Determinación de la solubilidad de oxígeno en la emulsión de perfluoro-octilbromuro (PFOB) por medio del método enzimático de glucosa.
Aura Paola Boada Melgarejo
Proyecto de grado, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
Óscar Álvarez
Asesor, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C.
Tabla de contenido
RESUMEN
... 3
1.
INTRODUCCIÓN
... 4
2.
OBJETIVOS
... 5
2.1 Objetivo general: ... 5
2.2 Objetivos específicos: ... 6
3.
MATERIALES Y MÉTODOS.
... 6
3.1 Preparación de la emulsión y su caracterización ... 7
3.2 Primera etapa: Oximetría.... 7
3.3 Segunda etapa: Método enzimático. ... 7
4
RESULTADOS Y ANÁLISIS
... 9
4.1 Caracterización de la emulsión. ... 9
4.2 Primera etapa: Oximetría....10
4.3 Segunda etapa: Método enzimático. ...13
5
CONCLUSIONES
... 15
6
TRABAJO A FUTURO
... 15
RESUMEN
Los hemosustitutos han sido objeto de estudio en los últimos años, dada su función de transportar oxígeno en la sangre, lo cual es importante en escenarios médicos donde se requiere una transfusión, como en derrames o pérdida de sangre. El presente estudio se centra en determinar la solubilidad de oxígeno de una emulsión de PFOB (Perfluoro-octilbromuro) al 30% v/v y 1.2% w/v de lecitina de huevo (surfactante), con el fin de verificar el funcionamiento de transporte de oxígeno de esta. Esta emulsión se caracteriza por tener viscosidad de 2.12 cP, un tamaño de partícula 0.253 m y un pH de 7.11. La metodología experimental consta de dos partes, la primera consiste en identificar el comportamiento en la concentración de oxígeno al cargar la emulsión por medio de un equipo de Oximetría, y la segunda en determinar la solubilidad de oxígeno en la emulsión por medio de un método enzimático. Además, se analizaron dos factores sobre la solubilidad: tiempo de contacto entre el oxígeno y la emulsión y tiempo de almacenamiento de esta. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa, se estípula un tiempo de saturación de oxígeno en la emulsión de 40 minutos en el momento de cargarla y para la segunda etapa, se obtuvo un concentración de oxígeno de 0.675 𝑚𝑙𝑂2/𝑑𝑙 𝑒𝑚𝑢𝑙𝑠𝑖ó𝑛, en la cual, es mayor la concentración
de oxígeno en el plasma, donde se evidencia que la capacidad de transportar oxígeno en la emulsión disminuye al transcurrir el tiempo de almacenamiento, ya que en la semana cuatro la concentración obtenida fue de 0.287 𝑚𝑙𝑂2/𝑑𝑙 𝑒𝑚𝑢𝑙𝑠𝑖ó𝑛. Por ende, el método enzimático da
una aproximación a la solubilidad de oxígeno en la emulsión, tanto en la fase continua como en la fase dispersa.
Palabras claves: solubilidad, concentración, método enzimático, transporte de oxígeno, ley de
1. INTRODUCCIÓN
La demanda de sangre se debe principalmente a las hemorragias en los pacientes, ya sea por accidentes o por procedimientos quirúrgicos tales como cirugías cardiovasculares, trasplantes, traumatología u otros. Actualmente, la oferta de sangre (donaciones voluntarias) no está en un punto de equilibrio con su demanda. Debido a esta falla en la oferta y demanda de sangre y sumado a otras limitaciones como los tipos de sangre, transmisión de patógenos o la disponibilidad y viscosidad en el tiempo; están en estudio sustancias y emulsiones sustitutas para suplir las necesidades de oferta de sangre en el campo de la medicina [1].
