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Bandeo cromosómico 1

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(1)
(2)

¿PARA QUE?

En algunas especies los pares

cromosómicos no pueden diferenciarse

claramente considerando sólo sus

componentes distintivos en sentido

longitudinal;

se debe recurrir a técnicas citológicas

especiales para la tinción de los

cromosomas,

Se evidencian "bandas" transversales

(oscuras y claras) que corresponden a los

distintos tipos de cromatina.

(3)

TECNICAS MAS USADAS

Bandeo G

Bandeo Q

Bandeo R

Bandeo C

Bandeo NOR

(4)

BANDEO G

Se utiliza tratamiento con

tripsina

previo a la

utilizacion de

Giemsa

ya que la tripsina

degrada la proteinas y da lugar a bandas

claras

y

oscuras.

Bandas Oscuras:

Regiones de ADN ricas en

A-T

y pobres en genes constitutivos.

Bandas Claras:

Regiones de ADN con

G-C

Y

en genes constitutivos

Regiones A-T son resistentes a la tripsina lo cual genera una coloración oscura en el bandeamiento.

(5)

Mayor nivel de bandas = Mayor calidad del estudio

(6)

BANDEO Q

Se

basa en el uso de colorantes fluorescentes

como la

quinqcrina.

Dando a lugar bandas

brillantes

y

oscuras.

Técnica similar al bandeo

G

Bandas Brillantes:

Contienen regiones ricas

en

A-T.

Bandas oscuras

:

G-C

Regiones con G-C reprimen la fluorescencia y por eso no se tiñen, al contrario que las regiones con A-T

(7)
(8)

BANDEO R

Técnica opuesta al bandeamiento y se utiliza

el

calor

como desnaturalizante o

BrdU

Bandas oscuras

:

G-C

Bandas claras:

A-T

El calor desnaturaliza las regiones ricas en A-T por eso se visualizan mas las regiones con G-C

(9)

BANDEO C

Marcan

las

regiones

Centromericas

y

pericentromericas.

Permite la tinción de la

heterocromatina

constitutiva.

Se utiliza

hidroxido de sodio

e

hidroxido de

bario

para desnaturalizar el ADN.

(10)

Se usa principalmente para los cromosmas 1, 9

y 16

(11)

BANDEO NOR

Marcan las

regiones de los

organizadores nucleolares

acrocentricos

.( regiones cromosómicas

que forman y mantienen el nucléolo)

(12)

BASES MOLECULARES DEL

BANDEO CROMOSOMICO.

(13)

CLASIFICACIÓN

BANDEOS CROMOSOMICOS MORFOLOGICOS QFQ GTG RFA RHG THG CBG DINAMICOS GBG RBA RBG GB-AAu RB-AAu

(14)

Se basan en técnicas inherentes a la

heterogeneidad de la cromatina.

Importante la relación con proteínas(histónicas y no

histónicas) e interacciones

ADN

.

Se subclasifican en

:

1.

Técnicas de tinción diferencial

2.

Métodos de tinción selectiva

3.

Coloraciones con fluoroeromos específicos

aislados o combinados con colorantes no

fluorecentes

(15)

Nomenclatura Bandeos

Morfologicos

QFQ

:

Bandas Q

por fluorecencia usando

quinacrina.

GTG

:

Bandas G

por tratamiento enzimático

con tripsina utilizando Giemsa.

RFA

:

Bandas R

por fluorecencia usando

naranja de acridina.

RHG

:

Bandas R

mediante desnaturalización

térmica utilizando Giemesa.

THG

:

Bandas T

por desnaturalización térmica

empleando Giemesa.

CBG

:

Bandas C

por hidróxido de bario

utilizando Giemesa.

1) tipo de bandeo 2) técnica de detección empleada 3) tipo de tinción.

(16)

 Incorporación de una base analoga, (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina también bandeo de

replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación.

 Si se incorpora BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C.

 Si se incorpora la base análoga durante la fase tardía de

replicación se obtiene un patrón de bandas G, destacándose las zonas de predominio de secuencias A-T.

