Criopreservación de esperma del abulón rojo Haliotis rufrescens

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Y APROBADA POREL SIGUIENTE COMITE

Dra. Carmen G. PAniagua Chavez Directora del Comité

&

-f

—>-Dr. Miguel Angel del Rio Portilla Dr.Bygenio Carpizo Ituarte

Miembro del Comité Miembro del Comité

Miembso del Comité

goASA,

Jefe del Departamento de Director de Estudios de Posgrado Acuicultura, Biotecnologia Marina

CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA Y DE

EDUCACION SUPERIOR DE ENSENADA

DIVISION DE OCEANOLOGIA

DEPARTAMENTO DEACUICULTURA,

BIOTECNOLOGIA MARINA

ne

Criopreservacion de espermadel abulon rojo Haliotis rufescens

TESIS

que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS CON ORIENTACION EN ACUICULTURA

presenta:

LILIANA SALINAS FLORES

CRIOPRESERVACION DE ESPERMA DEL ABULON RQJO HALIOTIS RUFESCENS

Resumen aprobadopor:

Dra. Carmen G. Paniagua Chavez Directora de Tesis

E] cultivo de abulén en Baja California, México es una industria floreciente que requiere de tecnologias de apoyo para un rapido desarrollo. La criopreservacién de esperma ofrece una alternativa, no sdlo a la acuicultura, sino también a la problematica de conservacién de especies amenazadas o en peligro de extincién. En el presente trabajo se desarrollaron protocolos para el almacenamiento a corto plazo y de criopreservacién de esperma del abuldn rojo Haliotis rufescens.

El espermade abulonse activa al entrar en contacto con el medio acuatico. Debido a que en otras especies uno de los factores que es el responsable de la activacién del espermaes la acidez o alcalinidad del medio en que ocurra el desove, fue necesario realizar ensayos para determinar si soluciones con diferente pH podian desactivar el esperma de abulén. Se refrigeraron muestras de esperma fresco en soluciones con diferente pH durante una semana. Se verificé la motilidad diariamente antes de resuspender las muestras en agua de mar filtrada. Se encontraron diferencias significativas con respecto al tiempo de almacenamiento. La maxima motilidad, respecto al control, fue encontrada el dia 1 para el esperma suspendido en agua de mar con pH 6 (88%) después de haber sido resuspendido. Sin embargo, no fue posible encontrar una solucién desactivadora, por lo que no se considera que el pH sea el factor activador del esperma de abulén rojo. El esperma de abulon rojo puede mantenerse movil bajo refrigeracidén y concentrado en un pequefio volumen de agua de marfiltrada.

considerd que las soluciones crioprotectantes mas adecuadas para la criopreservacién de esperma de abulon rojo son DMSO 10% y Gly 10%.

La criopreservacion de muestras se Ilevé a cabo en camaras de congelamiento del método simplificado (MS), programado (CP) y comercial (GNX). Se utilizaron tres parametros para evaluar la viabilidad del esperma criopreservado: motilidad, viabilidad de acuerdo a células teflidas con SYBR 14® y yoduro de propidio y analizadas por citometria de flujo, y la tasa de fertilizacion. La mayor motilidad observada (48 + 7%) correspondio a las muestras congeladas utilizando Gly 10% en la camara de congelacién MS, mientras que la maxima viabilidad de células espermaticas analizadas en el citémetro de flujo fue observada para las muestras congeladas en GNX (48 + 2%), utilizando 10% DMSO. En cuanto a la tasa de fertilizacién, se observé una tasa maxima para muestras congeladas en GNX (29 + 10%), utilizando Gly 10%.

CRYOPRESERVATION OF RED ABALONE SPERM HALIOTIS RUFESCENS

Abstract approved by::

Abalone culture in Baja California, México is a flourishing industry that requires supporting technologies. Sperm cryopreservation offers an alternative, not only to aquaculture, but also to solve conservation problems of endangered species. In this project, protocols for the short term storage and cryopreservation of red abalone sperm Haliotis rufescens were developed.

Abalone sperm becomes active as soon asit is released into sea water. In other aquatic species, one of the factors involved in sperm activation is the acidity or alkalinity of the water in which gametes are spawned. For this reason, it was necessary to find a solution by testing different pH which would be able to inactivate sperm once spawned. Samples of fresh sperm were refrigerated for a week in different pH solutions. Motility was observed daily before and after resuspension of the samples in filtered sea water. Significant differences were found regarding time of storage. Regarding the treatments, the highest motility, was found on day 1 for samples of sperm resuspended in sea water with pH 6 (88%). However, it was notpossible to find an inactivating solution, therefore,it is thought that pH is not aninactivating factor for abalone sperm. Red abalone sperm can mantain its motile capability for six days underrefrigeration at high concentrations and suspendedin small amounts offiltered sea water.

Cryoprotectant solutions have a toxic effect on cells. Thus, the acute toxic effect of cryoprotectants was determined by suspending samplesof fresh abalone sperm in dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol (PG) or glycerol (Gly) solutions at concentrations of 5, 10, 15 and 20% for equilibration times of 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min. The highest motility was observed in samples suspended for 5 min in 5% DMSO (88 + 0.58%). A decrease in motility was observed as the concentration and equilibration time increased for the three cryoprotective solutions. Significant differences were found among cryoprotectants, concentrations and equilibration times (P < 0.05). Specifically, no significant differences were found for 5 and 10% DMSOorGlyfor sperm incubated for 5 and 10 min. Also, no significant differences were found in the motility of sperm suspended in 5% Gly throughout time (P < 0.05). The optimum cryoprotective solutions for the cryopreservation of red abalone sperm are 10% DMSO and Gly.

rate. The highest motility (48 + 7%) was observed for samples frozen with 10% Gly in the MSfreezing chamber, while the highestviability of cells analyzed with the flow cytometer was for samples frozen in the GNX with 10% DMSO (48 + 2%). Regarding the fertilization rate, the highest rate was observed in samples frozen with 10% Gly at the GNX freezing chamber (29 + 10%).

AGRADECIMIENTOS

Mi mas sincero agradecimiento a la Dra. Carmen G. Paniagua Chavez porla direccién de este trabajo, por compartir su conocimiento y por todo el apoyo brindado. Asimismo, deseo agradecera los miembros del comité, Dr. Miguel Angeldel Rio Portilla, Dr. Eugenio Carpizo Ituarte y Dr. José A. Fernandez Zepedapor la revisién y comentarios propositivos de este trabajo.

Agradezco el apoyo brindado por el Dr. Terrence R. Tiersch, Dra. Jill A. Jenkins, Mike Christensen, Daisy Dong y todo el personal técnico, administrativo y estudiantil de la Aquaculture Research Station de la Universidad Estatal de Louisiana, en Baton Rouge, E. U. A.para la realizacién de la parte experimentalde este trabajo.

Gracias al Dr. Ronald Malone, Sandy Malone y Tere Wing por darme albergue en sus casas, asi como compafifa y amistad durante mi estancia en Baton Rouge.

Infinitas gracias a la Dra. Ma. del Pilar Sanchez Saavedra, M. en C. Jorge A. Simental Trinidad, Bidl. Norberto Flores Acevedo y todo el personal del laboratorio de Microalgas por su buena disposicién para ayudar en todo momento.

Mil gracias a mis amigas, compafieras y cémplices de laboratorio Naielly, Cecy e Idalia . A mis amigas locales Angélica, Maru, y Gaby, asi como a Ale, Cynthia y Anapor el apoyo a distancia.

Agradezco muy especialmente a Carlos Cruz Fraga por el apoyo incondicional en las buenas y enlas no tan buenas.

Al CONAC)Tporel apoyo econémico a través de una beca durantela realizacion de este trabajo.

Al Centro de Investigacién Cientifica y de Educacion Superior de Ensenada por la oportunidad de una maestria mediante el financiamiento del proyecto No. 6546.

A todos los investigadores, técnicos, estudiantes y personal administrativo del Departamento de Acuicultura, Biotecnologia Marina de CICESE, que de una u otra forma me proporcionaron su ayuda.

A la granja Abulones Cultivados S. de R. L. de C. V., por proporcionar los abulonesy al Oc. Enrique Vazquez porla asesoria brindada.

La estancia en Ensenada para mis estudios de maestria nunca hubiera sido posible sin el apoyo en TODOSlos sentidos de mi mamaLiliana Flores Gonzalez. Gracias Ma.