Entre estas se encuentran los hemosustitutos, que son sustancias transportadoras de oxígeno, las cuales pueden reemplazar la sangre en casos de hemorragias. Sin embargo, no la sustituye por completo, ya que no cumple con las funciones inmunológicas o de coagulación. También, se encuentran las emulsiones de perfluorocarbono, las cuales presentan algunas ventajas como que transportar oxígeno eficientemente y en grandes cantidades, no son biológicamente activas y tampoco presentan problemas de compatibilidad de grupos sanguíneos, entre otras [2].
Así mismo, otro hemosustituto es la hemoglobina modificada, aunque este no se tendrá en cuenta en este proyecto, puesto que presenta efectos secundarios tóxicos, como por ejemplo el aumento de la tensión arterial y disminución en el gasto cardíaco, riesgo de contraer una infección, neurotoxicidad o generación de radicales tóxicos, entre otros [3].
Por otro lado, el transporte de oxígeno dentro del organismo se da desde los alvéolos pulmonares por la difusión de oxígeno hacia la sangre. El oxígeno puede ser transportado en la sangre de dos formas diferentes: disuelto en el plasma o por medio de la hemoglobina (glóbulos rojos o eritrocitos) [4]. Las emulsiones de perfluorocarbono transportan oxígeno disuelto.
Es importante aclarar que, el perfluoro-octilbromuro es un perfluorocarbono, el cual se está empleando como uno de los principales constituyentes en las emulsiones inyectadas. Debido a que tiene un alto grado de pureza y un rango bajo de peso molecular, evita efectos secundarios y un tiempo aceptable en el tiempo de retención en los tejidos. Este tiene una molécula alifática que contiene ocho átomos de carbono, diecisiete átomos de flúor y un átomo de bromo [5]. Además, la solubilidad de oxígeno en perfluorocarbonos líquidos utilizados como sustitutos de la sangre es mayor en comparación con el mismo gas en agua [6].
Por otra parte, un valor reportado por la literatura de la solubilidad de oxígeno en emulsiones de perfluorocarbono, es la pendiente de la Figura 1, donde 𝛼𝑂2 es 0.0235 𝑚𝑙𝑂2/𝑑𝑙. 𝑚𝑚𝐻𝑔
Figura 1 Curva de disociación del oxígeno de la sangre y PFC. Adaptada de [7]
Según esta curva, conceptualmente se considera un equilibrio entre una fase líquida (PFC) y una gaseosa (O2), generando una relación química basada en conceptos de solubilidad, el coeficiente de solubilidad (𝛼𝑂2), el cual según la ley de Henry se expresa como una relación
entre la presión parcial del gas y la concentración de este en el líquido: [10]
[𝑂2] = 𝛼𝑂2𝑃𝑂2 (1)
Donde [𝑂2] es la concentración de oxígeno disuelto y 𝑃𝑂2es la presión parcial de oxígeno
(tensión del oxígeno) [10]
No obstante, la medición de solubilidad en emulsiones por medio de experimentos con equipos comerciales, no es siempre adecuada, dado que la medición del electrodo de oxígeno habitual no toma en cuenta con precisión la cantidad de gas en la fase orgánica, la cual contiene mayor cantidad de oxígeno que en la fase acuosa en un sistema heterogéneo. Debido a que la solubilidad del gas depende en gran medida de las condiciones internas de la micela, tales como el tamaño y la naturaleza de la cola del surfactante. Por lo tanto, Ghosh et al., propuso el método enzimático para medir el oxígeno en esta fase, el cual se fundamenta en la oxidación de la glucosa por el oxígeno molecular, reacción catalizada por glucosa oxidasa [6].
