INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA POSGRADO
___________________________________________________
Y
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS DEL
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
“DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DEL RECEPTOR PARA
FIBRONECTINA “EhFNR” EN TROFOZOÍTOS DE
Entamoeba histolytica RECUPERADOS DE LESIONES
HEPÁTICAS”
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS EN INVESTIGACIÓN EN MEDICINA
P R E S E N T A
M en C. VERÓNICA IVONNE HERNÁNDEZ RAMÍREZ
DIRECTORES DE TESISDR. ENRIQUE CASTILLO HENKEL
DRA. PATRICIA TALAMÁS ROHANA
DEDICATORIAS
El presente trabajo lo he dedicado a las personas más importantes de mi vida:
A: Arturo Magos Hernández, quien es ejemplo de superación constante
“Gracias hijo, por que a través de ti recibo estímulos continuos para poder seguir adelante”
A: Belem Raquel Pérez Hernández, una niña con virtudes que la harán alcanzar cualquier meta que se proponga
“Gracias hija, por que eres un motivo para que la vida sea bella”
A la Sra. Gloria Ramírez Rangel
“El éxito radica en saber hacia donde vamos y el camino a seguir”
Gracias mamá, por que durante esta trayectoria, tú apoyo, confianza, y comprensión me guiaron hasta el final
Al Sr. Miguel Hernández Ramírez
“La constancia y perseverancia son virtudes que nos permiten concluir metas propuestas”
Gracias papá, por que he aprendido esto a través de ti
A: Claudia Hernández Ramírez y Miguel Angel Hernández Ramírez
“El trabajo en equipo enriquece nuestras capacidades”
Gracias Claudia y Miguel, su apoyo como hermanos lograron la culminación de un objetivo familiar
Se dice que cuando una mujer avanza no hay hombre que retroceda…...Comandante Ramona (E Z L N)
Agradecimientos
De manera especial le agradezco a la Dra. Patricia Talamás Rohana por el apoyo brindado en la realización del presente proyecto de tesis, así como su empeño en que nuestro trabajo sea de calidad y por su constante ejemplo de
superación académica y laboral. Su invaluable calidad humana nos ha enseñado que muchos de nuestros objetivos se pueden alcanzar
Gracias Dra. Paty
Al Dr. Enrique Castillo Henckel, le expreso mi agradecimiento por la asesoría en este proyecto de investigación. Sus apreciaciones lograron estimular la
madurez científica en mi persona para lograr obtener el grado de Dra. en Ciencias en esta Institución
Gracias Dr Enrique
A la Dra. Norma Herrera le agradezco su asesoría, sus comentarios así como a su constante optimismo, ya que muchas de las veces fue de gran
apoyo durante la realización de este trabajo. Gracias Dra. Al Dr. Rafael Campos, gracias por sus comentarios y por sus sugerencias, ya que éstas enriquecieron de manera importante el desarrollo de
esta tesis doctoral.
Al Dr. Jesús Serrano, le expreso mi agradecimiento por su asesoría y observaciones durante este trabajo de tesis. Sus comentarios son primordiales
para el crecimiento de la línea de investigación que se desarrolló en esta investigación.
Al Dr. José Luis Rosales le agradezco su asesoría durante la obtención de la sonda molecular y la proteína recombinante.
A la Dra. Bibiana Chávez, por su colaboración en la obtención de las imágenes de microscopía electrónica de transmisión así mismo le expreso mi admiración y respeto como investigadora, su apoyo fue muy significativo para
mi durante todo este tiempo.
A Amelia Ríos, amiga y compañera, con quien compartí muchas de las más importantes decisiones de mi vida profesional, su amistad es uno de los logros más trascendentales que obtuve durante el desarrollo de este proyecto
de trabajo. A mi colaboradora más respetable y querida……Gracias…… A Leticia Pérez Castillo………amiga, te agradezco todo el apoyo y comprensión
durante las jornadas de trabajo, tu sensibilidad muchas de las veces mantuvo la ecuanimidad en mi persona……Gracias Lety.
A Belem De Luna Vergara, su compañerismo y amistad fueron una combinación que durante toda mi estancia en el laboratorio hizo que este
A Amelia Angel por su colaboración y su siempre disponibilidad para la realización de nuestro trabajo experimental. Su amistad es un motivo que nos
enriquece constantemente en el ámbito personal y laboral
A mis compañeros de laboratorio, Yevel, Rosario, Carlos, Alfredo, Luilli, Norma, Luis y Olga por su siempre colaboración y disponibilidad
A Lupita Castañón, por brindarnos la oportunidad de estimular aún más nuestro potencial como grupo de investigación, trabajar con ella es una motivación
constante……
A todas las personas que en cada momento participan en mi constante superación personal y académica, Gracias……
A la C. Irma Edith Miranda Orea, por su asistencia técnica y secretarial durante el desarrollo de la tesis doctoral.
A la C. Ma. Elena Cisneros Albavera, por su asesoría y asistencia técnica en el área secretarial durante el desarrollo de la presente tesis doctoral.
A la C. Clara Castelán Domínguez, por su asistencia técnica y secretarial durante el desarrollo de la tesis doctoral.
A la Técnico, Belem De Luna Vergara, por la purificación de la FN, la cual fue empleada para los ensayos de adhesión celular.
Al Técnico, Enrique De Luna, por su participación en el área de mantenimiento del área de cultivo durante el desarrollo metodológico del presente trabajo de
Investigación.
A la Auxiliar de Investigación Lic. en Biología Lidia Baylón, por su asesoria durante el desarrollo de la metodología del manejo de proteínas
recombinantes.
