FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Departamento de Química Orgánica, Inorgánica y Bioquímica.
ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD METABÓLICA
DEL TEJIDO ADIPOSO BLANCO EN RATA
WISTAR. EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO, LA
RESTRICCIÓN CALÓRICA Y EL TRATAMIENTO
ICV CON LEPTINA.
Alejandro Fernández Briones.
Junio, 2013
Tutores:
Dr. Antonio Andrés Hueva.
Dra. Nilda Gallardo Alpizar.
AGRADECIMIENTOS.
Esta tesis va dedicada a todas aquellas personas que la han hecho posible, esta es la única parte de la tesis donde me puedo tomar la licencia de no ser políticamente correcto, aunque intenteré serlo en la medida de lo posible.
En primer lugar, quiero agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Nilda Gallardo y el Dr. Antonio Andrés, su empeño y esfuerzo en que este trabajo salga hacia delante. Siempre los recordaré con cariño, por la confianza que ambos han depositado en mi persona durante todo éste tiempo y por la cantidad de cosas que he aprendido de ellos. No solo del trabajo, también de la vida.
Como no, a mis compañeros del laboratorio, a los cuales aprecio, y a los que siempre recordaré con cariño.
A mis amigos, con los que he compartido tantas y tantas cosas que no podría quedarme con ninguna en concreto. Sé que siempre estarán ahí para lo bueno y para lo malo.
A mi familia, ya que durante el transcurso de estos años, han sucedido demasiados acontecimientos negativos, como la perdida de varios familiares muy cercanos a los que echo mucho de menos, un accidente de coche en el que casi pierdo la vida, además de un sinfín de adversidades que no habría podido superar de no haber tenido el apoyo incondicional por parte de mi familia en especial de mi padre por ser capaz de templarme los nervios en los momentos difíciles, y de mi madre que contra todo pronóstico consiguió hacer de mi un hombre de provecho.
Quiero hacer una mención especial a mi hermano, la persona con la que más tiempo he pasado en mi vida, con el que siempre discuto hasta el punto de mandarnos a la mierda casi a diario, pero al que siempre echo en falta cuando necesito desahogarme, y sé que siempre estará ahí para lo que necesite.
INDICE DE CONTENIDOS
1-INTRODUCCIÓN. ... 1
1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2. ... 1
1.2- El tejido adiposo. ... 3
1.2.1- El tejido adiposo blanco. ... 4
1.3- Fisiología del tejido adiposo. ... 5
1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo. ... 5
1.3.2- La Gota Lipídica. ... 7
1.3.3- Lipólisis... 8
1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino. ... 12
1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα). ... 14
1.4.2- IL-6. ... 15
1.4.3- PPARγ. ... 16
1.4.4- Resistina. ... 17
1.4.5- Adiponectina. ... 18
1.4.6- Leptina. ... 19
1.4.7- Transmisión de la señal de leptina. ... 21
1.4.8- Secreción de leptina por el TAB. ... 23
1.5- Insulina. ... 24
1.5.1- Transmisión de la señal de la insulina. ... 24
1.6- Interacción leptina-insulina. ... 25
1.7- Control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la
sensibilidad a la insulina. ... 26
1.8- El envejecimiento. Deterioro del organismo, y pérdida de
funcionalidad. ... 27
1.10- Hipótesis y objetivos. ... 31
2- MATERIALES Y MÉTODOS. ... 33
2.1- Materiales. ... 33
2.2- Modelos de experimentación. ... 33
2.2.1- Modelo animal de envejecimiento. ... 33
2.2.2- Modelo animal de restricción calórica. ... 34
2.3- Test in vivo de sobrecarga oral de lípidos. ... 35
2.4- Ensayo Ayuno-Alimentación. ... 35
2.5- Ensayo de Liposisis. ... 36
2.5.1- Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e INS. ... 36
2.6- Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular
(ICV) con Leptina. ... 37
2.6.1- Test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal. ... 40
2.6.2- Tratamiento “in vivo” con insulina. ... 40
2.6.3- Denervación del tejido adiposo. ... 40
2.6.4- Ensayo ex vivo de captura de glucosa (2DOG). ... 41
2.7- Determinación de Metabolitos y Hormonas en suero. ... 42
2.8- Extracción de ARN. ... 42
2.9- Transcripción inversa. ... 43
2.10- Real-time PCR. ... 44
2.11- Fraccionamiento subcelular del tejido adiposo blanco.
Obtención de extracto total, membrana plasmática,
membrana interna, gota lipídica y citosol. ... 45
2.11.1- Extracto total y fracciones subcelulares. ... 45
2.11.2- Gota lipídica. ... 45
2.12- Determinación de la concentración de proteínas. ... 48
2.12.2- Mediante el método Lowri. ... 48
2.13- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGC-SDS),
e Inmuno detección de proteínas mediante Western Blot. ... 48
2.14- Caracterización de fracciones subcelulares. ... 49
2.15- Tratamiento de datos y procesamiento estadístico. ... 52
3- RESULTADOS. ... 53
3.1- Ensayo de sobrecarga oral de grasas. ... 54
3.2.- Ensayo ayuno-realimentación. ... 59
3.2.1-Lipolisis ex vivo. Efecto del envejecimiento y la
restricción calórica. ... 60
3.2.2- Estudio de la lipolisis del tejido adiposo visceral.
Efectos del isoproterenol y la insulina. ... 67
3.2.3- Estudio del estado de activación de la enzima HSL
en tejido adiposo. Efectos de isoproterenol y la insulina. ... 70
3.2.4- Efectos del isoproterenol y la insulina sobre los
niveles proteicos de ATGL, AQ7 y perilipina en los explantes
de tejido adiposo. ... 71
3.2.5- Estudio del estado de activación de la enzima AMPK
en tejido adiposo. Efectos del envejecimiento y la restricción
nutricional. Efectos de isoproterenol y la insulina. ... 72
3.2.6- Estudio de los cambios en la localización subcelular
de proteínas durante la lipolisis. Efectos del envejecimiento y la
restricción calórica. ... 75
3.2.7- Estudio de la vía lipogénica. Capacidad de síntesis de
novo de ácidos grasos y de captura de lípidos por el tejido
adiposo para la síntesis de TAG. ... 83
3.3- Efectos de la infusión ICV de leptina en el metabolismo
del tejido adiposo blanco en ratas de 3 meses de edad. Papel
del SNA en la transmisión de la señal de la leptina. ... 89
3.3.1- La leptina a través del SNA regula la funcionalidad
del TAB y la sensibilidad a la insulina. Resultados del test
de tolerancia a glucosa. ... 90
3.3.2- Resultados de los ensayos de captura de glucosa
en respuesta a insulina por el TAB. ... 91
3.3.3- Regulación de la expresión génica en el TAB por el SNA. ... 93
3.3.4- Modificación de la capacidad lipogénica del tejido
adiposo blanco por la leptina a través del SNA. ... 94
3.3.5- Incremento del tono simpático y de la capacidad
lipolítica del tejido adiposo blanco por la leptina. ... 96
4- DISCUSIÓN ... 99
5- CONCLUSIONES. ... 117
INDICE DE TABLAS.
Tablas de la Introducción.
Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB. ... 13
Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con
funciones endocrinas / paracrinas / autocrinas . ... 14
Tablas de Materiales y Metodos.
Tabla 3. Sondas utilizadas de los genes sometidos a estudio. ... 45
Tabla 4. Anticuerpos utilizados en el estudio. ... 51
Tablas de Resultados.
Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del
tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.
