Genes implicados en la respuesta molecular al estrés hídrico en Pinus pinaster Ait

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(1)UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS DE MONTES. GENES IMPLICADOS EN LA RESPUESTA MOLECULAR AL ESTRÉS HÍDRICO EN Pinus pinaster Ait.. TESIS DOCTORAL. PEDRO PERDIGUERO JIMÉNEZ Licenciado en Ciencias Ambientales 2012.

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(3) DEPARTAMENTO DE SILVOPASCICULTURA. ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS DE MONTES. GENES IMPLICADOS EN LA RESPUESTA MOLECULAR AL ESTRÉS HÍDRICO EN Pinus pinaster Ait.. PEDRO PERDIGUERO JIMÉNEZ Licenciado en Ciencias Ambientales. DIRECTORES:. CARMEN COLLADA COLLADA. ÁLVARO SOTO DE VIANA. Doctora en Ciencias Químicas. Doctor Ingeniero de Montes.

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(5) UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID. Tribunal nombrado por el Magfco. Y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica de Madrid, el día …. de ……………….. de 201…. Presidente: .………………………………………………………………… Vocal: ……………………………………………………………………….. Vocal: ……………………………………………………………………….. Vocal: ……………………………………………………………………….. Secretario: ………………………………………………………………….. Suplente: ..………………………………………………………………….. Suplente: ..…………………………………………………………………... Realizado el acto de defensa y lectura de tesis el día …. de ……………….. de 201… en la E.T.S.I. Montes. EL PRESIDENTE. LOS VOCALES. EL SECRETARIO.

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(7) MENCIÓN DE DOCTORADO INTERNACIONAL INTERNATIONAL DOCTORATE MENTION. Esta Tesis ha sido informada positivamente para su defensa en exposición pública por los siguientes investigadores:. This Ph.D. Thesis has been positively evaluated for its defense by the next external reviewers:. Dr. Célia Maria Miguel Instituto de Tecnologia Química e Biológica (ITQB) Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica (IBET) Universidade Nova de Lisboa, Portugal. Dr. Pablo Fuentes Utrilla ARK- Genomics. The Roslin Institute University of Edinburg.

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(9) Agradecimientos. Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que de alguna manera han participado en el largo camino que ha supuesto, no solo la realización de este trabajo, sino cada paso que he dado hasta llegar al mismo. A mi familia, porque jamás cuestionaron ninguna de las decisiones que tomé en mi vida y dejaron que fuera yo el que eligiera mi propio camino. Creo que el ensayoerror es tan importante en la vida como en la ciencia, a ellos les debo la mayoría de mis aciertos. A mi Rous, mi pareja, mi mejor amiga, mi confidente; porque a su lado todo me parece más fácil y su compañía es un aliciente para rendir más en el trabajo y en la vida. Gracias por apoyarme desde el principio en mi decisión de “subirme al carro de la ciencia” aun sabiendo que tiene numerosas “averías” lo que se traduce en una constante economía de subsistencia… al final tendremos que ir a buscar “piezas” al extranjero. Gracias por escuchar mis despotriques de esa PCR que se resiste, esas plantas que no crecen, mi ataque frontal a la lengua inglesa… en resumen, gracias por estar ahí siempre. A mis directores Álvaro Soto y Carmen Collada, porque sin apenas conocernos me concedieron la oportunidad de entrar en un proyecto que me interesó desde que lo vi en la larga lista de FPIs. Gracias por vuestra entrega y apoyo durante todos estos años; esperemos seguir recogiendo frutos después de tantos esfuerzos. A toda la unidad de Anatomía al completo; a Luis Gil por su apoyo científico, técnico y logístico, gracias a este apoyo he podido acabar la tesis con relativa tranquilidad. A Unai, Pilar, Nikos, Mamen, Guille, Martin, Jesús, Rosa Ana, Javi, David Victoria, Chechu, Ricardo… por intercambiar inquietudes y dar ánimos en los momentos de agobio. Y por supuesto a mi queridísima red de la buhardilla; la niña del moño, Zaiduqui, el Rober, Paulita, la pies sucios, mi supuesto doble Víctor, la morocha, er Hose y mi añorado y querido calvito, “capag que” sin vosotros seguramente esta tesis sí hubiese sido posible pero seguro que no tan, tan, tan gratificante. Es difícil decir los por… gracias por todo. A Célia Miguel y todo su grupo del ITQB, por su calidad humana y por abrirme de par en par las puertas de su laboratorio. Gracias por darme la posibilidad de trabajar con nuevas y apasionantes técnicas que me han permitido “ponerle la guinda al pastel”. A Carmen Díaz-Sala y su grupo de la Universidad de Alcalá por sus consejos para la realización y análisis de las RT-PCRs, y una mención especial a Elena.