La finalidad de este proyecto es medir la cantidad de oxígeno de la emulsión de perfluoro-octilbromuro con una formulación determinada, para evaluar la efectividad de la solución. Para llevar esto a cabo, se determina la solubilidad de oxígeno en la emulsión de perfluoro-octilbromuro mediante un método enzimático (Kit de Glucosa Assay de Cayman). Cabe resaltar que los métodos enzimáticos son específicos, reproducibles, sensibles, rápidos y por lo tanto ideales para fines analíticos [13]. Es importante mencionar que la emulsión ya establecida cumple con los valores de viscosidad, pH y tamaño de partículas, requerido para que esta pueda ser empleada [12], pero antes de esto, se debe corroborar su funcionalidad de transporte de carga.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general:
Medir la cantidad de oxígeno de la emulsión de perfluoro-octilbromuro por medio de un método enzimático, kit de prueba D-glucosa
2.2 Objetivos específicos:
Analizar el efecto sobre la solubilidad, dado por variaciones en el tiempo de contacto entre oxígeno y la emulsión.
Determinar el efecto del tiempo de almacenamiento de la emulsión sobre la solubilidad del oxígeno.
3. MATERIALES Y MÉTODOS.
La metodología del proyecto consta de tres fases: Primero, preparación de la emulsión y su caracterización, segundo, la oximetría y centrifugado y, por último, el método enzimático. Adicionalmente, se establece un diseño experimental, el cual presenta dos etapas. La primera consta en identificar el comportamiento de la emulsión frente a la carga de oxígeno y el proceso de centrifugación, comparándola además con el comportamiento de solución salina, agua y PFC puro. Para las diferentes mediciones se empleó el montaje presentado en la Figura 2.
Figura 2 Montaje experimental.
Para la segunda etapa, donde se determina la solubilidad del oxígeno en la emulsión a través de un método enzimático, se plantea un diseño experimental, con el fin de analizar dos factores sobre la solubilidad de oxígeno: tiempo de contacto con el oxígeno y tiempo de almacenamiento de la emulsión. Donde x será el tiempo donde se satura la emulsión, el cual resulta de la primera etapa. Para esta parte se empleó el mismo montaje, pero en lugar de poner el oxímetro, se selló este agujero con un tapón.
3.1 Preparación de la emulsión y su caracterización
Se preparó una emulsión con su respectiva réplica de perfluoro-octilbromuro (preparación de la fase acuosa, etapa pre mezcla, mezcla, microfluilización, esterilización y autoclavado). Las concentraciones para realizar la emulsión son: 30% v/v de perfluoro-octilbromuro 1.2% w/v de lecitina de huevo (surfactante), 0.11% w/v de Desoxicolato (cosurfactante), 0.16% v/v L-histidina (solución buffer) y 0.012% w/v de NaOH (agente para el ajuste de pH).
Se realiza una caracterización al inicio del procedimiento en las dos muestras iniciales de emulsión. Para esto se miden propiedades como: tamaño de partícula, viscosidad y pH, por medio de Master Sizer, reómetro y ph-metro, respectivamente.
3.2 Primera etapa: Oximetría.
Se mide la concentración con el oxímetro. Para emplear este, se debe realizar un proceso de calibración antes de tomar la medida. Luego de esto, se introduce el sensor en el recipiente que contiene la emulsión y el oxígeno, después se oprime el botón “Read” y el equipo toma la medición hasta llegar a un valor estable, el cual reporta este dato en la pantalla con unas unidades de mg/L.
En cuanto a las mediciones de concentración de oxígeno se tienen en cuenta dos métodos. El primero es cargar la emulsión de oxígeno durante una hora, tomando medidas de la concentración de oxígeno en intervalos de 10 minutos. Después de esto, centrifugar la emulsión cargada a 3000 rpm, 20 ºC por 30 minutos. Mientras tanto, en intervalos de 10 minutos se mide la concentración de oxígeno. El segundo método es primero centrifugar la emulsión durante 30 minutos a las mismas condiciones que el primer método, después si cargar con oxígeno la emulsión durante una hora, registrando la concentración de oxígeno cada 10 minutos.
Por otra parte, se mide la concentración de oxígeno tanto en solución salina, PFC puro y agua desionizada. Estas sustancias se cargan de oxígeno durante una hora, registrando la concentración de oxígeno dada por el oxímetro cada diez minutos.