I. Prefacio IL. Introduccion

I. 1 Biologia del Género

I]. 2 Pesqueria y Cultivo del Abulon en México

IL. 3 La Criopreservacién como Herramienta en la Acuicultura Il. 4 Comportamiento del Agua Intracelular

IL. 5 Soluciones Fisioldgicas IL. 6 Crioprotectantes

II. 7 Verificacion de Viabilidad II. 8 Ventajas de la Criopreservacion

III. Objetivos

IIL. 1 Objetivo General IIL. 2 Objetivos Particulares

IV. Hipotesis

V. Justificacién

VI. Materiales y Métodos

VI. 1 Obtencidn de los Abulones VI. 2 Induccién al Desove

VI. 3 Determinacién de Densidad Espermatica

VI. 4 Almacenamiento a Corto Plazo de Esperma de Abulén Experimento 1. Motilidad del esperma en soluciones de agua

de mar con diferentes pH ajustados con HCl y NaOH Experimento 2. Motilidad del esperma en soluciones de agua de mar con diferente pH a base de soluciones amortiguadoras VI. 5 Efecto Toxico Agudo de los Crioprotectantes

VI. 6 Criopreservacion de Esperma del Abulén Rojo Haliotis rufescens

VIL. Resultados

VII. 1 Determinacion de Densidad Celular

VIL. 2 Almacenamiento a Corto Plazo de Esperma de Abulén Experimento 1. Motilidad del esperma en soluciones de agua

de mar con diferentes pH ajustados con HCl y NaOH Experimento 2. Motilidad del esperma en soluciones de agua de mar con diferente pH a base de soluciones amortiguadoras VIL. 3 Efecto Toxico Agudo de los Crioprotectantes

VII. 4 Criopreservacion de Esperma del Abulén Rojo Haliotis rufescens

Literatura citada

Apéndice I Preparacion de Soluciones

Apéndice II Procedimientos Estandares Operacionales

Apéndice III Procedimientos de Manejo y Seguridad de Reactivos Apéndice IV Matrices de Analisis Estadistico

Apéndice V Analisis Econémico

Pagina l mo uo 10 11

Distribucién de cinco especies de abuldén en Baja California (tomado de Guzman-del Proo, 1992).

Ciclo de vida del abulon. A, abulones adultos; B, zigoto; C, blastula; D, larva veliger; E, semilla después del asentamiento (tomado de

Fallu, 1991).

Diagrama esquematico de cambiosfisicos dentro de la célula durante el congelamiento. Los hexagonossefialan la formacionde cristales de hielo (Tomado de Mazur, 1977).

Esquemadptico del citémetro de flujo (Tomado de Riley, 2002).

Camara de congelamiento para el método simplificado de criopreservacion de esperma de abulon.

Tasas de congelamiento para el método simplificado y congelamiento programado (A) y congelamiento comercial en Genex, Inc (B).

Analisis de citometria de flujo de esperma descongelado de abulonrojo, tefiido con yoduro de propidio (A) y SYBR 14° (B).

Espectro de absorcién del esperma de abulonrojo a diferentes diluciones.

Regresionlineal entre la absorbancia (nm) y el nimero de espermatozoides wL'en muestras de esperma de abulén.

Porcentaje de motilidad del esperma de abuldon antes (A) y después (B) de diluir con agua de mar(19°C, 34 %o).

Motilidad del espermaa diferentes pH amortiguados con 2mM HEPES y 3mM TRIS.

Toxicidad de los crioprotectantes DMSO,PG y Gly en esperma de abuldn suspendido en cuatro diferentes concentraciones e incubados durante seis diferentes tiempos de equilibrio.

Regresion lineal de viabilidad espermatica estimadaal tefiir con SYBR 14® y yoduro de propidio para diferentes porcentajes de espermatozoides viables de abuldn rojo.

14 Estadios de desarrollo de ovocitosfrescos fertilizados con esperma $2 criopreservado de abuldn rojo (A: extrusion del primer cuerpo

polar, la flechasefiala el primer cuerpopolar y se alcanzan a observar espermatozoidesen el exterior, B: primera divisién, C: segunda division, D: mas de cuatro células, E: larva trocofora temprana

y F: larva trocofora. Temperatura: 18 °C).

II OI IV VI VIL VII

Crioprotectantes utilizados en la criopreservacion de esperma de algunos moluscos.

Ventajas y desventajas de los parametros de evaluacion de la calidad del espermacriopreservadodel abuldn.

Verificacion de la calidad del esperma de abuldn rojo

criopreservado en camaras de congelamiento de MS, CP y GNX, utilizando como parametros de evaluacién la motilidad, viabilidad y tasa de fertilizacién (Letras iguales indican que no existe

diferencia significativa entre crioprotectante y camara de congelamiento para cada uno delos parametros evaluados; a> b > c > d, prueba

a posteriori Tukey HSD).

Numero de organismos (% sin correccién por el control) en cadaestadio de desarrollo observadoen ovocitosfertilizados con esperma de abulonrojo criopreservado con DMSO 10% y

Gly 10% (MS, método simplificado; CP, congelamiento programado y GNX, congelamiento comercial).

Preparacionde solucionescrioprotectantes para la criopreservacion de esperma de abulon rojo Haliotis rufescens.

Tratamientos del espermacriopreservadoutilizados para cada machoen lafertilizacién de ovocitos de abulén rojo Haliotis rufescens (T, Tratamiento; MS, Método simplificado;

CP, Congelamiento programado; GNX, Congelamiento comercial).

Analisis de Covarianza para la comparacion del efecto de los diferentes pH (4 a 10) sobre la motilidad del esperma de abulén rojo Haliotis rufescens antes de diluir alo largo del tiempo (7 dias) (Gl, grados de libertad; SC, suma de cuadrados;F, distribucién F; P, probabilidad).

Prueba a posteriori de Tukey HSDparaidentificar diferencias significativas especificas entre el efecto de los diferentes pH (4 - 10) sobre la motilidad del esperma de abuldn rojo Haliotis rufescens antes de diluir (* Media transformada = asen

[sqrt (mot/ 100) de los datos).

IX Xx XI XII XI XIV XV XVI

Analisis de Covarianza para la comparacion del efecto de

los diferentes pH (4 a 10) sobre la motilidad del esperma de

abuldn rojo Haliotis rufescens despuésde diluir a lo largo

del tiempo (7 dias) (Gl, gradosde libertad; SC, suma de cuadrados; F, distribucién F; P, probabilidad).

Pruebaa posteriori de Tukey HSDparaidentificar diferencias significativas especificas entre el efecto de los diferentes pH

(4 - 10) sobre la motilidad del esperma de abulén rojo Haliotis

rufescens después de diluir (* Media transformada = asen

[sqrt (mot/ 100) delos datos).

Analisis de Covarianza para la comparacion del efecto de los crioprotectantes (DMSO 10% y Gly 10%) y concentracion

(5, 10, 15 y 20%)a lo largo del tiempo(5, 10, 15, 20, 25 y 30 min) (Gl, grados de libertad; SC, suma de cuadrados; F, distribucion F; P, probabilidad).

Prueba a posteriori de Tukey HSD paraidentificar diferencias significativas especificas entre el efecto de los crioprotectantes

(DMSO 10% y Gly 10%) y las concentraciones (5, 10, 15 y 20%) (* Media transformada = asen [sqrt (mot/ 100) de los datos).

Analisis de Varianza de dos vias para la comparacion de los

crioprotectantes (DMSO 10% y Gly 10%) y las tres camaras

de congelamiento (MS, CP y GNX) conrespectoa la motilidad

(GI, grados de libertad; SC, suma de cuadrados; F, distribucion F;

P, probabilidad).

Prueba a posteriori de Tukey HSD paraidentificar diferencias

significativas especificas entre la motilidad, crioprotectantes (DMSO 10% y Gly 10%) y cémaras de congelamiento

(MS, CP y GNX) (* Media transformada = asen [sqrt (mot/ 100) de los datos).

Analisis de Varianza de dos vias para la comparacién de los

crioprotectantes (DMSO 10% y Gly 10%) y las tres camaras de congelamiento (MS, CP y GNX)conrespecto a la viabilidad (Gl, grados de libertad; SC, suma de cuadrados; F, distribucion F;

P, probabilidad).

Pruebaa posteriori de Tukey HSD paraidentificar diferencias significativas especificas entre la viabilidad, crioprotectantes

(DMSO 10% y Gly 10%) y camaras de congelamiento

(MS, CP y GNX) (* Media transformada = asen [sqrt (mot/ 100) de los datos).

XVII

XIX

XX

XXI

XXII

de fertilizacién (Gl, gradosde libertad; SC, suma de cuadrados; F, distribucion F; P, probabilidad).

Costoscapitales (en délares) para integrar la criopreservacién en una granja establecida de peces (Caffey y Tiersch, 2000).

Costos operacionales anuales (en ddlares) para la criopreservacion en una granja de peces establecida (Caffey y Tiersch, 2000).