(10) Carneros por compartir conmigo todo su conocimiento sobre embriogénesis somática de pinos, parte de los resultados obtenidos están directamente relacionados con sus buenos consejos. A mis compañeros de laboratorio en mis inicios en el laboratorio de Bioquímica; Ángela, Irene, Víctor, Raquel y Rosa, por facilitarme la adaptación, por los buenos consejos y por las largas conversaciones en comidas y cañeos. A toda mi gente de Villalba, por cada “miernes”, “juernes” y fines de semana intentando desconectar la neurona y por escuchar pacientemente mis desvaríos a pesar de no entender “por qué quiero poner pinos en el desierto”. A toda mi gente de Ávila, Elche y Salamanca, que aunque sea en la distancia siempre me han transmitido palabras de ánimo. A mis compañeros de “Rûa da Quintinha” Josep, Marcelo y Liliana, por esas cervecitas en “o quiosque” y por las cenas en la cocina rodeados de goteras..

(11) ÍNDICE. RESUMEN…………………………………………………………………………………….. i. ABSTRACT………………………………………………………………………………….... ii. 1. Introducción……………………………………………………………………………..... 1. 1.1 Respuesta de las plantas al estrés hídrico...…………….……………………….. 5. 1.1.1. Proteínas reguladoras en respuesta a estrés hídrico…...………………. 6. 1.1.2. Proteínas funcionales implicadas en la tolerancia al estrés hídrico….... 9. 1.2 El estudio de la respuesta al estrés hídrico en coníferas……………………….. 10. 1.2.1. Las especies modelo utilizadas en este trabajo…………………………. 13. 2. Objetivos………………………………………………………………………………....... 19. 3. Identificación de genes inducidos por estrés hídrico…………………………….. 23. 3.1 Material y métodos………………………………………………………………….. 26. 3.1.1. Material vegetal y condiciones de cultivo…………………………………. 26. 3.1.2. Tratamiento de estrés hídrico…………………………………………….... 27. 3.1.3. Extracción de ARN y construcción de la genoteca sustractiva……….... 27. 3.1.4. Preselección de genes inducidos……………..………………………....... 28. 3.1.5. Análisis de secuencias…………………………………………………….... 28. 3.2 Resultados y discusión……………………………………………………………... 29. 3.2.1. Construcción de la genoteca sustractiva…………………………………. 29. 3.2.2. Anotación y clasificación funcional de los genes obtenidos……………. 30. 4. Análisis de expresión durante el estrés hídrico……………………………………. 37. 4.1 Material y métodos………………………………………………………………….. 40. 4.1.1. Material vegetal y condiciones de cultivo…………………………………. 40. 4.1.2. Tratamiento de estrés hídrico en sustrato……………………………....... 40. 4.1.3. Tratamiento de estrés hídrico con PEG…………………………………... 40. 4.1.4. Análisis de expresión con microarray…………………………………...... 40. 4.1.5. PCR a tiempo real…………………………………………………………... 41. 4.1.6. Análisis de datos…………………………………………………………….. 42. 4.1.6.1. Normalización e identificación de genes inducidos……………... 42. 4.1.6.2. Expresión diferencial entre órganos y especies……………........ 42.

(12) Análisis funcional………………………………………………….... 43. 4.2 Resultados y discusión…………………………………………………………….... 43. 4.1.6.3. 4.2.1. Análisis de la expresión de los genes durante el tratamiento de PEG... 43. 4.2.2. Tratamiento de sequía en sustrato sólido……………………………….... 52. 4.2.2.1. Genes inducidos por la suspensión de riego en P. pinaster y P. pinea………………………………………………………………. 4.2.2.2. 52. Patrón de expresión en respuesta a sequía en P. pinaster y P. pinea………………………………………………………………. 59. 5. Caracterización molecular de la familia de las deshidrinas en P. pinaster..….. 71. 5.1 Material y métodos………………………………………………………………….. 75. 5.1.1. Material vegetal y tratamiento de estrés hídrico…………………………. 75. 5.1.2. Análisis de secuencias…………………………………………………….... 75. 5.1.3. Extracción de ADN y ARN y amplificación de los genes completos…... 76. 5.1.4. PCR a tiempo real…………………………………………………………... 76. 5.1.5. Análisis estadístico………………………………………………………….. 76. 5.2 Resultados y discusión……………………………………………………………... 77. 5.2.1. Búsqueda de deshidrinas in silico y amplificación de genes completos…………………………………………………………………….. 77. 5.2.2. Identificación de nuevos segmentos conservados………………………. 78. 5.2.3. Análisis de la estructura de las deshidrinas de P. pinaster...…………... 79. 5.2.4. Análisis de la expresión por RT-PCR……………………………………... 82. 6. Caracterización molecular de genes inducidos por estrés hídrico en P. pinaster..………………………………………………………………………………... 87. 6.1 Material y métodos………………………………………………………………….. 92. 6.1.1. Amplificación de los genes completos y de la su promotora………….... 92. 6.1.2. Análisis de secuencias…………………………………………………….... 92. 6.1.3. Construcción del vector de sobreexpresión………………………………. 93. 6.1.4. Material vegetal y condiciones de cultivo…………………………………. 94. 6.1.4.1. Arabidopsis thaliana………………………………………………... 94. 6.1.4.2. Células embrionárias de Pinus pinaster………………………….. 94. Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens…... 94. 6.1.5. 6.1.5.1. Transformación de Arabidopsis thaliana…………………………. 94. 6.1.5.2. Transformación de células embrionarias de Pinus pinaster….... 95. 6.2 Resultados y discusión……………………………………………………………... 95.

