(En Español)
IFA de IgGs contra Bartonela
REF IF1300G
Rev. K
Inmunoensayo Fluorescente Indirecto (IFA) para la
Detección en Suero Humano de Anticuerpos IgG en
Suero Humano contra Infecciones de Bartonela
Este prospecto es sólo para exportación y no para
su distribución en Estados Unidos.
Fuera de los Estados Unidos:
Para Uso Diagnóstico in vitro
PROPÓSITO DE LA PRUEBA
El Inmunoensayo Fluorescente Indirecto (IFA) de Bartonela de Focus Diagnostics tiene como finalidad el asistir en el diagnóstico clínico de infecciones de Bartonela. Este producto usa células de Vero que han sido infectadas con B. henselae o con B. quintana como sustratos individuales permitiendo la detección cualitativa y semicuantitativa en Suero Humano de anticuerpos IgG en el suero humano contra Bartonela.
RESÚMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
Hasta hace poco el agente etiológico de la Enfermedad del Arañazo de Gato (EAG) ha estado en disputa. Se han asociado varios agentes putativos con esta enfermedad incluyendo esp. de Clamidia y Afipia felis. Hoy en día se reconoce generalmente que la causa de EAG de hecho es un bacilo pequeño Gram negativo del género Bartonela (anteriormente Rochalimaea)1.
La enfermedad por arañazo de gato es una enfermedad común (0.77 a 0.86 casos por población de 100,000) y afecta anualmente a 22,000 personas en los Estados Unidos2,3. La mayoría de los casos reportados han ocurrido en personas menores de 20 años de edad, que normalmente son hombres. El número de reportes de
EAG es máximo en el otoño o en el invierno4.
La EAG es normalmente precedida de una historia de un arañazo o mordisco de gato que causa la lesión primaria de la superfície de la piel. Esto es seguido a menudo, por la inflamación de ganglios linfáticos regionales que eventualmente drenan el lugar de inoculación primario. La mayoría de los casos se autolimitan y se resuelven espontaneamente en 2 a 4 meses5.
Formas atípicas de EAG constituyen aproximadamente el 11% de los casos documentados6. En estos pacientes la conjuntivitis granulomatosa, el síndrome
oculoglandular, la tonsilitis, la enfermedad granulomatosa visceral, la encefalitis y la arteritis cerebral son más comunes6. En personas inmunosuprimidas, B.
henselae se asocia más frecuentemente con la EAG clásica, la angiomatosis bacilar y la peliosis hepatis7.
Tradicionalmente, el diagnóstico se predicaba con una historia de mordiscos de gato o arañazos, la demostración del organismo en el tejido por tinción de plata de Warthin-Starry o pruebas positivas de la piel. Ahora es posible confirmar casos sospechosos de EAG usando métodos serológicos4. Hay estudios que indican
que aproximadamente el 90% de casos sospechosos de EAG tienen títulos de IgG en el suero de >1:64 determinado por IFA y/o títulos de IgM de ≥1:20 durante la fase aguda8. Es raro detectar títulos de fondo en gente sana1.
Recientemente, ha habido una resurgencia en interés por otra espécie del género de Bartonela, B. quintana. Este organismo es el agente causativo de la Fiebre de Trinchera clásica9. Ahora B. quintana ha sido implicada en la endocarditis aguda y la angiomatosis bacilar en pacientes VIH positivo10, 11. La diagnosis serológica
de B. quintana es similar a la de B. henselae. Hay extensa reacción cruzada de IgGs entre estas dos especies mientras que la respuesta de IgMs es más especie específica. Por lo tanto, la diferenciación serológica entre B. henselae y B. quintana típicamente no es posible cuando sólo se detectan IgGs. En estos casos es necesario evaluar muestras subsecuentes y confiar en la presentación clínica.
La respuesta inmune primaria contra Bartonela son los anticuerpos de la clase IgM que aparecen temprano en la infección y son sumamente diagnósticos cuando están presentes. La respuesta de anticuerpos IgG sigue de cerca a la respuesta inicial de IgM. Ya que la respuesta de IgGs tiene una reactividad cruzada extensa entre especies, estos resultados se deben interpretar con cautela.