Costos aproximadosanuales (en ddlares) para los desoves en la empresa Abulones Cultivados S. de R. L. de C. V.

Costos operacionales aproximados anuales (en dolares) para el mantenimiento de reproductores, lineas genéticas y organismos libres de patégenos en una granja hipotética.

Costos anuales aproximados(en délares) para el procesamiento de muestrasutilizando el servicio de GENEX Cooperative, Inc.

97

98

99

100

I. PREFACIO

Eneste trabajo se establecen los protocolospara la criopreservacién de esperma de abulén

rojo Haliotis rwfescens. También se describe a detalle los procedimientos de desove de

gametos y de almacenamiento a corto y largo plazo del esperma. Asimismo,se califican

métodos de evaluacidn de la calidad del espermacriopreservado mediante la verificacién de

motilidad, viabilidad y tasa de fertilizacién.

A lo largo del escrito se encuentran términosreferentes a la evaluacién de la calidad del

espermacriopreservado, por conveniencia, a continuacién se proporcionan las definiciones

que describen dichos términos tomando en cuenta el contexto en el que se aplican.

Motilidad: Porcentaje de espermatozoides que se desplazan activamente en direccién de

avance.

Viabilidad: Evaluacion de calidad espermatica que involucra la condicién de la membrana

citoplasmatica. Los espermatozoides viables son aquellos cuya membrana

citoplasmatica se encuentra intacta, por otro lado, los espermatozoides no

viables tienen las membranas dafiadas.

Tasa de fertilizacion: Es la cantidad de ovocitos fertilizados sobre la cantidad total de

ovocitos. El porcentaje reportado incluye unicamente organismos que Ilegaron

Durante la elaboracién de este proyecto nos enfrentamos con dificultades diversas. La

propuesta inicial contemplaba la criopreservacién de esperma de cuatro especies de abulén

de las costas de Baja California: abulén rojo (Haliotis rufescens), azul (Haliotis fulgens),

negro (Haliotis caracherodii) y amarillo (Haliotis corrugata). Se obtuvieron organismos

del medio natural (Isla Guadalupe, B.C.) de todas las especies mencionadas con excepcidn

del abulén rojo, ya que éste fue posible obtenerlo de la granja Abulones Cultivados S. de R.

L. de C. V. Sin embargo, la aclimatizacion de los organismos del medio natural a las

condiciones de laboratorio es dificil, sobre todo si se considera queel traslado de éstos les

produce un estrés. Es posible que algunos de los ejemplares hayan desovado durante el

traslado de Isla Guadalupe, B. C. a Ensenada, por lo que la recuperacién de la gonada

tardaria y habria que esperar a la siguiente temporada de desove. Asimismo, el estrés

producido result6 en una alta produccién de productos de deshecho nitrogenados en el

tanque del laboratorio, por lo que fue necesario cambiar el agua constantemente para

mantener dichos niveles bajos. La alimentacién de los abulones en el medio natural y la

alimentaci6n en el laboratorio es otra variable a considerar. En ocasiones se dispuso como

alimento natural de la macroalga Macrocystis pirifera. Sin embargo, cuando este alimento

no estuvo disponible, fue necesario proporcionar a los abulones unadietaartificial, en este

caso se utiliz6 ABMac (Aquafauna, Bio-Marine Inc., CA). Para un organismo del medio

natural, es dificil el cambio abrupto en su dieta. La combinacién de los factores de estrés

mencionados anteriormente trajo como resultado la muerte del 85% de los organismos

colectados en la Isla Guadalupe, B. C., quedando tnicamente seis organismos (dos

Trabajar con abuldn rojo tuvo varias ventajas. La primera fue que, al ser un organismo cultivado, es menos sensible a la manipulacién y mas tolerante a los cambios abidticos. Otra ventaja es que es una especie que se encuentra sexualmente madura en cualquier época del afio, a diferencia de las otras especies que tienen épocas definidas. Finalmente, es

importante mencionar la asesoria proporcionada por el personal de la granja Abulones Cultivados S. de R. L. de C. V. para los desovesy las fertilizaciones.

La parte experimental de este proyecto se puede dividir en tres etapas: (1) almacenamiento

a corto plazo y optimizacién de soluciones crioprotectantes para el esperma de abulon,(2) evaluacién de la calidad espermatica por medio de motilidad y viabilidad por citometria de flujo y (3) evaluacion de la calidad espermatica por medio de la tasa de fertilizacién. La segunda etapa fue realizada en Aquaculture Research Station (ARS) en la Universidad Estatal de Louisiana, E.U.A. ya que dicha institucién cuenta con un congelador

programable (KRYO 10 series II, Planer Products, Sunbury-on-Thames), un citémetro de flujo (FACSCalibur®, Becton Dickinson, CA) y convenios para congelar muestras utilizando las instalaciones del Genex Cooperative, Inc., ubicado enel T. E. Patrick Dairy

Improvement Center de la Universidad Estatal de Louisiana en Baton Rouge, Louisiana, E.U.A.

estrés, por lo que los niveles de productos de deshecho nitrogenados en el agua del tanque aumentaron. Al igual que con los organismos transportados del medio natural al laboratorio, fue necesario hacer cambios de agua continuos. Se realizé una induccidnal

desove de 10 machosal dia siguiente del arribo de los abulones, sin embargo, a pesar de

haber obtenido esperma, se observo necrosis de tejido gonadal y baja o nula motilidad de los espermatozoides. Los organismos murieron al segundo dia de haber Ilegado a las

instalaciones de la ARS.

Como unaalternativa al transporte de abulones, se tom6la decisién de hacer los desoves en el laboratorio de Reproduccién y Desarrollo del Departamento de Acuicultura, Biotecnologia Marina de CICESE y enviar las muestras de esperma concentrado y refrigerado a ARS. Detal forma que asi fue como se obtuvieron las muestras para los experimentos de verificacién de viabilidad con el citémetro de flujo y congelamientos programado y comercial.

A pesar de que el proyecto original con las cuatro especies de abuldn nose realizd, los

resultados presentados en este trabajo proporcionan una visién de la criopreservacién de esperma de abuldn rojo y las bases para la criopreservacién de otras especies de este

Il. INTRODUCCION

Los abulones viven en las costas de todos los continentes del mundo y se conocen por ser parte de los platillos de alta cocina desde tiempos histéricos. Las primeras pesquerias comenzaron en China y Japon hace mas de 1,500 afios (Shepherd ef al., 1992). Sin embargo, no fue sino hasta 1860 que las pesquerias de abulén en México se convirtieron en economicamente importantes (Cox, 1962).

II. 1 Biologia del Género

Los abulones pertenecen a la familia Haliotidae, estos gasterdpodos han sido de suma

importancia comercial en las costas del Pacifico mexicano y estadounidense (Guzman del Proo y Ortiz-Quintanilla, 1972). Para la peninsula de Baja California se registran cinco especies, siendo Haliotis rufescens (abulén rojo), H. corrugata (abulén amarillo) y

a

DAL

z}s

ROSARIO

MEXICO

I. CEDROS

P. EUGENIA

H.

Corrugata

y

H.

fufulgens

H.

caracherodii

. TORTUGAS

i ABREOJOS S. HIPOLITO i LA BOCANA ‘

ROCA BALLENA:

CABO'SN’LUCAS™ ~

La mayorparte de estos organismos se encuentran desde la zona intermareal hasta los 20 m de profundidad, siendo este rango el que les proporciona las condiciones ambientales preferidas para su desarrollo (Hahn, 1989a). Las especies anteriores suelen encontrarse en la base de los talos de las macroalgas como Macrocystis pirifera y Nereocystis luekeana, mismas quelos adultos utilizan como fuente natural de alimento (Leighton, 2000).

Los abulones son organismos didicos, es decir, tienen sexos separados. Para las distintas especies se reportan periodos de desove que pueden ser semestrales, anuales o continuos, dependiendo de la integracién de factores biéticos y abidticos presentes en el ambiente (Hahn, 1989a). Los primeros estadios larvales son lecitotréficos y posteriormente se asientan para convertirse en una postlarva bentonica, una vez que la radula es funcional. Su modode alimentacién consiste en ramonear superficies cubiertas por bacterias o diatomeas, principalmente (Leighton, 2000). La madurez sexual se alcanzaa partir de los dosafios de edad, siendo un indicador,el tamafio de la gonada. El desove en el medio natural lo activan factores como la temperatura (Diaz et al., 2000), condiciones oceanicas y ciclos lunares (Leighton, 2000), entre otros. Una vez liberados los gametos se Ileva a cabo la fertilizacién, seguida de unaserie de divisiones celulares hasta la aparicion de la primera fase larvaria, la larva trocéfora (~16 h). El resto del periodo larvario transcurre en aproximadamente 100 horas,hasta que la larva se asienta (Leighton, 2000) (Fig.2).

