea prunifolia.

5.1.1.1. Descripción. Calea, deriva del griego “calos”, bello, posiblemente alude a

los capítulos florales; prunifolia, del nombre Prunus (género de Rosáceas) y folium, -ii n. = hoja; por la similitud de sus hojas con las de algunas especies de este género de plantas38.

Es un arbusto de 1.5 a 3.5 metros de altura en promedio, pero puede llegar hasta los 5 metros con ramas y láminas ásperas. Sus hojas simples, opuestas, decusadas, margen dentado, envés con pubescencia blanquecina y nerviación prominente,

37 ROBS y GREEMN. “5.3.Calea prunifolia lamina XXII”. Internet: http://bibdigital.rjb.csic.es/Imagenes/Ff(8)MUT_Fl_Exp_Bot_N_Gra_48/MUT_Fl_Exp_Bot_N_Gra_4 8_070.pdf

38 HIGUITA, David. et al. Calea prunifolia Kunth. “Guía Ilustrada Flora Cañón del río Porce, Antioquia.

EPM”. Internet:

https://www.epm.com.co/site/Portals/Descargas/2015/rio_porce/Guia_Ilustrada_canon_de_rio_Porc e_Antioquia_Flora.pdf

Imagen 1, HIGUITA David et al. Calea prunifolia Kunth. [Fotografía] Guía Ilustrada Flora Cañón del río Porce, Antioquia. EPM E.S.P. Universidad de Antioquia, Herbario Universidad de Antioquia - Medellín, Colombia. 264 p. 2014.

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34

sésiles o con pecíolos cortos. Sus flores dispuestas en conjunto naciendo agrupadas de un mismo tallo, con colores que van desde amarillo pálido hasta anaranjado39

Imagen 1, Flores de la planta Calea prunifolia Tomado de:

http://www.biovirtual.unal.edu.co/es/colecciones/result/species/Calea%20prunifolia

/plants/.

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35

Imagen 2. Calea prunifolia (Ocaña norte de Santander)

5.1.1.2. Distribución geográfica. Nativa de América tropical, se distribuye desde Costa Rica hasta Ecuador. En Colombia, se distribuyen en bosques húmedos entre 0 y 1500 metros de altitud, según las colecciones de los herbarios de la Universidad Nacional de Colombia con Calea prunifolia se registra una amplia distribución en departamentos como: Caldas, Cundinamarca (Cerro de la Conejera), Chocó, Santander (Cañón de Chicamocha), Valle del cauca, Norte de Santander, Tolima, Huila, Antioquia, Nariño (región biogeográfica del páramo), Cauca y Archipiélago de San Andrés, Providencia y Santa Catalina utilizandose en medicina popular para el tratamiento de la hipertensión arterial, la fiebre alta y la malaria40.

40 CASTRO DIAZ, Sandra Liliana. Evaluación de la actividad citotóxica de extractos y fracciones de

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36

5.2.CITOTOXICIDAD EN MODELOS IN VITRO

La toxicidad celular se explica como una alteración de las funciones celulares básicas la cual lleva a un daño que puede ser detectado. Diferentes autores han desarrollado diferentes pruebas in vitro para determinar efectos tóxicos producido por compuestos y fármacos empleando modelos experimentales como cultivos primarios y órganos aislados como líneas celulares establecidas41.

Los ensayos más conocidos y validados son, la reducción del MTT el ensayo de captación del rojo neutro, el enlazamiento al azul de kenacid, ensayo de viabilidad con azul de tripano y ensayos de citotoxicidad en glóbulos rojos.

5.2.1. Ensayo de MTT. Uno de los métodos más empleados en pruebas de citotoxicidad in vitro con la ventaja que es un método efectivo y cuantitativo a diferencia de otros métodos colorimétricos que son cualitativos, y el cual se utilizó en este trabajo. Este ensayo mide la función metabólica de las células presentes en un cultivo tras la exposición a un compuesto. Es método colorimétrico el cual mide la formación de un compuesto coloreado proporcional a la reacción mitocondrial de las células viables El Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) es un colorante amarillo pálido, captado y reducido por las células viables a formazán mediante la enzima succínico deshidrogenasa mitocondrial42. Finalmente,

la reducción de formazán por las células es cuantificada por espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm.