Tabla 5. Características biológicas de los animales... 53
Tabla 6. Área bajo la curva. ... 57
Tabla 7. Niveles de mRNA de la enzima LPL y de la proteína
relacionada con el receptor de LDL (LPR-1) en tejido adiposo
de animales de 3, 8 y 24 meses de edad. ... 58
Tabla 8. Niveles de Glicerol, NEFA y TAG en suero. ... 59
Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido
adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.
Tabla 9. Niveles de leptina en suero tras el tratamiento icv con leptina. . 90
Tabla 10. Estudio de expresión de genes relacionados con
el tono simpático del tejido adiposo. ... 94
Tabla 11. Estudio de expresión de genes relacionados con la
INDICE DE FIGURAS.
Figuras de la introducción.
Figura 1. Estructura del Isoproterenol. ... 10
Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos. ... 11
Figura 3. Señalización de leptina. ... 22
Figura 4. Esquema del mecanismo de transmisión de la señal
de la insulina . ... 25
Figuras de materiales y métodos.
Figura 5. Ratas albinas Wistar de 3 y 24 meses de edad
alimentadas ad libitum. ... 34
Figura 6. Modelo experimental utilizado en este trabajo. ... 36
Figura 7. Esquema de la distribución de las muestras en la placa. ... 37
Figura 8. Representación esquemática de la implantación de las
minibombas osmóticas. ... 39
Figura 9. Coordenadas del ventrículo lateral en el estereotáxico.
VL – ventrículo lateral. ... 39
Figura 10. Imagen de la denervación quirúrgica. ... 41
Figura 11. Representación esquemática del protocolo de
centrifugación diferencial utilizada para aislar las distintas
fracciones de membrana, la gota lipídica y el citoplasma
celular a partir del TAB. ... 47
Figura 12. Western-blot representativo de la presencia de marcadores
en fracciones subcelulares de tejido adiposo blanco epididimal. ... 50
Figura 13. Western-blot representativo de la presencia de
marcadores en fracciones subcelulares de cada condición
de tejido adiposo blanco epididimal. ... 50
Figuras de Resultados.
Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del
tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.
Figura 14. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de
TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 8 meses de edad
alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. ... 54
Figura 15. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de
TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 24 meses de edad
alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. ... 55
Figura 16. Área bajo la curva ... 56
Figura 17. Medida de la liberación de NEFA y glicerol al medio
de incubación. ... 61
Figura 18. Medida de la expresión génica de las hormonas HSL
y ATGL y del transportador de glicerol AQ7 en condición basal. ... 63
Figura 19. Niveles totales de proteína de AQ7, ATGL y Perilipina
en extracto total de tejido adiposo visceral. ... 65
Figura 20. Niveles totales de proteína y de las especies fosforiladas
Figura 21. Medidas de glicerol en los medios de los explantes
en estado basal. ... 68
Figura 22. Medidas de lactato en los medios de los explantes
en estado basal. ... 69
Figura 23. Representación de los cambios en la activación de
la enzima HSL . ... 70
Figura 24. Niveles de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total
de los explantes. ... 72
Figura 25. Niveles basales de expresión proteica de las especies
fosforiladas y de la masa de AMPK. ... 73
Figura 26. Representación de los cambios en la activación de la
enzima AMPK. ... 74
Figura 27A. Traslocación de la ATGL... 76
Figura 27B. Niveles de expresión proteica de ATGL en condición basal. .. 76
Figura 28A. Traslocación de la HSL.. ... 77
Figura 28B. Niveles de expresión proteica de HSL en condición basal. ... 78
Figura 29A. Traslocación de la P-565-HSL. ... 79
Figura 29B. Niveles de expresión proteica de la especie fosforilada
inactiva de HSL en condición basal. ... 79
Figura 30A. Traslocación de la Perilipina. ... 80
Figura 30B. Niveles de expresión proteica de Perilipina en
condición basal. ... 81
Figura 31A. Traslocación de la Acuoporina 7. ... 82
Figura 31B. Niveles de expresión proteica en membrana plasmática
y membrana interna de AQ7 en condición basal. ... 82
Figura 32. Niveles basales de mRNA de CHERBP y PPARγ... 83
Figura 33. Niveles basales de mRNA de ACC y FAS en tejido
adiposo visceral. ... 84
Figura 34. Niveles proteicos de la enzima ACC y de la forma
fosforilada en serina, p-ACC en tejido adiposo visceral. ... 85
Figura 35. Niveles basales de mRNA de CD36, Glut4, LPL y LRP-1. ... 86
Figura 36. Niveles expresión génica y proteica LPL en condición basal. ... 88
Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido
adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.
Figura 37. Se muestran los resultados de un western-blot
representativo de STAT3. ... 90
Figura 38. Resultados del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal... 91
Figura 39. Efectos de la leptina sobre la capacidad lipogénica
del tejido adiposo. ... 92
Figura 40. Cambios en el peso de TAP y de los niveles de
norepinefrina con la denervación... 93
Figura 41. Niveles proteicos de LPL en extracto total tras
el tratamiento ICV con leptina... 95
Figura 42. Niveles de expresión génica y proteica de ATGL
tras el tratamiento ICV con leptina. ... 96
Figura 43. Niveles proteicos de HSL en extracto total de tejido
Abreviaturas.
AC Adenilato ciclasa. ACS Acil-CoA sintasa. ACC Acetil-CoA carboxilasa. ACTH Hormona corticotrófica. AG Ácidos grasos.
AGL Ácidos grasos libres.
AGPR Proteína relacionada con agouti.
AKT RAC-beta serine/threonine-protein kinase. AL Ad-libitum.
AMPc Adenosinmonofosfato cíclico.
AMPK Proteína quinasa activada por monofosfato de adenina. Apo CII Apolipoproteína CII.
aP2 Proteína activadora 2. AQ7 Acuoporina 7.
AR Receptor adrenérgico.
ARC Nucleo arcuato del hipotálamo. ATGL Triglicérido lipasa.
AUC Área bajo la curva.
BSA Albumina de suero bobina. CART Transcrito regulado por cocaína. CD36 Proteína de diferenciación 36.
ChREBP Carbohydrate-reponse-element-binding.
CREB Factor de transcripción de la proteína de respuesta a AMPc . CYT Citoplasma celular.
DNAc Ácido desoxirribonucleico complementario DNL Lipogénesis de novo.
DTT Dithiothreitol.
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético.
EGTA Ácido etilenglicol (aminoetil éter) tetraacético. FAS Sintetasa de ácidos grasos.
FIRKO Fat-specific insulin receptor knockout mice. FR Restricción calórica.
GH Hormona de crecimiento. Gi Proteína G inhibitoria. GL Gota lipídica.
GLUT1 Transportador de glucosa 1. GLUT4 Transportador de glucosa 4. GPDH Glicerol 3 fosfato deshidrogenasa. Gs Proteína G estimulatoria.
G3P Glicerol 3 fosfato.
HDL Lipoproteínas de alta densidad.
HOMA Indicador de control de la homeostasis de la glucosa. HSL Lipasa hormona sensible.
ICV Intra cerebro ventricular.
IGF-1 Factor de crecimiento de insulina-1. IL-6 Interleuquiina 6.
INS Insulina.
IR Receptor de la insulina.
IRS Substrato del receptor de insulina. ISO Isoproterenol.
JAK2 Tirosina-quinasas de la familia Janus. KRH Krebs-Ringer-Hepes.
KRP Krebs-Ringer-fosfato. LCR Líquido cefaloraquideo.
LDL Lipoproteínas de baja densidad. LPL Lipasa lipoproteína.