3.3 Segunda etapa: Método enzimático.
Se empleó el método enzimático, el cual consta de varios subprocesos tales como: preparación del ácido sulfúrico con concentración de 12 N, carga de oxígeno, procedimiento de la reacción y curva de calibración. Para este método se emplean los reactivos o-dianisida, glucosa oxidasa/ peroxidasa y solución estándar. Estos tienen un acondicionamiento inicial según la guía específica del kit.
Este método se utiliza comúnmente para la dosificación de glucosa cuando el oxígeno en exceso está presente. El cual está descrito por las siguientes ecuaciones [13]:
3.3.1 Carga de oxígeno:
Para realizar la carga de oxígeno a la emulsión, se realiza con oxígeno medicinal (Tanque de 1 𝑚3 y presión manométrica de 1379 kPa). A este se le puede graduar el flujo de gas por medio de un rotámetro. Este es transportado en una manguera hasta que llegue al recipiente hermético, el cual contiene la emulsión. Se tiene en cuenta que el oxígeno que respira y procesa un individuo en condiciones normales es de 250 ml/min, por lo cual, se fija este flujo para cargar la emulsión de oxígeno [12]. Dependiendo del tiempo de saturación de la emulsión obtenido en la primera etapa (x minutos), se carga durante el tiempo establecido. Aunque se tomó una muestra de la emulsión en el momento 0, x/2 y x para hacer el procedimiento de la reacción.
3.3.2 Procedimiento de la reacción:
Para el procedimiento de la reacción se realizan dos mediciones mediante el kit de glucosa, con su respectiva réplica. El procedimiento a seguir es el mostrado en el siguiente esquema (Figura 3), donde el “reactivo” contiene 0.8 ml de o-dianisidina y 39.2 ml de glucosa oxidasa.
Figura 3 Diagrama de flujo del procedimiento de la reacción.
3.3.3 Curva de Calibración:
El procedimiento para la curva de calibración se realiza con base en los siguientes volúmenes
Desgasificación de reactivos
+
Carga de oxigeno a la emulsión
1 ml de emulsión +
1 ml de D glucosa.
2 ml de reactivo. Dejar reaccionar
por 30 m in en un
baño termostático (°T = 37°C)
Se detiene la reacción 2 ml de
ácido sulfúrico
Centrifugar por 30 min a 3000 rpm
Medir absorbancia (540 nm)
Desgasificación de reactivos
+
Carga de oxigeno a la emulsión
1 ml de emulsión +
1 ml de D glucosa.
2 ml de reactivo. Dejar reaccionar
por 30 m in en un baño termostático
(°T = 37°C)
Se detiene la reacción 2 ml de
ácido sulfúrico
Centrifugar por 30 min a 3000 rpm
Medir absorbancia (540 nm)
Tabla 1 Volúmenes para la curva de calibración.
Agua desionizada
(ml)
D-glucosa (ml)
Blanco 1.00 0
Estándar 1 0.99 0.01
Estándar 2 0.97 0.03
Estándar 3 0.95 0.05
Estándar 4 0.90 0.10
Se comienza la reacción al adicionar 2.0 ml del reactivo a cada tubo, se deja reaccionar por 30 minutos en un baño termostático a una temperatura de 37ºC. Se finaliza con la reacción adicionando 2.0 ml de ácido sulfúrico (12 N). Por último, se mide la absorbancia de cada tubo a 540 nm.
3.3.4 Cálculo de concentración de oxígeno y coeficiente de solubilidad:
Primero se debe obtener la ecuación de la recta de la curva de calibración con la siguiente forma:
A = mx + b (5)
Donde A es la absorbancia, x es la masa de glucosa, m la pendiente de la curva y b el punto de intersección. Despejando de la ecuación 5 la masa de glucosa y convirtiéndola a moles con el peso molecular de esta (180.16 g/mol), se tiene los moles de glucosa. Según la ecuación 2, la relación de moles de glucosa y moles de oxígeno es 1:1, por ende, se tendría la cantidad de moles en un mililitro que se reaccionó de la emulsión.