La lámina del IFA de Bartonela de Focus Diagnostics contiene ambos B. henselae y B. quintana. Cuando se mira por el microscopio con la parte deslustrada a la izquierda, B. quintana aparece a la izquierda y B. henselae aparece a la derecha.
PRINCIPIO DEL MÉTODO
La prueba de anticuerpos inmunofluorescentes indirecto (IFA) es un procedimiento "sandwich" en dos etapas. En la primera fase el suero del paciente se diluye en solución isotónica tamponada de fosfato (PBS) con suero normal de cabra (SNC) al 10%. El SNC bloquea el ligado inespecífico así pues reduciendo la tinción de fondo indeseable. El suero se añade a las celdas apropiadas de la lámina poniéndolo en contacto con el sustrato y se incuba. Después de la incubación, la lámina es lavada con solución isotónica tamponada de fosfato para eliminar los anticuerpos séricos no ligados. En la segunda etapa, cada celda de antígeno se cubre con anticuerpos marcados con fluoresceína contra las IgGs humanas. Después de que la lámina es lavada, secada y montada, se examina con microscopía de fluorescencia. En las reacciones positivas aparecen bacterias fluorescentes de color verde manzana brillante. La determinación semicuantitativa de los títulos finales se obtiene evaluando diluciones en serie de los especímenes positivos.
PRESENTACIÓN
El kit de pruebas de Focus Diagnostics contiene materiales suficientes para 80 determinaciones.
Láminas para el Sustrato de IgGs contra Bartonela REF IF1301 Ag
Bartonella IgG Substrate Slide
Diez láminas de ocho celdas cada una. Cada celda contiene 2 áreas: dos áreas individuales sensibilizadas de antígeno que consisten en células de Vero infectadas. Almacene los paquetes sellados en 2 a 8°C. Las láminas selladas son estables hasta la fecha impresa en el envase. . Para evitar condensación, permita que las láminas alcancen la temperatura ambiente antes de abrir los paquetes sellados.
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Nota: La mayoría de los microscopios fluorescentes invierten la imagendel portaobjetos. Cuando se visualicen a través del microscopio, los antígenos aparecerán en orden inverso con respecto al que se muestra a continuación.
Conjugado de IgG Especie Dual, 3.5mL REF IF0011 CONJ IgG
IgG Conjugate-Dual Species
Un frasco de anticuerpos de cabra contra IgGs humanas marcados con fluoresceína, específica para cadenas gamma, mezclado con anticuerpos de cabra contra IgGs de ratón marcados con fluoresceína. El anti-IgG de ratón ha sido standardizado para proporcionar un control de antígeno específico. Contiene tinción azul de Evan, un estabilizador de proteínas y conservante. Listo para usar. Estable hasta la fecha de validez impresa en el envase si es conservado de 2 a 8 °C. No lo use si hay turbidez, descoloramiento u otros indicios de contaminación bacteriana. Antes de usar, espere a que alcance la temperatura ambiente.
Control Detectable Polivalente de Bartonela, 0.30mL REF IF1314 CONTROL >
Bartonella Polyvalent Detectable Control
Un frasco de suero de ratón embotellado a dilución de prueba. Contiene conservante. Estable hasta la fecha de validez impresa en el envase si es conservado de 2 a 8 °C. No lo use si hay turbidez, descoloramiento u otros indicios de contaminación bacteriana. Antes de usar, espere a que alcance la temperatura ambiente.
Control No Detectable de IFA de Bartonela, 0.25mL REF IF1313 CONTROL <
Bartonella Non-Detectable Control
Un frasco de suero humano embotellado a dilución de prueba. Contiene conservante. Estable hasta la fecha de validez impresa en el envase si es conservado de 2 a 8°C. No lo use si hay turbidez, descoloramiento u otros indicios de contaminación bacteriana. Antes de usar, espere a que alcance la temperatura ambiente. No lo diluya. La congelación y descongelación repetida es perjudicial y debe ser evitada.