INDICE
RESUMEN 11
ABSTRACT 12
INTRODUCCIÓN 13
ANTECEDENTES GENERALES 13
Ciclo de vida y Morfología 14-16
Patogénesis 17-19
Posibles mecanismos del proceso de patogenicidad 19-24
Manifestaciones Clínicas 24-26
Diagnóstico, tratamiento y control 26-28
ANTECEDENTES PARTICULARES 28-32
Integrinas 32-34
Activación y Modulación de la expresión de las integrinas 34-39
JUSTIFICACIÓN 40-41 HIPÓTESIS 42 OBJETIVO GENERAL 42 OBJETIVOS PARTICULARES 42 METODOLOGIA 43 -Cultivo celular 43 -Purificación de FN 43
-Anticuerpo monoclonal 3C10 y anticuerpos policlonales 43-49 anti EhFNR
-Purificación de fracciones membranales 44-45 -Aislamiento de clonas de cDNA que codifican para el
Receptor EhFNR 45
-Purificación de la proteína recombinante (GST-EhFNR) 45-46 -Obtención de anticuerpos policlonales contra la proteína
recombinante GST-EhFNR 46
-Ensayo de adhesión celular 46-47
-Ensayo de Overlay utilizando FN-biotinilada (FNB) 47 -Recuperación de trofozoítos a partir de lesiones hepáticas 47-48
-Cuantificación del EhFNR en trofozoítos biotinilados 50-51 -Ensayo de inmunoprecipitación de fracciones membranales
biotiniladas 51
-Microscopía electrónica 51
-Microscopía de fluorescencia 51-52
RESULTADOS 53
-Obtención de una clona de cDNA que codifica para la
molécula EhFNR 53
-Caracterización de la proteína recombinante (GST-EhFNR) 53-59 -Participación de la molécula EhFNR durante el proceso invasor 59-71
DISCUSIÓN 72-80
RESUMEN DE RESULTADOS Y CONCLUSIÓN 81
PERSPECTIVAS 82-85
BIBLIOGRAFÍA 86-93
LISTA DE FIGURAS
-Quiste y trofozoítos de Entamoeba histolytica 14 -Ciclo de vida de E. histolytica 16 -Muestra intestinal de un paciente con colitis amibiana aguda 18 -La elevada prevalencia e incidencia de disentería amibiana es debido a la ausencia de adecuadas condiciones sanitarias 19
-Trofozoítos de Entamoeba histolytica con eritrocitos fagocitados 20 -Proceso patogénico de E. histolytica 24 -E. histolytica posee tres tipos de receptor con actividad de
tirosina cinasas 31
-Las integrinas son heterodímeros funcionales cuando se asocian
en la membrana plasmática 33
-Las integrinas 34
-Estados conformacionales de las integrinas 36
-Modelo hipotético de reciclaje de integrinas y la agregación
en los contactos focales (FCs) 39 -Integrinas en la adhesión y migración de células inmunes 82
-Modelo hipotético del papel de las integrinas en
LISTA DE FIGURAS DE RESULTADOS
Figura 1.- Validación antigénica de la proteína recombinante
GST-EhFNR 53
Figura 2.- Identificación y caracterización de la
proteína recombinante 55
Figura 3.- Identidad entre las proteínas EhFNR e Igl 57
Figura 4.- La proteína recombinante no se une a FN 59
Figura 5.- Niveles de expresión de la proteína EhFNR y del RNA en trofozoítos cultivados por tiempo prolongados en FN 60
Figura 6.-Distribución subcelular de la proteína EhFNR en
trofozoítos de cultivo y trofozoítos incubados en FN 62
Figura 7.-Localización membranal del EhFNR en trofozoítos
incubados con componentes de matriz extracelular. 63
Figura 8.-.Distribución del EhFNR con diferentes concentra-
ciones de FN 64
Figura 9.- Distribución subcelular de EhFNR en trofozoítos
Incubados con FN. 66
Figura 10.- Niveles de expresión de la proteína EhFNR y del RNA en trofozoítos recuperados a partir de lesiones
hepáticas 68
Figura 12.- Determinación de la distribución del receptor EhFNR en trofozoítos recuperados a partir de lesiones
hepáticas. 71
ANEXO 94
RESUMEN
Durante la interfase de trofozoítos de Entamoeba histolytica con las células del hospedero el parásito tiene que sufrir un proceso de adaptación. La presencia de receptores membranales le permiten al trofozoíto censar los estímulos externos y de esta manera mantener las condiciones adecuadas para su establecimiento y posteriormente cumplir con su ciclo infectivo. En este estudio se analizó la modulación del receptor caracterizado previamente como un receptor funcional de tipo integrina β1 en trofozoítos recuperados de lesiones hepáticas, así como en trofozoítos incubados con fibronectina (FN). Los resultados obtenidos en este trabajo permiten establecer que el receptor EhFNR se modula de forma similar a las integrinas de células de eucariontes superiores. Al respecto, utilizando el inserto de la clona 5A, se estableció que la expresión del gen que codifica para el receptor EhFNR no es regulado como resultado de la interacción con el ligando específico del receptor, la FN o con los componentes del hospedero. No obstante se observó una redistribución del EhFNR. El receptor se localiza principalmente en una población vesicular heterogénea en cuanto al tamaño y a la concentración del receptor que se encuentra decorando estas estructuras. Así mismo se sugiere que el EhFNR se redistribuye a través de un proceso de translocación en el cual se podría involucrar la participación de proteínas Rab. Al analizar la secuencia del inserto que se utilizó como sonda se estableció que el componente de 150 kDa del EhFNR presenta una identidad del 99 % y 97% con las subunidades de la cadena intermedia del complejo de la lectina inhibible con galactosa (270 kDa). Por ensayos de inmunoprecipitación se mostró que tanto el anticuerpo monoclonal anti-subunidad intermedia EH3015 así como el anticuerpo monoclonal 3C10, el cual reconoce específicamente al EhFNR, reconocen epitopos similares en el componente del EhFNR de 150 kDa. Reportes previos, por otros grupos de trabajo, han mostrado la presencia en E. histolytica de proteínas similares a las integrinas, por lo que es posible sugerir su participación durante la adhesión, migración e invasión como se ha descrito en otros modelos celulares.
Abstract
Entamoeba histolytica trophozoites recovered from the host-parasite interface during abscess development obtain different stimuli compared with long-term cultured cells. In order to have a better understanding about the mechanisms in which the 140 kDa fibronectin (FN)-binding molecule (EhFNR) is involved during the invasive process, we decided to compare the regulation process of this molecule among long-term cultured trophozoites, FN-stimulated trophozoites, and trophozoites recently recovered from a liver abscess. A cDNA clone (5A) containing a fragment of the EhFNR that shows identity to the C-terminal region of the intermediate galactose lectin subunit Igl, was selected with a mAb (3C10). Identity of EhFNR with Igl was confirmed by immunoprecipitation with 3C10 and EH3015 (against the Gal/GalNAc intermediate subunit) mAbs. The 3C10 mAb was used as a tool to explore the modulation of the amoebic receptor (EhFNR). Our results showed specific regulation of the EhFNR in FN-interacted amoebas, as well as in trophozoites recovered at different stages of abscess development. This regulation involved mobilization of the receptor molecule from internal vesicles to the plasma membrane. Therefore, we suggest that in the host-parasite interface, the EhFNR (Igl) plays an important role in the adhesion process during abscess development.
INTRODUCCIÓN
Antecedentes Generales
La amibiasis es definida como una infección invasora intestinal o extraintestinal provocada por el protozoario parásito Entamoeba histolytica. Mas de 500 millones de personas en el mundo están infectadas y aproximadamente 110, 000 de éstas mueren anualmente. Solamente la malaria y la esquistosomiasis superan la morbilidad causada por la amibiasis (1, 2).
Las evidencias bioquímicas, inmunológicas y genéticas han permitido reclasificar a E. histolytica, en dos especies morfológicamente idénticas, pero genéticamente distintas: E. histolytica, la cual es potencialmente invasora y E. dispar, potencialmente no invasora (3, 4). Ambas especies infectan alrededor del 10 % de la población mundial (5). La infección con la especie comensal E. dispar es la más común, sin embargo la prevalencia de la especie invasora E. histolytica tan solo abarca el 1% de la población mundial. El proceso de infección por E. histolytica inicia por la ingestión de quistes, los cuales liberan trofozoítos móviles en el intestino delgado. Si los pacientes son infectados con E. dispar, los trofozoítos permanecen como comensales en el lumen intestinal.
La primera evidencia de la patología amibiana es la depleción local del moco intestinal y la disrupción de la barrera epitelial como resultado de la degradación de la matriz extracelular, en parte, como consecuencia de la acción del las cistein proteasas. Los trofozoítos subsecuentemente se adhieren al moco del colon y a las células epiteliales a través de la lectina inhibible por galactosa (6, 7), posteriormente invaden a la capa epitelial y se extienden hacia la capa de la submucosa causando úlceras en forma de boca de botella. La colitis amibiana se caracteriza por diarrea sanguinolenta, con escasez de neutrófilos. A partir del intestino, los trofozoítos pueden diseminarse causando abscesos distantes, en particular en el hígado (8). El proceso invasor por E. histolytica puede ocurrir en algunos pacientes asintomáticos. Un estudio longitudinal realizado durante un año, en el Sur de África, en pacientes
portadores asintomáticos sin tratamiento, mostró que el 10% de los portadores desarrollaron colitis amibiana (9). Por lo tanto el desarrollo de una amibiasis invasora depende del balance entre los factores de virulencia del parásito y de la respuesta del hospedero.
Ciclo de vida y morfología
E. histolytica posee un típico ciclo de vida oral-fecal, el cual consiste en la evacuación de quistes y la replicación de los trofozoítos dentro del intestino grueso. La infección se adquiere a través de la ingestión de quistes y los factores de riesgo son similares a los de otras enfermedades transmitidas por una ruta fecal-oral (10).
Las fuentes probables de infección son los alimentos y agua contaminados con materia fecal. La elevada prevalencia en áreas de bajo estatus socioeconómico se debe probablemente a una ausencia de medidas de sanidad y a la carencia de instalaciones sanitarias. Prevalencias elevadas de infección por E. histolytica se presentan en instituciones, tales como hospitales para enfermos con discapacidad mental, orfanatos y prisiones, donde existen problemas con contaminación fecal y factores asociados que contribuyen a este problema (10).