LPR-1 LDL receptor protein related-1. MAG Mono acil-gliceridos.
MGL Monoglicérido lipasa. MI Membrana interna. MP Membrana plasmática.
MSH Hormona melanocito estimulante. mRNA Ácido ribonucléico mensajero. mTOR Diana de rapamicina.
NA Noradrenalina. NaN3 Azida sódica.
NE Norepinefrina. NEFA Ácidos grasos libres. NPY Neuropeptido Y.
NTC Membranas de nitrocelulosa. P Perilipina.
PBS Buffer Fosfato Salino.
PCR Reacción en cadena de la polimerasa. PDE Fosfodiesterasa.
PDHc Complejo de la piruvato deshidrogenasa. PD3B Fosfodiesterasa 3B.
PEPCK Fosfoenol-piruvato-carboxi-quinasa. PGC-1α Coactivador de la transcripción 1α. PI3K Fosfoinositol-3- kinasa.
PKA Proteína quinasa A.
PMSF Fenil-metil-sulfonil-fluoruro. POMC Pro-opiomelacortina.
PPARγ Activador de la proliferación peroxisomal γ. PTP1B Fosfotirosina fosfatasa 1B.
PVN Núcleo paraventricular del hipotálamo. QM Quilomicrones.
RNA Ácido ribonucléico. rpm Revoluciones por minuto. RT Transcriptara reversa. SDS Dodecilsulfato sódico.
SEM Desviación estándar de la media. Ser Serina.
SNA Sistema nervioso autónomo. SNC Sistema nervioso central. SNS Sistema nervioso simpatico. SIRT1 Sirtuinas.
SOCS-3 Supresor de la señalización por citoquinas. SOG Sobrecarga oral de grasas.
SREBP-1c Proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c. STAT3 El transductor de señal y activador de la transcripción 3. S6K Proteína ribosomal S6 quinasa.
TAE Tejido adiposo epididimal. TAG Triacilgliceridos.
TAM Tejido adiposo marrón. TAP Tejido adiposo perirrenal.
TG-LP Triglicéridos provenientes de los lípidos.
TG-QM Triglicéridos provenientes de los quilomicrones.
TAG-VLDL Triglicéridos provenientes de los lípidos de muy baja densidad. Thr Treonina.
TNFα Factor de necrosis tumoral.
TSH Hormona estimulante de la tiroides. Tyr Tirosina.
Tween 20 Monooleato de Polioxietileno Sorbitan. TZDs Tiazolidinedionas.
T2DM Diabetes mellitus tipo 2. UI Unidades internacionales.
VMH Región del hipotálamo ventromedial. VL Ventrículo lateral.
VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad. 2DOG 3H-2-desoxiglucosa
1
1-INTRODUCCIÓN.
Estado de la cuestión.
1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2.
La masa del tejido adiposo está regulada por un equilibrio dinámico entre la ingesta diaria y el gasto energético. La ruptura de este balance conlleva obesidad, una enfermedad multifactorial que involucra un incremento en la masa del tejido adiposo. Factores como la urbanización y la dieta desequilibrada, asociado con la susceptibilidad genética han permitido que emerja el fenotipo obeso.
Además de los problemas físicos derivados del exceso de peso, la obesidad se asocia con frecuencia a otras enfermedades crónicas y trastornos metabólicos como la diabetes tipo 2, hipertensión arterial, dislipemias, enfermedades cardiovasculares, resistencia a insulina y otras alteraciones que contribuyen al desarrollo de la morbilidad. La Organización Mundial de la Salud considera que la prevalencia del sobrepeso y de la obesidad ha alcanzado en muchas regiones proporciones epidémicas ((Wild y col., 2004).
La diabetes mellitus es la enfermedad endocrina más común y es una de las causas principales de mortalidad en las sociedades desarrolladas. Esta enfermedad puede ser de 2 tipos, en función de su origen.
La diabetes tipo I representa menos del 10 % de los casos y, generalmente, se diagnostíca en la infancia. Se caracteriza por elevados niveles de glucosa en sangre debido a que el organismo no produce o produce poca insulina. En estos casos se necesitan inyecciones diarias de insulina para sobrevivir.
La diabetes tipo II corresponde aproximadamente al 90% de todos los casos de diabetes y, generalmente, se presenta en la edad adulta. Es una condición patológica en la que existe resistencia a la acción de la insulina, con lo cual el metabolismo de carbohidratos y lípidos no es regulado de manera adecuada por dicha hormona. Esta patología se caracteriza por hiperglucemia, hiperlipidemia e hipoinsulinemia. En estas condiciones, el organismo llega a necesitar del aporte de grandes cantidades de insulina exógena (Saltiel AR, 2001).
2
La diabetes tipo II es una enfermedad multifactorial con raíces poligénicas, así como de naturaleza ambiental, ya que influye de forma importante, la dieta y una vida sedentaria (Fujimoto WY, 2000). Sin embargo, desde hace décadas, existe un consenso general en cuanto a la aparición de la Diabetes tipo II, la cual se debe al desarrollo previo de resistencia a la insulina, que es un estado fisiológico en el que los tejidos diana de esta hormona presentan una respuesta disminuida ante un estímulo insulínico normal (Kahn CR, 1978).
Entre los mecanismos responsables de la resistencia a la insulina se han descrito alteraciones de la expresión génica, de la distribución subcelular y del estado de fosforilación de diferentes proteínas de la vía de transducción de señales de la insulina, como por ejemplo: los sustratos del receptor de insulina, la PI3K (Saltiel AR, 2001), la AKT o el GLUT4 (Shepherd PR y col., 1999). Sin embargo, la obesidad es el principal factor adquirido responsable de la disminución de la sensibilidad a la insulina (Lewis G y col., 2002).
En este contexto, el tejido adiposo es reconocido actualmente como un tejido clave en el desarrollo de la resistencia global a la insulina (Arner, 2003; Bays y col, 2008). Además de su función como depósito de energía y principal proveedor de ácidos grasos para su utilización por otros tejidos, el tejido adiposo es un importante órgano endocrino, liberando a la circulación péptidos semejantes a hormonas que afectan al metabolismo sistémico y a la propia célula adiposa. Desde una perspectiva “adipocéntrica” se postula que la expansión del tejido adiposo constituye un nexo importante entre obesidad y resistencia a insulina (Virtue y Puig, 2010). En esta dirección se ha propuesto que: un exceso del combustible energético almacenado que sobrepasa la capacidad oxidativa/almacenamiento, sumado a la alteración de la producción de citoquinas por los adipocitos y macrófagos residentes, más, el aumento del estrés oxidativo y la inflamación crónica, entre otros, contribuiría a la desregulación funcional del tejido adiposo (Medina-Gomez y col., 2007). En su conjunto los aspectos mencionados convierten al tejido adiposo en un tejido clave en el estudio de las bases moleculares de la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus tipo II.
3
Se estima que la prevalencia de la diabetes a nivel mundial será del 4.4% en el año 2030, de modo que la epidemia de la diabetes continuará y para 2030 habrá en el mundo 366 millones de diabéticos. Estas cifras continuarán incrementándose siempre que se mantenga o incremente la prevalencia de obesidad (Wild y col, 2004).
1.2- El tejido adiposo.
Tradicionalmente, el tejido adiposo había sido considerado como un tejido pasivo, destinado a ser exclusivamente un almacén energético. Sin embargo, en el año 1987 se identificó como uno de los principales tejidos implicados en el metabolismo de hormonas esteroideas (Siiteri PK, 1987) y en la producción y secreción de adipsina, un factor cuya expresión está marcadamente disminuida en situación de obesidad de roedores (Flier JS y col, 1987).