En el medio natural, una gran variedad de depredadores atacan al abulén en todos sus

~2 afios

100h

II. 2 Pesqueria y Cultivo del Abulén en México

La pesqueria de abulé6n en México comenzo en Baja California porel afio de 1860. El area de captura se extendia desde las Islas Coronado hasta la Isla de Cedros (Cox, 1962). Sin embargo,el registro oficial de captura mas antiguo de la pesqueria mexicana de abulon en

Baja California se remonta al afio de 1929. En ese afio se capturaron 1,721 toneladas, alcanzandose una produccién maxima de 6,000 toneladas en 1950 (Guzman del Proo,1992). Enla actualidad, la pesqueria de abulén se ha visto reducida debido a la sobre explotacioén (Oakes y Ponte, 1996), cambios climaticos (Shepherd et a/., 1998) y baja tasa de recuperacion de las poblaciones naturales (Leighton, 2000).

Debido al agotamiento de las poblaciones naturales de abuldon, el cultivo de este gasterdpodo en México se ha visto favorecido. En sus inicios, el cultivo de abulén se limitaba a la produccién de larvas por medio de desoves inducidos y suliberacién en el medio natural. Actualmente, las sociedades cooperativas se dedican a la produccién y engorda de abulén tanto para suliberacién, como para su comercializacion (Garza Salas, y Bernal-Sarcy, 1992). Asimismo, el cultivo comercial de abulén también se ha visto impulsadopor laboratorios y granjas particulares.

internacionales (Johanssonef al., 1999).

II. 3 La Criopreservacién como Herramienta en la Acuicultura

Una herramienta que se podria emplear en la acuicultura para mantener y mejorar la produccion enlos cultivos de especies de interés comerciales la criopreservacion. Durante las ultimas décadas, la criopreservacién de gametos y embriones ha jugado un papelcritico en el desarrollo de tecnologias de reproducciénasistida (Dennistonef a/., 2000).

En términos sencillos, la tecnologia de la criopreservacion se refiere al congelamiento,

almacenamiento y descongelamiento de material vivo. La criopreservaci6n consta desiete

pasos basicos: recoleccién de muestras, mantenimiento de muestras en una solucién fisioldgica, verificacién de la calidad, refrigeracién, congelamiento, descongelamiento y verificacién de viabilidad (Tiersch, 2000).

Existen diversos factores que se involucran en el éxito de la aplicacién de las técnicas de criopreservacién, como lo son el tipo y concentracién de crioprotectante (Tiersch ef al.,

11

formacién de hielo intracelular y extracelular, cambios en la concentracion de solutos y volumenytoxicidad del crioprotectante (Leung, 1991).

II. 4 Comportamiento del Agua Intracelular

El agua liquida se considera como un componente esencial para la vida. Sin embargo, en su forma solida es generalmente letal. Paraddjicamente, el congelamiento del agua es capaz de preservar células durante largos periodos en un estado viable, lo cual permite su almacenamiento a largo plazo (Mazur, 1984). El metabolismo celular disminuye al

disminuir la temperatura, por lo tanto, es de esperarse que a temperaturas de -196 °C (temperatura del nitrégeno liquido) no exista ninguna reaccién enzimatica o metabdlica dentro de las células, ya que no existe suficiente energia térmica para llevar a cabo reacciones quimicas (McGee y Martin, 1962).

Una célula expuesta a ~ -5 °C puede permanecersin congelarse debido a la disminucidn del punto de congelacién, generalmente provocadapor los solutos en el medio o dentro de la célula. La formacién de cristales de hielo ocurre entre los -5 y los -15 °C, sin embargo, en

el interior de la célula permanece superfrio, no congelado, ya que la membrana plasmatica inhibe la formaciénde cristales en el citoplasma (Fig. 3).

interior y el exterior de la célula, por lo tanto, no queda agua en el interior para formar cristales de hielo que pudieran dafiar a la célula. Una tasa de congelamiento rapida impide una deshidratacién completa de la célula, formandocristales de hielo en el interior. Si se aplica una tasa de congelamiento muy rapida, la célula no es capaz de perder agua lo

suficientemente rapido para mantener un balance osmotico con el medio y se super enfria, lo cual formacristales de hielo pequefios en su interior (Fig. 3). El principal problemade la

formacién de estos pequefios cristales de hielo es que al descongelar las células, éstos se

agregan entre sit y forman cristales de mayor tamafio. Por lo tanto, la tasa de descongelacion debe ser rapida para evitar la formacién de dichoscristales. Debido a lo anterior, una tasa de congelamiento lenta, en conjunto con una tasa de descongelamiento rapida, son las condiciones mas apropiadasparala criopreservacion decélulas.

<-10°C

-2°C -5°C

Enfriamiento

e @ — lento

Enfriamiento

, ~~ rapido

a €

@ @ “—. Enftiamiento

muy rapa @ =D

= G2)

2B

II. 5 Soluciones Fisiologicas

Graybill y Horton (1969) definen unasolucionfisiolégica (“extender”) como “una solucién salina, en ocasiones con contenido de compuestos organicos, que ayuda a mantener la viabilidad de la célula durante la refrigeracién o congelacién”. La solucién fisioldgica ideal debe de contar con las siguientes caracteristicas: 1) conservar un balanceelectrolitico

y presion osmética adecuados dentro de las células para reducir el efecto por sales, 2) contener quelantes que puedan contrarrestar el efecto de metales pesados que puedan dajfiar a la célula, 3) presentar una capacidad amortiguadora para proteger a la célula contra cambios en el pH debido a deshechos metabdlicos que se pudieran acumular, 4) ser estable, es decir, resistir la degradacién enzimatica y no-enzimatica, 5) contener antibidticos que inhiban la contaminacién bacteriana y 6) proporcionar un ambiente apropiado para las actividades metabdlicas normales de la célula (Gwo, 2000a). Las solucionesfisiolégicas se

seleccionan conel criterio de que su composicién idnica y presién osmotica sean lo mas similar posible a aquella en la sangre o plasma seminal del organismo (Morisawa y Susuki,

1980).

activacién del esperma (Goodall et al., 1989, Oda y Morisawa, 1993, Gwo, 1995, Lin y Dabrowski, 1996, Marianef a/., 1997). Sin embargo, existen factores diferentes a éstos, y

no de menor importancia, que también estan involucrados con la activacién de esperma en

peces comoloson:la edad del esperma (Suquetet a/., 1998), contenido de ATP (Perchec e¢

al., 1995) y densidad celular (Tvedtet al., 2001).

Eninvertebrados marinosse ha utilizado el modelo delerizo para describir la activacién del

esperma. Dicho proceso involucra la dilucién del esperma en el agua de mar,

incrementandose el consumo de oxigeno, y por lo tanto, disparandose la motilidad

(Christensen et a/., 1982). En moluscos, los estudios relacionados con la activacién del

esperma son escasos. Se han identificado factores quimicos de activacién como péptidos

atrayentes en el caso de la sepia Sepia officinalis (Zatylny et al., 2002) y amino acidos,

como el L-triptofano, en el caso del abulén rojo Haliotis rufescens (Riffell et al., 2002).

Asimismo, se ha comprobado que la presién osmdtica es responsable de la activacion del

espermade ostién americano Crassostrea virginica (Paniagua Chavez, 1999).

Existen pocos estudios relacionados con la criopreservacién de esperma de otras especies

de abulén y éstos estan directamente enfocados a determinar la toxicidad de

crioprotectantes y tasas de congelacién (Matsunagaef al., 1983; Tsai y Chao, 1994; Gwo, 2000a). No se cuenta atin con un estudio que pretenda determinar una solucidn fisioldgica

que permita prolongar la viabilidad del esperma de abuldn en condiciones de refrigeracion.

muestras a bajas temperaturas puede retrasar el deterioro progresivo en la viabilidad de los

gametos (Glenny Tiersch, 2002).

II. 6 Crioprotectantes

Los crioprotectantes son esenciales para la supervivencia de los espermatozoides durantela criopreservacién. Estos son sustancias que,al ser utilizadas en concentraciones adecuadas, minimizan el dafio celular asociado a la formacién de hielo. Las propiedades mas importantes que deben de presentar son: capacidad de adhesién al agua y la reduccién de

formacion de hielo intracelular (Gwo, 2000b). Los crioprotectantes pueden prevenir la mayorparte de las lesiones ocasionadas en la criopreservacién de células, sin embargo,si se utilizan en concentraciones altas, la mayoria pueden ser toxicos para el material biolégico (Jaimeson, 1991).