Quiste y trofozoíto de Entamoeba histolytica. Muestras obtenidas a partir de material fecal. Fuente:
El humano es el único hospedero de E. histolytica y no existe un reservorio animal para este protozoario. Cuando se ingieren quistes éstos pasan al estómago y desenquistan en el intestino delgado, proceso que involucra una disrupción de la pared del quiste y la salida de amibas cuadrinucleadas. La amiba sufre otra ronda de división nuclear seguida por tres rondas de citocinesis para producir ocho pequeños trofozoítos uninucleados, llamados algunas veces como amébulas. Estos trofozoítos inmaduros colonizan el intestino delgado, especialmente la región cecal y del sigmoideo rectal, donde se alimentan de bacterias y debris celular, ahí sufren repetidas rondas de fisión binaria. Los trofozoítos de E. histolytica tienen un aspecto amorfo y generalmente poseen un diámetro de 15-30 μm. Los trofozoítos se desplazan a través de extensiones denominadas seudópodos e impulsan el resto del volumen celular en un movimiento denominado ameboideo. Los seudópodos y en algunas ocasiones el otro extremo del trofozoíto, presentan una apariencia clara refráctil denominada ectoplasma. El resto del citoplasma es de apariencia granular, denominado como endoplasma. Ocasionalmente vacuolas con glucógeno son evidentes. En muestras teñidas se aprecia un núcleo que se caracteriza por la presencia de cromatina periférica de apariencia granular fina y de cromatina central. Como una alternativa para la replicación asexual los trofozoítos también pueden enquistar. Los factores responsables de la inducción del enquistamiento aún se desconocen. Cuando ocurre el enquistamiento los trofozoítos adquieren una apariencia esférica y se visualizan cuerpos cromatodies (estructuras alargadas que se generan por la agregación de los ribosomas). La pared del quiste esta compuesta de quitina, posee una apariencia lisa y refráctil. La maduración de los quistes implica dos rondas de replicación nuclear sin división celular y quistes con 1-4 núcleos pueden ser detectados en las heces. La morfología nuclear de los quistes es similar a la de los trofozoítos, excepto por que los núcleos son más pequeños. Algunos quistes inmaduros (1-2 núcleos) pueden presentar una vacuola de glucógeno. Los cuerpos cromatoides tienden a desaparecer en los quistes maduros. Los quistes son generalmente de un diámetro de 12-15 µm y son inmediatamente infectivos después de ser excretados con las heces; dependiendo de las condiciones ambientales pueden ser viables desde semanas hasta meses (11).
Ciclo de vida de Entamoeba histolytica. (1) Los quistes son transmitidos a través de las heces. La infección por E. histolytica ocurre por la ingestión de quistes (2) maduros presentes en alimentos y agua contaminadas con material fecal. La enquistación (3) ocurre en el intestino delgado y los trofozoítos (4) son liberados, los cuales migran al intestino grueso. Los trofozoítos se multiplican por fisión binaria y producen quistes (5) los cuales son transmitidos por las heces
(1). Debido a la protección conferida por la pared del quiste, éstos pueden sobrevivir de días a
semanas en el medioambiente externo, favoreciendo la transmisión del parásito (también los trofozoítos pueden ser transmitidos en las deposiciones diarreicas, no obstante son destruidos rápidamente una vez que están expuestos al medio ambiente; en caso de ser ingeridos los trofozoítos no sobreviven a exposiciones del ambiente gástrico). En la mayoría de los casos, los trofozoítos permanecen confinados en el lumen intestinal ([A]infección no invasora) de individuos quienes son portadores asintomáticos, transmitiendo quistes en las heces. En algunos pacientes los trofozoítos invaden la mucosa intestinal ([B]enfermedad intestinal), a través del torrente sanguíneo, pueden migrar hacia sitios extraintestinales como son el hígado, cerebro y pulmones ([C]enfermedad extraintestinal). Se ha establecido que las formas invasora y no invasora representan a dos especies de ameba, E. histolytica y E. dispar, sin embargo no todas las personas infectadas con E. histolytica presentan una enfermedad invasora. Estas dos especies son morfológicamente indistinguibles. La transmisión puede también ocurrir a través de exposición fecal durante el contacto sexual. CDC División of
Patogénesis
E. histolytica frecuentemente se establece como un comensal dentro del intestino grueso sin ocasionar manifestaciones clínicas. Sin embargo los trofozoítos pueden invadir el epitelio colónico y producir úlceras y disentería. La progresión del proceso invasor puede provocar amibiasis extraintestinal. En otras palabras E. histolytica es un patógeno facultativo que exhibe una gran capacidad de virulencia (12).
La enfermedad no-invasora es frecuentemente asintomática, sin embargo puede causar diarrea u otros síntomas gastrointestinales tales como dolor abdominal o intestinal. Esta infección no invasora puede persistir o progresar hacia una enfermedad invasora en la que los trofozoítos penetran la mucosa intestinal y eliminan las células epiteliales. Las lesiones tempranas consisten en pequeñas áreas de necrosis, o úlceras, caracterizadas por bordes abultados y prácticamente no existe inflamación entre las lesiones. Las amibas pueden extenderse lateralmente en la submucosa (debajo del epitelio) eliminando células del hospedero durante el progreso de la lesión, formando una úlcera en forma de botella con una pequeña abertura y una base amplia. Los trofozoítos son más numerosos entre el límite del tejido sano y el tejido necrótico. Estas amibas invasoras están ingiriendo células del hospedero, los trofozoítos con eritrocitos ingeridos son más evidentes. Algunas veces estos trofozoítos hematófagos se encuentran en heces disentéricas. La producción de quistes disminuye durante el estado invasor de la infección y en las lesiones extraintestinales nunca se encuentran quistes (7).
El proceso ulcerativo puede continuar hacia una expansión lateral o descendente. Si el número presente de úlceras es grande, éstas pueden coalescer lo cual conduce a la eliminación localizada de la pared intestinal. La expansión de la úlcera puede también penetrar la capa serosa y provocar la perforación de la pared intestinal (7). Esta perforación puede conducir a la formación de un absceso local o a una peritonitis generalizada; las úlceras amibianas eventualmente pueden contaminarse. Ocasionalmente la infección
por E. histolytica puede conducir a la formación de un granuloma amibiano también denominado ameboma, que consiste en un espesamiento inflamatorio de la pared intestinal y que puede confundirse con un tumor (8). La amibiasis también puede progresar hacia una infección sistémica o extraintestinal. La diseminación a partir de la lesión intestinal primaria es predominantemente a través del flujo sanguíneo, no obstante puede también ocurrir por una extensión directa de la lesión. El hígado es el órgano comúnmente más afectado y esto probablemente se debe al transporte directo de los trofozoítos a partir del intestino grueso hacia el hígado vía la vena porta hepática. Inicialmente las lesiones son focos pequeños de necrosis los cuales tienden a extenderse y fusionarse generando un solo absceso. Este absceso hepático puede continuar ampliándose conforme los trofozoítos progresivamente destruyan e ingieran células hepáticas. La parte central del absceso esta constituida por hepatocitos lisados, eritrocitos, bilis y grasas. Este material necrótico (en algunas ocasiones incorrectamente llamado pus) puede adquirir un rango de color que va desde amarillento hasta un café rojizo. Las infecciones bacterianas en el absceso hepático no son comunes (~2%) (8,7).
Muestra intestinal de un paciente con colitis amibiana aguda. En la imagen se puede
observar diversas lesiones nodulares bien desarrolladas, entre estas se encuentran algunas áreas ligeramente elevadas de mucosa con centros necróticos irregulares rodeados por tejido hiperémico edematoso. Los centros necróticos contienen un material mucoide de color amarillento, excepto en un par de ulceras, las cuales son centros hemorrágicos. El pliegue intermedio de la mucosa presenta una apariencia generalmente más normal, aunque un segmento esta colapsado y edematoso (8).