Diluyente de Muestra de IgG de Bartonela (10X) REF IF1316 DIL IgG
10X Bartonella IgG Sample Diluent
Un frasco de concentrado basado en proteína para pruebas de IgG. Contiene conservante. Estable hasta la fecha de validez impresa en el envase si es conservado de 2 a 8°C. Antes de usar, espere a que alcance la temperatura ambiente.
Prepare una Solución de prueba de Diluyente de Muestra de IgG (1X) añadiendo 1 parte de Diluyente de Muestra de IFA de IgG de Bartonela (10X) con 9 partes de PBS.
Medio de Montaje, 2.5mL REF IF0007 REAG MONT
Mounting Medium
Un frasco con gotero que contiene glicerol PBS-tamponado a un pH de 7.2 ± 0.1. Contiene conservante. Estable hasta la fecha de validez impresa en el envase si se conserva refrigerado entre 2 y 8°C. Antes de usar, espere a que alcance la temperatura ambiente.
PBS REF IF0005 BUF
PBS
Un frasco de solución salina tamponada de fosfato (PBS) en polvo. Reconstituya con 1 litro de agua destilada (o purificada). La solución reconstituída es tampón a 0.01M de pH 7.2 ± 0.1. Antes y después de la reconstitución, guarde el PBS refrigerado entre 2 y 8°C. Antes de usar, espere a que alcance la temperatura ambiente. No lo use si hay turbidez, descoloramiento u otros indicios de contaminación bacteriana.
MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS 1. Cubreláminas de 24 X 50mm
2. Tubos de prueba y soporte de tubos, tubos para microcentrifugación o plato microtítulo para diluciones de suero. 3. Centrifugador clínico
4. Incubadora de 35 a 37°C o baño María para incubación de láminas 5. Refrigerador de 2 a 8°C
6. Botella de plástico para lavados
7. Pipetas calibradas o de pistón con puntas desechables
8. Jarras Coplin o bandeja de tinción de láminas con soporte para láminas 9. Balón volumétrico o cilindro graduado limpio de 1 litro
10. Cámara húmeda para la incubación de láminas 11. Agua destilada o purificada
12. Reloj
13. Papel absorbente para secar las láminas
14. Microscopio de fluorescencia. Parámetros recomendados
Filtro de Excitación 470-490nm
Filtro Barrera 520-560nm
Fuente de Luz HBO 100W, mercurio
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ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1. Este prospecto es sólo para exportación y no para su distribución en Estados Unidos. Fuera de Estados Unidos, este kit es para uso diagnóstico in vitro. 2. Todos los productos sanguíneos deben ser tratados como potencialmente infecciosos. Los materiales de los cuales se ha derivado este producto (incluyendo
el control No Detectable), han sido analizados con métodos aprobados por el FDA con resultados negativos, por la presencia de antígenos de superficie de hepatitis B, anticuerpos de hepatitis C y de VIH-1/2 (SIDA). Sin embargo, como ningún método conocido puede garantizar un 100% de seguridad que los productos derivados de sangre humana no transmitirán esos u otros agentes infecciosos, todos los controles, muestras de suero y el equipo que entre en contacto con estos especímenes, deberán ser considerados como potencialmente infecciosos y descontaminados o desechados tomando las precauciones de bioseguridad necesarias. El CDC y los institutos nacionales de la salud recomiendan que los agentes potencialmente infecciosos estén manejados en el nivel 2 de Biosafety.12,13
3. El azul de Evan es cancerígeno; no obstante, su concentración en este producto es inferior al umbral notificable (inferior al 0,1 %). 4. No sustituya o mezcle reactivos de lotes de kit diferentes o de otros fabricantes.
5. Use únicamente los protocolos descritos en este prospecto. Si los intervalos o temperaturas de incubación empleados en la prueba no son los especificados, los resultados pueden ser erróneos.
6. La contaminación cruzada en una lámina con especímenes de pacientes distintos puede causar resultados erróneos. Añada los especímenes de pacientes y maneje las láminas con cuidado para evitar que los sueros de las celdas adyacentes se mezclen.