(13) 6.2.1. Análisis de la secuencias…………………………………………………... 95. 6.2.1.1. Ppter_dhn_ESK2 ………………………………………………….... 95. 6.2.1.2. Nodulina……………………………………………………………... 97. 6.2.1.3. Factor de transcripción tipo AP2………………………………...... 101. 6.2.2. Transformación de Arabidopsis thaliana……………………………......... 105. 6.2.3. Transformación de Pinus pinaster……………………………………....... 106. 7. Conclusiones/Conclusions…………………………………………………………..... 113. 8. Bibliografía………………………………………………………………………………... 117. ANEXOS………………………………………………………………………………………. 137. I. Aranda I., Gil-Pelegrín E., Gascó A., Guevara M.A., Cano J., de Miguel M., Ramírez-Valiente J.A., Peguero-Pina J.J., Perdiguero P., Soto Á., Cervera M.T., Collada C. 2012. Drought response in forest trees: from the species to the gene. En Ricardo Aroca (Ed): Plant Responses to Drought Stress: From Morphological to Molecular Features (2012) 293-333. Springer. II. Fernández-Pozo N., Canales J., Guerrero-Fernández D., Villalobos D., DíazMoreno S., Bautista R., Flores-Monterroso A., Guevara M.A., Perdiguero P., Collada C., Cervera M.T., Soto Á., Ordás R., Cantón F., Ávila C., Cánovas F., Claros M.G., EuroPineDB: a high-coverage Web database for maritime pine transcriptome, BMC Genomics 12 (2011) 366. III. Perdiguero P., Collada C., Barbero M.C., García Casado G., Cervera M.T., Soto Á., Identification of water stress genes in Pinus pinaster Ait. by controlled progressive stress and suppression-subtractive hybridization, Plant Physiology and Biochemistry 50 (2012) 44-53. IV. Perdiguero P., Barbero M.C., García Casado G., Cervera M.T., Collada C., Soto Á., Molecular response to water stress in two contrasting Mediterranean pines (Pinus pinaster and Pinus pinea). Manuscrito V. Perdiguero P., Barbero M.C., Cervera M.T., Soto Á., Collada C., Novel conserved segments are associated with differential expression patterns for Pinaceae dehydrins, Planta 236 (2012) 1863-1874..

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(15) ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1.1 Predicciones climáticas en Europa para los años 2070-2100…………... 4. Figura 1.2 Respuestas de las plantas al estrés hídrico………………………………. 7. Figura 1.3 Área de distribución de Pinus Pinaster…………………………………….. 14. Figura 1.4 Área de distribución de Pinus pinea……………………………………….. 15. Figura 3.1 Banco clonal de P. pinaster del SERIDA...………………………………... 26. Figura 3.2 Esquema del tratamiento de estrés hídrico aplicado…………………….. 27. Figura 3.3 Amplificación de los clones de la genoteca sustractiva………………….. 29. Figura 3.4 Preselección de clones inducidos….………………………………………. 30. Figura 3.5 Clasificación funcional de los genes obtenidos en la genoteca sustractiva………………………………………………………………………………….. 31. Figura 4.1 Número de transcritos sobreexpresados de manera significativa en cada órgano estudiado durante el tratamiento de sequía inducida con PEG………. 44. Figura 4.2 Análisis de enriquecimiento de aquellos genes identificados específicamente durante el tratamiento de PEG………………………………………. 45. Figura 4.3 Patrones de expresión de los genes sobreexpresados a lo largo del tratamiento de PEG……………………………………………………………………….. 46. Figura 4.4 RT-PCR de diez genes inducidos en el tratamiento de PEG………….... 50. Figura 4.5 Potencial hídrico medido al mediodía en acícula a lo largo del experimento de sequía con P. pinaster y P. pinea…………………………………….. 52. Figura 4.6 Número de transcritos sobreexpresados de manera significativa en cada órgano estudiado durante el tratamiento de sequía en sustrato con P. pinea..……………………………………………………………………………………. 53. Figura 4.7 Número de transcritos sobreexpresados de manera significativa en cada órgano estudiado durante el tratamiento de sequía en sustrato con P. pinaster……........................................................................................................... 54. Figura 4.8 Número de transcritos sobreexpresados de manera significativa en ambas especies para un mismo órgano ……………………………………………….. 54. Figura 4.9 Análisis de enriquecimiento de los genes candidatos seleccionados….. 55. Figura 4.10 Clasificación funcional de los genes seleccionados como candidatos para estrés hídrico en pinos…………………………………………………………….... 55. Figura 4.11 Número de transcritos sobreexpresados de manera significativa en cada tratamiento de sequía aplicado……………………………………………………. 59.

