INFORME 3

PRACTICA N° 03 y 04

PRACTICA N° 03 y 04

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS, CONTEO DE BACTERIAS

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS, CONTEO DE BACTERIAS

VIABLES Y TINCION GRAM

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I.1. Obje!"# $e%e&'(

I.1. Obje!"# $e%e&'(

•

• PrepPreparacaración de ión de medmedios de ios de culcultivtivo o a a partpartir deir de Mac Conkey Agar y aMac Conkey Agar y a

 partir de leche de tigre “ceviche”.  partir de leche de tigre “ceviche”.

I.). Obje!"#* e*+e-!#*

I.). Obje!"#* e*+e-!#*

•

• ReaRealizalizar r el el conconteo de teo de bacbacteriterias as viaviablebles s en en una muestuna muestra ra comcomo o unun

mtodo para evaluar el crecimiento microbiano. mtodo para evaluar el crecimiento microbiano.

•

• CoCononocer cer el el !u!undndamamenento to de de cocololoracracióión n de de lalas s babactecteriarias s papara ra ser ser 

observadas a travs del microscopio. observadas a travs del microscopio.

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"no o de de lolos s sisiststememas as m#m#s s imimpoportrtanantetes s papara ra la la ididenentiti!i!icacacición ón dede microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias arti!iciales preparadas en el laboratorio. $l material alimenticio en el %ue arti!iciales preparadas en el laboratorio. $l material alimenticio en el %ue crecen los microorg

crecen los microorganismoanismos es s es elel

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y el y el crecimicrecimiento deento de lo

los s mimicrcroooorgrgananisismomos s es es elel

C(!"#

C(!"#

. . PaPara ra %u%ue e lalas s babactecteririas as crecrezcazcann adecuadamente en un medio de cultivo arti!icial& ste debe reunir una adecuadamente en un medio de cultivo arti!icial& ste debe reunir una seri

serie e de de concondicdicioniones es taletales s comcomo' o' temtemperperaturatura& a& gragrado do de de huhumedmedad ad yy  presión

 presión de de o()geno o()geno adecuado& adecuado& as) as) como como un un grado grado correcto correcto de de acidez acidez oo alcalinidad. "n medio de cultivo debe contener los nutrientes y !actores alcalinidad. "n medio de cultivo debe contener los nutrientes y !actores de crecimiento necesarios y debe estar e(ento de todo microorganismo de crecimiento necesarios y debe estar e(ento de todo microorganismo contaminante.

contaminante.

Me&2, )00)

Me&2, )00)

II.1

II.1.1.

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#5

Página 1 Página 1

*eg+n su estado !)sico'

L-6!/#*5

"sualmente se denominan caldos ya %ue contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado n+mero de microorganismos. $,. Caldo nutritivo.



S(!/#*5

*e pueden preparar a partir de medios l)%uidos a los cuales se les a-aden agentes solidi!icantes como agar& gelatina o s)lica gel. *e utilizan con !recuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. $,. Agar nutritivo.

 C('"e((, L., 177).

II.).

C#%e# B'e&!'%#

$l crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde di!erentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar  la medida del crecimiento mediante diversas metodolog)as.

$l conteo bacteriano se-ala la magnitud de la población total bacteriana. $n ese sentido se puede determinar por diversas tcnicas %ue se basan en algunos de los siguientes tipos de medida' cuenta celular directamente al microscopio o mediante un contador electrónico de part)culas o indirectamente con la cuenta de colonias/& masa celular en !orma directa  pesando el contenido celular del nitrógeno o indirectamente por 

turbidimetr)a& proporcional al n+mero de clulas/ y actividad celular  indirectamente relacionando el grado de actividad bio%u)mica al tama-o de la población bacteriana/.

O&e$', Y8 9e"e/# :, 1771.

II.).1. C#%e# E% P(''* Pe&!

$s el mtodo m#s usado para el conteo de bacterias. 0as muestras del cultivo de bacterias son distribuidas en Placas Petri %ue son contenedoras de agar  alimento de las bacterias/. $s de suponerse %ue cada clula  se dividir# en sus m+ltiples alrededores para producir  colonias separadas en el agar. Cada clula es llamada unidad !ormadora de colonias "1C/. 2espus de la incubación& el n+mero de colonias se re!le,ar# en el n+mero de clulas "1C originalmente  presentes. $s importante considerar un n+mero limitado de colonias  pues de no ser as)& stas pueden sobre poblarse y di!icultar el conteo de las mismas. $l conteo se !acilita utilizando un contador de colonias. $ste mtodo es deseable por%ue arro,a el total de clulas viables sólo clulas vivas/3 en contraste con el conteo microscópico y el conteo de peso seco. "na desventa,a radica en el tiempo %ue re%uiere para producir las colonias& ya %ue se necesitan como m)nimo veinticuatro horas o m#s. Por otra parte& no es cien por ciento !iable  por%ue generalmente las colonias crecen unidas en cadenas o en

grupos.