Con estos moles se calcula la concentración de oxígeno de la siguiente manera:
[O
2]
mL O2dL emulsión
=
nO2∗PMO2[molg ]∗(1000mg1g )∗( 1
ρO2[mgmL]
)
V [dL]
(6)
Por último, se calcula el coeficiente de solubilidad, según la ecuación 1 y asumiendo la presión parcial de oxígeno como la atmosférica, la cual en Bogotá es 560 mmHg.
4 RESULTADOS Y ANÁLISIS
A continuación, se presentan los resultados obtenidos de concentración de oxígeno en la emulsión, obtenidos para la primera etapa experimental. Inicialmente, se muestra la caracterización de la emulsión. Después se clasifican los resultados según el método empleado (carga de oxígeno y centrifugación) y después la concentración de oxígeno otras sustancias (Solución salina, agua desionizada, PFC puro).
4.1 Caracterización de la emulsión.
Se preparó una emulsión con su respectiva réplica de perfluoro-octilbromuro (preparación de la fase acuosa, etapa pre mezcla, mezcla, microfluilización, esterilización y autoclavado). Las concentraciones para realizar la emulsión son: 30% v/v de perfluoro-octilbromuro 1.2% w/v de
lecitina de huevo (surfactante), 0.11% w/v de Desoxicolato (cosurfactante), 0.16% v/v L-histidina (solución buffer) y 0.012% w/v de NaOH (agente para el ajuste de pH).
Se realiza una caracterización al inicio del procedimiento en las dos muestras iniciales de emulsión. Para esto se miden propiedades como: tamaño de partícula, viscosidad y pH, por medio de Master Sizer, reómetro y ph-metro, respectivamente.
La Tabla 2 refleja los datos obtenidos al caracterizar la emulsión en su momento inicial de preparación.
Tabla 2 Caracterización de la emulsión
Viscosidad [cP] 2.12 ± 0.34
Tamaño de partícula [m] 0.253 ± 0.005
pH 7.11 ± 0.14
4.2 Primera etapa: Oximetría.
Se mide la concentración con el oxímetro. Para emplear este, se debe realizar un proceso de calibración antes de tomar la medida. Luego de esto, se introduce el sensor en el recipiente que contiene la emulsión y el oxígeno, después se oprime el botón “Read” y el equipo toma la medición hasta llegar a un valor estable, el cual reporta este dato en la pantalla con unas unidades de mg/L.
En cuanto a las mediciones de concentración de oxígeno se tienen en cuenta dos métodos. El primero es cargar la emulsión de oxígeno durante una hora, tomando medidas de la concentración de oxígeno en intervalos de 10 minutos. Después de esto, centrifugar la emulsión cargada a 3000 rpm, 20 ºC por 30 minutos. Mientras tanto, en intervalos de 10 minutos se mide la concentración de oxígeno. El segundo método es primero centrifugar la emulsión durante 30 minutos a las mismas condiciones que el primer método, después si cargar con oxígeno la emulsión durante una hora, registrando la concentración de oxígeno cada 10 minutos.
Por otra parte, se mide la concentración de oxígeno tanto en solución salina, PFC puro y agua desionizada. Estas sustancias se cargan de oxígeno durante una hora, registrando la concentración de oxígeno dada por el oxímetro cada diez minutos.
4.2.1 Carga de oxígeno y centrifugación.
En la figura 4, se muestra el promedio de los datos obtenidos para la concertación de oxígeno en la emulsión, mientras ésta se cargaba con un flujo continuo de 240 ml/min de oxígeno medicinal, el cual tiene características específicas para el consumo humano. En este primer método, se cargó la emulsión durante 60 minutos y después se centrifugó registrando cada 10 minutos por tres veces, donde en intervalos de cada 10 minutos se midió la concentración de oxígeno.
En la Figura 4, se observa que después de 30 minutos de estar cargando la emulsión, ésta se satura, es decir, después de este tiempo la concentración de oxígeno es constante en la fase continua.