La propagación de los trofozoítos hematófagos hacia otros sitios, tales como los pulmones o el cerebro es poco frecuente, sin embargo puede ocurrir.
Las infecciones pulmonares generalmente resultan a partir de una propagación directa de las lesiones hepáticas que atraviesan el diafragma y entran a la pleura y los pulmones. Las lesiones cutáneas formadas como resultado de una fístula hepática o intestinal pueden ocurrir, aunque es extremadamente raro. Otras lesiones cutáneas incluyen úlceras perianales y en áreas genitales incluyendo el pene. Estas manifestaciones tardías son debidas a que los trofozoítos llegan a estar en contacto con la mucosa del tejido o de la piel (8, 10).
La elevada prevalencia e incidencia de disentería amibiana es debido a la ausencia de condiciones sanitarias adecuadas Fuente: Wikipedia enciclopedia libre.
Posibles mecanismos del proceso de patogenicidad
La patogénesis asociada con la infección por E. histolytica se debe, entre otros factores a la capacidad de este parásito para invadir tejidos y destruir células del hospedero. A la fecha se han identificado varios factores de virulencia potenciales, sin embargo no esta claro cuales son cruciales para el desarrollo del proceso invasor. Los estudios genéticos entre E. histolytica y E. dispar indican que la virulencia es una característica inherente del parásito, ya
que cualquiera de los factores de virulencia se encuentran en ambas especies, aunque con diferencias cuantitativas. La adherencia, la actividad citolítica y la actividad proteolítica son inherentes a la biología de ambas especies, estas actividades no necesariamente conducen a un proceso patológico. Por lo tanto la patogénesis es el resultado de los efectos combinados de varios factores del parásito y/o del hospedero y por lo tanto, la virulencia puede representar el grado en el cual el hospedero puede controlar la invasión y replicación del parásito (12).
Trofozoítos de Entamoeba histolytica con eritrocitos fagocitados. Los eritrocitos ingeridos
presentan una apariencia obscura. La eritrofagocitosis es una característica que puede ser empleada para diferenciar morfológicamente a Entamoeba histolytica de la especie no patógena Entamoeba dispar. En estas muestras el núcleo del parásito presenta el típico cariosoma central y cromatina periférica fina y uniforme Fuente Wikipedia enciclopedia libre.
Los estudios de patología han determinado que durante las relaciones hospedero-parásito, participan factores propios del parásito, factores del hospedero o una combinación de ambos, favoreciendo el establecimiento de la enfermedad. El desarrollo de la enfermedad invasora puede depender de aspectos cuantitativos y cualitativos de la respuesta inmune. La respuesta de IgA en mucosas ocurre como resultado de la infección, sin embargo parece que
esta respuesta no juega un papel importante en la eliminación del parásito. Una situación similar ocurre, con los títulos elevados de anticuerpos séricos que se presentan en pacientes con abscesos hepáticos, ya que se cuestiona el papel de estos anticuerpos debido a que la enfermedad invasora es progresiva e incesante (13).
Por su parte, la respuesta inmune celular si parece jugar un papel limitante en la amibiasis invasora y un papel protector durante los tratamientos subsecuentes del hospedero. Sin embargo, no esta claro como la inmunidad del hospedero participa en el proceso de la eliminación del parásito. La resistencia del parásito hacia la respuesta inmune del hospedero es otro posible factor de virulencia el cual puede contribuir al desarrollo y exacerbación de la amibiasis invasora. Por ejemplo, un fenotipo diferente entre E. dispar y E. histolytica es la resistencia a la lisis mediada por complemento. Además, E. histolytica rápidamente degrada IgA secretororia y la respuesta de células-T hacia antígenos de E. histolytica parece ser suprimida por un factor sérico inducido por el parásito. E. histolytica también es hábil para eliminar neutrófilos y otras células efectoras del sistema inmune a través de un proceso dependiente de contacto. La lisis de los neutrófilos puede conllevar a la liberación de productos tóxicos los cuales contribuyen a la destrucción del tejido del hospedero. Sin embargo el papel que los diferentes componentes juegan en la patogénesis aún no se conoce con precisión.
La invasión de la mucosa intestinal por E. histolytica es un proceso activo mediado por el parásito y se pueden distinguir varias etapas. La primera es la adhesión de los trofozoítos a la mucosa. Esta adherencia por si misma probablemente no contribuye a la patogénesis y es simplemente un mecanismo por el cual la amiba se asienta al substrato. Una vez que los trofozoítos se han adherido y han provocado la depleción de la barrera del moco, la amiba mantiene un contacto con las células epiteliales, induciendo la lisis de éstas y provocando la disrupción de la barrera mucosal del intestino. A este proceso de citólisis se le considera como la segunda etapa y durante ésta, los trofozoítos pueden continuar eliminando células de la submucosa del hospedero y posteriormente disgregarlos e ir migrando. La disrupción de la pared intestinal o
la metástasis a través del sistema circulatorio también es posible. Por último durante la fagocitosis, correspondiente a la tercera etapa, los trofozoítos ingieren células y restos celulares completando así el proceso invasor (6).
A lo largo de esta tercera etapa participan varios componentes del parásito, de los cuales, algunos han sido estudiados con mayor detalle. En el caso de la lectina de 260 kDa, se sabe que es una glicoproteína heterodimérica de 260 kDa que reconoce en las células blanco residuos de galactosa y N-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc). La adherencia de los trofozoítos de E. histolytica a las células del hospedero y mucinas colónicas es mediada en forma muy importante por la actividad de esta lectina, ya que la adhesión y muerte celular de células blanco es inhibida por galactosa, lo que permite sugerir que esta lectina participa en el proceso de virulencia. Además se sabe que la lectina de 260 kDa, esta involucrada en la resistencia a la lisis mediada por complemento (12). Esta lectina esta constituida por una cadena pesada de 170 kDa y una cadena ligera de 31-35 kDa. La cadena pesada tiene la actividad de adherencia y la cadena ligera funciona como anclaje a la membrana debido a la presencia de una estructura de tipo glicosil-fosfatidil inositol (GPI). Ambas subunidades están codificadas por una familia de multigenes. Existen 5 miembros de la cadena pesada y de 6 a 7 miembros para la familia de la cadena ligera. E. dispar también expresa una lectina de superficie inhibible por galactosa. La secuencia de los genes de la cadena pesada y de la cadena ligera de la cepa E. dispar son homólogos, sin embargo no idénticos a los de E. histolytica, de hecho se han descrito diferencias antigénicas entre las lectinas de E. dispar y E. histolytica. Se ha determinado que de seis epítopos presentes en ambas especies, solo dos queden fuera en porcentaje de identidad. No se sabe si las diferencias en secuencias puedan tener alguna correlación con diferencias en la virulencia entre E. dispar y E.histolytica. La adherencia es obviamente importante para ambas especies, sin embargo es posible que la adherencia sea cualitativamente o cuantitativamente diferente entre las dos especies (14).
En E. histolytica se ha caracterizado un polipéptido formador de poros cuya secuencia mostró un 95 % de identidad con la secuencia del ameboporo
de E. dispar. El ameboporo de E. dispar presenta aproximadamente la mitad de la actividad de formación de poros comparada con la actividad de la proteína presente en E. histolytica. Una probable explicación para esta diferencia de actividad, es la substitución de una prolina por un glutámico, el cual afecta la estructura α-hélice y se sabe que las hélices amfipáticas son cruciales para la función de la formación de poros. El ameboporo se localiza en los compartimientos vacuolares de los trofozoítos y éstos son más activos en pH acídicos. Aparentemente la principal función del ameboporo es la de lisar las bacterias ingeridas, por lo que se sugiere que el ameboporo no juega un papel importante en la muerte de las células del hospedero (15).
