Tipos de cultivos celulares
Generalidades
Curso
“Introducción al Cultivo de Células Eucariotas”
Año 2018
Abarca al conjunto de técnicas que permiten el
mantenimiento de las células in vitro,
conservando al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Existen 3 formas principales de iniciar un cultivo celular:
CULTIVO DE
ÓRGANOS
EXPLANTES
PRIMARIOS
CULTIVO
CELULAR
PRIMARIO
Cultivo de órganos
• El tejido se coloca sobre una
rejilla situada en la interfase
líquido-gas de un medio del que
obtiene los nutrientes.
• Representa una buena réplica
del tejido de origen ya que se
conservan las interacciones
histológicas.
• El crecimiento es limitado.
• Se necesita un nuevo explante
para cada experimento.
• Constituidos por fragmentos pequeños de tejidos u órganos
que se adhieren a una superficie en la que generalmente crecen
las células de la periferia del explante.
• Útiles para pequeñas cantidades de tejidos, como biopsias de
piel.
Explantes primarios
explante crecimiento temprano de células (3 dpe) crecimiento celular luego de la remoción del explante (7dpe)Cultivo de células disgregadas
• Este tipo de cultivo está formado por
células dispersas disgregadas de un
tejido vivo, de un cultivo primario, o de
una línea celular, mediante distintos
sistemas
mecánicos,
químicos
o
enzimáticos.
• Las células crecen en suspensión o
adheridas a una superficie.
• Generalmente
son
cultivos
que
contienen un único tipo de célula y éstas
suelen ser homogéneas genéticamente.
Mecanismos de disgregación
• Enzimática
• Mecánica
1.tripsina fría
2.tripsina caliente
3.colagenasa
Tripsina fría
Las porciones de tejido se
incuban en tripsina a 4°C
durante 6-18 hs
permitiendo la
penetración con una
mínima actividad tríptica y
la digestión se puede
hacer en un tiempo corto
de 20-30 min a 37°C.
Tripsina caliente
Pequeñas porciones de
tejido se incuban con
tripsina a 37°C y las
células disociadas deben
recolectarse por
centrifugación cada media
hora. La tripsina se
neutraliza con suero en
medio de cultivo.
TAMIZADO DISGREGACIÓN CON LA JERINGA PIPETEO
Disgregación mecánica
SCRAPING O “RASCADO”LÍNEA CELULAR
Cuando las células o tejidos procedentes de un ser vivo
crecen sin haber pasado previamente por una fase de
crecimiento in vitro.
CULTIVO PRIMARIO CULTIVO SECUNDARIO Cuando el cultivo procede
de una fase previa de crecimiento in vitro
Existen 2 tipos de cultivos celulares
MONOCAPA
SUSPENSIÓN
Las células crecen adheridas sobre un soporte sólido. El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular.
Ejemplos: es el método utilizado para la mayoría de las células, excepto para las hematopoyéticas.
Las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Alcanzan la confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes son insuficientes. Ej. Células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas o tumorales.
El origen de una línea celular
Aislamiento y selección del tejido
Disección fina Disgregación mecánica Disgregación enzimática
Explante primario
Tripsina fría Tripsina caliente Colagenasa
ON, frío, incubación corta incubación larga, repetir muestreo incubación larga, medio completo centrifugar Resuspender y sembrar Cultivo primario en suspensión LÍNEA CELULAR Explante outgrowth subcultivo
Líneas celulares finitas y continuas
• Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita, entre
20 y 80 generaciones. Superado ese límite, las células entran
en senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar.
• Sin embargo, algunas células (como las células de roedores y
las células tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a
líneas celulares continuas, que crecen indefinidamente.
• Estas células pueden surgir de forma espontánea o inducida y
son el resultado de un cambio genotípico denominado
transformación.
• Las células transformadas se caracterizan porque son
inmortales; su crecimiento es aberrante, son malignas,
genéticamente
inestables
y
presentan
aberraciones
cromosómicas.
Células con historia: He La, la primera línea
celular continua.
Años 50. Dpto. de Ginecología de la Univ. John Hopkins. Febrero 1951, ingresa Henrietta Lacks, una paciente afroamericana de 31 años, que había cursado con éxito 5 embarazos (el último en sept de 1950). La misma presentaba una lesión uterina de unos 2 cm de diámetro, que posteriormente fue diagnosticado como un adenocarcinoma. El Dr. Gey fue quien cultivó sus células cancerosas y obtuvo la primera línea celular continua humana.
He La, es una de las líneas celulares establecidas más estudiadas en el mundo y más citadas de la literatura relacionada a cultivos celulares. Con la ayuda de esta línea de células se ha producido la vacuna contra la poliomielitis, las primeras células híbridas entre ser humano y ratón. Además del desarrollo del medicamento trastuzumab (Herceptin®) contra el cáncer de mama. Con ayuda de las células HeLa se han desarrollado terapias génicas y medicamentos para tratar enfermedades como el enfermedad de Parkinson y la leucemia. Se calcula que desde el desarrollo de la línea de células HeLa se han producido aproximadamente 50 toneladas de material celular.
Concepto de CEPA celular
Con los sucesivos pasajes o subcultivos, un cultivo
primario forma una línea celular. Este término
implica la presencia de varios linajes celulares de
fenotipos similares o distintos.
Así, al seleccionar uno de los linajes celulares por
clonado o por separación celular física o por
cualquier otra técnica de selección, para tener
ciertas propiedades específicas que han sido
identificadas en la masa de células del cultivo, esta
línea celular se transforma en lo que se conoce
como cepa celular (o cell strain).
Líneas celulares más frecuentemente
utilizadas
Algunas Células en Cultivo
Fibroblastos Mioblastos Células de tabaco
Células VERO Células RAW 264.7 Epimastigotes de T. cruzi
HeLa
Consideraciones al elegir una línea celular
• Línea celular finita o continua
• Células normales o transformadas
• Especie
• Fuente del tejido
• Características de crecimiento
• Disponibilidad
• Validación
• Expresión fenotípica
• Línea celular control
• Estabilidad
• Técnicas de biología molecular (Ej. PCR, STR
(Short Tandem Repeats) )
• Perfiles de isoenzimas
• Técnicas cariotípicas
Autenticación de línea celular
Perfiles de isoenzimas
Autenticación de línea celular
Técnicas cariotípicas
El método estándar implica la hinchazón de las células detenidas en metafase al exponerlas brevemente a solución salina hipotónica. Las células luego se fijan,
se colocan en portaobjetos para optimizar la dispersión, se tiñen y se montan para observación microscópica