41 ESCOBAR, Linamaría. RIVERA, Augusto y ARISTIZÁBAL, Fabio. Estudio comparativo de los métodos de resazurina y MTT en estudios de citotoxicidad en líneas celulares tumorales humanas. En: Revista de la facultad de química farmacéutica. 2010. vol. 17, no. 1, p. 2145-2660

(37)

37

5.2.2. Ensayo de captación del rojo neutro. Este método evalúa la toxicidad generada por un compuesto a corto o largo tiempo dada por la liberación de rojo neutro en consecuencia a la pérdida celular.

Este ensayo se emplea para medir células vivas por captación del colorante rojo neutro (Básico rojo 5, Toluene red), Las células viables captan el colorante mediante transporte activo y lo integran al lisosoma mientras que las células no viables no lo hacen. Seguido el colorante es incorporado, las células son lavadas y fijadas. El colorante incorporado es liberado de las células utilizando una solución etanólica ácida. La liberación del colorante al medio indica la pérdida de la viabilidad por acción del compuesto que se evalúa ya que solo las células viables son capaces de retenerlo en su interior43.La cantidad de rojo neutro incorporado por la célula a

través de endocitosis es proporcional a la viabilidad celular y cuantificada mediante absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.

5.2.3. Ensayo de enlazamiento al azul de kenacid. A través del enlazamiento al azul de kenacid, otra técnica empleada para la determinación de citotoxicidad, se exponen las células al colorante el cual es retenido por estas y se enlaza a proteínas44. Este ensayo mide el contenido de proteínas totales mediante

proliferación celular, por lo tanto, al afectar el crecimiento celular, se reduce el número de células en el cultivo y la concentración de proteínas presentes constituye un índice de toxicidad44. Por último, se determina la cantidad de azul de kenacid

retenido por las células mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 570 nm y se cuantifica el porcentaje de inhibición del crecimiento celular.

43ACEVEDO FERNÁNDEZ, Juan José. Modelos in vitro para la evaluación y caracterización de

péptidos bioactivos. Disponible en Internet:

(http://www.omniascience.com/monographs/index.php/monograficos/article/download/38/6)

(38)

38

5.2.4. Ensayo de viabilidad con azul de tripano. Este evalúa la viabilidad de células por exclusión de captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células vivas con membranas íntegras. Es considerado como un método de exclusión de células no viables, ya que al estar afectada la permeabilidad de la membrana celular hay tinción de la célula. Esto permite contar células excluyentes del colorante (viables) como también células teñidas (no viables). El recuento puede ser realizado manualmente observándose bajo el microscopio haciendo uso de un hemocitómetro de Neubauer. Es un método económico que requiere sólo una pequeña fracción de células y es utilizado generalmente para determinar la concentración de células (número células/ml) en cultivos44. Además no es necesario para realizar conteos

simples de células, sin embargo, es imprescindible para diferenciar entre las células muertas de las vivas con membranas íntegras.

5.2.5. Ensayo de hemólisis en glóbulos rojos. Es una prueba que consiste en exponer el glóbulo rojo a diferentes concentraciones de unas moléculas que potencialmente puede alterar la membrana del glóbulo rojo, provocando la presencia o ausencia de hemólisis, por consiguiente, si dicha alteración ocurre habría lisis y se observará con coloración en el sobrenadante del ensayo.

Una de las ventajas del uso de este ensayo es que indicará que tan dañinas podrían ser las moléculas en caso de estar en contacto con las células de la sangre. Esta actividad se evaluó midiendo la cantidad de hemoglobina del sobrenadante usando un espectrofotómetro a una longitud de onda l=500 nm.

5.3.MICROORGANISMOS

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39

esporulados, reducen los nitratos (algunos), anaerobios y son oxidasa negativa. Habitan principalmente en el tubo digestivo, aunque también se pueden encontrar en diversos ambientes como el agua, suelo, las plantas y en la microbiota intestinal normal de muchos animales incluyendo el hombre. Tienen la capacidad de colonizar además del tubo digestivo, la orofaringe, el aparato genitourinario y la piel45.