(16) Figura 4.12 Patrones de expresión de los genes sobreexpresados a lo largo del tratamiento de P. pinaster en sustrato sólido..…………………………………………. 60. Figura 4.13 Patrones de expresión de los genes sobreexpresados a lo largo del tratamiento de P. pinea en sustrato sólido…..…………………………………………. 63. Figura 4.14 RT-PCR de los 16 genes seleccionados para los tratamientos de estrés hídrico con P. pinaster y P. pinea.……………………………………………….. 66. Figura 5.1 TCs correspondientes a posibles deshidrinas de Pinus sp. agrupadas de acuerdo con el número de segmentos conservados………………………………. 77. Figura 5.2 Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida para las 8 deshidrinas identificadas en P. pinaster…..…………………………………………….. 79. Figura 5.3 Productos de PCR correspondientes a los diferentes loci de Ppter_dhn_K2 y Ppter_dhn_SK3 amplificados mediante ADN genómico haploide de megagametofito………………………………………………………………………... 80. Figura 5.4 Análisis de la expresión por RT-PCR de las ocho deshidrinas identificadas en P. pinaster…...………………………………………………………….. 83. Figura 6.1 Vector de sobreexpresión pK7WG2.0 utilizado en la transformación de Arabidopsis thaliana………………………………………………………………….... 93. Figura 6.2 Vector de sobreexpresión pMBb7Fm21GW-UBIL utilizado en la transformación de Pinus pinaster………………………………………………………... 93. Figura 6.3 Estructura de la deshidrinas Ppter_dhn_ESK2………………………….... 96. Figura 6.4 Secuencia de nucleótidos correspondiente al gen completo y región promotora de la deshidrina Ppter_dhn_ESK2 y secuencia de aminoácidos deducida para la misma…………………………………………………………………... 96. Figura 6.5 Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la nodulina con genes homólogos en otras especies (transportadores de azucares tipo Sweets)…. 98. Figura 6.6 Estructura del gen de la nodulina…………………………………………... 99. Figura 6.7 Secuencia de nucleótidos correspondiente al gen completo y región promotora de la nodulina y secuencia de aminoácidos deducida para el mismo…………………………………………………………………………………........ 100 Figura 6.8 Alineamiento de la secuencia de aminoácidos del factor de transcripción tipo AP2 frente a genes homólogos en otras especies, correspondientes a la familia ERF………………………………...…………………….. 102. Figura 6.9 Secuencia de nucleótidos correspondiente al gen completo y región promotora del factor de transcripción tipo AP2 y secuencia de aminoácidos deducida para el mismo………………………………………………………………….. 104.

(17) Figura 6.10 Plantas de Arabidopsis transformadas con diferentes genes correspondientes a la primera generación t0…………………………………………... 105 Figura 6.11 Plantas de Arabidopsis correspondientes a la generación t2 y comprobación de la transformación por PCR …………………………………..……... 106. Figura 6.12 Comprobación por PCR de la colonia de Agrobacterium empleada en la transformación……………………………………………………………............... 107 Figura 6.13 Selección de líneas transformantes con crecimiento visible en medio selectivo con PPT…………………………………………………………………………. 108. Figura 6.14 Proliferación de líneas transformantes…………………………………... 108 Figura 6.15 Comprobación por PCR de las líneas transformantes…………………. 109. Figura 6.16 Obtención de falsos positivos……………………………………………... 110. Figura 6.17 Maduración y germinación de las líneas transformantes………………. 111.

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(19) ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 5.1 Descripción de las deshidrinas de P. pinaster analizadas en la presente tesis…………………………………………………………………………….... 81. Tabla 6.1 Selección de líneas transformantes con crecimiento en medio de selección con PPT……………………………………………………………………….... 107. Tabla 6.2 Líneas transformantes que fueron transferidas a medio de proliferación………………………………………………………………………………... 109. Tabla 6.3 Maduración de las líneas transformantes seleccionadas………………… 110.

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(21) ÍNDICE MATERIAL SUPLEMENTARIO. Tabla S1. Correspondencia entre los distintos identificadores para los 351 unigenes nucleares identificados en la genoteca sustractiva……………………….... MS-3. Tabla S2. Clasificación funcional de los 351 unigenes nucleares identificado en la librería sustractiva en base a su homología con proteínas de Arabidopsis thaliana……………………………………………………………………………………... MS-8. Tabla S3. Términos GO y EC asociados con los unigenes identificados…………... MS-14. Tabla S4. Valores de expresión del experimento de P. pinaster con PEG...………. MS-35. Tabla S5. Valores de expresión del experimento de P. pinea en sustrato sólido……………………………………………………………………………………….. MS-40 Tabla S6. Valores de expresión del experimento de P. pinaster en sustrato sólido……………………………………………………………………………………….. MS-45 Tabla S7. Selección de 113 genes candidatos sobreexpresados de manera significativa en ambas especies y para el mismo órgano/s…………………………... MS-51. Tabla S8: Combinaciones de cebadores empleados en las distintas actividades desarrolladas en la tesis doctoral……………………………………………………….. MS-53 Tabla S9. Motivos de unión para diferentes factores de transcripción identificados en las regiones promotoras de los genes de estudio…………………………………. MS-55 Tabla S10. Generación de líneas transformantes de Arabidopsis thaliana con el gen de la nodulina……………………………………………………………………….... 偐MSMS-57. Tabla S11. Generación de líneas transformantes de Arabidopsis thaliana con el factor de transcripción AP2………………………………………………………………. MS-58. Tabla S12. Generación de líneas transformantes de Arabidopsis thaliana con Ppter_dhn_ESK2………………………………………………………………………...... MS-59. Figura S1. Alineamiento de las deshidrinas identificadas en P. pinaster frente a otras de gimnospermas y angiospermas disponibles en las bases de datos públicas…………………………………………………………………………………….. MS-60.

