INFORME DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS PARA LA
EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE LOS IMPLANTES
DENTAL TECH S.r.l./NORMON
Referencia: D.d.t. n. 694/00 del 14.04.14 y carta de solicitud del
Sr. Gabriele CAVALLET del 15.04.14.
Nuestra referencia: 2501400237
Evaluación realizada por:
Dra. Clara CASSINELLI
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Dr.
Marco MORRA
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Portacomaro, 19/05/2014
n.º de copias distribuidas: 1
destinatario: Sr. Gabriele CAVALLET, DENTAL TECH S.r.l./NORMON, Via
DI VITTORIO 10/12, 20826 MISINTO (MI), ITALIA
EL TEXTO DE ESTA RELACIÓN SE CONSERVA EN DISCO EN NBR
.
RESERVADO RESERVADO RESERVADO
Generalidades
El objetivo de este trabajo consistía en evaluar las características de citotoxicidad de las muestras de implantes dentales suministradas por DENTAL TECH S.r.l.
Materiales y métodos
El material sometido a análisis estaba formado por cinco implantes dentales suministrados en su envase estéril de venta, en concreto implantes NORMOPLANT HI, Ø 3.25, L. 10, con código 020862 lote 0140/14 y caducidad en abril de 2019.
Las pruebas de citotoxicidad se realizaron conforme a las directrices de la norma EN ISO 10993-5: 2009, Evaluación Biológica de los Dispositivos Médicos - Pruebas de Citotoxicidad in vitro y a la bibliografía internacional.
En el ámbito de los métodos sugeridos por la norma ISO se adoptó el método "por contacto directo" que prevé que las células y los materiales que se han de comprobar no estén separados físicamente por ningún medio.
Las células utilizadas para la comprobación de la citotoxicidad fueron osteoblastos de sarcoma osteogénico humano SaOS-2 (BS TCL 90), obtenidos del Centro de Substratos Celulares del Instituto Zooprofiláctico Experimental de Lombardía y Emilia Romagna. Se calculó una suspensión de 3.250.06 x 105 osteoblastos/ml (la densidad de la
suspensión celular se calculó mediante un instrumento TC10 Automated Cell Counter, BIO-RAD) en 2.5 ml de medio de cultivo McCoy’ 5a, al que se adicionó un 20% de suero de feto bovino (FBS), penicilina y estreptomicina (todos los componentes del medio de cultivo de crecimiento celular GIBCO proceden de la empresa INVITROGEN Srl, San Giuliano Milanese (MI), Italia) y se introdujo, el día 1, en contenedores estériles de poliestireno para cultivos celulares de 12 compartimentos (placa de 12 pocillos Cell Star, de Greiner One). El día 3, al cabo de unas 36 horas de crecimiento, con las células en estado de subconfluencia (fig. 1), es decir al final de la fase de crecimiento logarítmico, el medio de cultivo de crecimiento se sustituyó por un medio fresco.
Fig. 1: Células en subconfluencia
A continuación, se introdujeron en los contenedores de 12 pocillos los cinco ejemplares de implante, en contacto directo con el monoestrato celular subconfluente. También se colocaron en los correspondientes pocillos 4 blancos carentes con seguridad de efectos citotóxicos pues estaban formados por medio de cultivo fresco estéril y 4 controles negativos, es decir carentes con seguridad de efectos citotóxicos_(cilindros de polietileno de forma y dimensiones comparables a las de las muestras) y los cuatro controles positivos, es decir dotados sin duda de efectos citotóxicos (cilindros de goma nitrílica NBR, de forma y dimensiones comparables a las de las muestras). Todas las operaciones descritas se llevaron a cabo bajo una capa de flujo laminar (Faster BIO 48, DASIT).
Los contenedores de 12 pocillos se colocaron seguidamente en una incubadora a 37° C, 5 % de CO2 y humedad relativa del 98 % durante otras 48 horas.