Años más tarde, en 1994 la identificación y caracterización de la leptina, estableció al tejido adiposo como un autentico órgano endocrino (Zhang Y y col., 1994). En los últimos años, se ha confirmado que el tejido adiposo secreta numerosos péptidos bioactivos y proteínas, llamadas colectivamente adipoquinas (Kershaw EE y col., 2004; Guerre-Millo M.J, 2002), que pueden actuar tanto a nivel local (autocrino/paracrino) y sistémico (endocrino) (Kershaw EE y col., 2004), como a nivel del sistema nervioso central (Ahima RS y col., 2006). Estos factores desempeñan un papel muy importante por su influencia sobre una amplia variedad de procesos fisiológicos, la mayoría de ellos relacionados con la homeostasis de la glucosa y la regulación del balance energético. Algunas adipoquinas como la leptina y la resistina, intervienen junto con la insulina, en el control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la sensibilidad a la insulina del organismo.
El preocupante aumento de la obesidad y las complicaciones derivadas de ésta, como la diabetes mellitus y la enfermedad cardiovascular, ha incrementado notablemente la necesidad de profundizar en el estudio del tejido adiposo, su metabolismo y las consecuencias de la alteración de su actividad metabólica, endocrina e inmunológica (Bays y col, 2008).
4
En mamíferos, existen dos tipos de tejido adiposo: el tejido adiposo blanco (TAB) y el tejido adiposo marrón (TAM) (Cinti, 2001). Ambos tienen capacidad de metabolizar y almacenar lípidos, pero presentan claras diferencias en cuanto a su morfología, distribución, expresión génica, características del proteoma así como de su función (Pulido y col, 2012). El tejido adiposo blanco es el órgano específico que almacena la energía sobrante en forma de grasa; mientras que el tejido adiposo marrón, tiene una función fisiológicamente opuesta: permite la disipación de energía en forma de calor. Nuestra investigación se ha centrado en el estudio del TAB, por lo tanto, dirigiremos nuestra atención hacia la descripción del mismo.
1.2.1- El tejido adiposo blanco.
En mamíferos, el TAB se encuentra extensamente distribuido en el organismo, principalmente a escala dérmica, subcutánea, mediastínica, perigonadal, perirrenal, y retroperitoneal (Cinti, 2001). Una vez que el tejido adiposo está completamente formado, los adipocitos representan entre uno y dos tercios del mismo. El resto del tejido adiposo está constituido por células sanguíneas, células endoteliales, pericitos, y precursores de adipocitos con distintos grados de diferenciación, aunque también pueden encontrarse preadipocitos (células intersticiales o vacías de lípidos) y células mesenquimales, probablemente diferenciadas (las cuales poseen pequeñas gotas de lípidos) (Hauner y col., 1989). Los adipocitos que son las células principales de este tejido provienen de células mesenquimales indiferenciadas. En su origen presentan pequeñas inclusiones lipídicas que al hacerse mayores y más numerosas, confluyen en una única gota lipídica que ocupa casi todo el citoplasma.
Como se ha mencionado, el TAB es el mayor reservorio de energía, de componentes de membrana y probablemente de moléculas señalizadoras de naturaleza lipídica del organismo. Participa en el control de la homeostasis lipídica, almacenando la energía sobrante en forma de triacilglicéridos y liberando ácidos grasos libres y glicerol cuando el gasto energético excede la ingesta de energía. Todo ello está regulado por los sistemas nervioso y endocrino.
5
La liberación de ácidos grasos no esterificados a la circulación sanguínea en momentos de demanda energética, continúa siendo la principal función del tejido adiposo y la forma en que se regula la movilización de los lípidos almacenados en la gota lipídica es un tema difícil de estudiar, que requiere de mucha investigación por la estrecha relación que existe entre los niveles circulantes de ácidos grasos y la diabetes tipo 2 (Birnbaum MJ, 2003).
1.3- Fisiología del tejido adiposo.
Cuando se incrementa la ingesta alimentaria y/o disminuye el gasto de energía, el exceso de ésta se deposita de manera eficiente en el tejido adiposo en forma de triglicéridos neutros. Sin embargo, cuando la alimentación es escasa y/o se incrementan los requerimientos energéticos, las reservas de lípidos son liberadas para proporcionar combustible energético en forma de ácidos grasos y de glicerol para la síntesis de glucosa por otros tejidos.
Los triglicéridos provenientes de la dieta (exógenos) ingresan a la circulación plasmática desde la linfa en la forma de quilomicrones. Por su parte, el hígado sintetiza y secreta la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), la cual transporta los triglicéridos endógenos sintetizados desde el hígado hasta los tejidos extrahepáticos.
1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo.
La enzima lipoproteína lipasa (LPL) es una enzima multifuncional, que juega un papel clave en la distribución de los ácidos grasos de los triglicéridos de las lipoproteínas plasmáticas hacia los tejidos periféricos (Wang y col., 2009).
Presente en el endotelio capilar de los tejidos extrahepáticos, entre ellos el tejido adiposo blanco, cataliza la hidrólisis de los triglicéridos de las lipoproteínas ricas en triglicéridos (VLDL y quilomicrones). Estas lipoproteínas se unen a la enzima a través de la apolipoproteína CII (Apo CII) y como resultado de la actividad de la LPL se libera progresivamente ácidos grasos libres (AGL) y glicerol. Los AGL pueden difundir a través
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de la membrana plasmática o entrar a la célula adiposa a través de transportadores del tipo CD36 y moverse al interior de la misma unidos a la proteína aP2. Luego, por acción de la acetil-CoA sintasa son transformados en el acil derivado, acil-CoA. Los acil-CoA son principalmente reesterificados con moléculas de glicerol-3P y almacenados nuevamente como triglicéridos, mientras que el glicerol queda en la sangre y es captado principalmente por las células hepáticas. En estas condiciones, los ácidos grasos que no entran a los tejidos, se unen a la albúmina para su circulación por el organismo.
Ahora bien, la captura de AGL, su activación y su esterificación al glicerol-3P para formar TAG en el tejido adiposo, es un proceso que requiere en paralelo de la captura de glucosa estimulada por la insulina y su transformación en glicerol-3P. En el estado basal, cuando la glucemia es baja, la glucosa entra al adipocito a través del transportador de membrana GLUT1, sin embargo, en situación de elevada glucemia y en respuesta a la insulina, la glucosa es transportada preferentemente por el transportador de membrana GLUT4. Una vez en el citoplasma, puede ser transformada en dihidroxiacetona-P, la cual originará la molécula de glicerol-3P.
Una fracción de la glucosa capturada es metabolizada hasta piruvato. El piruvato puede formar lactato en el citosol, o ingresar a la mitocondria y por descarboxilación oxidativa irreversible (a través del complejo de la piruvato deshidrogenasa – PDHc) se transforma en acetil-CoA. Los átomos de carbono del acetil-CoA pueden sufrir una oxidación completa a CO2, con la consecuente liberación de energía y formación de ATP.