La destrucción de los componentes de la matriz extracelular (CME) puede facilitar la invasión de tejidos por los trofozoítos. La degradación de los CME involucra la actividad de proteasas y se ha demostrado en modelos experimentales que inhibidores de las cistein-proteasas pueden disminuir el tamaño del absceso hepático. Por otra parte se observó que E. histolytica presenta niveles elevados de cisteín-proteasas comparados con los niveles de estas enzimas presentes en E. dispar. A la fecha se han identificado seis diferentes genes para cistein proteasas, de los cuales 4 son homólogos a E. dispar. En particular, uno de estos genes es único para E. histolytica, designado como CP5. Esta proteasa se expresa en niveles elevados en la superficie del trofozoíto. Mutantes que expresan bajos niveles de CP5 son menos eficientes paras producir abscesos hepáticos en el modelo experimental del hámster. Estas mutantes también muestran una reducción en el crecimiento celular y una disminución en la actividad eritrofagocítica, de tal manera que no queda claro si la CP5 participa directamente en el proceso invasor de E. histolytica (15).
Proceso patogénico de Entamoeba histolytica. La invasión de la mucosa intestinal por E.
histolytica es un proceso activo. Los trofozoítos se adhieren a la capa de moco (1). Esta adherencia per se probablemente no contribuya a la patogénesis y es simplemente un mecanismo por el cual la amiba avance lentamente sobre el sustrato. La depleción de la barrera del moco permite adherirse el trofozoíto con las células epiteliales. Las células epiteliales son eliminadas por contacto promoviendo la disrupción de la mucosa intestinal (2). Los trofozoítos podrían continuar con la eliminación de las células de la submucosa del hospedero y además dañar el tejido conforme avanzan los parásitos (3). La disrupción de la pared del intestino (4) promueve la metástasis a través del sistema circulatorio (5). La adherencia, citotoxidad y disrupción de los tejidos son factores importantes en la patogénesis de E. histolytica (12).
Manifestaciones clínicas
La amibiasis presenta un amplio rango de síndromes clínicos los cuales reflejan el potencial para que E. histolytica pueda volverse invasora y causar una enfermedad progresiva. El período de incubación puede abarcar un rango de pocos días a meses o años. Las transiciones a partir de un tipo de síndrome intestinal a otro pueden ocurrir y las infecciones intestinales pueden propiciar infecciones extraintestinales. CELULAS EPITELIALES CME BARRERA DE MOCO
SUBMUCOSA
CAPA MUSCULAR CAPA SEROSACAVIDAD PERITONEAL
METASTASIS VIA VENA PORTAL
LUMEN
1 2 1 4 3 5 CÈLULAS EPITELIALESLa mayoría de los individuos diagnosticados con E. histolytica (o E. dispar) no presentan síntomas intestinales específicos. Este estado puede persistir o progresar hacia infecciones sintomáticas. Las infecciones sintomáticas no disentéricas exhiben síntomas variables los cuales pueden ser desde poco duraderos hasta transitorios o intensos, prolongados y duraderos. Estos síntomas incluyen: diarrea, calambres, flatulencias, náuseas y anorexia. Frecuentemente la diarrea alterna con períodos de estreñimiento o defecación de heces blandas. Las evacuaciones en ocasiones pueden contener moco, sin embargo no es visible la presencia de sangre. Generalmente la disentería amibiana inicia lentamente y durante varios días se presentan calambres abdominales, tenesmos y ocasionalmente se presenta la evacuación de heces blandas. Sin embargo los síntomas pueden progresar hacia una diarrea con sangre y moco. La sangre, moco y trozos de tejido necrótico pueden ser más evidentes conforme aumenta el número de defecaciones (10-20 o más por día). Conforme aumenta la severidad de la enfermedad, algunos pacientes pueden presentar fiebre, vómito, dolor abdominal, o deshidratación (especialmente en niños). A partir de una amibiasis intestinal se puede desencadenar una colitis fulminante la cual es rara y extremadamente severa. También puede presentarse la amibiasis crónica que se caracteriza por ataques recurrentes de disentería que alternan con períodos con síntomas moderados o ausencia de éstos.
El ameboma se presenta como una masa abdominal dolorosa la cual puede ocurrir más frecuentemente en el ciego y ascender hacia el colon, en ocasiones con manifestaciones obstructivas o hemorrágicas. Los amebomas son poco frecuentes y pueden ser confundidos con carcinomas o tumores. Las úlceras perianales se derivan de una amibiasis cutánea que resulta de una propagación directa de la infección intestinal (7).
Dentro de las manifestaciones clínicas extraintestinales, el absceso hepático amibiano es el más común. La aparición de los síntomas hepáticos puede ser rápida o gradual y éstos se caracterizan por hepatomegalia, dolor en el cuadrante superior derecho, fiebre y anorexia. En algunas ocasiones se puede presentar fiebre diaria principalmente durante las tardes o noches. Las
pruebas funcionales del hígado generalmente dan resultados normales o ligeramente anormales y la ictericia es poco frecuente. Ocasionalmente el absceso en el hígado puede presentar una ruptura dando lugar a una peritonitis (7).
La amibiasis pulmonar generalmente resulta de la extensión directa del absceso hepático a través del diafragma. Los síntomas clínicos más frecuentes incluyen tos, dolor de pecho, disnea (dificultad para respirar) y fiebre. También puede ocurrir una expectoración abundante de material purulento con sangre y con algunos trofozoítos. La infección en otros órganos (cerebro, bazo, pericardio) es rara. En estos casos los síntomas clínicos dependen del órgano afectado (7).
La amibiasis cutánea se desarrolla como consecuencia de la exposición de la piel o membrana mucosal a fluidos conteniendo trofozoítos. Este proceso puede provocar una fístula (intestinal, hepática, perineal) o una invasión en genitales. Las lesiones cutáneas tienen una superficie húmeda, granular, necrótica con bordes prominentes. El diagnóstico clínico es difícil y generalmente se deben considerar factores epidemiológicos de riesgo (áreas endémicas, homosexualidad, etc.) (7).
Diagnóstico, tratamiento y control
El diagnostico definitivo requiere la demostración de quistes o trofozoítos de E. histolytica en heces o tejidos. Las defecaciones pueden ser preservadas y teñidas para luego ser examinadas en el microscopio. Los quistes pueden ser predominantes en evacuaciones bien formadas y los trofozoítos en defecaciones diarreicas. Las evacuaciones frescas también pueden ser inmediatamente examinadas para la presencia de trofozoítos móviles, la sigmoidoscopia puede revelar las úlceras características, especialmente en enfermedades más severas. Los aspirados o biopsias pueden ser útiles para observar microscópicamente a los trofozoítos.
E. histolytica y E. dispar no se pueden distinguir por criterios morfológicos. Sin embargo existe una prueba de laboratorio para detectar y diferenciar antígenos de ambas especies. La serología es especialmente útil para el diagnóstico de amibiasis extraintestinal. Más del 90% de los pacientes con colitis amibiana y absceso hepático presentan anticuerpos séricos contra E. histolytica. Las técnicas de imagen (ultrasonido, resonancia magnética) pueden ser utilizadas para detectar el absceso hepático. Esto permite también que sea posible aspirar el absceso hepático, sin embargo, esta práctica es indicada en muy raras ocasiones. Generalmente los aspirados consisten en un líquido espeso café rojizo el cual pocas veces contiene trofozoítos, ya que por lo general, éstos se encuentran localizados en las paredes del absceso y no en el debris del material necrótico que se encuentra en la parte central del absceso.
Existen drogas para el tratamiento de la amibiasis y la selección de las mismas depende del estado clínico de la infección. En casos donde la especie de E. histolytica se confirma o se desconoce la identidad de la especie (E. dispar o E. histolytica), el portador debe ser tratado para prevenir una progresión que desencadene una enfermedad más severa y así controlar la propagación de la enfermedad. Sin embargo en cualquier área endémica, donde las proporciones de re-infección son elevadas se recomienda el tratamiento con Metronidazol o Trinidazol, tratamiento que puede continuar con el uso de drogas antiamibianas luminales como está descrito para pacientes asintomáticos. La emetina puede también usarse para el tratamiento de la disentería aguda y severa.