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(23) RESUMEN La presente tesis doctoral se centra en el estudio de la respuesta molecular de las coníferas mediterráneas al estrés hídrico. Para ello se ha escogido como especie modelo Pinus pinaster Ait., la conífera más abundante en España, y que habita un amplio rango de situaciones ecológicas, especialmente en lo relativo a la disponibilidad de agua. En primer lugar, se ha aplicado un estrés hídrico controlado en cultivo hidropónico y se ha generando una genoteca sustractiva con objeto de identificar los genes inducidos por el estrés, analizando su expresión en raíces, tallos y acículas. A continuación, se ha analizado, la expresión de los genes anteriormente obtenidos así como de otros seleccionados de las bases de datos disponibles, durante una sequía prolongada en tierra, similar a las que las plantas deben afrontar en la naturaleza. Se ha utilizado en este caso, además de P. pinaster, P. pinea, otra conífera mediterránea adaptada a las sequías recurrentes. Este trabajo ha permitido identificar genes candidato expresionales, presumiblemente comunes en la respuesta molecular de las coníferas al déficit hídrico. Se han detectado diferencias notables en la expresión de determinados genes, que podrían ser los responsables de las diferencias exhibidas por ambas especies en el comportamiento frente a la sequía. Entre los genes identificados como inducidos por el estrés hídrico se encuentran varios miembros de la familia de las deshidrinas. Trabajos previos han utilizado deshidrinas como genes candidato; no obstante, la falta de especificidad de ciertos fragmentos y marcadores utilizados, debido a la complejidad estructural de esta familia, resta fiabilidad a algunos de los resultados publicados. Por este motivo, se ha estudiado en detalle esta familia en P. pinaster, se han identificado y caracterizado 8 miembros y se ha analizado su patrón de expresión frente a sequía. Este estudio ha permitido describir por primera vez unos segmentos conservados en la secuencia de aminoácidos de las deshidrinas de pináceas, cuya presencia y número de repeticiones parece estar relacionado con su especificidad. Por último, se han escogido tres genes implicados en distintas fases de la respuesta al estrés hídrico para su análisis exhaustivo: una deshidrina, una nodulina y un factor de transcripción tipo AP2. Se ha caracterizado su estructura exón/intrón y secuenciado su región promotora. Además, se han obtenido líneas transformadas que sobreexpresan estos genes tanto de forma heteróloga, en la especie modelo Arabidopsis thaliana, como en el propio P. pinaster. Este material facilitará la realización de futuros estudios sobre la función y el mecanismo de actuación de estos genes en la respuesta al estrés hídrico.. i.

(24) ABSTRACT This thesis focuses in the study of the molecular response to water stress in Mediterranean conifers. For this purpose, P. pinaster was selected as model species. It’s the most abundant conifer in Spain, living in a wide range of ecological conditions, especially regarding water availability. First, we have applied a controlled polyethylene glycol-induced water stress in hydroponic culture and obtained a suppression subtractive hybridization (SSH) library, with the aim of identifying genes induced by water stress, analysing their expression in roots, stems and needles. We have then analysed the expression patterns of the identified genes, together with other genes selected from public databases. This study was conducted throughout a prolonged drought stress in soil, similar to the ones plants have to face in nature. In this case not only P. pinaster was analysed but also P. pinea, another Mediterranean conifer well adapted to recurrent droughts. This work has enabled us to identify of reliable candidate genes, presumably shared with other conifers in the response to water stress. We observed remarkable differences in the expression of some genes, which could be involved in the differential behaviour that these species show in the water stress response. Within the genes induced by water stress, several members of the dehydrin gene family were identified. Due to the structural complexity of the family, certain ambiguities and inconsistencies have been detected in previous works that have used dehydrins as candidate genes. For this reason, we have analysed thoroughly this gene family in P. pinaster, and have identified and characterized eight different members, whose expression patterns during drought have also been assessed. This study has allowed us to identify for the first time novel conserved segments in the amino acids sequences of Pinaceae. The presence and number of repetitions of these segments could be associated with the functional specificity of these proteins. Finally, three genes involved in different steps of the water stress response were selected for an exhaustive analysis: a dehydrin, a nodulin and an AP2 transcription factor. For all of them, the exon/intron structure was established and their promoter region was sequenced. Also, transformed lines were obtained both in Arabidopsis thaliana and in P. pinaster for the constitutive overexpression of these genes. This material will facilitate the development of further studies to investigate the function of these genes during the water stress response.. ii.

(25) 1. INTRODUCCIÓN.