5.3.1.1. Patógenos específicos.

- Escherichia coli. Es un bacilo Gram negativo que habita normalmente en el intestino de animales incluyendo el hombre. Se caracteriza bioquímicamente por ser indol positivo, fermentador de lactosa y manitol, lisina descarboxilasa y producir gas a partir de glucosa. Se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como productos de carne picada cruda o poco cocida, leche cruda, y hortalizas y semillas germinadas crudas contaminadas46.

Las cepas de E. coli causantes de diarrea se ha clasificado en seis patotipos: E. coli enteropatógena (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), con adherencia difusa (DAEC) y enteroagregativa (EAEC). Escherichia coli enterotoxigénica es la causa más común de deshidratación por diarrea en niños de menos de dos años y es la principal causa de la diarrea del viajero, son cepas productoras de toxinas causantes de diarreas secretoras. Escherichia coli enteropatógeno es una causa importante de diarrea en neonatos en países subdesarrollados, se caracteriza por producir diarrea exudativa debido a que provoca una lesión en la mucosa intestinal. Escherichia coli enteroinvasora producen un cuadro disentérico ya que tiene la capacidad de invadir y destruir el epitelio intestinal, es de gran importancia en niños de seis meses de edad. Escherichia coli enterohemorrágica se encuentra asociada con brotes causados por

45 PUERTA GARCÍA, A. y MATEOS RODRÍGUEZ, F. Enterobacterias. En: Medicine. 2010. vol. 10, no.51, p. 3426-31.

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40

alimentos en países desarrollados, causa diarrea con sangre, colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico y púrpura trombocitopénica47,48.

Es el microorganismo de mayor interés clínico debido a que se encuentra asociado a una gran variedad de enfermedades como gastroenteritis, diarrea del viajero, colitis hemorrágica y síndrome hemolítico urémico (SHU). Es el patógeno causante con mayor frecuencia de infecciones de vías urinarias. Los síntomas y signos consisten en polaquiuria, disuria, hematuria y piuria. La infección del sistema urinario puede ocasionar bacteriemia con signos clínicos de septicemia46.

- Género Klebsiella. Las especies que se aíslan con mayor frecuencia son K. pneumoniae y Klebsiella oxytoca. Son bacilos encapsulados no móviles que habitan normalmente en el suelo y agua. Se pueden encontrar en las superficies mucosas de mamíferos y en los seres humanos es capaz de colonizar la nasofaringe y el tracto gastrointestinal49.

Se asocia principalmente a neumonías adquiridas en la comunidad y nosocomiales, también puede producir infecciones de heridas, de partes blandas y del aparato urinario. Las neumonías por las distintas especies de Klebsiella se caracterizan por causar destrucción necrótica de los espacios alveolares, la formación de cavidades y la producción de esputos hemoptísicos50.

47MOLINA LÓPEZ, José. Escherichia coli diarrogénica”. Internet: (http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/escherichia-coli.html).

48 FARFÁN GARCÍA, Ana Elvira. et al. Mecanismos de virulencia de Escherichia coli enteropatógena. En: Rev Chilena Infectol. 2016. vol. 33, no. 4, p. 438-450

49 LÓPEZ VARGAS, Jaime Alberto y ECHEVERRI TORO, Lina María. K. pneumoniae: ¿la nueva “superbacteria”? Patogenicidad, epidemiología y mecanismos de resistencia. En: IATREIA. Junio, 2010. vol. 23, no. 2.

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41

- Género Salmonella. Son bacterias Gram negativas móviles no esporuladas y anaerobias facultativas. Se caracterizan por fermentar glucosa y manosa, producir H2S y no ser fermentador de lactosa ni sacarosa. Se encuentra ampliamente

distribuido en el medio ambiente puede colonizar a casi todos los animales, incluyendo aves, reptiles, ganado, roedores, animales domésticos, aves y el ser humano51.

En el hombre se encuentra principalmente asociado a enfermedades como fiebres tifoideas y gastroenteritis, aunque también puede producir bacteremias y septicemias. La fiebre tifoidea es una enfermedad sistémica que se caracteriza por la aparición de fiebre progresiva asociada a diarrea o estreñimiento. La gastroenteritis es la forma clínica más frecuente de Salmonelosis, se produce por la ingestión de alimentos o aguas contaminadas son sintomatología de náuseas, vómitos, fiebre y diarreas no sanguinolentas52.