Las medidas de prevención y control son similares a otras enfermedades de transmisión por una ruta fecal oral. La diferencia principal es que el humano es el único hospedero para E. histolytica, ya que en el ciclo de vida de este parásito no se presenta una transmisión zoonótica. El control se basa en vigilar y tratar de evitar la contaminación de agua y alimentos con materia fecal. Algunas intervenciones particularmente efectivas son la educación sanitaria, la higiene personal, la disposición adecuada de la materia fecal y lavarse las manos. La protección y manejo adecuado del agua puede disminuir
considerablemente la endemia y epidemia de esta enfermedad. Como en el caso de Giardia, los quistes de Entamoeba también son resistentes a tratamientos convencionales con cloro, sin embargo éstos pueden ser eliminados con iodo o hirviendo el agua. Los procesos de sedimentación y
filtración son efectivos para remover los quistes de Entamoeba.
Antecedentes particulares
Una de las moléculas de adherencia mejor caracterizadas sobre la superficie de los trofozoítos de E. histolytica es la lectina inhibible con Gal/GalNAc. La lectina esta compuesta por una subunidad pesada de 170 kDa unida por enlaces disulfuro con la subunidad ligera de 35/31 kDa y la asociación no covalente de la subunidad intermedia de 150 kDa. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste de un dominio putativo extracelular dividido en tres regiones con base en la composición de aminoácidos y un dominio citoplásmico carboxi-terminal formado por 41 aminos ácidos (12). La cadena pesada, modula la adherencia in vitro de los trofozoítos hacia una gran variedad de células blanco (6, 12).
La subunidad intermedia (Igl), conocida como la lectina de 150 kDa (16) se asocia en forma no covalente con la lectina heterodimérica de 260 kDa (6, 12). Esta proteína inicialmente se identificó como blanco de anticuerpos que bloquean la adherencia de los trofozoítos, más recientemente se ha demostrado que se asocia en forma estrecha con la lectina inhibible Gal/GalNAc. La lgI esta presente en pequeñas cantidades de preparaciones de la lectina Gal/GalNAc purificada por cromatografía de afinidad, usando la galactosa como ligando, ó por cromatografía de afinidad utilizando una columna acoplada a un anticuerpo anti-Hgl. En forma similar, la Hgl esta presente en pequeñas cantidades en preparaciones de la Igl purificada con el anticuerpo monoclonal dirigido contra esta última. En geles nativos, estas proteínas forman un complejo que migra con un peso molecular aparente de 380 kDa (12).
En el caso de E. histolytica ha sido posible clonar dos copias diferentes de genes de la Igl (6, 12). Los genes que codifican para estas proteínas tienen un 84% de identidad y codifican para 1101 aminoácidos con secuencias señales hidrofóbicas en el extremo carboxi-terminal de tipo GPI (proteína anclada a membrana). Se ha calculado un peso molecular para la Igl1 e Igl2 de 119,987 kDa y 119,513 kDa, así como un punto isoeléctrico (pI) de 5.03 y 5.61 respectivamente. En contraste, el peso molecular estimado y el punto isoeléctrico de la Igl son de 150 kDa y 6.9, lo cual sugiere la existencia de modificaciones post-traduccionales en la proteína nativa. Los residuos de aminoácidos más abundantes son las cisteínas (12.3%), lisinas (9.5%) y treoninas/serinas (ambas 8.9 %). El análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína predice la existencia de 12 sitios potenciales de N-glicosilación y O-glicosilación. Las proteínas Igl carecen del motivo de unión a carbohidratos, sin embargo poseen una secuencia idéntica a la glicoproteína variente de superficie (VSPs) identificada en Giardia lamblia. El análisis de la secuencia incluye algunos de los motivos “CXXC” de las VSPs implicadas en las interacciones proteína-proteína (6, 12).
E. histolytica ingiere bacterias del lumen del colon y lisa células epiteliales del hospedero después de la invasión de la pared del intestino (17). A la fecha se han caracterizado varios determinantes de virulencia amibiana, incluyendo a la lectina Gal/GalNAc involucrada en la adhesión a células del hospedero, cistein proteasas que degradan CME y péptidos formadores de poros (ameboporos) capaces de lisar células blanco (17). El análisis reciente del genoma de E. histolytica, revela redundancia en los genes codificantes de estos factores de virulencia. Se han identificado 30 genes homólogos de la subunidad intermedia y un homólogo de la subunidad pesada de la lectina Gal/GalNAc. Así mismo se han identificado 10 nuevos genes que codifican para proteasas con un anclaje transmembranal N-terminal, el cual puede permitir que éstas se localicen en la superficie de la membrana de la amiba. Así mismo existen tres nuevos genes que codifican para ameboporos y un homólogo de hemolisina, sugiriendo que además de los ameboporos, las hemolisinas pueden jugar un papel importante en la lisis de las células del hospedero (18).
E. histolytica utiliza un sistema de transducción de señales muy complejo, con el cual puede censar e interactuar con los diferentes ambientes en los que se encuentra. Hasta ahora se han identificado al menos 270 proteína-cinasas, las cuales están representando a las 7 familias de la superfamilia de cinasas de eucariontes superiores (18). Estas incluyen tirosina cinasas con dominios SH2, proteínas similares a proteína-tirosin-cinasas y 90 receptores putativos del tipo Ser/Tre cinasas. Estas cinasas de tipo Ser/Tre no son frecuentes en los protistas, aparentemente están ausentes a partir de Dictyostelium y se han descrito previamente solo en plantas, animales y Choanoflagelados (18).
Todos los receptores de tipo Ser/Tre cinasas contienen un péptido señal en el extremo N-terminal, un dominio extracelular, una estructura transmembranal de tipo hélice y un dominio citosólico con actividad de tipo cinasa. Los receptores con actividad de cinasa se agrupan de acuerdo a sus diferencias en el dominio extracelular. El primer grupo consta de 50 proteín-receptor cinasas que contienen repetidos CXXC similares a los encontrados en la subunidad intermedia (Igl) de la lectina de E. histolytica y en la proteínas variantes específicas de superficie de G. lamblia. Así mismo se ha identificado un segundo grupo de 32 proteínas con dominios ricos en repetidos CXC. El tercer grupo identificado, esta constituido por 8 proteínas tipo receptores con actividad de cinasa que carecen de dominios extracelulares ricos en cisteína (18).
Aunque no se han podido identificar efectores inmediatos río abajo a los receptores de tipo cinasa, E. histolytica contiene genes que codifican para al menos 100 proteínas con actividad de fosfatasa, las cuales desfosforilan proteínas. El genoma de E. histolytica codifica para numerosos receptores de tipo serpentin-transmembranal y proteínas G triméricas, las cuales están probablemente involucradas en la modulación de la estimulación autocrina del enquistamiento (19). En contraste a la estimulación autocrina de la esporulación de Dictyostelium, la cual emplea AMPc, el enquistamiento de E. histolytica es por si mismo estimulado por la secreción de catecolaminas (19). Finalmente, E. histolytica tiene numerosas proteínas citosólicas involucradas en
la transducción de señales, incluyendo proteínas de la familia Ras, proteínas de unión a calcio, cinasa de la fosfatidilinositol-3-OH y MAP cinasas. Estas representan una variedad de proteínas relacionadas con la señalización descrita en eucariontes superiores (18).