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(27) Introducción. 1.. INTRODUCCIÓN. A lo largo de la evolución y diversificación de las plantas vasculares desde su aparición en el Silúrico (hace 420 millones de años) la adaptación a ambientes secos ha sido sin duda una de las condiciones que ha ejercido mayor presión selectiva. El paso del hábitat acuático al terrestre fue asociado al desarrollo de un complejo abanico de adaptaciones anatómicas y moleculares tanto para la adquisición y transporte del agua como para hacer frente a la pérdida de la misma hacia una atmósfera insaturada. Algunas de estas adaptaciones tienen un carácter constitutivo, mientras que otras se inducen como mecanismos de emergencia para hacer frente a los periodos de sequía. Estas adaptaciones presentan mayor relevancia en especies perennes, que tienen que hacer frente a la escasez de agua en numerosas ocasiones a lo largo de su ciclo de vida.. En la actualidad la Tierra vuelve a enfrentarse a un importante cambio climático a nivel global. Durante el siglo pasado ya se observaron importantes modificaciones sobre la mayoría de parámetros meteorológicos, con el aumento de la temperatura media mundial del aire y del océano, la fusión incrementada de nieves y hielos y el aumento medio del nivel del mar. Este calentamiento se ve especialmente agravado por el aumento de los gases de efecto invernadero (CO2, CH4 y N2O) de origen antrópico así como por la deforestación de montes y bosques para convertirlos en tierras de cultivo y pastoreo. Según diferentes modelos climáticos este cambio global será especialmente intenso en regiones concretas del planeta, como el arco mediterráneo (IPCC, 2007).. Según el informe Clivar España 2010 (Pérez et al., 2010), ya los registros instrumentales del siglo XX muestran un aumento progresivo de la temperatura que fue especialmente acusado en las tres últimas décadas cuando se registró una tasa media de calentamiento de ~0,5ºC/década (un 50% superior a la media continental en el Hemisferio Norte y casi el triple de la media global). Igualmente, la precipitación anual en las dos últimas décadas disminuyó de forma significativa en relación a las décadas de los 60 y 70, especialmente a finales de invierno. La mayoría de las predicciones muestran un incremento en las temperaturas medias diarias de aproximadamente 3º- 5.5ºC en invierno y verano respectivamente. Los cambios en la precipitación estacional mostrarían una estructura norte-sur en invierno, con aumentos. 3.

(28) Genes implicados en la respuesta molecular a estrés hídrico en Pinus pinaster Ait.. ligeros en la mitad norte y descensos en la parte sur, mientras que en verano pronostican un descenso significativo en toda la Península Ibérica (Figura 1.1).. Figura 1.1 Predicciones climáticas en Europa para los años 2070-2100. Se muestra a la izquierda la predicción sobre el incremento de las temperaturas medias anuales. A la derecha los cambios en la precipitación media de los meses de verano en %. (Fuente; Plataforma europea de adaptación al clima). Las especies mediterráneas deben afrontar la dificultad añadida que supone la coincidencia del período más favorable para la actividad fisiológica en cuanto a luz y temperatura con el de máxima restricción hídrica. Por consiguiente, la creciente sequía que sufren los ecosistemas que integran el suroeste europeo limitará el crecimiento y probablemente. la. supervivencia. de. las. actuales. poblaciones. naturales. y. reforestaciones pudiendo provocar una importante simplificación estructural de la vegetación acompañada de migraciones altitudinales de especies así como extinciones locales (Mestre y de Cara, 2009).. Si el cambio del clima es tan rápido como se espera los seres vivos más longevos, entre ellos los árboles, estarán obligados a hacer frente a las condiciones adversas con sus estructuras genéticas actuales, sin tiempo disponible para que los procesos selectivos permitan la definición de otras estructuras adaptadas a las nuevas condiciones ambientales (Jump y Peñuelas, 2005). Ante estas predicciones y debido a la importancia de las especies forestales desde un punto de vista de conservación, uso sostenible y productividad, se están realizando grandes esfuerzos para conocer los mecanismos tanto moleculares como fisiológicos de adaptación a la sequía a todos los. 4.

(29) Introducción. niveles, desde las poblaciones en su conjunto hasta la función de un gen concreto (Anexo I).. 1.1. Respuesta de las plantas al estrés hídrico. El agua es el principal factor limitante para el crecimiento y la reproducción de las plantas, y el déficit hídrico puede suponer un grave riesgo para el equilibrio homeostático, alterando el metabolismo; aumenta la producción de radicales libres y especies reactivas del oxígeno (reactive oxygen species, ROS), tales como iones oxígeno, superóxido y peróxidos, que pueden dañar las membranas celulares, especialmente la maquinaria fotosintética, así como el ADN, llegando incluso a suponer un serio riesgo para la propia supervivencia de la planta. Las plantas a lo largo de la evolución han desarrollado tres diferentes estrategias que han permitido la supervivencia ante las sucesivas sequías (Valladares et al., 2004). Así una primera estrategia sería la elusiva o de escape, mediante la cual las plantas completarían su ciclo vital antes de la llegada del estrés hídrico, pasando el período desfavorable en forma de semilla. Otra estrategia sería la de tolerancia del estrés: un conjunto de modificaciones fisiológicas permiten a estos individuos soportar un notable grado de deshidratación de los tejidos, protegiendo de manera eficaz sus estructuras celulares o reconstruyéndolas una vez restablecidos los niveles hídricos apropiados. Es el caso de las conocidas como “plantas resurrección” (pertenecientes a géneros como Craterostigma, Eragrostis, Myrothamnus, Selaginella, Sporobolus, o Xerophyta), propias de territorios extremadamente áridos. Sin embargo, la estrategia más común, y a partir de la cual presumiblemente evolucionaron las otras dos (Levitt, 1980), es la denominada evitadora. En este caso las plantas previenen o minimizan la penetración del estrés en sus tejidos, maximizando la absorción de agua (por ejemplo mediante sistemas radicales profundos) y/o minimizando las pérdidas de agua (por ejemplo con un rápido cierre de estomas). Estas tres estrategias no son excluyentes las unas de las otras, y en la práctica las plantas suelen combinarlas (Ludlow, 1989); así, por ejemplo, los mecanismos de tolerancia complementan los mecanismos evitadores en las plantas resurrección, y se aprecian también mecanismos evitadores en plantas anuales que eludirán la peor fase del estrés hídrico.. Las respuestas de las plantas al estrés son dinámicas y engloban una serie de complejos mecanismos interconectados para la regulación a diferentes niveles, incluyendo ajustes del metabolismo así como la expresión de genes implicados en la adaptación fisiológica y morfológica (Farooq et al., 2009) (Figura 1.2). La identificación 5.