No obstante, durante el proceso de centrifugación la emulsión pierde oxígeno, debido a las fuerzas que ejercen sobre la emulsión. Cabe resaltar, para esta última parte la emulsión se separa en tres fases. Donde se realizó la medida de la fase del fondo, que contiene el PFC al ser un líquido más pesado que la fase continua. Este, registra un mayor valor de concentración; como se observa en la Figura 4. Tal comportamiento evidencia que las gotas de PFC pueden cargar más oxígeno que la fase acuosa de la emulsión.
4.2.2 Centrifugación y carga de oxígeno.
La Figura 5, muestra el promedio de los datos obtenidos para la concertación de oxígeno en la emulsión con un flujo de 240 ml/min de oxígeno medicinal. En este segundo método, se centrifugó primero la muestra por 30 minutos, para luego cargar la emulsión durante 60 minutos.
Se obtiene que, después de 30 minutos el valor de la concentración de oxígeno dentro de la emulsión cambia de manera significativa, lo cual se debe a dos factores: primero la separación de la muestra cambia el comportamiento de carga, ya que acá están las fases totalmente separadas; segundo un error atribuido a la calibración del equipo. La concentración de la réplica, baja después de 30 minutos, lo cual se atribuye a un error del equipo. Comparando los
16 18 20 22 24 26 28 30
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
C o n c e tr a c ió n d e o x íg e n o , O 2 , [m g / L ]
Tiempo, t, [min]
Promedio Fondos 21 22 23 24 25 26 27 28 29
0 10 20 30 40 50 60 70
C o n ce tr ac ió n d e o xí ge n o ,O 2 ,[ m g/ L]
Tiempo, t, [min]
Figura 5 Concentración de oxígeno en la emulsión para el segundo método. Figura 4 Concetración de oxígeno para el primer método.
dos métodos, el primero carga alrededor de 4% más para el momento en el que se satura la emulsión en la fase continua, alrededor de los 40 minutos que se expone está con oxígeno gaseoso.
4.2.3 Oximetría..
En la Figura 6, se presentan todos los datos experimentales obtenidos para la primera etapa del estudio.
En esta figura, se observa como el primer método carga mayor oxígeno. Por lo cual para la segunda etapa se debe cargar primero el oxígeno. Además, se corrobora que el tiempo de saturación de la emulsión en la fase continua es alrededor de 30-40 minutos, el cual es similar al resultado obtenido con el método de Winkler [12], por tanto este valor va a ser el tiempo que empleado en la segunda etapa del proyecto.
Otro de los resultados importantes de esta primera etapa es que, aunque el PFC puro se carga a los diez minutos, dentro de la emulsión este se satura en más de 30 minutos. Esto se debe a que en la emulsión se está cargando tanto en la fase dispersa que contiene el PFC y la fase continúa.
Aunque en esta gráfica, se evidencia que tiene mayor concentración de oxígeno la solución salina que la emulsión, esto no es del todo cierto. Lo anterior ocurre para la fase continua, dado que este equipo no logra un valor exacto de concentración de oxígeno, al no poder identificarla en la fase dispersa de la emulsión. En los valores reportados por la literatura, la solución salina presentan un 𝛼𝑂2 de 0.0043 𝑚𝑙𝑂2/𝑑𝑙. 𝑚𝑚𝐻𝑔 [9], el cual es menor al del PFC
puro 0.0235 𝑚𝑙𝑂2/𝑑𝑙. 𝑚𝑚𝐻𝑔[7]. Por lo cual, se puede evidenciar que el método de oximetría no es el recomendado para medir esta cantidad de oxígeno presente en la emulsión. Con igual importancia, se debe revisar el montaje donde se carga de oxígeno la emulsión, dado que el valor de concentración obtenido para el PFC puro debería ser mayor. Igualmente, es
15 17 19 21 23 25 27 29 31 33
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
C o n ce tr a ci ó n d e o x íg e n o , O 2 , [m g /L ]
Tiempo, t, [min]
Primer método Segundo método Agua desionizad Sln Salina PFC puro
4.3 Segunda etapa: Método enzimático.
Se obtuvo la siguiente curva de calibración (Figura 7), donde el color visible de la reacción entre el agua y la D-glucosa, es magenta:
Figura 7 Curva de calibración del método enzimático.