Transcurridas las 48 horas de crecimiento en contacto directo con las muestras y los controles, se observaron las células con un microscopio óptico inverso LEICA DMI4000B, con objeto de determinar la citotoxicidad a nivel cualitativo. En particular, se observó y
documentó toda la zona relativa al perímetro de los implantes con objeto de comprobar, en primer lugar, el nivel de proliferación celular, luego la posible presencia de células muertas, células con la morfología alterada, células gigantes multinucleadas (indicador de presencia de efectos de tipo inflamatorio) y células vacuolizadas. Los resultados cualitativos de la observación microscópica se confrontaron con lo observado a nivel del estrato celular en contacto con el blanco (medio de cultivo fresco), con el control negativo (los cilindros de polietileno) y en contacto con el control positivo (los cilindros de goma NBR).
Después de la observación microscópica, las células de un solo pocillo se fijaron con una solución a base de tampón fosfato Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) y glutaraldehído al 4 %, teñido con azul de toluidina (0,5 % p/v en agua MilliQ, todos los reactivos utilizados en esta última fase se adquirieron a SIGMA ALDRICH Srl de Milán) y finalmente se fotografiaron con el microscopio LEICA DMI4000 B. Las células de los otros cuatro pocillos se sometieron a evaluación cuantitativa de la citotoxicidad mediante el ensayo MTT, de acuerdo con el anexo C de la norma ISO 10993-5, para la evaluación de la eficiencia de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH) mitocondrial. El ensayo MTT evalúa la eficiencia de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa, parte del complejo enzimático conocido como complejo II o complejo de la succinato deshidrogenasa, implicado en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de los electrones. Esta enzima solo es activa en las mitocondrias de las células vivas y su función consiste en cortar el anillo de tetrazolio del MTT (sustancia de color amarillo) con la consiguiente formación de formazano (una sal azul). En la práctica, el ensayo MTT prevé que después de la observación microscópica se incuben las células con una solución de 5 mg/ml de la sal de tetrazolio soluble bromuro de 3-(4.5-dimetiltiazol – 2yl)-2.5 difeniltetrazolio, Sigma Aldrich S.r.l., Milano. La enzima succinato deshidrogenasa, durante las siguientes tres horas de incubación a 37 °C, induce la transformación de las sales de tetrazolio, inicialmente en forma soluble y de color amarillo, en un producto de color azul insoluble en agua, el formazano: cuanto mayor es la cantidad de precipitado
más elevada ha sido la actividad enzimática y, en consecuencia, el número de células vivas, metabólicamente vitales. El precipitado se solubiliza con dimetilsulfóxido (Sigma Aldrich S.r.l, Milano) y se mide espectrofotométricamente a una longitud de onda de 570 nm mediante un espectrofotómetro GENios (TECAN srl). Esta medición proporciona la densidad óptica (DO) que se utilizará para el cálculo de la vitalidad celular. El dato se suministra en forma de media y desviación estándar de las cuatro medidas obtenidas de cuatro pocillos distintos.
Resultados
La evaluación empezó el 24-04-2014 y finalizó el 28-04-2014.
El blanco y los controles negativo y positivo ofrecieron los resultados esperados, permitiendo además validar el experimento realizado. Por otro lado, las observaciones con el microscopio óptico de las distintas fases de la vida celular ofrecieron siempre los resultados esperados, excluyendo también errores sistemáticos a nivel de inoculación celular y diferencias morfológicas de las características de las células expuestas a los materiales.
Los resultados obtenidos con los implantes mostraron la ausencia total de fenómenos adversos en comparación con los osteoblastos SaOS-2.
Las figuras 2 a 4 muestran el estrato de células SaOS-2 cultivadas, respectivamente, en ausencia de materiales (blanco), en presencia de los controles negativos (cilindros de polietileno) y en presencia de los controles positivos (cilindros de goma NBR).
Fig. 2: blanco
Con respecto a las células en ausencia de estímulos de cualquier naturaleza (blancos) y las expuestas a controles negativos (los cilindros de polietileno), se obtuvieron los resultados esperados.
Las células osteoblásticas SaOS-2, de hecho, en su forma poligonal típica presentan una elevada densidad (colonizaron todo el espacio puesto a su disposición), no se vacuolizan, no se agregan para formar células gigantes multinucleadas y quedan bien ancladas al fondo del contenedor de poliestireno (recordemos que las células SAOS-2 con células dependientes de anclaje). Se presentan, por tanto, con las típicas características mostradas en caso de ausencia de fenómenos tóxicos o inflamatorios.