Las sustancias crioprotectantes se afiaden previamente a la congelacion y la membrana celular puede ser permeable o impermeable a ellas. Algunos crioprotectantes tienen la capacidad de penetrar a través de la membrana citoplasmatica, entre éstos se incluyen el glicerol (Gly), dimetil sulféxido (DMSO), n, n-dimetil acetamida, propilen glicol (PG) y metanol. Los crioprotectantes que no pueden penetrar a la membrana incluyen, azticares,

El tiempo de equilibrio es el periodo que transcurre desde la adicién de la solucién

crioprotectante al medio hasta que la célula alcanza un balance osmotico con el mismo, ya

que es necesario que exista un equilibrio entre la salida de agua del interior de la célula al

medio y la entrada de crioprotectante a la célula (Fahning y Garcia, 1992).

En la criopreservacion de esperma de moluscos, especialmente abuldn y ostidn, el uso de

DMSO Gly es comtin (Tabla I). El tiempo de equilibrio esta en funcién de la

concentracion quese utilice y el tiempo de equilibrio.

Es necesario tener en mente que cada paso que se siga en el empleo de las técnicas de

criopreservacion depende, en gran medida, de la especie de organismo con la que se

trabaja. Debido a lo anterior, los protocolos que se siguen para la criopreservacion de

gametos de otros moluscos, e inclusive de peces, pueden proporcionar una base, mas no ser

TablaI. Crioprotectantes utilizados en la criopreservacién de esperma de algunos moluscos.

Densidad de Tiempo

Especie esperma Crioprotectante de Referencia

. (cels mL”) equilibrio

Haliotis Sy 10

diversicolor.

3.3. X.10°

DMSO 5 y 10%

Ay.

Gwoet al., 2002

DMSO(4,812, 16%)

Glycerol(4, 8, 12, 16%)

1 0, 0,

Fay

“Oop”

DMED Bi I ie

No

‘Tsai y Chao, 1994

diversicolor _{DMSO 8% + 1.4%}gino especifica trehalosa

Haliotis

gigantea 13-6.1X10°

Matsunagaetal.,

; 5 :

Halions Glicerol 12% 8 min 1983

discus

63-11 X 108

Ceassostege_{virginica 1X10? Propilen glicol 15% 20 min} Paniagua Chavez._{aobs °}

Crassostrea_{hae especifica}No LMSOSiet Sti_{sucrosa + 6 mM asnaciiien}No _{Chao y Liao, 2001}

ae glutation reducido P

Il. 7 Verificacion de viabilidad

contenido de ATP (Perchec ef al., 1995) y la integridad del acrosoma (Wilhem et ai., 1996). Cada medida de verificacién de calidad espermatica presenta ventajas y

desventajas-(Tabla II). La eleccién de una o una combinacién de éstas depende del tiempo y el

presupuesto con el que se cuente.

La motilidad es el parametro mas utilizado para evaluar la calidad del esperma. Para la

evaluacién de dicho parametro es necesario colocar el esperma en una soluciénfisiolégica

y observarlo al microscopio (Bromage y Roberts, 1995). Algunos autores han establecido

categorias numéricas de clasificacién de muestras de esperma, dondeel cero se refiere a

muestras con nula motilidad y el nimero maximode laclasificacién se refiere a muestras

19

Tabla II. Ventajas y desventajas de los parametrosde evaluacién dela calidad del esperma

criopreservado del abuldén.

Parametro de_{: j Desventaja}

Evaluacion Mente J

- Puede proporcionar datos incorrectos ya que un esperma-La oteanige de resnibsiion oa tozoide inmévil puede fecundarsi el

; ; i n el

i inmediata a la observacién. gerosoma onetie BOntasiO oN Motilidad Ei equipo. que se utilise es de ovocito o si se microinyecta el

neodrelativanrante eatiiiti nucleo (Bromagey Roberts, 1995). . - Los criterios para establecer un

porcentaje de motilidad varian segtin el observador.

- Las muestras se tienen que filtrar para evitar que el esperma

La obtencién de resultados es_{. : pact muestra al interior del cit6metro.}aplihnéis Ghettage. ef tiie ge te Viabilidad ees al andlisis de las - Como consecuencia del filtrado, el

con este. . porcentaje final de células no

: ; - Proporciona un niimero muy n :

citometria de_{; alto de datos (10,000 células).}é viables es menor al porcentaje_{Bae, P :}

flujo-y : pies inicial (real) de células no viables.

aay Se pueden realizar andlisis ; =

tinciones Gdtetiores: de Sntecridad <del” El equipo y reactivos son costosos.

fluorescentes Pahcbaae awetewna * Losreactivostienen alta toxicidad.

ani

- Las células tefiidas con SYBR-14°®

P ° pueden presentar dafio en el

acrosomay, porlo tanto, no tenerla capacidad de fecundar.

Tasa de Losresultadossonreales. - Los resultados se obtienen en mayor ay ont El equipo que se utiliza es de tiempo que en la motilidad en la

El uso de la citometria de flujo es una técnica que permite la medicion de células en un medio acuoso y proporciona resultados inmediatos y precisos. Un citémetro de flujo

requiere de unos cuantos segundos para analizar poblaciones de células y diferenciar cada una a tasas de 1,000 a 10,000 células por segundo (Shapiro, 1985). Utiliza un rayo laser como fuente de luz monocromatica. A partir de una camara de flujo se hace pasar un

volumen de células a través de dicho rayo. Las sefiales de luz de interés son seleccionadas con un par delentes y las sefiales de luz dispersa y de fluorescencia se dirigen a un par de

detectores de luz ( Haynes, 1988) (Fig. 4). La integracién de la citometria de flujo y las tinciones fluorescentes para la verificacién de viabilidad espermatica se han utilizado

ampliamente en muestras de mamiferos (Garner y Jonson, 1995), peces (Segovia etal., 2000) y moluscos (Paniagua Chavez, 1999).

Los colorantes fluorescentes proporcionan una alternativa para la medicién de organelos,

asi como un analisis con mayorprecision de la organizacién celular (Kasten, 1999). Dichas

tinsiones Son especificas para cada organelo celular. En la verificacion de viabilidad y

potencial de fertilizacién espermatica se ha utilizado la sonda comercial Live-Dead Sperm

Viability Kit® (Molecular Probes, Eugene, Oregon) (Thomasef al., 1987; 1988; Paniagua Chavez, 1999). Esta sonda consta de dos colorantes, uno que es permeable a la membrana y tifie las células vivas (SYBR 14°) y otro impermeable a la membranay tifie células

muertas (yoduro de propidio). Ambos colorantes se unen a los acidos nucléicos y emiten

fluorescencias caracteristicas, rojo para el yoduro de propidio y verde para el SYBR 14°

Medidas

de

Dispersion Frontal

Tubo fotomiultiple

Filtro

de

Fluorescencia

Medidas

de

Dispersion Lateral

Figura

4.

Esquema

dptico

del

citémetro

de

flujo

(Tomado

deRiley,

2002).

La tasa de fertilizacién es la medida de evaluacién de la calidad espermatica que

proporciona los resultados mas reales. Sin embargo, integra un factor independiente, que

es la “calidad” de los ovocitos (Bromage y Roberts, 1995). Asimismo, uno de losfactores

mas importantes a considerar al establecer la capacidad de fertilizacién es la proporcién

esperma-ovocito y el tiempo de contacto entre gametos (Tvedt et al., 2001).

I. 8 Ventajas de la Criopreservacién

Las ventajas que ofrece la criopreservacién, ya sea en el cultivo de especies de interés

comercial, como en el de especies en peligro de extincién son: almacenamiento a largo

plazo de gametos, mejoramiento genético mediante programas de cruzas selectivas,

produccién de hibridos, reduccién en los costos de mantenimiento de reproductores,

sincronizacion y repeticidn de desoves, facil manejo de muestras enel transporte nacional e

internacional, creacién y conservacién de bancos de germoplasma (Mongkonpunyaet al.,

2000).

La variedad de materiales y técnicas de congelamiento utilizadas para la criopreservacién

de células es muy amplia. Las muestras se pueden empaquetar en pajillas de 0.25 mL, 0.50

mL, o volimenes mayoresy éstas a su vez se pueden descongelar en camaras programables

o en camaras manuales, ambas_ enfriadas con vapor de nitrégeno liquido. Sin embargo,

cada uno de estos métodos requiere tiempo y se vuelve ineficiente si se trata de

23

necesario recurrir a los métodos comerciales de criopreservacién. Un ejemplo es la industria lechera. En esta drea se han implementado exitosamente las técnicas de criopreservacién mediante el etiquetado computarizado de pajillas, llenado de pajillas automatizado, camaras de congelacién para grandes volimenes y bases de datos organizadas para el manejo y distribucién de muestras (Riley, 2002). Por lo anterior, se considera que la criopreservacién del esperma de abulén puederealizarse tanto a pequefia

I. OBJETIVOS

III. 1 Objetivo General

Desarrollar protocolos para la criopreservacién de esperma de abulén rojo Haliotis

rufescens.