En el tejido adiposo funcional, un exceso de glucosa estimula la síntesis de novo de ácidos grasos, esto implica la salida de acetil-CoA de la mitocondria. La forma de extraer acetato de la mitocondria es en forma de citrato, el producto de la condensación de acetil-CoA y oxalacetato. En el citosol, el citrato es desdoblado a oxalacetato y acetil-CoA. El acetil-CoA es transformado a malonil-CoA por carboxilación irreversible catalizada por la acetil-CoA carboxilasa (ACC). Luego, el malonil-CoA sufre un proceso de elongación catalizado por el complejo de la sintetasa de ácidos grasos (FAS) para formar acil-CoA. A partir de este y de glicerol-3-P se sintetizan triglicéridos que pasan a formar parte del reservorio de triglicéridos del tejido. En esta vía
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metabólica intervienen las enzimas glicerol-3-P aciltransferasa, ácido lisofosfatídico acil transferasa y diacil-glicerol acil transferasa, esta última enzima es clave en el control de este proceso (Proscura e Ignatieva, 2002).
La enzima LPL juega un papel fundamental en el almacenamiento de AG y de colesterol en los adipocitos en forma de TAG y ésteres de colesterol que son lípidos neutros. La esterificación dependerá del suministro de glicerol-3P generado a partir de la glucolisis y de la captura de los AG. La entrada de AG al tejido adiposo depende del gradiente de concentración. De modo que cuando aumenta la velocidad de esterificación, aumenta la entrada de AG a la célula y la hidrólisis de los TG de las lipoproteínas, catalizada por la LPL. Estos procesos están favorecidos en respuesta a la insulina.
1.3.2- La Gota Lipídica.
La síntesis de la mayoría de los lípidos neutros como los TAG y los ésteres de colesterol se realiza en el retículo endoplásmico y rápidamente estos lípidos se depositan en un tipo especial de organelo llamado gota lipídica, presente en todas las células (eucariotas) o en las partículas de lipoproteínas en células especializadas como los hepatocitos y cardiomiocitos. Se piensa que la gota lipídica se forma a partir del retículo endoplásmico por un mecanismo que aún no está descrito. Debido a la dificultad que comporta el trabajo con lípidos, los estudios relacionados con los mecanismos que modulan la actividad de la gota lipídica son escasos, sin embargo tienen gran repercusión debido a su relación con la obesidad, la diabetes, el cáncer y la neurodegeneración (Zechner y col, 2012).
Actualmente se acepta que la síntesis de lípidos neutros es suficiente para crear una película que los cubre y concentra en una gota lipídica, a esta película se van añadiendo fosfolípidos tomados a partir de la membrana del retículo endoplásmico hasta formar una verdadera cubierta. También se propone la intervención necesaria de las aciltransferasas en el proceso de formación, definición y orientación de la gota lipídica en la membrana del retículo endoplásmico (Sturley y Hussain, 2012).
8 1.3.3- Lipólisis.
En los mamíferos, la adaptación exitosa al estado de ayuno y de inanición depende en gran medida de la movilización regulada de los ácidos grasos almacenados en forma de triglicéridos en la gota lipídica del tejido adiposo blanco, proceso conocido como lipólisis. Por lo tanto se define la lipolisis como la parte catabólica del ciclo de los ácidos grasos. La regulación de la lipolisis es compleja y depende de las necesidades de energía, de los niveles circulantes de hormonas, de la modificación covalente de las enzimas lipolíticas y de la compartimentación subcelular de estas enzimas. Las alteraciones de los mecanismos de regulación de la lipolisis tienen gran impacto en la homeostasis de energía y la señalización celular (Birnbaum MJ, 2003; Zechner y col, 2012).
Los adipocitos contienen tres enzimas responsables de escindir los triglicéridos en glicerol y ácidos grasos, la triglicérido lipasa (ATGL), la lipasa sensible a hormonas (HSL) y la monoglicérido lipasa (MGL)). El primer paso en la degradación de los triglicéridos está catalizado por la ATGL, que convierte los TAG en DAG. La HSL es responsible de la hidrólisis de los DAG a MAG y la MGL de la hidrólisis de los MAG. En el tejido adiposo la lipólisis se produce fundamentalmente por la acción de las enzimas ATGL y HSL (Zechner y col, 2012).
Los ácidos grasos liberados pueden abandonar la célula y ser transportados por la sangre unidos a la albúmina para ser utilizados por tejidos no adiposos (hígado, músculo esquelético, cardiaco, etc) oxidándose o reesterificándose según las condiciones nutricionales (Figura 1). Por otra parte, el glicerol generado tras la degradación metabólica de los triglicéridos es transportado a través de la membrana plasmática por medio, fundamentalmente, del canal de glicerol acuoporina 7 (AQP7). (MacDougald y Burant, 2005).
La ATGL juega un papel fundamental en la regulación de la lipólisis basal. Se conoce que tanto los agonistas de los receptores nucleares PPAR, el ayuno y los glucocorticoides aumentan la expresión del gen de ATGL, mientras que la alimentación
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y la insulina la disminuyen. A diferencia de la HSL, los b-adrenérgicos regulan su actividad de forma indirecta, a través del reclutamiento del coactivador CGI-58 (Zechner y col, 2012).
Sin embargo, la regulación de la actividad de la HSL depende fuertemente, de los niveles intracelulares de cAMP y la actividad de la enzima PKA. En condiciones de elevada demanda energética, la activación de los receptores β adrenérgicos en la superficie de los adipocitos y de la proteína G estimulatoria (Gs) lleva a la generación de AMPc, por activación de la enzima de membrana adenilil ciclasa. El AMPc activa la proteína quinasa A (PKA), una serina-treonina quinasa que activa mediante fosforilaciones de diferentes residuos de serina a la HSL. Al contrario, la estimulación del receptor α2-adrenérgico promueve la inhibición de la adenilil ciclasa por medio de la proteína G inhibitoria (Gi), reduciendo el contenido intracelular de AMPc e inhibiendo la lipólisis (Lafontan y Berlan, 1995).
La HSL fosforilada y activa se mueve desde el citosol hacia la superficie de la gota lipidica de la célula adiposa. La fosforilación de proteínas de la familia de las perilipinas localizadas en la superficie de la gota lipidica, es también necesaria antes de que la HSL pueda catalizar la hidrólisis de los triglicéridos. Las perilipinas no fosforiladas crean una barrera entre la HSL y los lípidos, que evita la lipólisis, mientras que la fosforilación de las perilipinas por la PKA permite a la HSL acceder a la superficie de la gota lipidica. La acción de la HSL sobre los triglicéridos presenta especificidad por los ésteres unidos en posición 1 y 3 del glicerol (Yeaman, 1990). En la regulación postraduccional de la HSL intervienen también otras enzimas entre las que se encuentra la AMPK (Zechner y col, 2012).
La hidrólisis de los monoglicéridos remanentes para dar glicerol y un ácido graso, ocurre por la acción de la monoglicéridolipasa (MGL), que no se encuentra bajo control hormonal y cuya abundancia en la célula es suficiente para evitar la acumulación de productos intermediarios de la lipólisis (Horowitz, 2003).
Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,
corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos dependientes de la insulina, la fosfoinositol
fosforilación a la PDE (Langin y col., 1996).
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios
vivo de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la
adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores
metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su función metabólica modificando los niveles intracelular
PKA, y por consiguiente la de la HSL.
Figura 1. Estructura del Isoproterenol.
Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expr
que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis
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Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,
corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos dependientes de la insulina, la fosfoinositol-3- kinasa (PI3-K), que activa por
osforilación a la PDE (Langin y col., 1996).
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios
de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores adrenérgicos, por lo que a efectos metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su función metabólica modificando los niveles intracelulares de cAMP, la actividad de la PKA, y por consiguiente la de la HSL.
Estructura del Isoproterenol.
Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expresión de HSL, por lo que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón, hormona corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil ciclasa inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos K), que activa por
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios in vitro o ex de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la adrenérgicos, por lo que a efectos metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su es de cAMP, la actividad de la
Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una esión de HSL, por lo que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis
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basal (Langin y col, 2005; Jocken y col, 2007). Por otra parte, la lipolisis estimulada por catecolaminas es superior en el tejido adiposo visceral en comparación con el tejido adiposo subcutáneo, así como la liberación de ácidos grasos libres y de glicerol a la sangre portal, de modo que la lipolisis mediada por catecolaminas afecta directamente al contenido de glucosa y de grasa del hígado, promoviendo el desarrollo de dislipemias, hiperglucemia y resistencia a la insulina (Bays y col, 2008).
Dadas sus funciones, no es de sorprender que el tejido adiposo esté exquisitamente diseñado para responder a los cambios agudos de las señales nutricionales. En realidad, a nivel molecular y bioquímico, los adipocitos están equipados con la maquinaria necesaria para responder a la estimulación hormonal, por ejemplo, el adipocito es sensible a la insulina, la cual estimula la captación de glucosa y la lipogénesis e inhibe la lipólisis y además está sujeto a la regulación adrenérgica que estimula la lipólisis (Sethi y Vidal-Puig, 2007).
Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos. En la figura se muestran las principales vías
metabólicas de los lípidos y de la glucosa en el tejido adiposo. Además se señalan algunas enzimas, transportadores y receptores importantes de estas vías metabólicas. AC: adenilil ciclasa, ACS: acil-CoA sintasa, ACC: acetil-CoA carboxilasa, AGL: ácido graso libre, cAMP: monofosfato de adenosina cíclico, AR: receptor adrenérgico, FAS: sintasa de ácidos grasos, G3P: glicerol 3 fosfato, HSL: lipasa hormona sensible, IR: receptor de la insulina, IRS: substrato del receptor de insulina, LPL: lipoproteína lipasa, MGL: monoglicérido lipasa, PDE: fosfodiesterasa, PI3K: fosfatidilinositol 3- quinasa, PKA, proteína quinasa A, P: perilipina, AQP7: acuoporina 7 (Modificado de Sethi y Vidal- Puig, 2007).
12 1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino.
El tejido adiposo actúa como un órgano endocrino liberador de hormonas, produciendo numerosas sustancias, llamadas adipocitoquinas, que incluyen varias citoquinas, hormonas y factores de crecimiento. Han sido identificados más de 100 de estos factores secretados. A través de estas sustancias, el tejido adiposo, no solo influye sobre la propia biología adipocitaria sino también sobre la regulación de la homeostasis energética, la sensibilidad insulínica, el metabolismo de lípidos y carbohidratos, el crecimiento celular, la inflamación y el desarrollo de cáncer (Havel, 2004, Bays y col, 2008).
Hoy en día se considera que el TAB es un órgano muy dinámico con funciones pleiotrópicas. En la tabla 1 se muestran ejemplos de receptores expresados por el TAB, mientras que en la tabla 2 se enumeran algunas adipocitoquinas expresadas y secretadas por este tejido como: la adipsina (Cook y col, 1985), el factor de necrosis tumoral (TNFα) (Hotamisligil y col., 1995), la leptina (Friedman, 2000), la resistina (Steppan y col., 2001b) y la adiponectina (Hu y col., 1996; Maeda y col., 1996; Nakano y col., 1996; Keys y col., 1972).
Algunas pueden regular funciones como la reproducción, la función cardiovascular y la inmunidad. La secreción de estas citoquinas por el TAB está regulada entre otros factores por el ayuno, la ingesta y la obesidad (Hamilton y col., 1995; Hotamilligil y col., 1995; Lefebvre y col., 1998). De esta manera, el adipocito se ha convertido en el integrador central del programa metabólico del organismo y está completamente establecido, que la función endocrina del adipocito ejerce una influencia directa sobre otros órganos clave, como el cerebro, el hígado o los músculos esqueléticos.
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Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB (Bays y col, 2008.
Revisión)
.
Receptores de membrana para hormonas Insulina (lipogénico / antilipolítico) Glucagón (lipolítico)
GH TSH Receptores de hormonas nucleares y otros
receptores nucleares
Glucocorticoides Andrógenos Estrógenos Hormona tiroidea PPAR, PPAR /, PPARγ Receptor de adipoquinas y citoquinas Leptina
Adiponectina IL-6
TNFα
Receptores de catecolaminas β1,β2,β3 (lipolíticos) α1,α2 (antilipolíticos) Receptores de factores de crecimiento y
otros receptores
FGF, EGF, IGF, …
Cannabinoides, melanocortinas, NPY Lipoproteínas
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Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con funciones
endocrinas / paracrinas / autocrinas (Bays y col, 2008. Revisión).
Adipoquinas y Citoquinas Leptina TNFα IL-6 Proteínas relacionadas con el sistema inmunitario
MCP-1
Proteínas implicadas en el sistema fibrinolitico
PAI-1
Factor tisular Proteínas del complemento y relacionadas Adipsina
Adiponectina Lípidos y proteínas del metabolismo y
transporte de lipidos
LPL
Apolipoproteina E
Otras Resistina
A continuación haremos una breve descripción de algunas de las más importantes adipocitoquinas secretadas por el TAB. Como la segunda parte de esta tesis está relacionada con los efectos de la leptina, ésta será analizada con más detalle.
1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα).
EL TNFα es una citoquina identificada inicialmente en macrófagos y linfocitos en respuesta a un estimulo inflamatorio. Dentro del tejido adiposo, TNFα se expresa en adipocitos y células estromales vasculares (Fain y col., 2004). Se sintetiza como una proteína transmembrana de 26 kDa que sufre la degradación por una metaloproteinasa que libera a la circulación la molécula soluble de TNF- α de 17 kDa (Kriegler y col., 1988).
Los adipocitos aislados y diferenciados son capaces de producir TNF-α y aunque el tejido adiposo está compuesto de una variedad de tipos celulares incluyendo adipocitos, células del estroma, células del sistema inmune y células endoteliales
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vasculares, todas capaces de producir citoquinas, los adipocitos son la fuente predominante de TNF-α (Ruan y col., 2003).
Aunque inicialmente se sospechó que TNF- podría estar jugando un papel importante en la caquexia, hoy se sabe que está implicado en la patogénesis de la obesidad y la resistencia a la insulina (Fernández-Real y Ricart, 2003; Ruan y Lodish, 2003). La expresión del TNFα de TAB está aumentada en ratones y humanos obesos y se correlaciona positivamente con la adiposidad y la resistencia a insulina (Ruan y Lodish, 2003; Hotamisligil y col., 1993; Hotamisligil, 2003). Sus acciones en tejido adiposo incluyen la represión de genes involucrados en la captación y el almacenamiento de AGL y glucosa y de genes implicados en la adipogenesis como PPARγ y el cambio en la expresión de otras adipocitoquinas como leptina, adiponectina e IL-6 (Ruan y col., 2002). Por otro lado, TNFα deteriora la señalización de insulina mediante la alteración del estado de fosforilacion de IRS-1 y 2 (Hotamisligil, 2003). Estos efectos pueden producirse de forma directa e indirectamente a través del aumento de AGL (Ruan y Lodish, 2003). El modelo de deficiencia de TNFα en ratón presenta mejor insulinemia, mejor tolerancia a la glucosa y protección para el desarrollo de la obesidad y la resistencia a la insulina cuando se administra una dieta rica en grasas (Uysal y col., 1997; Ventre y col., 1997).
1.4.2- IL-6.