7. Contaminación bacteriana de muestras de suero o de reactivos, puede producir resultados erróneos. Use técnicas asépticas para evitar la contaminación microbiana.
8. Este kit y sus componentes están formulados especificamente para usar en determinaciones de IgG. No use el kit ni sus componentes para determinaciones de IgM.
9. El medio de montaje contiene entre 30 y 60% de glicerol, lo que puede causar irritación si se inhala o entra en contacto con la piel. En caso de inhalación o contacto, deben tomarse inmediatamente medidas de primeros auxilios.
ESTABILIDAD Y MANIPULACIÓN
1. Los kits son estables hasta el último día del mes indicado en la fecha de validez cuando son almacenados entre 2 y 8°C. 2. No use los kits de prueba o los reactivos si están caducados.
3. No exponga los reactivos a luz intensa durante el almacenamiento o incubación. OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE ESPECÍMENES
El suero es el espécimen preferible. Ningún intento se ha hecho para evaluar la compatibilidad de la prueba con otros tipos de espécimen. El suero hiperlipidémico, hemolítico, o contaminado puede causar resultados erróneos por lo tanto, se debe evitar su uso.
Obtención y manejo de los especímenes
Obtenga las muestras sanguíneas asépticamente, usando técnicas de venopunción aprobadas por personal calificado12. Permita que las muestras se coagulen a temperatura ambiente antes de centrifugarlas. Transfiera el suero asépticamente a un recipiente estéril, bien sellado, para el almacenaje de 2 a 8°C. En caso de que la evaluación se demorase más de 5 días, las muestras deberán ser congeladas a –20°C o menos. Daños de congelo y descongelo podrían ocurrir, si los especímenes se guardan en congeladores con ciclos de auto-descongelación. Descongele y mezcle bien las muestras antes de usarlas.
Preparación de los especímenes
La dilución de screening del suero es 1:64 en Solución de Prueba de Diluyente de Muestra IgG (1X) (vea Presentación, arriba). Para determinar títulos finales, use PBS para diluir en serie la dilución de screening.
PROCEDIMIENTO (Incubación a 37°C)
1. Saque las láminas del refrigerador. Para evitar condensación, permita que alcancen temperatura ambiente antes de abrir los paquetes.
2. Añada 20µL del Control Detectable, tal como viene en el frasco (sin diluir), a la celda apropiada de la lámina. Si se desea una lectura de 1+ en la Lectura del Control, use PBS para diluir el control Detectable (vea Control de Calidad, abajo). Añada 20µL de cada dilución a la celda apropiada de la lámina. 3. Añada 20µL del Control No Detectable, tal como viene en el frasco, a la celda apropiada de la lámina.
4. Por cada muestra a evaluar, añada aproximadamente 20µL de la muestra diluída (vea Preparación de Especímenes, arriba) a la celda apropiada de la lámina. Haga anotaciones para después poder identificar cada celda en la lectura de resultados.
5. Incube las láminas en una cámara húmeda durante 30 ± 2 minutos a 35-37 °C.
6 Retire las láminas de la cámara húmeda y enjuague cada una con un chorro suave de PBS. No apunte el chorro directamente a las áreas de antígeno de las celdas. Enjuague una fila a la vez para evitar que los especímenes se mezclen. Lave las láminas sumergiéndolas en Coplin o en una jarra de tinción con PBS por 10 minutos.
7. Sumerja brevemente las láminas lavadas en agua destilada o purificada y permita que se sequen al aire. 8. Añada aproximadamente 20 µl de conjugado de IgG a cada celda de la lámina.
9. Incube las láminas en una cámara húmeda durante 30 ± 2 minutos a 35-37°C. 10. Repita los pasos de lavado 6 y 7.
11. Coloque unas gotas de medio de montaje en la lámina y cubra con un cubreláminas de 24 X 50 mm. Elimine cualquier burbuja (si hay) y el exceso de medio de montaje con papel absorbente.