Según los diferentes cálculos, se calculó la concentración de Oxígeno [ 𝑚𝑔/𝐿], para las dos semanas evaluadas y los diferentes tiempos de carga de oxígeno, tal como se ve en la Figura 8.
Después, al calcular el valor del coeficiente de solubilidad, finalmente dio los resultados de la Tabla 3.
Tabla 3 Resultados método enzimático
αO2 [O2]
[ mlO2 dl. mmHg]
μmolO2 ml Sln
mlO2 dl Sln S2 0.00121 0.301 0.675 S4 0.00051 0.128 0.287
Con el fin de comparar estos valores obtenidos, se presenta el porcentaje que representan los valores de la literatura, por medio de la Tabla 4.
y = 12.166x + 0.0786 R²= 0.99039
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
A b o so rb an ci a [A ] D-glucosa [mg] 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
0 10 20 30 40 50
[O 2 ] m lO 2 /d L e m u ls ió n
empo de contacto con O2, min
S2
S4
Tabla 4 Paralelo valores teóricos con los obtenidos
Valores teóricos S2(%) S4(%)
𝜶𝑶𝟐 0.003 mlO2/dl plasma *mmHg [4] 40 17
0.007 (mlO2/dl PFC *mmHg). (30%) 17 7
0.0043 mlO2/dl sln. Salina *mmHg [9]] 28 12
[𝑶𝟐] 40 mlO2/dl PFC [8] 2 1
0.8 mlO2/dl emulsión comercial [8] 84 36
8 mlO2/dl emulsión comercial [8] 8 4
0.3 mlO2/dl plasma [4] 225 96
[𝑶𝟐] 0.965 umolO2/ml emulsión (50% PFC) [6] 31 13
0.579 umolO2/ml emulsión (30% PFC) 52 22
Según los datos obtenidos, el 𝛼𝑂2es mucho menor que el del plasma y del coeficiente de PFC al 30% en solución. Cabe mencionar, el coeficiente de solubilidad calculado se obtuvo con la suposición de que la presión parcial de oxígeno es la atmosférica, por lo tanto este sería el 𝛼𝑂2
mínimo de lo que podría cargar la emulsión, ya que la presión parcial de oxígeno sobre la emulsión es menor a la atmosférica, pero no se conoce con certeza.
Al comparar la concentración de oxígeno obtenida en la emulsión con los reportados en la literatura, se observa que esta es mayor que la concentración de oxígeno en el plasma, un poco más del doble para la semana dos, pero para la cuatro ya es menor. También, está en el orden de magnitud de la concentración mínima de las emulsiones comerciales (0.8 mlO2/dl), pero es menor a ésta, por lo que no generaría una ventaja en el mercado. De igual manera, es menor a los valores de cantidad de oxígeno en los perfluorocarbonos, pero se debe a que al porcentaje de volumen de PFC, presente en la emulsión y la naturaleza del surfactante. Aunque, si se compara con una regla de cálculo con el reportado para 50% PFC y para obtener el valor teórico al 30%, igual sigue siendo menor que este valor, ya que carga solo la mitad (54%) del dato reportado en la literatura.
En cuanto al factor de tiempo de almacenamiento de la emulsión, se evidencia en los resultados que al pasar dos semanas, al cargar el oxígeno, esta presenta menor concentración de oxígeno disuelto, al igual que un menor coeficiente de solubilidad. Esto podría darse por dos factores, el primero es por la naturaleza del surfactante y el segundo es por el kit enzimático, ya que el kit después de preparado tiene un tiempo límite de almacenamiento de máximo un mes a unas condiciones específicas, por lo cual las enzimas de este se pueden ver afectadas (desnaturalizarse) al transcurrir el tiempo.