E. histolyitca posee tres tipos de receptor con actividad de tirosina cinasas: un grupo que
contiene repetidos CXXC en el dominio extracelular, un segundo grupo con repetidos CXC y un tercero el cual carece de dominios ricos en cisteína [NCR]. Los trofozoítos tienen Tirosinas cinasas citosólicas, sin embargo no presentan hasta el momento receptores con actividad de tirosina cinasas. Algunas serin/treonin fosfatasas [S/TP] contienen un dominio de union LRR. Proteína de unión a calcio CaBP; diacil grlicerol [DAG]: proteína G; proteína activadora (GAP) de GTPasa; factor intercambiador de nucleotidos de guanina [GEF]; inositol-1,4,5-trifosfato [IP3]; cinasa de fosfatidilinositol-3-OH [PI(3)K]; fosfatidil inositol 4,5-bifosfato [PIP2], fosfatidil inositol-3,4,5-trifosfato [PIP3], proteína cinasa C [PKC], fosfolipasa C [PLC], fosfatasa y homologo de tensina [PTEN], fosfatasa de tirosina [TyrP], receptores con 7 dominios transmembranales [7TM] (18).
Reportes previos han demostrado la presencia de moléculas en la superficie de los trofozoítos de E. histolytica, con características de receptores para CME (20). En el caso de la proteína de 140 kDa se ha reportado que ésta
Receptores CXXC Receptores CXC R ecp et or es 7T M Re ce pt or es s in do min ios ric os e n C Proteínas blanco fosforiladas Proteínas blanco no-fosforiladas Proteínas blanco fosforiladas Proteínas blanco no-fosforiladas Receptores CXXC Receptores CXC R ecp et or es 7T M Re ce pt or es s in do min ios ric os e n C Proteínas blanco fosforiladas Proteínas blanco no-fosforiladas Proteínas blanco fosforiladas Proteínas blanco no-fosforiladas
es una molécula funcional, bioquímica y antigénicamente similar a las integrinas β1 (21).
Una de las principales consecuencias de la unión de las integrinas con su ligando es la activación de proteínas con actividad de tirosina cinasa (TPK). Recientemente se ha demostrado que cuando los trofozoítos son incubados con FN, las TPKs se activan y se asocian con el receptor amibiano de tipo integrina β1 (22). Recientemente en trofozoítos estimulados con FN, se identificó la activación y asociación de la cinasa FAK y de las proteínas estructurales, vinculina y paxilina con el receptor de tipo integrina β1 (23). Así mismo se reportó que el anticuerpo monoclonal 3C10 (AcM3C10) dirigido contra el receptor a FN (molécula de 140 kDa), inhibe la adhesión de los trofozoítos a CME (24). Ensayos de microscopía electrónica demostraron que este receptor se localizó en la superficie celular y en membranas vacuolares (24).
Integrinas
Las interacciones de las células con la membrana basal y con la matriz extracelular son cruciales durante el mantenimiento de la integridad de los tejidos, la embriogénesis, la reparación de lesiones y el proceso metastásico de las células tumorales. Estos procesos involucran la adhesión y migración celular. Los eventos adhesivos y migratorios requieren de la participación de proteínas citoplásmicas, las cuales forman complejos multiproteícos, permitiendo la comunicación funcional entre estas y otras moléculas.
La adhesión celular es mediada a través de receptores de adhesión celular o glicoproteínas transmembrananles que unen a componentes de la matriz extracelular (CME) o a sus contrareceptores presentes en otra célula. La familia de los receptores incluye a las caderinas, selectinas, sindecanos, la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgCAMs) y a las integrinas.
Las integrinas comprenden una gran familia de glicoproteínas transmembrananles. Son moléculas heterodiméricas compuestas por una
subunidad α y una β. El extremo N-terminal de las subunidades α y β presentan un dominio extracelular extenso que se une a los CME, en el extremo C-terminal de las subunidades se presenta un dominio citoplásmico pequeño (con excepción del dominio citoplásmico de la subnunidad β4 que se asocia con el citoesqueleto y proteínas de señalización (25). Las integrinas pueden señalizar en ambas direcciones, cuando estas proteínas se unen a CME se promueve la asociación del receptor con el citoesqueleto de actina y se activan señales bioquímicas en el interior de la célula (señalización) (26). En cambio, las señales intracelulares pueden inducir la unión de las integrinas con el ligando (activación) (27).
Las integrinas son heterodímeros funcionales cuando se asocian en la membrana plasmática. El receptor funcional es responsable de censar, transmitir y disparar una serie de
procesos intracelulares a través de vías de señalización especificas; la consecuencia de esta serie de eventos modifica el microambiente extracelular, de esta manera las integrinas son un importante eslabón entre los estímulos externos y la dinámica celular.
La familia de las integrinas en mamíferos incluye 18 distintas subunidades α y 8 subunidades β, la combinación de las cuales potencialmente genera 24 distintos heterodímeros αβ (25).
Las integrinas regulan la estructura y arquitectura de los tejidos celulares y al mismo tiempo orquestan la transducción de señales externas, modulando
Diferenciación, Apoptosis y Crecimiento
α
β
Ligando Reconocimiento del ligando Dominios Citoplásmicos Influjo de Ca2 Fosforilación en Tirosina Activación decinasas Organización del
citoesqueleto expresión de genesRegulación de la Otras rutas de señalización Interacciones Señalización “Inside-Out” Señalización “Outside-In”
Integrina
una diversidad de funciones celulares. Es decir las integrinas son receptores que censan estímulos externos y que simultáneamente transducen esta señalización a través de la formación de complejos multiproteínicos que finalmente fosforilan factores de transcripción, los cuales regulan la expresión de genes.
Las integrinas participan en la formación y remodelación de los complejos de adhesión, lo
que induce un cambio en la dinámica del citoesqueleto, promoviendo directamente el movimiento celular. Paralelamente la regulación en la expresión de genes que participan en el mantenimiento celular y ciclo celular. De tal manera que las integrinas son moléculas que coordinan procesos celulares interconectado por vías de señalización específicas.
Activación y Modulación de la expresión de las integrinas
Trabajos recientes han establecido que las integrinas se presentan en la superficie celular por lo menos en tres diferentes estados conformacionales (28). En el estado de conformación inactiva de las integrinas, éstas se encuentran plegadas en si mismas y presentan una baja afinidad por el ligando, además son incapaces de llevar a cabo un proceso de señalización. Las integrinas sensibilizadas se encuentran erguidas y ordenadas en la membrana plasmática, son capaces de unirse con elevada afinidad al ligando y como resultado de esta unión ocurre un cambio en la conformación de la cadena β, promoviendo la separación de los dominios citoplásmicos, lo que permite la
Movimiento celular Dinámica de actina Remodelación de complejos adhesión Integrinas Regulación de expresión de genes y ciclo celular Supervivencia celular Movimiento celular Movimiento celular Dinámica de actina Dinámica de actina Remodelación de complejos adhesión Remodelación de complejos adhesión Integrinas Integrinas Regulación de expresión de genes y ciclo celular Regulación de expresión de genes y ciclo celular Supervivencia celular Sobrevivencia celular
Las integrinas en la formación y remodelación de los complejos de adhesión
formación del complejo de señalización. El cambio de la conformación puede ser transmitido a través de la membrana en cualquier dirección, lo que conlleva a que el proceso de activación pueda también ser blanco de una señalización interna y/o externa. La separación de los dominios citoplásmicos induce cambios en el dominio extracelular, específicamente en el sitio de unión al ligando, el cual presenta un aumento en la afinidad del receptor, en consecuencia las integrinas se agrupan y se promueva la activación de la ruta de señalización. Finalmente las integrinas activas y la formación del complejo de señalización es regulado tanto por las concentraciones extrínsecas del ligando como por la actividad de la ruta de señalización intrínseca (29, 28).