5.3.2. Género Acinetobacter. Son cocobacilos Gram negativos que se caracterizan por ser aerobios estrictos, catalasa positiva y oxidasa negativa. La mayoría de las especies se encuentran en el ambiente e incluso hacen parte de la microbiota normal de la piel humana. Acinetobacter baumanii es la especie más representativa de este género siendo el más frecuente en infecciones intrahospitalarias como neumonías, sepsis y meningitis; también se encuentra asociado a infecciones de piel y tejidos blandos, infecciones de heridas e infecciones del tracto urinario53. La

característica más importante de este microorganismo radica en la capacidad de adquirir resistencia a múltiples antimicrobianos y por ende producir tasas elevadas

51 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. “Salmonella (no tifoidea)”. Internet: http://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/salmonella-(non-typhoidal)

52 JURADO JIMÉNEZ, R. et al. Fiebre tifoidea y otras infecciones por salmonellas. En: Medicine. 2010. vol.10, no. 52, p. 3497-501.

(42)

42

de mortalidad (26-68%)54. Los mecanismos de resistencia que posee son los

siguientes: betalactamasas de espectro extendido (BLEE), metalo-beta-lactamasas, alteraciones de las proteínas ligadoras de penicilina, disminución de la permeabilidad de la membrana externa, mutación de los sitios blanco e inactivación de los sitios por enzimas modificantes55.

5.3.3. Género Staphylococcus. Los estafilococos son cocos Gram positivos que se caracterizan por presentarse en agrupaciones que asemejan racimos de uva, producen catalasa, fermentan lentamente muchos carbohidratos y producen ácido láctico. Las especies de mayor relevancia clínica son S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus50.

5.3.3.1. Staphylococcus aureus. Es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo, se caracteriza por ser coagulasa positiva. La colonización más frecuente por S. aureus es la mucosa nasal, el hombre puede ser portador. Se asocia principalmente con pacientes con hemodiálisis, diabéticos, pacientes con lesiones cutáneas, sujetos infectados con VIH y adictos a las drogas56. Es el agente etiológico de

diversas patologías como infecciones cutáneas, intoxicación alimentaria, síndrome de la piel escaldada, síndrome del shock tóxico, artritis séptica, bacteriemia, empiema, endocarditis, osteomielitis y neumonía55.

5.3.3.2. Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus epidermidis pertenece al grupo de estafilococos coagulasa negativos, Hace parte de la microbiota normal de piel llegando a producir infecciones en esta y anexos. Está asociado con cuadros clínicos como bacteriemia, endocarditis, heridas quirúrgicas, infecciones del tracto

54 HERNÁNDEZ TORRES, A. Acinetobacter baumanii multirresistente: situación clínica actual y nuevas perspectivas. Rev Esp Quimioter 2010; 23(1):12-19

55 DÍAZ JIMÉNEZ, Virginia. Acinetobacter baumannii: actualidades. Revista de Enfermedades Infecciosas en Pediatría Vol. XXIII Núm. 92.

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43

urinario, infecciones oportunistas de los catéteres, anastomosis, prótesis y dispositivos de diálisis peritoneal46.

5.3.4. Streptococcus pneumoniae. S. pneumoniae también conocido como neumococo es un coco Gram positivo encapsulado en forma de lanceta, se caracteriza por producir alfa hemolisis en agar sangre y presentar sensibilidad a la optoquina. Es un patógeno humano que coloniza la bucofaringe, y puede llegar a diseminarse a pulmones, senos paranasales y oído medio. Se encuentra asociado frecuentemente a enfermedades como neumonía, meningitis, endocarditis, otitis media y sinusitis46.

5.3.5. Género Candida. Este género se encuentra constituido por levaduras de desarrollo unicelular agrupando a más de 150 especies. Estos microorganismos son parte de la flora normal en el hombre ya que se encuentran ubicadas en piel, mucosas y aparato gastrointestinal57.

Las especies de Candida crecen generalmente en medios aerobios con pH entre 2.5 a 7.5 y una temperatura entre 25 a 37°C creciendo como levaduras ovales en gemación con un tamaño entre 3 a 10 µm, forman pseudohifas cuando estas continúan creciendo, no se desprende generando células alargadas constreñidas con tabiques. Los agentes causales más comúnmente involucrados en micosis sistémicas en el hombre son: C. albicans,C. glabatra, C. parasilopsis C. dubliniensis C. tropicalis y Candida guillermondii58.