12. Examine las celdas con un aumento final de400 con un microscopio de fluorescencia equipado correctamente. Lea las láminas el mismo día que la prueba ha sido realizada para que la fluorescencia sea la óptima. Si esto no fuese posible, guarde las láminas en la oscuridad de 2 a 8°C hasta un máximo de 24 horas.
PROCEDIMIENTO (Incubación a temperatura ambiente)
1. Saque las láminas del refrigerador. Para evitar condensación, permita que alcancen temperatura ambiente antes de abrir los paquetes.
2. Añada 20µL del Control Detectable, tal como viene en el frasco (sin diluir), a la celda apropiada de la lámina. Si se desea una lectura de 1+ en la Lectura del Control, use PBS para diluir el control Detectable (vea Control de Calidad, abajo). Añada 20µL de cada dilución a la celda apropiada de la lámina. 3. Añada 20µL del Control No Detectable, tal como viene en el frasco, a la celda apropiada de la lámina.
4. Por cada muestra a evaluar, añada aproximadamente 20µL de la muestra diluída (vea Preparación de Especímenes, arriba) a la celda apropiada de la lámina. Haga anotaciones para después poder identificar cada celda en la lectura de resultados.
5. Incubar la(s) lámina(s) durante 60 ± 2 minutos a temperatura ambiente, cubiertas.
6 Retire las láminas de la cámara húmeda y enjuague cada una con un chorro suave de PBS. No apunte el chorro directamente a las áreas de antígeno de las celdas. Enjuague una fila a la vez para evitar que los especímenes se mezclen. Lave las láminas sumergiéndolas en Coplin o en una jarra de tinción con PBS por 10 minutos.
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el proceso de lavado, tal vez no pueda dejarse que las láminas se sequen al aire antes de la adición del conjugado.8. Añada aproximadamente 20 µl de conjugado de IgG a cada celda de la lámina. 9. Incubar las láminas durante 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente, cubiertas. 10. Repita los pasos de lavado 6 y 7.
11. Coloque unas gotas de medio de montaje en la lámina y cubra con un cubreláminas de 24 X 50 mm. Elimine cualquier burbuja (si hay) y el exceso de medio de montaje con papel absorbente.
12. Examine las celdas con un aumento final de400 con un microscopio de fluorescencia equipado correctamente. Lea las láminas el mismo día que la prueba ha sido realizada para que la fluorescencia sea la óptima. Si esto no fuese posible, guarde las láminas en la oscuridad de 2 a 8°C hasta un máximo de 24 horas.
CONTROL DE CALIDAD
Cada serie (cada vez que una lámina, o un grupo de láminas sea procesada) deberiá incluir ambos controles Detectables y No Detectables.
1. Cuando el Control Detectable se use sin diluir (tal cual está en el frasco), deberiá exhibir fluorescencia de 3 a 4+ en ambas áreas antigénicas de B. quintana y de B. henselae.
2. Si se desea una lectura de 1+ en la Lectura del Control, diluya el Control Detectable (vea Procedimiento, arriba) 1:8 y lea el área antigénica de B. quintana. Debido a las diferentes condiciones de laboratorios, incluyendo el equipo, la lectura 1+ del Control de Lectura puede variar ± 1 en una dilución doble. 3. El Control No Detectable deberiá exhibir reactividad insignificante con todas las áreas.
Si los controles no exhiben estos resultados, los resultados de las muestras del paciente deben ser considerados inválidos y la prueba deberiá repetirse.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La óptica del microscopio, su condición y el tipo de fuente de luz determinan la intensidad fluorescente total y los títulos finales. En cada determinación se deben leer primero las celdas control para asegurar la interpretación correcta.
Lectura de las láminas
Lea la intensidad fluorescente de las bacterias en cada área y valore la fluorescencia de la forma siguiente: 2 a 4+ Fluorescencia verde manzana moderada a intensa.
1+ Fluorescencia definitiva pero atenuada, equivalente a la observada en el título final de referencia del control Detectable. Negativa No hay fluorescencia o ésta es igual a la observada en la celda del Control No Detectable.