Estados conformación holees de las Integrinas. La señalización y activación por integrinas son mediadas por cambios conformacionales que son propagados desde la cabeza (extremo extracelular) hasta el dominio citoplásmica de la integrina y viceversa (27). Las integrinas existen en dos conformaciones alostericas principales, la inactiva, (estado de baja afinidad por el ligando) y la activa (estado de elevada afinidad por el ligando). El estado inactivo se caracteriza por una débil interacción entre la porción C-terminal del segmento transmembranal de las dos subunidades (empalme o cierre de subunidades). Cuando el ligando se une a la cabeza de las integrinas, éste induce un cambio conformacional que es propagado a lo largo de las dos extremos o piernas de las integrinas (en un inicio se encuentran torcidas), experimentando un cambio que permite el desplazamiento y la adquisición de una conformación erguida, mientras que la unión entre ambos extremos transmembranales se mantiene débil y estable. Este estado conformacional modera probablemente el desplazamiento más distante de los dominios citoplásmicos de ambas subunidades, permitiendo así la interacción con el citoesqueleto. En tanto los activadores intracelulares están listos para interactuar con cualquier extremo de las subunidades α y β e inducir en el extremo C-terminal de los segmentos transmembrananles y los dominios citoplásmicos la separa ración de una forma de la otra en el dominio C-terminal de las subunidades α y β. El continuo enderezamiento de los extremos de las integrinas puede causar el cambio conformacional que permite la apertura de la cabeza de las subunidades, permitiendo que las integrinas se unan al ligando con una mayor eficiencia. La talina es una proteína que se autoinihibe, cuando se une PIP2 o se promueve una actividad proteolitica sobre ésta, la cabeza se separa del resto de la proteína y se expone el dominio F3 (dominio FERM presente en ERM; ezrina, radixinina y moesina) el cual se caracteriza por presentar un residuo de Y (747) y un residuo aromático (W), el cual es conservado en los C-terminal de las integrinas β. De esta manera la talina se une primero al sitio disponible de unión con elevada afinidad en la región central del tallo de la β y subsecuentemente al sitio de baja afinidad, es decir la porción helicoidal en el extremo del segmento transmembranal, provocando la separación de los dos tallos de las subunidades, probablemente esto también promueve la perturbación del cierre o empalme después de la unión de la talina (27).
INACTIVO ACTIVO AGREGADO
Integrina ligando
Talina vinculina
actina
INACTIVO ACTIVO AGREGADO
Integrina ligando Talina vinculina actina
*
*
F3 F2 β3 W N X Y P (- 8 ) PIPEn líneas parentales derivadas de melanoma, se ha reportado la presencia de niveles elevados de transcriptos (RNAm) correspondientes a la integrina αVβ3 y a transcritos que codifican para el receptor de tipo urocinasa que activa el plasminogéno (uPAR). Utilizando un antisentido que codifica para la integrina (αV) se observó una disminución en los transcritos de uPAR. Así mismo, un anticuerpo anti-integrina causa una disminución de los RNAm de uPAR. Estos resultados sugieren que la expresión de uPAR en las células esta asociada a la expresión y función del receptor αVβ3 (30).
En una gran variedad de células se ha reportado que el factor necrosante de tumores (TNFα) modula la expresión de diversas subunidades de los receptores de tipo integrina. Así mismo, estos receptores pueden promover ó inhibir la muerte celular y modular la producción de mediadores inflamatorios, en los que se incluye al TNFα (31). Ratones que carecen de TNFα/TNFβ, presentan un desarrollo anormal de la placenta durante el proceso de gestación (31). En células de trofectodermo, derivadas de ratones carentes de TNFα se ha observado que no existen alteraciones en la expresión de la subunidad β1, sin embargo se presenta una alteración notable en el proceso de migración en estas células (31), indicando que estas citocinas pueden ser interruptores que permiten el cambio en la expresión de las integrinas. Dependiendo del tipo celular, en el caso del IFNγ se ha demostrado tanto aumento como disminución en la expresión de las integrinas. Las subunidades de las integrinas α2, α5, α6 y β1 son sobre expresadas en timocitos (31) mientras que en células endoteliales se observa una disminución de la integrina α5β3, ambos tipos celulares tratados con IFNγ. En células T-citotóxicas, se ha observado que la producción de IFNγ puede ser alterada cuando se bloquea con anticuerpos específicos a la subunidad α6 (31).
Estudios realizados con redes tridimensionales de colágena han mostrado una inducción en la translocación de p50, un miembro de la familia de
los NFKB y la degradación de un inhibidor de la proteína NFKB, la proteína IK B-α. La inhibición de NF-KB por SN50, un péptido inhibidor de la translocación nuclear de NF-KB, disminuye significativamente la inducción de los RNAm y los niveles de proteína de la subunidad α2, inducida por la red tridimensional de colágena. Así mismo se ha reportado que en el promotor del gene de esta subunidad (-549 y -351pb) se encuentra la región que confiere la inducibilidad por las redes tridimensionales de colágena (32). El empleo del péptido inhibidor SN50 ó de la mutante IKB-α 32,36 inhiben el proceso de inducibilidad, indicando que la activación de la expresión es posiblemente mediada por NF-KB a través de esta región. Aunque estos tres factores formaron complejos DNA-proteína, con regiones que fueron sensibles a la inhibición de la translocación nuclear de NF-KB, el mismo NF-KB no estuvo presente directamente en los complejos de unión. Por lo tanto, los ensayos con redes tridimensionales de colágena sugieren un mecanismo regulado por NF-KB en la expresión del gene α2, (32). Así mismo se ha reportado que el papel de NF-KB en la reorganización y contracción de la red tridimensional de colágena, es un proceso que requiere la presencia de abundante integrina α2β1. La inhibición de la actividad de NF-KB por el SN50 principalmente bloqueó la contracción, sugiriendo que la activación por redes tridimensionales de colágena modula la regulación de la expresión del gene α2, y regulan de manera importante el proceso de contracción, participando así en la remodelación de los tejidos (32).
La movilización de las integrinas también ha sido estudiada utilizando fármacos como ésteres de forbol (PMA). En leucocitos polimorfonucleares (PMN), se observó que el PMA puede promover la movilización de receptores de tipo integrina, a partir de pozas preexistentes de receptores. Estas integrinas se encuentran almacenadas en gránulos, que en tinciones, se muestran negativos a la peroxidasa. Como resultado de la activación se observa que las integrinas se translocan hacia la membrana de la célula (33).
En PMN sembrados sobre FN, se ha demostrado que α5β1, una de las integrinas que unen a este componente de matriz, se promueve la movilización de [Ca++] i. Así mismo se ha reportado que las α5β1 se encuentran localizadas
en vesículas endocíticas y que la α5 coloaliza con un marcador para un compartimiento de reciclaje endocítico. Cuando el [Ca++] i es amortiguado, la integrina α5β1 empieza a concentrarse en la zona posterior de las células adherentes, sugiriendo que el tránsito de [Ca++] i es requerido para la desunión de la integrina α5β1 del sustrato. La inhibición de la desunión del receptor α5β1, por la amortiguación de [Ca++]
i resulta en la disminución de la subunidad α5 a partir de las vesículas endociticas y del reciclaje del compartimiento. Por lo tanto se sugiere que las integrinas están siendo recicladas por una ruta de endocitosis y tráfico intracelular durante la migración celular. Este modelo se sustenta con la demostración del reciclaje del compartimiento endocítico, reorientándose hacia la zona posterior durante la formación de una lamela cuando migran los PMN, lo que indica que el reciclaje de la membrana durante la migración de los neutrófilos tiene direccionalidad (34).
Modelo hipotético del reciclaje de integrinas y la agregación en los contactos focales (FCs). Las integrinas de superficie son probablemente internalizadas por endocitosis (1)
concentrándose en torno al núcleo en tiempos de 30 min a 1 h. Posteriormente a través de un sistema dependiente de actomiosina las integrinas son transportadas en vesículas hacia la cara ventral de la célula (2), en este sitio se agregan, todo esto mediado probablemente por exocitosis, localizándose este evento en un extremo de la extensión del FC (las flechas verdes muestran la secuencia de estos eventos) (3). La flecha azul indica la direccionalidad del crecimiento del FC. Aparentemente el crecimiento del FC se interrumpe cuando éste alcanza alrededor de 7 µm (34,35).
1 2
3
Dirección del crecimiento del contacto focal