D!# y BBL, )003.

II.3.

T!%!% /e G&';

*eg+n

Pe/&# :. M'e#* )##<.

 $s la tcnica de tinción di!erencial m#s importante %ue se utiliza en bacterias. $l primero en describirla !ue el dans Christian 4ram. Consiste b#sicamente en a-adir lo siguiente'

 Cristal violeta colorante azul/

 0ugol mordiente& sustancia no colorante %ue re!uerza la acción de un colorante/

 $tanol 567 decolorante %ue remueve el colorante de ciertas bacterias/

 *a!ranina colorante de contraste& ro,o/

$sta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias seg+n la composición de la pared celular3 las 4ram 8/ %ue no retienen el comple,o cristal violeta8lugol despus de la decoloración con alcohol y aparecen te-idas de ro,o& y las 4ram 9/ %ue s) lo retienen y aparecen te-idas de azul oscuro.

II.4.

T!+#* /e ;e/!#* /e (!"#*

*eg+n se mencionó& los medios de cultivo en distintas !unciones y& con base en ellas es posible clasi!icarlos en'

II.4.1. Me/!#* *e(e!"#*

Cuando de una mezcla bacteriana interesa aislar espec)!icamente un solo tipo de bacteria %ue est# en escasa cantidad& es recomendable utilizar medios selectivos.

2ichos medios permiten el crecimiento de esa bacteria& inhibiendo al resto de las e(istentes en la muestra. Cada producto inhibe a un grupo de bacterias sin a!ectar a otras. Prats& :;;</

II.4.). Me/!#* /!e&e%!'(e*

Permiten distinguir con mayor !acilidad las colonias del microorganismo deseado de otras colonias %ue crecen en la misma  placa. 2e manera similar& los cultivos puros de microorganismos

tienen reacciones identi!icables con los medios di!erenciales& sea en tubos o en placas. =ortora et al.& :;;>/.

II.4.3. Me/!#* *e(e!"#=/!e&e%!'(e*

$n los medios selectivos siempre crecen algunas bacterias di!erentes a la buscada& por ello& para di!erenciar las distintas colonias& se a-ade a los medios selectivos sustancias %ue con!ieren un color di!erente a las colonias seg+n la distinta actividad metabólica de las bacterias %ue las !orman& convirtindolos en medios selectivo8di!erenciales. Para ese propósito se utilizan az+cares como el manitol& la lactosa& el sorbitol y otros& ,unto con un indicador de p? ro,o neutro& azul de  bromotimol& etc./. Prats& :;;</

II.4.4. I%b'!%

Cada tipo de bacteria re%uiere para su multiplicación una temperatura y atmós!era adecuada. Por ello& una vez sombrados los medios de cultivo& deben llevarse a la estu!a& en cuyo interior e(iste la temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias& %ue es de @< a @> 7C. Prats& :;;</

III.

MATERIALES

III.1. M'e&!'(e*

III.1.1.M'e&!' P&!;'=I%*;#*

Mac Conkey Agar .< g/. 0eche de tigre Bml

Agua destilada 5;ml

=

III.1.).M'e&!'(e*

• Placa Petri (9cm de diámetro, material de vidrio )

• Pipeta (35cm x 0.6cm de 10ml, material de vidrio pirec) • Tubos de ensao (10cm x 1.!5cm, material de vidrio pirec)

• "atra# (15cm x $cm de !50ml, de material vidrios pire%) • Papel cra&t (material de una pulpa celulosa suspendidas en

a'ua) Papel aluminio

III.1.3.E6!+#*

• Autoclave. (.5cm x 9$cm *+ %essel .-) • alanza anal)tica. • Agitador. • Calculadora.

• Microscopio. primo estar D$B8:D P5<8C / Primo B;;(EB.:<oil

FE;.B>/

• Conta colonias. colony meter =GM*8"*A *CH$IC$8=$C?

CJGGP. 0A CM8B/

=

IV.

PROCEDIMIENTO

=

=

0a pr#ctica de laboratorio se realizar# en tres etapas& tal como se detalla continuación.

=

4.1.

P&!;e&' e'+'.=

Preparar para la esterilización los materiales %ue se usaran en la pr#ctica de laboratorio& matraz& pipeta& placas Petri& tubos de ensayo/ tapando los ori!icios con algodón y envolvindolos con papel cra!.

=

=

4.).

Se$%/' e'+'.=

0a segunda etapa consistir# en preparar la cantidad de deshidratado& %ue servir#n de alimento para las bacterias.

=

=

Pesar la cantidad e(acta del medio deshidratado. Cerrar  inmediatamente el !rasco de medio de cultivo.