III. 2 Objetivos Particulares

a. Determinar una solucidén fisiol6gica y un tiempo de refrigeracién dptimo que

mantenganviable el esperma de abulon.

Evaluar el efecto toxico agudo de tres crioprotectantes (DMSO, propilenglicol y

glicerol) en cuatro concentraciones diferentes (5%, 10%, 15%, 20%) sobre el

esperma de abuldn.

Determinar las tasas de congelacién y descongelacién optimas para la

criopreservacion de espermade abulén.

Evaluar la calidad del esperma de abulén descongelado mediante la observacién de

la motilidad, viabilidad espermatica (por medio de la integridad de la membrana

celular utilizando sondas fluorescentes y citometria de flujo) y tasa de fertilizacion.

IV. HIPOTESIS

Si es posible aplicar las técnicas de criopreservacion para el caso del esperma del abulén

rojo Haliotis rufescens, entonces sera posible obtener esperma viable después de haberlo

V. JUSTIFICACION

Una de las principales dificultades en la acuicultura del abuldn es la sincronizacién de los

desoves (Com.Pers. Enrique Vazquez, Abulones Cultivados S. de R. L de C. V., 2002). La

criopreservacion de esperma de abuldn es unaalternativa para superar dichas dificultades,

ya que no condiciona la disponibilidad de reproductores. Sin embargo, el equipo

especializado para implementar esta tecnologia no se encuentra al alcance de los

productores de abulén. Por lo tanto, es necesario proporcionarles unaposible alternativa en

la produccién y mejora de este recurso. En términos del abulén como producto de interés

comercial para consumo humano, cabe mencionar que su cultivo exige una tecnologia

capaz de producir especies comercialmente competitivas en los mercados nacionales y

mundiales.

El] impacto que tienen las actividades pesqueras no reguladas, asi como las actividades

antropogénicas en los ecosistemas acuaticos han conducido a que exista un mayor interés

en Ja conservacién de especies animales. Esta nueva conciencia de conservacion involucra

la restauracién de habitats y la reincorporacién de especies nativas en éstos. Lacreacién

de bancos de germoplasma, en dondese preservenlas caracteristicas de los organismos, es

unaalternativa para la conservacién de especies amenazadas, comolo es el abuldn en las

costas de Baja California, cuya pesqueria comercial comenzo hace 150 afios (Cox, 1962).

Este evento desencadeno una actividad pesquera con poca o nula regulacidn que provocd

una dramatica caida de las poblaciones naturales de este molusco. La liberacién de semilla

Sur, ha solucionado parcialmente la problematica del desequilibrio ecoldgico en las areas

naturales (McBride, 1998). Sin embargo, estas actividades de repoblacion se ven frenadas,

en parte, por los escasos recursos econdmicos destinados a dichas actividades con los que

disponen las sociedades cooperativas.

La criopreservacion de esperma de abulén permitiria establecer un acervo genético de las

poblaciones locales. Asimismo, se podrian llevar a cabo proyectos cooperativos de

intercambio coninstituciones nacionales e internacionales para mejorar las caracteristicas

de los organismospara repoblacidn para cultivo.

Finalmente, en el campo de la investigacién cientifica, los reportes sobre la

criopreservacién de esperma de abulon son escasos y discontinuos. Entre dichos trabajos

destacan el de Tsai y Chao (1994) y Gwo (2002 e¢ al.) quienes establecieron las

caracteristicas especie especificas del protocolo para la criopreservacion del abulén Haliotis

diversicolor y el de Matsunagaet al. (1983) con H. gigantea y H. discus. Sin embargo, no

VI. MATERIALES Y METODOS

VI. 1 Obtencidn de los Abulones

Los abulones se obtuvieron de la compafifa Abulones Cultivados S. de R. L.de C. V. y se

transportaron dentro de bolsas plasticas con oxigeno en hieleras enfriadas al Departamento

de Acuicultura, Biotecnologia Marina del CICESE para la induccién al desove. Los

organismos se mantuvieron en un sistema de recirculaci6n con un volumen de 250 L en

agua de marnatural con unasalinidad de ~ 35%o + 2 y una temperatura de ~ 15 °C +1.

VI. 2 Induccién al Desove

Para la induccién al desove, tanto para hembras, como para machos, se siguid el

procedimiento descrito en los Procedimientos Estandares Operacionales (Apéndices I y II,

PEO-1).

VI.3 Determinacioén de Densidad Espermatica

Se llevaron a cabo dos métodos para la estimacién de densidad celular: conteo al

microscopio y espectrofotometria. Para ambos métodos se seleccionaron abulones cuyo

Para la determinacion de densidad celular mediante conteos al microscopio se colocé en un

hematocit6metro Neubauer una muestra (10 pL) del esperma recién desovado. La muestra

fue previamente fijada con una solucion de lugol-eosina (Apéndice I). Se contaron las

células en un microscopio compuesto (Olympus BH-2, Olympus America Inc., NY) con un

aumento de 100X.

Para los experimentos de espectrofotometria, las muestras de esperma recién desovado se

pasaron por un tamiz de nylon de 30 wm de luz de malla (Small Parts, Inc., FL) para

eliminar particulas que pudieran interferir con la lectura del espectrofotémetro. La

metodologia que se siguid fue la descrita por del Rio Portilla (1996). En resumen, se

realizaron dilucionesa partir de la concentracién original (100%) al 80%, 60%, 40%, 20%,

10% y 1% con agua de marfiltrada a través de un filtro de 0.45um. Se obtuvo el espectro

de absorcién desde 200 nm a 800 nm delongitud de ondacon intervalos de 2 nm para cada

dilucién utilizando un espectrofotémetro (HACH DR/4000U, Loveland, CO). Se

registraron los picos de longitud de onda de maxima absorbancia para cada dilucién. Una

vez identificada la longitud de maxima absorbancia (se consideré como la longitud de

maxima absorbancia aquella identificada en los 270 nm), se realizaron curvas de

calibracion parala estimacién de las células espermaticas en las diferentes diluciones.

Analisis Estadistico. Se realizé una regresién lineal simple para relacionar la densidad

29

VI. 4 Almacenamiento a Corto Plazo de Esperma de Abulén

Experimento 1. Motilidad del esperma en soluciones de agua de mar con diferentes pH ajustados con HC] y NaOH

El esperma de tres machos recién desovados se concentré en tubos de 50 mL centrifugando

inicialmente a 200 X g para removerdetritos durante 5 minutos y posteriormente a 1,000 X

g durante 10 minutos para formar un comprimido. Este se resuspendié en 3 mL de agua de

mar isotérmica para formar el concentrado de esperma. Se tomaron 10 pL del concentrado

y se resuspendieron en tubos de microcentrifuga de 1.5 mL conteniendo 1 mL de agua de

mar con pH de | a 12 preparada previamente con HCl 0.5 M y 1M y NaOH 0.5M y1M

(Apéndice I). Inmediatamente se evalué la motilidad del esperma resuspendido

visualizandolo en el microscopio compuesto. Las muestras fueron refrigeradas a 4 °C. La_

motilidad espermatica se registré diariamente hasta no ver motilidad. En cada registro se

tomé una muestra de 10 pL en un portaobjetos y se le afiadieron 20 pL de agua de mar

filtrada y se registré la motilidad con ayuda del microscopio compuesto. Loanterior se

llev6 a caboportriplicado,

Experimento 2. Motilidad del esperma ensoluciones con diferente pH a base de soluciones amortiguadoras

Para este experimento se utilizaron soluciones amortiguadoras con agua de mar y HEPES

2 mM para ajustar los pH a 6 y 7 o TRIS 3 mM para ajustar los pH a 8 y 9 (SIGMA

Chemical Co., St. Louis, MO) (Apéndice I). El protocolo utilizado para verificar el efecto

Analisis estadistico. Antes del analisis, los datos porcentuales se transformaron a la raiz

cuadrada del arcoseno (Trans = asen [sqrt (mot/ 100)], después se Ilevaron a cabo las

pruebas de normalidad y homocedasticidad utilizando el paquete estadistico

STATISTICA 5. 0 © (Statsoft, Inc. Tulsa, OK). Al cumplirse estos requisitos, se realizaron

andlisis de covarianza para determinar diferencias significativas entre el porcentaje de

motilidad en los distintos pH lo largo del tiempo. Para detectar diferencias significativas

especificas se utilizé la prueba a posteriori de Tukey de maximasdiferencias significativas

(Highest Significance Difference, HSD) («= 0.05).