Interpretación de Resultados de los Especímenes de Pacientes
El recíproco de la dilución de suero más alta que exhiba fluorescencia verde manzana definitiva (1+) se denomina título final de suero. ≥1:256 Títulos finalesde IgG de 1:256 y más altos son considerados como presunta evidencia de infección reciente.
<1:256 y ≥1:64
Títulos finales de IgG singulares ≥1:64 y <1:256 sugieren infección en periodo indeterminado. Un segundo espécimen obtenido 10 a 21 días después del original debe ser evaluado en paralelo con el primero. Si el segundo espécimen exhibe un título ≥1:256 o un incremento cuadruple sobre aquél del espécimen inicial, es indicativo de infección presente (aguda). Títulos que no cambian ≥1:64 y <1:256 sugieren infección en el pasado.
<1:64 Títulos finales de IgG menores de 1:64 sugieren que el paciente no tiene infección presente. Esto puede sucerder en pacientes sin historia de infección de Bartonela o en aquéllos con infección en el pasado cuyos títulos de anticuerpos han disminuído por debajo del nivel de detección. Fluorescencia inespecífica
Ocasionalmente un espécimen puede reaccionar con las células de Vero. Cuando esto ocurra la prueba no será interpretable. LIMITACIONES
1. Es esencial que los resultados de las serologías de Bartonela tengan correlación con la historia clínica y otros datos disponibles al médico.
2. La óptica del microscopio, su condición y el tipo de fuente de luz determinan la intensidad fluorescente total y los títulos finales. En cada determinación se deberán leer primero las celdas control para asegurar la interpretación correcta.
3. Muestras obtenidas demasiado temprano en la infección pueden no contener anticuerpos detectables. Si se sospecha infección de Bartonela, se deberiá obtener un segundo espécimen 10 a 21 días más tarde y evaluado en paralelo con la muestra original.
RESULTADOS ESPERADOS
En un estudio, el 95% de los pacientes con presentación clínica típica, análisis de la piel y evidencia histopatológica de EAG, tenían anticuerpos IgG contra B.
henselae3. En otro estudio, el 88% de los pacientes con EAG sospechado clínicamente tenían títulos de suero contra B. henselae de ≥64 mientras que 3% de los
controles sanos exhibieron títulos positivos1.
CARACTERISTAS DE DESEMPEÑO
Para los clientes afuera de los Estados Unidos, las caracteristas de desempeños se suministran en una hoja seperada. REFERENCIAS
1. Regnery, R., J. Olson, B.A. Perkins, and W. Bibb. 1992. Serological Response to Rochalimaea henselae Antigen in Suspected Cat-scratch Disease. Lancet 339: 1443-45.
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3. Peter, J.E., M. Boyle, M. Patnaik, T.L. Hadfield, N.E. Barka, W.A. Schwartzman, and R. S. Penny. 1994. Persistent Generalized Lymphadenopathy and Non-Hodgkin’s Lymphoma in AIDS: Association with Rochalimaea henselae infection. Clin. and Diag. Lab Immunology. Vol. 1, No. 1. 115-116. 4. Zangwill, K.M., D.H. Hamilton, B.A. Perkins, and et al. 1993. Cat Scratch Disease in Connecticut: Epidemiology, Risk Factors, and Evaluation of a New
Diagnostic Test. New Engl. J. Med. 329: 8-13.
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6. Schwartzman, W.A. 1992. Infections Due to Rochalimaea: Expanding the Clinical Spectrum. Clin. Infect. Dis. 15: 893-902.
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European Congress of Clinical Microbiology and Infect. Dis.
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11. Tappero, J.W., J. Mohle-Boertani, J.E. Koehler, et al. 1993. The Epidemiology of Bacillary Angiomatosis and Bacillary Peliosis. JAMA 269: 770-775. 12. NCCLS. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline (NCCLS H18-A2). 2nd ed. (1999).
13. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A).
El manual de instrucciones del kit está disponible en francés, alemán, italiano y español en www.focusdx.com, y en otros idiomas de su distribuidor local.
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PI.IF1300G.OUS-ES Rev. K Escrito el día: 17 octubre 2016
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