Fig. 4: control positivo
Por contra, en la figura 4, que presenta el resultado obtenido con el control positivo, es decir con las células expuestas a los cilindros de goma NBR, aparece un cuadro completamente distinto: las células aparecen en número claramente reducido y con una morfología considerablemente alterada respecto a la del control negativo y del blanco (puesto que se trata de células moribundas en fase de separación del fondo del pocillo), típica de las situaciones en las que se han dado fenómenos citotóxicos graves.
Las figuras 5 a 8 muestran las células SAOS-2 desarrolladas en presencia de muestras de implante: en particular, las imágenes 5 y 6 se realizaron con baja ampliación, en las zonas cercanas al borde de los implantes, para documentar la zona de máxima interacción entre células y material, mientras que las figuras 7 y 8, a distancia del borde, ofrecen informaciones más detalladas sobre la morfología celular. Advirtamos que la zona negra de las imágenes microscópicas 5 y 6 corresponde al perfil del implante, que no es transparente a la luz.
Fig. 6
Fig. 8
Del conjunto de las imágenes, tanto las realizadas cerca del borde como a distancia, se deduce que las células SAOS-2 proliferan sin perturbaciones en presencia y en contacto con este tipo de implante, ya que del mismo no se libera ningún elemento citotóxico.
Expresando los resultados en forma final, ofrecidos según la norma ISO 10993-5: 2009: Tabla 1 Grados de reactividad de la citotoxicidad por contacto directo
Grado Reactividad Descripción de la zona de reactividad
0 ninguna Ninguna anomalía en las zonas alrededor y bajo la muestra 1 leve Algunas células con morfología anómala o degenerada bajo la
muestra
2 modesta Área anómala limitada bajo la muestra
3 moderada Área anómala a no más de 1 cm respecto a los bordes de la muestra
4 grave Área anómala que se extiende más allá de 1 cm respecto a los bordes de la muestra
Tabla 2 Resultado obtenido
Muestra Grado Interpretación
Control negativo (medio de cultivo fresco) 0 No citotóxico Control negativo (polietileno) 0 No citotóxico Control positivo (goma NBR) 4 Gravemente citotóxico Implantes NORMOPLANT HI, Ø 3.25 L. 10
código 020862, lote 0140/14 0 No citotóxico La vitalidad celular de los osteoblastos SaOS-2 se ha calculado conforme al punto C.2.5 del anexo C de la norma ISO 10993-5 con la fórmula siguiente:
vitalidad en % =100 x DO 570 BLANCO (medio de cultivo fresco) DO 570 IMPLANTES Y CONTROLES
Los resultados de citotoxicidad se han confirmado a nivel cuantitativo a partir de las evidencias generadas por el ensayo MTT. En la tabla siguiente se ofrecen los valores de absorbancia, el porcentaje de vitalidad y la reducción de vitalidad respecto al control negativo, iguales por definición al 100 %. En la confirmación del dato microscópico, el valor de absorbancia generado en las células cultivadas en presencia de los implantes NORMOPLANT HI ha resultado similar al obtenido en las células cultivadas en presencia del blanco y del control negativo, permitiendo así excluir con certeza los efectos citotóxicos.
Tabla 3: Absorbancia (ensayo MTT)
Muestra Valor medio
DO570 Vitalidad (% de los valores medios) Reducción del % de vitalidad Control negativo (medio de
cultivo fresco)
0,4825±0,0122 100 0 Control negativo (polietileno) 0,4742±0,0141 98,28 1,72 Control positivo (goma NBR) 0,1031±0,0066 21,37 78,63
NORMOPLANT HI 0,4735±0,0097 98,13 1,87
Gráfico 1
La norma ISO indica que el 70 % de reducción de la vitalidad celular respecto al blanco implica con seguridad un cuadro de citotoxicidad.
Conclusiones
En conclusión, las evaluaciones cualitativas (microscópicas) y cuantitativas (ensayo MTT) llevadas a cabo han indicado la total ausencia de fenómenos de citotoxicidad a nivel de las células SaOS-2 cultivadas en contacto con las muestras de implantes NORMOPLANT HI.