VI.5 Efecto Téxico Agudo de los Crioprotectantes

Para determinar el efecto t6xico de los crioprotectantes se probaron tres de ellos: DMSO,

propilenglicol (PG) y glicerol (Gly), en cuatro concentraciones diferentes (5%, 10%, 15%,

20%). Como control se utilizé una solucién de esperma suspendido en agua de mar. La

elaboracién de dichas soluciones se llevd a cabo siguiendo el protocolo descrito en el

Apéndice II, PEO-2.

Se determino el porcentaje de motilidad inicial y cada cinco minutos durante media hora

(tiempo de equilibrio). Para esto, se tomaron 10 pL de la muestra y se colocaron en un

portaobjetos. Posteriormente se afiadieron 20 nL de agua de marfiltrada y se registro la

31

Analisis estadistico: De igual forma que en elanalisis estadistico del experimento anterior,

los datos porcentuales fueron transformadosa la raiz cuadrada del arcoseno. Se aplicaron

pruebas de normalidad y homocedasticidad. Al encontrarse una distribucion normal en los

datos obtenidos, se procedié a realizar andlisis de covarianza para determinarel tipo y la

concentracién de crioprotectante dptimo a lo largo de un tiempo dptimo. Para detectar

diferencias significativas especificas se utilizé la prueba a posteriori de Tukey HSD

(a = 0.05).

VI. 7 Criopreservacion de Esperma del Abulén Rojo Haliotis rufescens

Manejo de muestras. Se transportaron muestras de esperma fresco y concentrado de cuatro

abulonesen tubos de centrifuga de fondo cénico de 15 mL (via Federal Express®) a ARS

en la Universidad Estatal de Louisiana, E.U.A. Los experimentos se Ilevaron a cabo 24

horas después del desove.

Suspension en solucién fisiolégica y crioprotectantes. Al recibir las muestras, el esperma

se resuspendié inmediatamente en un volumen de 20 mL de agua de marfiltrada y se

procedié a verificar su motilidad en el microscopio. Asimismo, se procedié a determinar la

densidad espermatica de cada muestra con el objeto de ajustar dicha densidad entre 1 X 10°

y 1 X 10° células mL. Las soluciones crioprotectantes (previamente optimizadas en

CICESE) se prepararon con agua destilada conteniendo DMSO 10% y Gly 10% para

equilibrio de 10 min a 19 °C. Se verificd la motilidad en el microscopio al transcurrir

dicho periodo.

Congelamiento. El congelamiento de las muestras se Ilev6 a cabo utilizando tres métodos

de congelamiento, mismos que se describen a continuacion:

A. Métodos simplificados (MS): Se construyé una camara de congelamiento con una caja

de poliestireno con tapa con capacidad de 10 L. En el interior se colocd una malla

plastica sujetada con cordones de nylon, los cuales permitieron ajustar la altura de la

malla y de esa forma controlar la temperatura de las muestras (Fig. 5). Se Ilenaron las

pajillas francesas con un volumen de 0.5 mL de esperma de cada abulon y tratamiento

(crioprotectantes) y se colocaron en la camara para proceder al congelamiento con

vapor de nitrégeno liquido. La temperaturase registré utilizando una termocupla

(Digi-Sense Dual JTEK, Cole-Palmer Instrument Company, Vernon Hills, IL). El control de

la temperatura se logré abriendo y cerrando la camara, asi como elevando o bajando la

canastilla que contienia las pajillas. El congelamiento de las muestras comenzo a una

temperatura inicial de —20 °C, posteriormente se disminuy6 la temperatura a razon de

1 °C min’! hasta aleanzar ~30 °C. Las muestras se mantuvieron a dicha temperatura

durante 5 minutos antes de ser sumergidas en nitrdgeno liquido para su analisis

33

Tapa de poli estireno

Caja o hielera de

poli estireno

Sensor digital _p»

de temperatura

Muestras

Termocupla Nitrégeno liquido

Figura 5. Camara de congelamiento para métodos simplificados de criopreservacién de espermade abulén.

B. Congelamiento programado (CP): Se Ilenaronlas pajillas francesas de 0.5 mL y fueron

colocadas en una camara de congelacién programable (KRYO 10 series II, Planer

Products, Sunbury-on-Thames, UK) y congeladasutilizando la mismatasa descrita en el

MS.AI finalizar el programa, las pajillas se sumergieron en nitrdgeno liquido para su

analisis posterior.

C. Congelamiento Comercial (GNX): Las muestras de espermafresco y resuspendido en 20

Cooperative, Inc., ubicado en el T. E. Patrick Dairy Improvement Center de la

Universidad Estatal de Louisiana en Baton Rouge, Louisiana, E. U. A. Las muestras se

mezclaron con las soluciones crioprotectantes (DMSO 10% y Gly 10%) y se dejo

. transcurrir un tiempo de equilibrio de 10 minutos antes de comenzar el proceso de

congelacién. Cabe mencionar que dicha camara tiene una capacidad para congelar

cientos de pajillas, por lo que, de no llegar a completar la capacidad de ésta, los

espacios que quedansin Ilenar se compensan con pajillas vacias para no alterar la tasa

de congelamiento y realizar el proceso de congelacidntal y comose hace para congelar

el esperma de toro. Las muestras se colocaron en la camara de congelacion a una

temperatura inicial de -140 °C. Durante los primeros tres minutos del proceso, la

camara incrementé su temperatura hasta—60 °C debidoa la introducciéndelas pajillas.

Posteriormente, se afiadié nitrégeno liquido para disminuir la temperatura a razén de

—16 °C minhasta alcanzar una temperatura de —140 °C (Fig. 6B). Una vez congeladas

las muestras, se sumergieron en nitrégeno liquido y una parte de estas muestras se

trasladaron al laboratorio de genética de la Aquaculture Research Station en la

Universidad Estatal de Louisiana, E.U.A. y al Departamento de Acuicultura,

Biotecnologia Marina del CICESEparasu andlisis posterior.

Descongelamiento. Las pajillas se descongelaron en un bafio de agua a 45 °C durante

~8 seg y se colocaron en tubos de microcentrifuga con un volumen igual de agua de mar

35

A B

60 ]

S

g 80

§

Z

e

_{& -100}

|

oO o

e

&

& & 120 7

-140 1

2 4 6 8 10 15 2 4 6 8 10 13

Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura 6. Tasas de congelamiento para métodossimplificados y congelamiento programado (A) y congelamiento comercial en Genex, Inc.(B).

Verificaci6n de _viabilidad. La viabilidad del esperma criopreservado se evalud

determinando la motilidad, viabilidad (integridad de la membrana) y tasa de fertilizacién.

Dichos parametrosse describen a continuacidn:

Motilidad. Se determiné el porcentaje de motilidad tomando unaalicuota de 50 wL de la

muestra y colocandola en un portaobjetos. ‘La muestra se observ6 en el microscopio

Viabilidad. Se elaboraron curvas de calibracién con proporciones conocidas de

espermatozoides de abuldn viables y no viables (100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100). El

espermase diluy6 en agua de marfiltrada para lograr una concentracién final de 1 X 10°

células mL" y se verificd la motilidad al microscopio. Para obtener esperma de abulén no

viable fue necesario agregar formaldehido al 10% en una proporcién de unaparte de

esperma por media de formaldehido. Posteriormente, las muestras se colocaron en un bajio

de agua a 70 °C durante 3 min y luego en nitrdgeno liquido durante 3 min.

Inmediatamente después, las muestras sefiltraron a través de un tamiz de 30 um de luz de

malla (Small Parts, Inc., Fl) y se centrifugé a 2,000 X g durante 5 min. Una vez

centrifugadas, se desheché el sobrenadante y el esperma se resuspendio en 1 mL de agua de

mar filtrada. Las muestras se tifieron con los colorantes SYBR 14° y PI (Apéndice II,

PEO-4).

E] analisis de muestras se !levé a cabo en un citdmetro de flujo (FACSCalibur®, Becton

Dickinson, CA). AI analizarse un total de 10,000 células y al graficar la intensidad de la

fluorescencia emitida de cada una de éstas en el color correspondiente, se identificaron dos

poblaciones de espermatozoides tefiidos con fluorescencia, las cuales se muestran

delimitadas mediante poligonos (Fig. 7). Las células tefiidas con yoduro de propidio

(fluorescencia roja) correspondena las células no viables que han sufrido algtin dafio en su

membranacitoplasmatica, mientras que las células tefiidas con SYBR 14® (fluorescencia

37

abalone? .O02

107

i0°

Fluorescencia

roja

FL3 1

FL1-H

Fluorescencia verde

Figura 7. Analisis de citometria de flujo de esperma descongelado de abulén rojo, teftido con yoduro de propidio (A) y SYBR 14° (B).