La IL-6 es una citoquina proinflamatoria, de la cual se estima que un tercio de sus valores circulantes provienen del TAB, correlacionándose con el IMC (Fruhberck y col., 2001; Fernández-Real y Ricart, 2003). Sin embargo, la mayor parte de la IL-6 derivada del tejido adiposo proviene de las células de la fracción del estroma vascular (Galic y col., 2010). Los valores circulantes de IL-6 están incrementados en individuos obesos, aspecto que podría estar mediado por el TNFα, ya que se ha demostrado su capacidad de estimular la expresión de IL-6 en adipocitos (Fruhbeck y col., 2001). En humanos, los valores circulantes de IL-6 se han correlacionado positivamente con resistencia a la insulina, fenómeno al cual podría contribuir, ya que la IL-6 incrementa la concentración de FFA circulantes e inhibe la actividad de la LPL (Bastard y col.,
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2000). Los niveles plasmáticos de IL-6 se encuentran elevados en obesidad y RI (Mohamed-Ali y col., 1997; Bastard y col., 2000; Vozarova y col., 2001). Según Frühbeck y col., (2001) la leptina induce la expresión de IL-6 en los adipocitos. Por otra parte se ha descrito que la IL-6 inhibe la producción de adiponectina (Yu y Ginsberg, 2005), adipoquina asociada al incremento de sensibilidad a la insulina. Sin embargo, el papel de IL-6 en la resistencia a la insulin, la obesidad y la inflamación no se conoce del todo. Otros estudios la implican tanto en procesos que promueven la inflamación como en procesos resolutorios de la inflamación (Allen T.L. y col., 2010). Los resultados publicados por (Sadagursky M y col., 2009) (Tabla 3) postulan que la IL-6 incrementa las acciones de la leptina.
1.4.3- PPARγ.
Es un miembro de la familia de receptores nucleares activados por proliferadores de peroxisomas que se expresan fundamentalmente en TA y macrófagos. Su función es clave en la regulación transcripcional de la adipogénesis. Agonistas de PPAR-γ como las TZDs (tiazolidinedionas), promueven la diferenciación de los adipocitos y mejoran la sensibilidad a la insulina en modelos animales de diabetes tipo II, así como en pacientes con diabetes tipo II (Olefsky, 2000).
Las vías de señalización mediadas por TNFα y PPAR γ son mutuamente antagónicas. Se plantea que la activación de PPAR γ puede atenuar los efectos metabólicos negativos de TNFα tanto “in vitro” como “in vivo” (Szalkowki y col., 1995;Milles y col., 1997; Souza y col.,1998).
También cabe destacar que PPARγ estimula la captación de los ácidos grasos, a través del aumento de la proteína transportadora de ácidos grasos, de la LPL, de la acil-CoA sintasa, y la esterificación de los triglicéridos en una acción concertada con otro factor de transcripción SREBP-1c que regula la lipogénesis para el llenado de las gotas lipídicas (Evans y col., 2004).
17 1.4.4- Resistina.
La resistina es una proteína de 94 aminoácidos que se describió inicialmente en el adipocito maduro de roedores (Steppan y col., 2001b). En humanos la resistina circulante proviene fundamentalmente de los macrófagos, células del sistema inmune. En roedores, la resistina produce resistencia a la insulina y aumenta la producción hepática de glucosa. Sin embargo, la contribución de la hiperresistinemia al desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2, continúa siendo objeto de una gran controversia. Según estudios iniciales, las concentraciones de resistina están aumentadas en modelos de obesidad inducida o genética (Steppan y col., 2001a) mientras que la neutralización de la misma empleando anticuerpos específicos contra resistina, disminuía la hiperglucemia y mejoraba la resistencia a la insulina en estos modelos.
En humanos las discrepancias son aún mayores, aunque se ha demostrado correlación entre los niveles circulantes de resistina y el peso corporal, la adiposidad o la resistencia a la insulina (Janke y col., 2002; Savage y col., 2001).
Diferentes factores afectan la síntesis de resistina en roedores, entre los que se encuentran la edad y el estado nutricional así como la localización anatómica del tejido adiposo. En la rata Wistar, la expresión de resistina por el tejido adiposo epididimal disminuye con el envejecimiento. Por otra parte, la restricción calórica moderada, disminuye la expresión de resistina por el tejido adiposo visceral así como los niveles circulantes de esta adipoquina, solo en animales jóvenes y maduros (Fernández y col, 2009).
Con el objetivo de profundizar en las funciones de las resistinas humana y de roedores se crearon ratones deficientes en resistina derivada del tejido adiposo, pero que producían resistina humana de forma similar a como la producen en humanos los macrófagos (ratones transgénicos humanizados). Cuando estos animales son alimentados con dieta alta en grasa desarrollan rápidamente inflamación en el tejido adiposo, a la par que aumenta la lipolisis y los niveles séricos de AGL. La inflamación del tejido adiposo se desencadena a partir del incremento en MCP-1 dependiente de resistina. Con el tiempo, estos animales acumulan lípidos en el músculo (incluyendo
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DAG) y desarrollan resistencia a la insulina en este tejido relacionada con el aumento de la fosforilación en serina del IRS-1. Estos resultados demostraron que tanto la resistina de roedores como la humana exacerba la inflamación del tejido adiposo y genera resistencia a insulina en músculo esquelético (Qatanani M y col, 2009).
1.4.5- Adiponectina.
La adiponectina es una proteína de 30 kDa producida abundantemente por el tejido adiposo que sufre numerosas modificaciones postraduccionales (Maeda y col., 1996; Scherer y col., 1995). A diferencia de la resistina, la adiponectina disminuye la producción hepática de glucosa. Además, la expresión de adiponectina se encuentra disminuida en todos los procesos relacionados con estados de inflamación y resistencia a la insulina, como en la obesidad, la diabetes mellitus y la enfermedad coronaria (Hotta y col., 2000; Weyer y col., 2001; Adamczak y col., 2003; Kishida y col., 2003). De modo que es la única adipoquina con efectos saludables sobre diferentes tipos de células y tejidos, efectos que generalmente se asocian al aumento de actividad de la enzima AMPK (Yamauchi y col, 2002).
Los niveles de adiponectina aumentan cuando la sensibilidad a la insulina mejora, ya sea por la disminución del peso corporal o por tratamientos con drogas sensibilizadoras de la insulina (Chandran y col., 2003; Diez e Iglesias, 2003). Los ratones deficientes en adiponectina desarrollan de forma prematura intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina inducida por dieta muestran, elevados valores de FFA séricos y una incrementada proliferación de células del músculo liso vascular en respuesta al daño tisular (Kubota y col., 2002; Maeda y col., 2002). Por otra parte, la sobreexpresión de adiponectina en ratones conduce a una mejora en la sensibilidad a la insulina, la tolerancia a la glucosa y los niveles séricos de FFA (Combs y col., 2004).
Se plantea que numerosos fármacos con efectos hipolipémicos como los ácidos grasos omega 3, las estatinas y fibratos así como la niacina, que mejoran el pérfil lipídico del organismo, no afectan la liberación de TNF, resistina o leptina, sin embargo, incrementan la producción de adiponectina por el tejido adiposo (Wanders y col, 2010).
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La leptina es una hormona peptídica de 16 kDa y no presenta modificaciones post-traduccionales (Halaas y col., 1995). Esta hormona codificada por el gen ob, es producida y secretada por los adipocitos y en menor medida se ha detectado en la placenta, donde estimula el crecimiento y la sobrevivencia de los trofoblastos (Masuzaki y col., 1997; Gambino y col, 2012), en la mucosa gástrica, donde potencia la respuesta vagal aferente frente a la distensión gástrica (Bado y col., 1998; Kentish y col, 2013) y en el músculo esquelético (Wang y col., 1998).