5.3.5.1. Candida albicans. C. albicans es la especie más patógena dentro del género Candida, es el principal agente etiológico aislado en infecciones fúngicas

57 Washington C. et al. Koneman Diagnóstico microbiológico: Texto y Atlas en color. 6ª Ed. Estados Unidos.Panamericana 2012,482 p.

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44

humanas, y relacionada con mayor frecuencia en infecciones a nivel de mucosas: cavidad oral y genitourinaria59.

Entre las características de C. albicans es un hongo dimórfico, se desarrollándose de forma distinta según la temperatura de crecimiento, como levadura, normalmente a 37ºC en el huésped, y como hongo de aspecto filamentoso, a 25ºC en la naturaleza60.

Pertenece al filo Ascomycota y su reproducción es asexual por gemación. En su forma de levaduriforme presenta un aspecto de células ovaladas o redondeadas, de 3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en pequeños grupos, mientras que, en forma de hongo filamentoso, las células se alargan y tomando la apariencia de filamentos, pseudohifas o pseudomicelio. El dimorfismo le permite evadir los mecanismos de defensa relacionados con la inmunidad celular del huésped. Macroscópicamente, en agar Sabouraud crece formando colonias blancas, blandas, cremosas y lisas60

5.3.5.2. Candida glabatra. Candida glabrata, se consideraba un organismo fúngico comensal relativamente no patógeno de los tejidos de la mucosa humana. Inicialmente fue clasificada como Cryptococcus glabratus (1917) y posteriormente reclasificada como Torulopsis glabrata (1938). Se aísla con mayor frecuencia como agente de candidiasis vaginal, o en micosis graves en pacientes inmunodeprimidos61.

En las mujeres afectadas de vaginitis, C. glabrata corresponde a la especie más predominante después de C. albicans (Instituto municipal de investigación médica).

59 ARENAS Guzmán, Roberto. Micología Médica Ilustrada. Universidad Nacional Autónoma de México.

60 QUINDOS, Guillermo. Micología Clínica. 2 Ed. Madrid.Elsevier.2015, Capítulo 6.

61 TORRES RODRÍGUEZ, Josep. MORERA, Yolanda y LÓPEZ, Olga. Candida glabrata: UN

PATÓGENO EMERGENTE.

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45

Además, se asocia a falla terapéutica por su mayor resistencia a fluconazol, y que posee factores de virulencia, por lo que debe ser estudiada hasta precisarse su especie en el laboratorio. En el agar dextrosa Sabouraud, C. glabrata forma colonias brillantes, de color crema, que son relativamente indistinguibles de las de otras especies de Cándida, excepto por su tamaño relativo, que es bastante pequeño.

5.4.MÉTODOSDEEVALUACIÓNDELAACTIVIDADANTIMICROBIANA

5.4.1. Método de dilución. Es el método/técnica que se usa habitualmente para determinar cuantitativamente la actividad in vitro de los antimicrobianos. Se basa en la determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar). Consiste en preparar diluciones del antimicrobiano utilizando un medio de cultivo ya sea liquido o sólido, se inocula el microrganismo en estudio y posteriormente se incuba. Transcurrido el tiempo de incubación se realiza la lectura determinando que concentración logra la inhibición del microrganismo. La ventaja de las pruebas de microdilución en caldo es que permiten obtener un resultado cuantitativo, indicando la cantidad necesaria de determinado fármaco para inhibir al microorganismo investigado62.

5.4.2. Método de difusión. El método más empleado es el ensayo de difusión en disco. Consiste en colocar un disco de papel impregnado de un antimicrobiano en la superficie de un medio en donde está sembrado el microorganismo en estudio, posterior a la incubación se mide el halo de inhibición que rodea el disco. El halo de inhibición se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución. Para obtener la CMI se

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46

debe medir el halo y extrapolarlo en una línea de regresión que expresa la relación entre el logaritmo de la concentración mínima inhibidora en las pruebas de dilución y el diámetro de las zonas de inhibición en las pruebas de difusión62.