=

=

2isolver las porciones pesadas en 5; ml de agua destilada en vaso  precipitado.

=

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$laboración propia :;B6/.

=

=

=

=

Colocar la me mezcla obtenida en un respectivo matraz y taponear la entrada con algodón y sobre este con papel cra!& hacer un nudo simple con un pabilo.

=

=

0levar muestras de los deshidratados ,unto con los materiales a esterilizar a la autoclave& de,#ndolo por un periodo de B< minutos a una temperatura de B:B 7C& de,#ndolo por < min.

=

=

4.3.

Te&e&' e'+'.=

 $n la tercera etapa se proceder# a realizar los cultivos de bacterias de,#ndolas solidi!icando& durante K horas& para  posteriormente realizar el conteo de bacterias.

=

Aguitar bien cada dilución y con la pipeta trans!iere B ml de dicha dilución al tubo de Agar correspondiente.

=

=

=omar con la pipeta e(actamente B ml de Muestra previamente acondicionada de la muestra a un tubo con 5 ml de agua destilada y agita bien la muestra obtendr#s una dilución de B;8B _LB'B;.

=

=

=rans!erir e(actamente B ml de esta dilución a un segundo tubo con 5 ml de agua destilada& mzclala bien

.

Gbtendr#s una disolución de B;8:

LB'B;;.

=

=

Repite la operación usando un tercer tubo con 5 ml de agua estril

,

Gbtendr#s una disolución de B;8@ _{L B'B;;;.}

=

=

ierte la mezcla en una placa Petri previamente preparada con el agar  nutritivo rotulada y ag)tela con cuidado.

=

=

"na vez %ue haya solidi!icado& invierte las ca,as e inc+balas a @>NC durante K horas.

=

=

Al !inal del periodo de incubación& cuenta las colonias en cada placa Petri& con el mtodo previamente e(plicado en clases.

=

=

=

Anota los resultados de cada dilución y calcula el n+mero promedio de clulas por mililitro de muestra en la muestra original. $l n+mero de colonias obtenidas se multiplica por el rec)proco del !actor de dilución determinando as) el n+mero original de bacterias. Por  e,emplo si se contaron >: colonias en la dilución B;8@ _{B'B;;;/ se}

multiplica >: O B;;;. B;;; es el rec)proco de B;8@_/.

=

=

P&#e/!;!e%# +'&' (' /e !%!% $&';

$(traer de una colonia las bacterias y sumergir en una gota de agua sobre la porta ob,etos.

*e de,a secar cerca al mechero para luego pintar. *e pinta con cristal violeta azul/ por B< min. *e lava con abundante agua.

*e agrega lugol como un !i,ador *obre eso se lava con el alcohol 5<7 0avar con abundante agua.

*ecar cerca del mechero

*e de,a secar cerca a al mechero para luego llevar al microscopio& pero antes de llevar al microscopio se le agrega una gota de aceite inmerso& solo para mirar en el microscopio. Anotar los resultados.

=

=

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=

 M' C#%2ey A$'&

=

<; g. B;;; ml

=

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=

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=

V.

RESULTADOS

=

C'/&#  1 #%e# /e b'e&!'* "!'b(e*

=

C#%e# /e B'e&!'*

=

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$laboración Propia :;B</.

=

@K.<( 6@.6: L :@6.66 "1CEB;8B _{:@66.6 "1CE ml}

=

L :( B;86 _{"1CE ml no}

aceptable



;

L 0)mite microbiológico %ue separa la calidad aceptable de la rechazable. $n general& un valor igual o menor a “m”& representa un producto aceptable y los valores superiores a Qm” indican lotes aceptables  inaceptables.

=



M

L 0os valores de recuentos microbianos superiores a QMQ son inaceptables& el alimento representa un riesgo para la salud.

=

• 0a coloración de las bacterias es para ser observadas a travs del

microscopio y determinar si son bacterias de gram 8/ o gram 9/.

=

2e a la !oto n7 B %ue se tomó en el laboratorio de microbiolog)a en la "niversidad Iacional de Mo%uegua.

=

VI.

CONCLUSIONES

=

• *e logró preparar los medios de cultivos adecuadamente con los nutrientes

deshidratados y las muestras %ue se ten)an %ue traba,ar& a su vez tambin se indicó el mtodo de esterilización adecuado para el presente traba,o.

=

• *e realizó con (ito el conteo de bacterias viables& tomando cuatro

cuadrantes de placa Petri& evalu#ndose el promedio del crecimiento microbiano !inal respecto a cada placa con su muestra& %ue se pueden ver en los cuadros de resultados.

• *e determinó %ue la leche de tigre no es apto para el consumo por%ue se

encuentra en el rango de M : ( B;86. _{/. las bacterias encontradas en el}

alimento son de gran negativo.

=

=

VII.

BIBLIOGRA:IA

=

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