Por otra parte, en el experimento se deben tener en cuenta varias eventualidades ocurridas, la más importante de ellas es lo referente al color resultante de la reacción, dado que en el kit menciona que la reacción es rosada, por lo que sugiere que la longitud de onda sea de 540 nm. Pero al reaccionar las enzimas del kit con la emulsión, se observó que, en el tiempo inicial de 0 minutos, la emulsión no tenía oxígeno gaseoso, y la reacción presenta un color complementario, amarillo – beige (Figura 9, tercer tubo) el cual podría entrar en una longitud de onda entre 340-475 nm [15], por lo cual, al ser tan diferente, se omitió en los cálculos del coeficiente de solubilidad, al no ser valores certeros experimentalmente.
Figura 9 Resultados visibles del método enzimático.
5 CONCLUSIONES
Las concentraciones de oxígeno en sistemas heterogéneos, no es adecuado medirlas con equipos como el Oxímetro, dado que este no logra medir con precisión la cantidad de oxígeno en la fase dispersa, la cual tiene mayor cantidad del gas. A pesar de esto, la medida, dio el valor de tiempo para cargar totalmente la emulsión, de 40 minutos, asumiendo equilibrio entre las dos fases (líquido –gaseoso).
Los valores de concentración de oxígeno son válidos, el cual uno de ellos para la emulsión es 0.67 ml O2/ dl Sln, siendo mayor a la del plasma (0.3 ml O2/ dl Sln) [4], además en cuanto a efectividad de liberación de oxígeno en el organismo, es más rápida la emulsión ya que no requieren una reacción como el plasma. [4]
Sin embargo, para el cálculo del coeficiente de solubilidad se tiene un porcentaje de incertidumbre sobre el valor real de la presión parcial de oxígeno en la emulsión, por lo cual no se logra conocer con certeza este valor. Aunque el valor obtenido de alfa (0.0012 𝑚𝑙𝑂2
𝑑𝑙.𝑚𝑚𝐻𝑔) es el valor mínimo.
El método enzimático logra medir la cantidad de oxígeno presente en la fase dispersa, aunque para que este sea más precisa, es necesario tener en cuenta los colores complementarios de la emulsión al reaccionar con el kit y las respectivas longitudes de onda.
6 TRABAJO A FUTURO
Como trabajo a futuro, con el fin de obtener valores más precisos se recomienda hacer un barrido en todo el espectro visible del sobrenadante obtenido por el método enzimático y la reacción con la emulsión. Para así identificar en qué longitudes de onda presenta absorbancia, dado el color inicial de la emulsión.
Además, se debe tener presente que después de preparado el Kit, se tiene un mes de vigencia antes que este se caduque, por lo que se recomienda tomar los datos en un momento puntual, solo al momento de preparar la emulsión y el kit, para evitar desviaciones por desnaturalización o algún otro inconveniente con las enzimas del kit de glucosa.
Igualmente, se sugiere revisar el porcentaje de w/v del PFC y el %v/v del surfactante, para lograr tener una emulsión con mayor capacidad de carga de oxígeno y que esta sea competitiva frente a las existentes en el mercado. Donde, también se debe considerar la naturaleza de la micela (tamaño de partícula, naturaleza de la cola y cabeza). Al igual que, verificar la naturaleza de la lecitina de huevo, puesto que éste es un punto crítico que afecta directamente la solubilidad de oxígeno en la emulsión [7].
Por otra parte, se debería plantear una metodología para conocer exactamente la presión parcial del oxígeno en presencia de la emulsión, ya que es un valor significativo para calcular el coeficiente de solubilidad.
BIBLIOGRAFÍA.
[1] D. Palacio Betancourt and M. Giraldo Suárez, “Política nacional de sangre.”.
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