5.5.RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

La resistencia a antimicrobianos es definida por la OMS como “fenómeno por el cual un microorganismo deja de ser afectado por un antimicrobiano al que anteriormente era sensible” (OMS). Como resultado los microorganismos, sean bacterias, virus, hongos o parásitos, sufren cambios que hacen que los medicamentos utilizados para tratar las infecciones dejen de ser eficaces63.

5.5.1. Tipos de resistencia.

5.5.1.1. Resistencia natural o intrínseca. La resistencia natural o intrínseca es propia de cada familia, especie o grupo bacteriano y un mecanismo determinado de manera genética y sin correlación a la dosis del antibiótico64.

5.5.1.2. Resistencia adquirida. La resistencia adquirida es una característica propia de una especie bacteriana, que por naturaleza es sensible a un antibiótico pero debido a alguna modificacion genéticamente ya sea por mutación o por adquisición de genes de resistencia otorgados por plásmidos, transposones e integrones. La resistencia bacteriana a los antimicrobianos es amplia de este modo se habla de resistencia en tres niveles: mecanismos resistencia individuales,

63 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. “Resistencia a los antimicrobianos”. Internet: http://www.who.int/topics/antimicrobial_resistance/es/

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47

resistencia poblacional y resistencia poblacional en microorganismos que están produciendo una infección65.

5.5.1.3. Resistencia individual. En la resistencia individual hay una interacción molecular entre una célula bacteriana con toda su maquinaria genética y metabólica y un antibiótico determinado. En este tipo de resistencia se encuentran distintas herramientas con las que cuenta una bacteria para evitar la acción del antibiótico, refiriéndose a maquinaria genética como los genes. Estos codifican enzimas capaces de romper distintos antibióticos y se encuentra naturalmente codificado en el cromosoma del microorganismo66.

5.5.1.4. Resistencia poblacional. Este tipo de resistencia representa el comportamiento in vitro de una población bacteriana enfrentada a una concentración determinada de un antibiótico, por un período de tiempo determinado.

Resistencia poblacional en microorganismos que están produciendo una infección

En esta resistencia se habla de la eficacia terapéutica y juegan otros factores, como el sitio de infección, las propiedades farmacocinéticas del antibiótico donde se encuentran incluidas la dosis, el estado inmunológico del paciente, el tamaño del inóculo bacteriano66.

5.5.2. Mecanismos de resistencia. La gran mayoría de los mecanismos de resistencia pueden agruparse en 3 categorías64:

1. Inactivación del antibiótico por modificación o hidrólisis

65 AYALA, Franco y SARMIENTO, Luis. Enfermedades infecciosas en ginecología y obstetricia. 1ª ed. Bogotá. 2018.

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48

2. Presencia de bombas de eflujo o disminución de la concentración intracelular del antibiótico por disminución de la entrada de las moléculas del antibiótico.

3. Modificación del sitio blanco de acción.

5.5.2.1. Inactivación del antibiótico. Este tipo de resistencia puede darse por mecanismos como: Inactivación por hidrolisis e inactivación de transferencia por un grupo químico64.

5.5.2.2 Inactivación por hidrólisis. Es el tipo de mecanismo más común de resistencia adquirida y es determinado por la producción de enzimas que hidrolizan el antibiótico. Uno de los ejemplos más representativos son las betalactamasas: penicilinasa, cefalosportinas, AmpC, Betalactamasas de espectro extendido BLEE, Klebsiella pneumoniae carbapenemasas KPC, New metallobetalactamase NDC estas enzimas inactivan el antibiótico hidrolizando el anillo betalactamico64.

5.5.2.3 Inactivación de transferencia por un grupo químico. En este mecanismo se da una inactivación por impedimento estérico que causan modificaciones químicas del antibiótico e impiden su llegada al sitio blanco.

5.5.2.4. Disminución de la concentración a nivel celular

Permeabilidad reducida: En este tipo de mecanismo la bacteria es capaz de reducir el número de canales por donde ingresa el antibiótico, dadas por porinas OmpF y OmpC y resistencias a los carbapenémicos.