(30) Genes implicados en la respuesta molecular a estrés hídrico en Pinus pinaster Ait.. de los caracteres genéticos responsables de los mecanismos de resistencia a sequía en plantas resulta especialmente difícil debido a la complejidad de la variación de factores climáticos, la diversidad de ambientes hidrológicos, las relaciones establecidas entre el suelo y planta, la disponibilidad de nutrientes y las distintas interacciones que se generan en cada ambiente. Además, otros factores que inciden en la respuesta deben ser considerados, ya que la falta de agua puede estar asociada a otros tipos de estrés, como el térmico o el salino.. Desde el punto de vista molecular, la respuesta al estrés hídrico incluye numerosos mecanismos de control a distintos niveles como la regulación posttranscripcional, post-traduccional o epigenética (Floris et al., 2009; Hirayama y Shinozaki, 2010; Vaahtera y Brosché, 2011). Los productos génicos asociados a la respuesta al estrés hídrico pueden clasificarse en dos grupos (Wang et al., 2003; Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki, 2007): el primero incluye proteínas implicadas en la regulación de la transducción de señales (proteínas reguladoras) y el segundo engloba proteínas con diferentes funciones biológicas implicadas en la tolerancia al estrés (proteínas funcionales).. 1.1.1. Proteínas reguladoras en respuesta a estrés hídrico. Las proteínas reguladoras controlan la expresión génica y la transducción de señal en respuesta al estrés; este grupo incluye factores de transcripción, quinasas y fosfatasas y enzimas implicadas en el metabolismo de los fosfolípidos.. Los resultados de numerosos estudios desarrollados en especies modelo, todas ellas angiospermas, describen una serie de etapas sucesivas que formarían la ruta general de transducción en respuesta a un estrés abiótico. El primer paso corresponde a la percepción de la señal, el cual sigue siendo el menos claro dado que aún no se han identificado los sensores responsables de la misma. Posteriormente intervienen mensajeros secundarios como el Ca++, ROS e inositol fosfatasas. Estos mensajeros intermedios están involucrados en la regulación de los niveles de calcio en el citoplasma celular, cuya perturbación cambia la conformación de proteínas sensoras de calcio. Este cambio activa una cascada de fosforilación que finaliza con la activación directa de genes de respuesta o con la activación de factores de transcripción que a su vez regulan la expresión de genes de respuesta al estrés (Huang et al., 2012).. 6.

(31) Introducción. El estudio en especies modelo herbáceas ha permitido identificar al menos cuatro rutas independientes de transducción de señal inducida por la sequía, cada una de ellas mediada por un tipo de factor de transcripción (Figura 1.2);. Figura 1.2 Respuestas de las plantas al estrés hídrico. La parte superior representa un esquema de la respuesta molecular de las plantas al estrés hídrico; se inicia con la percepción de la señal y posterior activación de las distintas rutas de señalización. Estas finalizan con la expresión de genes de respuesta al estrés implicados en las distintas respuestas metabólicas y fisiológicas. [Adaptado de Valladares et al. (2004) y García y Capiati (2011)].. 7.