Evaluaci6n de muestras_criopreservadas. Se descongelaron dos pajillas de esperma por

macho y por tratamiento (crioprotectante y tasa de congelacion). Se analizo la viabilidad

de cada muestra utilizando citometria de flujo y los colorantes SYBR 14° y PI comofue

descrito en la elaboracién de la curva de calibracién.

Tasa de fertilizacion con el contenido de unapaijilla. Se indujeron al desove una hembra y 4

machos. Los ovocitos obtenidos fueron colocados en vasos de precipitado plasticos de 250

mL conteniendo dicho volumen de agua de mar filtrada. Se determiné la densidad celular

Heerbrugg, Max ERB Instrument Company, CA). Para esto, se homogeneiz6 el agua de

mar filtrada que contenia los ovocitos y se tomdé una alicuota de 1 mL. La muestra se

colocé en un portaobjetos y se contaron los ovocitos con un aumento de 25X, estimandose

el numero total de ovocitos desovados. Solamente se utilizaron las hembras que desovaron

mas de 26,000 ovocitos. Se realizaron fertilizaciones de ovocitos frescos con esperma

fresco de aproximadamente 1 hr después del desove (control) y con el contenido de una

pajilla de esperma congelado siguiendo la metodologia descrita en el Apéndice II, PEO-3.

Al transcurrir 24 hr se tomaron alicuotas de 1 mL y se contabilizaron un total de 100

ovocitos, registrandose el estadio de desarrollo en el que se encontraron. Este experimento

se llevé a caboportriplicado.

Tasa de fertilizacién con el contenido de tres pajillas. Con el fin de observar un incremento

entre el ntimero de larvas trocdéforas eclosionadas a partir de ovocitos fertilizados con el

contenido de una pajilla y ovocitos fertilizados con tres pajillas, se realizé un segundo

experimento de tasa de fertilizacién. Para este ensayo, se siguiéd el mismo procedimiento

del experimento anterior, sin embargo, la fertilizacidn con esperma criopreservado se

realizé con el contenido de tres pajillas. Ademas, se incluyeron dos controles: Control A,

con el mismo ntimero de ovocitos utilizado en los tratamientos (1,000) y Control B, con

25,000 ovocitos. Ambos controles se fertilizaron con la concentracién de esperma

39

Analisis estadistico para los experimentos de motilidad, viabilidad y tasa de fertilizacién

utilizando el contenido de una pajilla. Los datos porcentuales de motilidad, viabilidad y

tasa de fertilizacién se transformarona la raiz cuadrada del arcoseno. Se aplicaron pruebas

de normalidad y homocedasticidad. Al encontrarse unadistribucién normal, se procedié a

la aplicacién de una analisis de varianza de una via para cada parametro de evaluacion de

calidad espermatica y la prueba a posteriori de Tukey HSD (a = 0.05) para determinar

VII. RESULTADOS

VII. 1 Determinaci6n de Densidad Celular

De los desoves obtenidos se obtuvo un promedio de 25,334 espermatozoides ul por

organismo, con un maximo de 113,625 espermatozoides yl' y un minimo de 2,858

espermatozoides pL”.

Los resultados obtenidos del espectro de absorcién mostraron dos picos de maxima

absorbancia correspondientes a los 210 y 270 nm paralas diferentes diluciones de esperma

(Fig. 8). Este ultimo pico se utilizd debido a que present6 un intervalo de longitud de onda

mayor que el primero. La correlacién entre los conteos al microscopio y la densidad dptica

mostraron que el 95% de los datos obtenidos se ajustan a la linea de regresién (re = 0.9506)

41

0.8 of

100%

0.6 _|

80%

2 04_ge

é

Z

x

0.2

OM

| 20%

ot 1% _SS 01 + + 4 t i——} + + + | ! ++

200 300 400 500 600 700 800

Longitud de onda (nm)

Figura 8. Espectro de absorcién del espermade abulonrojo a diferentes diluciones.

0.5

Absorbancia

Oo ‘ee

y=8X 105+ 0.0512

aad

2= 0.9506

0.1

oF , 1 : 7

0

2000

4000

6000

8000

10000

Células pL"!

VII. 2 Almacenamiento a Corto Plazo de Esperma de Abulén

Experimento 1. Motilidad del esperma en soluciones de agua de mar con diferentes pH

ajustados con HCl y NaOH

En el dia 0, el esperma suspendido en agua de mar con pH 4 y 10 se desactivé y al

resuspenderlo en agua de mar isotérmica con pH 8 noreinicié su motilidad. El esperma

suspendido en agua de mar con pH enel intervalo de 5 a 9 no se desactivé. Sdlo el

esperma suspendido en pH 5 cambié su motilidad de ~ 40% a ~ 70% después de ser

resuspendido (Fig. 10).

Se encontraron diferencias significativas en la motilidad del esperma antes y después de

diluir el esperma con respecto al tiempo de almacenamiento (Fy, 130) = 6.2960;

P < 0.0001) (Tablas VII, VIII, IX y X, Apéndice IV). La maxima motilidad se encontré en

el dia 1 para el esperma suspendido en agua de mar con pH 6 (88%) después de haber sido

resuspendido.

Al dia 2 de almacenamiento, el esperma suspendido en agua de mar a pH perdido

motilidad completamente. Para el dia 3, el esperma suspendido en agua de mar con pH 5 y

6 mantuvo < 40% de motilidad, mientras que el esperma suspendido en pH 7 y 8 perdi

completamente su motilidad.

Se observé aglutinamiento de células para los pH 2, 3, 11 y 12 inmediatamente a la

43

100

—

Dn

w

o

fo

Motilidad

(%)

Tiempo (dias)

©

a a

z

°

=

0 1 2 3 4 5 6

Tiempo(dias)

-s— pH 5 =pH6 -4+-pH7 -+4-pH8 -*—-pH9 -*~—control

Figura 10. Porcentaje de motilidad del esperma de abulon antes (A) y después(B)de diluir

Experimento 2. Motilidad del esperma en soluciones de agua de mar con diferentes pH utilizando soluciones amortiguadoras

La motilidad inicial del esperma suspendido en soluciones con pH de 6 a 9 amortiguadas

con 2mM HEPES y 3mM TRIS fue ~ 90% para todos los tratamientos. Al dia 1, la

maxima motilidad fue de 70% para el pH 7, mientras que la minima fue de 40% para el

pH 8, siendo nula la actividad para el pH 9. Para el dia 2, sdlo se observé un 40% de

actividad espermatica para el pH 6, misma que fue nula para el cuarto dia (Fig. 11).

100

Motilidad

(%)

&

8

8&8

N Oo

0 1 2

Tiempo (dias)

Oo

—— pH 6 —*— pH7 — pH 8 —* pH9 —*— Control

Figura 11. Motilidad del esperma a diferentes pH amortiguados con HEPES 2 mM y TRIS

45

VII. 3 Efecto Toxico Agudo de los Crioprotectantes

La maxima motilidad utilizando DMSO comocrioprotectante se observ6 utilizando una

concentracién de 5% después de incubarse por 5 minutos (88% + 0.58) (Fig. 12). Mientras

que la minima motilidad se encontro para el esperma suspendido en una concentracién de

20% después de incubarse por 30 minutos (4% + 6.93). Para PG, la maxima motilidad fue

de 51% + 19.29 después de que el esperma fue suspendido en una concentracién de 5% e

incubado por 5 minutos, mientras que la minima se observ6 en la concentracién de 15% y

un tiempo de 25 minutos (1% + 1.15). La maxima motilidad registrada para el Gly se

observ6 al incubar el esperma en una concentracién de 5% durante 5 minutos (80% +

24.02), mientras que la minima se observé para la concentracién de 20% y un tiempo de 25

minutos (2% + 4.04). La motilidad de esperma para el caso del DMSO y PG tendidé a

disminuir al ser expuestos cada vez a concentraciones masaltas de crioprotectante durante

mayortiempo.

Al realizar el andlisis estadistico de los datos obtenidos, se observé que existieron

diferencias significativas entre crioprotectantes (Fe, 254 = 43.5, P < 0.0001),

concentraciones (Fy, 254) = 610.6, P < 0.0001) y tiempos de equilibrio (Fa, 254) = 177.4;

P <0.0001) (Tabla XI, Apéndice IV). Asimismo, se encontré interacciénentre los efectos

(Fea, 254) = 7.2, P < 0.0001). Especificamente, para el caso del DMSO,no se encontraron

diferencias significativas entre las concentraciones de 5% y 10% para el esperma incubado

por 5 y 10 minutos, asi como tampoco se encontraron al comparar dichos tratamientos con

diferencias significativas entre la motilidad del esperma suspendido en Gly 5 % lo largo