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49

componentes en la membrana interna, periplásmica, externa. Estas proteínas forman canales que exportan activamente a un agente antimicrobiano fuera de la célula tan rápido como entra, confiriendo resistencia a antimicrobianos como: cloranfenicol, betalactámicos, tetraciclinas y quinolonas67

5.5.2.5. Modificación de los blancos. La modificación o alteración del sitio de unión del antimicrobiano se traduce en una pérdida de la afinidad y por ende le impide ejercer su acción. La modificación de un aminoácido genera un blanco diferente y así disminuye la afinidad de unión por el antimicrobiano.

5.2.5.6 Modificación en el blanco molecular por mutaciones: Se reportan diferentes mecanismos entre los cuales diferentes bacterias poseen copias de genes que actúan sobre el antibiótico. Es el caso de Modificación de PBP ( penicilin - binding - protein): es un complejo enzimático que permite la síntesis del peptidoglicano, compuesto de pared celular de bacterias principalmente grampositivas. Si se produce la mutación del sitio de unión al antimicrobiano como los betalactámicos, estos no pueden actuar y se genera resistencia al antimicrobiano.

5.2.5.7 Modificación y protección del blanco molecular. En este mecanismo existe una modificación ribosoma en donde genes como: ermA y ermB modifican el sitio activo del ribosoma mediante metilación, mecanismo importante en la resistencia a macrólido, lincosamidas, y estreptograminas (MLS) por metilación de la subunidad 23s ribosomal.

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50

6. METODOLOGÍA

6.1.DISEÑO DE ESTUDIO

Se realizó un estudio de tipo descriptivo en donde se evaluó la efectividad de dos moléculas aisladas de Calea prunifolia como agentes antifúngicos y antibacterianos en cepas de referencia. El proyecto se llevó a cabo en la Universidad de Santander UDES sede Bucaramanga, en laboratorios de investigación biomédicas y biotecnológicos LIBB

6.2.MUESTRA

Se seleccionaron microorganismos de interés clínico como: Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Streptococcus pneumoniae, Candida albicans, y Candida glabrata. La cantidad de cepas incluidas correspondió a la disponibilidad presupuestal del proyecto. Así mismo, se incluyeron cepas de importancia clínica.

6.3.HIPÓTESIS

Los resultados obtenidos mostrarán que al menos una de las dos moléculas tendrá potencial inhibitorio contra bacterias u hongos usados en este estudio.

6.4.MATERIALES

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para todas las separaciones junto con cromatografía de capa fina. Las moléculas fueron aisladas y liofilizadas y enviados a la Universidad de Santander UDES para su uso en pruebas antimicrobianas (Particularidades fisicoquímicas de las moléculas no están disponibles aun debido a que se encuentran otros estudios en proceso y de nombre confidencial).

6.4.2. Preparación de las moléculas. Las moléculas fueron recibidas en liofilizados con masas reportadas de 98.7 mg para la molécula 1 y 25 mg para la molécula 2 las mismas fueron resuspendidas en DMSO para lograr una homogenización plena de cada liofilizado. Las moléculas se diluyeron en medio DMEM a concentración final de 4935 µg/ml para la molécula 1 y 12500 µg/ml para la molécula 2. Esta dilución garantizo una concentración final de DMSO fuera inferior al 5%.

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Tabla 1. Microorganismos utilizados para los ensayos antimicrobianos

Nombre del Microorganismo Referencia de la cepa

Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC BAA 2340 Kebsiella pneumoniae ATCC 1705 Kebsiella pneumoniae ATCC 2146 Salmonella entérica subsp.

Entérica serovar enteritidis

ATCC 31194 Acinetobacter baumannii ATCC 19606 Candida albicans ATCC 22972 Candida grabata ATCC 90030 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

6.4.4 Solución de Rezasurin. El rezasurin es un indicador de óxido-reducción utilizado para evaluar el crecimiento celular que varía de azul a rosa cuando se reduce a resolufin por acción de las oxido reductasa dentro de las células viables. La solución de rezasurin se preparó agregando 1,5 mg por 100 mL de agua destilada estéril y se mezcló en un vortex la solución.

6.4.5. Células de mamífero. Se usaron líneas epiteliales Vero (Riñón de mono verde africano) cultivadas en el laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicos LIBB, en condiciones estándar mantenidas en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal incubadas a 37°C en la atmósfera con 5 % de CO2. Estas células fueron utilizadas para realizar los ensayos de

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