La secreción de leptina por los adipocitos tiene lugar en proporción directa a la masa de tejido adiposo y al estado nutricional (Frederich y col., 1995). La síntesis y secreción de leptina está regulada por una compleja red de señales neuroendocrinas y endocrinas que reflejan el estado fisiológico del organismo. Los niveles circulantes de leptina están asociados con la masa del tejido adiposo y también reflejan cambios inmediatos en el estado nutricional ya que disminuyen, poco después del comienzo del ayuno (Becker y col., 1995). En condiciones normales, sus niveles plasmáticos aumentan en casos de balance energético positivo, es decir, cuando la ingesta y la absorción de nutrientes exceden el gasto energético global. De esta forma, se comporta como un marcador del estado de las reservas del organismo. La impresión inicial después de su descubrimiento en 1994, fue que la leptina (del griego leptos, delgado) era una señal dirigida al cerebro para inhibir la ingesta de alimentos y disminuir el peso corporal (Zhang y col., 1994). Este concepto fue impulsado en parte por la observación de que los seres humanos y roedores que carecen de leptina funcional manifiestan un apetito exagerado y obesidad.
La leptina limita el depósito graso en el tejido adiposo protegiendo de la lipotoxicidad (Unger, 2002; Kahn y col., 2005). Estimula la oxidación de los ácidos grasos (Muoio y col., 1997; Minokoshi y col., 2002) y la captación de glucosa por los músculos esqueléticos (Haque y col., 1999; Kamohara y col., 1997). Estos efectos metabólicos de la leptina se encuentran en parte mediados por la activación del eje hipotálamo-sistema nervioso simpático (Buettner y col., 2008; Minokoshi y col., 2002). Muchos de estos efectos metabólicos tienen lugar demasiado rápido para ser atribuido
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a los cambios transcripcionales (señalización JAK-STAT) e involucran la activación de la señalización de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) como fue descrito en el músculo y el hígado por Kahn y col., (2005).
La leptina puede tener efectos autocrinos y paracrinos en el metabolismo del adipocito (Fruhbeck y col., 1997): la incubación de adipocitos de ratón con leptina estimula la lipólisis de los triglicéridos intracelulares, dicho efecto no fue observado en ratones db/db carentes de receptores de leptina y la sobreexpresión de leptina en adipocitos reduce la expresión de la acetil-CoA carboxilasa. La leptina también reduce la expresión de la proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c (SREBP1c) en tejido adiposo, lo que contribuye a inhibir la lipogénesis en este tejido (Yu y Ginsberg, 2005).
Aunque la leptina regula, a través del SNC, una multitud de funciones fisiológicas como la ingesta y el balance energético (Friedman y col., 1998), la función inmune y reproductiva (Lord y col., 1998; Hileman y col., 2000), la hematopoyesis (Margetic y col., 2002) la homeostasis de la glucosa (Friedman y Halaas, 1998), cabe destacar sus efectos antilipogénicos (Gallardo y col, 2007; Warne y col, 2011), antidiabéticos tanto en diabetes tipo I como tipo II y que éstos efectos son independientes de la regulación del peso corporal y la ingestión de alimentos (Coppari y Bjørbæk, 2012).
La observación fundamental que permitió relacionar la leptina con los procesos de regulación del peso corporal proviene de estudios realizados con ratones ob/ob, en los cuales la falta de leptina funcional provoca hiperfagia, obesidad y una disminución de la tasa metabólica. Por otra parte la administración de leptina es capaz de revertir las alteraciones causadas por la ausencia de esta hormona (Zhang y col., 1994; Rentsch y col., 1995; Maury y Brichard, 2010). Sin embargo, la noción de la leptina como una hormona anti-obesidad fue puesta en duda debido a que la obesidad se asocia típicamente con niveles altos de leptina y resistencia a la leptina (Ahima, 2008). Se conoce que humanos obesos y diversos modelos animales de obesidad inducida y genética (excepto el modelo ob/ob) presentan hiperleptinemia, condición indicativa de
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resistencia a esta hormona que se normaliza tras la pérdida de peso (Maffei y col., 1995).
Se han propuesto varios mecanismos que intentan explicar la resistencia central a la leptina como son los defectos en el sistema de acceso de la leptina al sistema nervioso central dado que el transporte a través la barrera hematoencefalica es saturable. Defectos en la expresión del receptor largo de leptina Ob-Rb en el hipotálamo y/o de la señalización mediada por el receptor, que incluye el aumento en niveles de SOCS-3. Defectos en los circuitos neuronales que regulan el balance energético. Estrés crónico del retículo e inflamación a nivel de los núcleos hipotalámicos (El Haschimi y col., 2000; Morris y Rui, 2009; Ozcan y col, 2009; Zachary y col, 2010; Olofsson y col, 2013). No obstante, se ha propuesto utilizar el término resistencia selectiva a la leptina cuando se analizan ciertos desórdenes metabólicos como la obesidad y la diabetes, debido a que la resistencia no afecta por igual a todas las células, a todos los órganos diana o a todas las vías de señalización en las que está implicada esta hormona ( Könner y Brüning JC, 2012).
1.4.7- Transmisión de la señal de leptina.
La leptina al igual que la insulina regula el peso corporal y el metabolismo a través de circuitos neuronales. La leptina ejerce sus acciones biológicas uniéndose a sus receptores. El gen db, que codifica para el receptor de leptina (ObR), se aisló por primera vez en el plexo coroideo de ratón (Tartaglia y col., 1995). Los receptores de leptina pertenecen a la superfamilia de receptores de citoquina clase 1. El splicing alternativo del gen db da origen a las 6 isoformas de los receptores: la forma soluble Ob-Re, la cual carece de dominio citoplasmático; cuatro formas con dominios citoplasmáticos cortos (Ob-Ra, Ob-Rc, Ob-Rd y Ob-Rf), y la forma Ob-Rb, la cual se encuentra en casi todos los tejidos y podría ser la única forma capaz de transducir la señal de la leptina al menos en el SNC (Friedman y Hass, 1998; Lago y col., 2007).
La leptina controla el balance energético y el peso corporal porque regula la actividad neuronal en el hipotálamo, estas acciones implican fundamentalmente la vía
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JAK/STAT. La unión de la leptina a su receptor (Ob-Rb), conduce a la autofosforilación de la quinasa citosólica JAK2 y a la fosforilación de STAT3 mediada por JAK2 (Figura 3). La activación de STAT3 regula la transcripción de neuropéptidos como POMC, CART, AgRP y NPY. Esta vía es importante para las funciones anti-obesidad de la leptina, es la vía de regulación de la homeostasis de energía. La activación de STAT3, a su vez, incrementa la expresión del inhibidor de la señalización por citoquinas SOCS3 (Frühbeck, 2006; Olofsson, 2013).
La leptina también actúa a través de la vía PI3K-AKT en determinados núcleos hipotalámicos (Figura 3). Se sugiere que esta vía es la que contribuye a regular la homeostasis de la glucosa y la sensibilidad a la insulina de todo el organismo. Así, esta vía media las acciones antiesteatóticas de la leptina sobre el tejido adiposo inhibiendo la lipogénesis en tejido adiposo blanco en respuesta a leptina (Bates SH y col., 2003; Bates SH y col nature 2003; Ernst MB y col., 2009; Morris DL y col., 2009).