 Los cromosomas pueden visualizarce utilizando distintos

métodos de tinción como Giemesa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos específicos

(17)

Nomenclatura Bandeos

Dinamicos

GBG

: Bandas G por incorporación de BrdU

utilizando Giemesa.

RBA

: Bandas R por incorporación de BrdU

empleando naranja de acridina.

RBG

: Bandas R por incorporación de BrdU

utilizando Giemesa.

GB-AAu

: Bandas G por incorporación de

BrdU empleando anticuerpos

específicos unidos a partículas deoro

coloidal.

RB-AAu

: Bandas R por incorporación de BrdU

usando anticuerpos específicos unidos a

partículas deoro coloidal.

(18)

Bromo desexiuridina (BrdU)

Análogo mutagénicamente activo de la timina, en que el

grupo -CH3 en posición 5' se reemplaza por Br.

Tratamiento e investigación del cancer debido a que

aumenta la susceptibilidad de las células a la radioterapia

porque inhibe la reparación de roturas causadas por la

radiación en la doble cadena de ADN

Agente mutagenico:

altera los patrones de transcripción

Aumenta la afinidad de las proteinas cromosomales por

las zonas de la cadena que contengan BrdU,

Altera la unión de proteínas reguladoras a la cadena de

ADN,

Inhibe la expresión de algunas funciones de

diferenciacion celular

(19)

PROCEDIMIENTO

BANDAS G

1.

Envejecer las preparaciones en estufa a 65°C / 14h o 3 dias

a temperatura ambiente

Bandeo GTG

Tripsina desnaturaliza proteinas de cromosomas

Tincion Giemsa o Leishman

Bandeo G con colorante Wright

Protocolo mas usado.

Se introduce la preparacion en solucion salina de 2SSC (Citrato

trisodico disuelto en NaCl 0,3M) durante 1 minuto a 65°C.

Esto permite que se abra la hebra de ADN

Lavar la preparacion con agua destilada y secar al aire.

Teñir con colorante Wright al 0.25% y tampon Sorensen en

proporcion 1 a 3 duraten 3 minutos

(20)

PROCEDIMIENTO BANDA

C

 CBG bandas C obtenidas con hidroxido Barico usando Giemsa

1. Introducir la preparacion en una cubeta con HCL 0.02N a

temperatura ambiente por 10 minutos, lavar con agua y dejar secar al aire

2. Introducir la preparacion en una cubeta a 60°C con Ba(OH)2

saturado durante 1 minuto. Esto despuriniza y desnaturaliza el ADN.

3. Lavar con agua destilada y metanol para eliminar restos de bario dos

veces

4. Dejar secar e incubar en 2xSSC a 65°C / 15 min 5. Lavar la preparacion y dejar secar

6. Teñir con colorante Leishman al 20% o Giemsa durate 5 a 10 minutos

Esta tecnica degrada un 50% del material cromosomico lo que dificulta la aplicación posterior de otras tecnicas.

El unico material que queda teñido es la heterocromatina constitutiva porque resiste a la degradacion

(21)

Procedimiento bandas NOR

1.

Añadir 0.2uL de solucion de nitrato de

plata al 50% filtrada a la preparacion

2.

Adicionar 6 a 8 gotas de formaldehido

al 0.3% (acelera la tincion)

3.

Incubar a 37°C durante 24h protegido

(22)

BIBLIOGRAFIA

http://www.oocities.org/researchtriangle/lab/25

13/bandeos.htm

Cristina Hernando Davalillo, Caracterizacion

de Anomalias cromosomicas en diagnostico

prenatal y postnatal mediante tecnicas de

citogenetica molecular, Tesis Doctoral 2005.

http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis/Docencia/G

enetmed/Bloque_1_2p.pdf

http://geneticahumana.tripod.com/libros/page2

01.html

http://www.fmed.uba.ar/depto/histo1a/genetica

/adm/sg2.pdf

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