¿PARA QUE?
En algunas especies los pares
cromosómicos no pueden diferenciarse
claramente considerando sólo sus
componentes distintivos en sentido
longitudinal;
se debe recurrir a técnicas citológicas
especiales para la tinción de los
cromosomas,
Se evidencian "bandas" transversales
(oscuras y claras) que corresponden a los
distintos tipos de cromatina.
TECNICAS MAS USADAS
Bandeo G
Bandeo Q
Bandeo R
Bandeo C
Bandeo NOR
BANDEO G
Se utiliza tratamiento con
tripsina
previo a la
utilizacion de
Giemsa
ya que la tripsina
degrada la proteinas y da lugar a bandas
claras
y
oscuras.
Bandas Oscuras:
Regiones de ADN ricas en
A-T
y pobres en genes constitutivos.
Bandas Claras:
Regiones de ADN con
G-C
Y
en genes constitutivos
Regiones A-T son resistentes a la tripsina lo cual genera una coloración oscura en el bandeamiento.
Mayor nivel de bandas = Mayor calidad del estudio
BANDEO Q
Se
basa en el uso de colorantes fluorescentes
como la
quinqcrina.
Dando a lugar bandas
brillantes
y
oscuras.
Técnica similar al bandeo
G
Bandas Brillantes:
Contienen regiones ricas
en
A-T.
Bandas oscuras
:
G-C
Regiones con G-C reprimen la fluorescencia y por eso no se tiñen, al contrario que las regiones con A-T
BANDEO R
Técnica opuesta al bandeamiento y se utiliza
el
calor
como desnaturalizante o
BrdU
Bandas oscuras
:
G-C
Bandas claras:
A-T
El calor desnaturaliza las regiones ricas en A-T por eso se visualizan mas las regiones con G-C
BANDEO C
Marcan
las
regiones
Centromericas
y
pericentromericas.
Permite la tinción de la
heterocromatina
constitutiva.
Se utiliza
hidroxido de sodio
e
hidroxido de
bario
para desnaturalizar el ADN.
Se usa principalmente para los cromosmas 1, 9
y 16
BANDEO NOR
Marcan las
regiones de los
organizadores nucleolares
acrocentricos
.( regiones cromosómicas
que forman y mantienen el nucléolo)
BASES MOLECULARES DEL
BANDEO CROMOSOMICO.
CLASIFICACIÓN
BANDEOS CROMOSOMICOS MORFOLOGICOS QFQ GTG RFA RHG THG CBG DINAMICOS GBG RBA RBG GB-AAu RB-AAu
Se basan en técnicas inherentes a la
heterogeneidad de la cromatina.
Importante la relación con proteínas(histónicas y no
histónicas) e interacciones
ADN
.
Se subclasifican en
:
1.
Técnicas de tinción diferencial
2.Métodos de tinción selectiva
3.
Coloraciones con fluoroeromos específicos
aislados o combinados con colorantes no
fluorecentes
Nomenclatura Bandeos
Morfologicos
QFQ
:
Bandas Q
por fluorecencia usando
quinacrina.
GTG
:
Bandas G
por tratamiento enzimático
con tripsina utilizando Giemsa.
RFA
:
Bandas R
por fluorecencia usando
naranja de acridina.
RHG
:
Bandas R
mediante desnaturalización
térmica utilizando Giemesa.
THG
:
Bandas T
por desnaturalización térmica
empleando Giemesa.
CBG
:
Bandas C
por hidróxido de bario
utilizando Giemesa.
1) tipo de bandeo 2) técnica de detección empleada 3) tipo de tinción. Incorporación de una base analoga, (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina también bandeo de
replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación.
Si se incorpora BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C.
Si se incorpora la base análoga durante la fase tardía de
replicación se obtiene un patrón de bandas G, destacándose las zonas de predominio de secuencias A-T.
Los cromosomas pueden visualizarce utilizando distintos
métodos de tinción como Giemesa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos específicos
Nomenclatura Bandeos
Dinamicos
GBG
: Bandas G por incorporación de BrdU
utilizando Giemesa.
RBA
: Bandas R por incorporación de BrdU
empleando naranja de acridina.
RBG
: Bandas R por incorporación de BrdU
utilizando Giemesa.
GB-AAu
: Bandas G por incorporación de
BrdU empleando anticuerpos
específicos unidos a partículas deoro
coloidal.
RB-AAu
: Bandas R por incorporación de BrdU
usando anticuerpos específicos unidos a
partículas deoro coloidal.
Bromo desexiuridina (BrdU)
Análogo mutagénicamente activo de la timina, en que el
grupo -CH3 en posición 5' se reemplaza por Br.
Tratamiento e investigación del cancer debido a que
aumenta la susceptibilidad de las células a la radioterapia
porque inhibe la reparación de roturas causadas por la
radiación en la doble cadena de ADN
Agente mutagenico:
altera los patrones de transcripción
Aumenta la afinidad de las proteinas cromosomales por
las zonas de la cadena que contengan BrdU,
Altera la unión de proteínas reguladoras a la cadena de
ADN,
Inhibe la expresión de algunas funciones de
diferenciacion celular
PROCEDIMIENTO
BANDAS G
1.
Envejecer las preparaciones en estufa a 65°C / 14h o 3 dias
a temperatura ambiente
Bandeo GTG
Tripsina desnaturaliza proteinas de cromosomas
Tincion Giemsa o Leishman
Bandeo G con colorante Wright
Protocolo mas usado.
Se introduce la preparacion en solucion salina de 2SSC (Citrato
trisodico disuelto en NaCl 0,3M) durante 1 minuto a 65°C.
Esto permite que se abra la hebra de ADN
Lavar la preparacion con agua destilada y secar al aire.
Teñir con colorante Wright al 0.25% y tampon Sorensen en
proporcion 1 a 3 duraten 3 minutos
PROCEDIMIENTO BANDA
C
CBG bandas C obtenidas con hidroxido Barico usando Giemsa
1. Introducir la preparacion en una cubeta con HCL 0.02N a
temperatura ambiente por 10 minutos, lavar con agua y dejar secar al aire
2. Introducir la preparacion en una cubeta a 60°C con Ba(OH)2
saturado durante 1 minuto. Esto despuriniza y desnaturaliza el ADN.
3. Lavar con agua destilada y metanol para eliminar restos de bario dos
veces
4. Dejar secar e incubar en 2xSSC a 65°C / 15 min 5. Lavar la preparacion y dejar secar
6. Teñir con colorante Leishman al 20% o Giemsa durate 5 a 10 minutos
Esta tecnica degrada un 50% del material cromosomico lo que dificulta la aplicación posterior de otras tecnicas.
El unico material que queda teñido es la heterocromatina constitutiva porque resiste a la degradacion
Procedimiento bandas NOR
1.
Añadir 0.2uL de solucion de nitrato de
plata al 50% filtrada a la preparacion
2.
Adicionar 6 a 8 gotas de formaldehido
al 0.3% (acelera la tincion)
3.
Incubar a 37°C durante 24h protegido
BIBLIOGRAFIA
http://www.oocities.org/researchtriangle/lab/25
13/bandeos.htm
Cristina Hernando Davalillo, Caracterizacion
de Anomalias cromosomicas en diagnostico
prenatal y postnatal mediante tecnicas de
citogenetica molecular, Tesis Doctoral 2005.