(32) Genes implicados en la respuesta molecular a estrés hídrico en Pinus pinaster Ait.. . Una primera ruta se caracteriza por la acción de los factores de transcripción tipo DREB (“Drought response element binding factor”) que regulan aquellos genes de respuesta poseen en sus promotores elementos DRE (“Dehydratation Responsive Element”).. . En la segunda ruta intervienen factores de transcripción con dominios tipo NAC (NAM, ATAF1, 2 y CUC2) así como los ZF-HD (Zinc finger homeodomain) que actúan de forma generalmente conjunta.. . Una tercera ruta estaría regulada por factores de transcripción tipo bZIP “ABRE binding protein” (AREB/ABF); se caracteriza por la presencia de genes que se sobreexpresan en condiciones de sequía y salinidad, los cuales contienen en sus promotores elementos de activación en cis ABRE (“ABA responsive Element”).. . La cuarta ruta estaría regulada por la acción combinada de varios factores de transcripción tipo MYC y MYB.. Otros tipos de factor de transcripción también han sido relacionados con respuestas a estrés abiótico como los NF-Y (Nuclear factor Y) o los factores de transcripción tipo WRKY pero aún no se han determinado las posibles rutas que controlan (ver (Agarwal y Jha, 2009; Cramer et al., 2011; Fujita et al., 2011; Qin et al., 2011; Huang et al., 2012) y referencias citadas en ellos). Las dos primeras rutas descritas anteriormente son independientes de los niveles de ácido abcísico (ABA) en la célula, mientras que las otras dos parecen estar reguladas por dichos niveles. Las hormonas vegetales, especialmente el ABA, etileno y jasmonatos, varían sus niveles a lo largo de la sequía y su presencia puede amplificar la señal inicial e incluso activar nuevas rutas de respuesta (Vanková, 2010). La activación de las rutas podría ser secuencial, iniciándose la activación de las rutas independientes de ABA como respuesta rápida de emergencia; si el estrés hídrico se mantiene, la acumulación de ABA endógeno provoca la activación de las rutas dependientes de ABA, comenzando con el sistema bZIP/ABRE y por último la ruta que requiere la producción de las proteínas MYB y MYC en respuesta a ABA. En todo caso las rutas descritas no funcionan de forma independiente, sino que se han identificado numerosas interacciones no sólo entre rutas dependientes e independientes de ABA, sino entre rutas activadas por otros tipos de estrés tanto abiótico como biótico (Fujita et al., 2006). 8.

(33) Introducción. 1.1.2 Proteínas funcionales implicadas en la tolerancia al estrés hídrico. Encontramos en este grupo proteínas que actúan minimizando la deshidratación o protegiendo las estructuras celulares de los efectos de ésta, como por ejemplo enzimas implicadas en la biosíntesis y transporte de osmoprotectores, proteínas LEA, chaperonas y enzimas de detoxificación (Oliver et al., 2010; dos Reis et al., 2012).. Osmoprotectores. Las plantas se enfrentan a la deshidratación mediante la producción y acumulación de osmolitos lo que les permite realizar un ajuste osmótico y minimizar la pérdida de agua y con ello la deshidratación de los tejidos. Muchos de los genes activados durante la respuesta a estrés hídrico codifican enzimas que catalizan los diferentes pasos en la biosíntesis de solutos compatibles. Los osmoprotectores comúnmente acumulados durante la deshidratación corresponderían con aminoácidos como prolina y GABA, aminas como poliaminas y glicin-betaínas, y azúcares como fructanos, tri-rafinosa y almidón, mono y disacáridos (dos Reis et al., 2012; Krasensky y Jonak, 2012). Otro grupo de genes directamente relacionados con los osmoprotectores son aquéllos que codifican proteínas de membrana implicadas en el transporte de los compuestos generados.. Proteínas LEA. Las proteínas LEA (Late Embryogenesis Abundant proteins) forman un numeroso grupo identificado inicialmente durante los últimos pasos del desarrollo embrionario, aunque en los últimos años se ha descrito una importante acumulación de estos transcritos en tejidos vegetativos ante diferentes estreses ambientales. Generalmente presentan bajos pesos moleculares y diferentes motivos conservados, en muchas ocasiones con numerosas repeticiones a lo largo de la secuencia de aminoácidos. Aunque no se conoce claramente su modo de acción durante condiciones de sequía, está aceptado su papel como moléculas capaces de conferir cierto grado de tolerancia a la deshidratación en las células de la planta. Se ha demostrado su implicación en procesos como secuestro de iones y estabilización de membranas plasmáticas así como de otras proteínas (Shih et al., 2008; Olvera-Carrillo et al., 2011).. 9.

(34) Genes implicados en la respuesta molecular a estrés hídrico en Pinus pinaster Ait.. Chaperonas. Las chaperonas, dentro de las cuales encontramos las proteínas de choque térmico (heat shock proteins, HSP) colaboran naturalmente en el plegado de otras proteínas, uniéndose de forma reversible a las zonas desplegadas de los polipéptidos. Evitan de este modo interacciones que conllevarían la adquisición de estructuras tridimensionales incorrectas o incluso la formación de agregados insolubles. La síntesis y acumulación de proteínas HSP juega un papel central en la respuesta y tolerancia de las plantas ante diferentes estreses ambientales, ya que están implicadas en el restablecimiento de la conformación nativa de las proteínas y con ello de la homeostasis celular. (Wang et al., 2004; dos Reis et al., 2012).. Enzimas de detoxificación. La disminución en los niveles intracelulares de CO2 da lugar a una sobrereducción de los componentes de la cadena de transporte electrónico generando ROS. Estos compuestos, como se mencionó anteriormente, son una parte importante en la respuesta a estrés hídrico ya que pueden actuar como mensajeros secundarios en la transducción de la señal de respuesta. Sin embargo pueden llegar a niveles tóxicos para la planta y deben ser eliminados para evitar que afecten al correcto funcionamiento de algunas enzimas como por ejemplo las de la maquinaria fotosintética. Los niveles de transcrito de algunos antioxidantes como catalasas, superoxido dismutasas o del ciclo ascorbato-glutatión aumentan durante el déficit hídrico protegiendo la célula de la oxidación producida por ROS (Oliver et al., 2010).. 1.2. El estudio de la respuesta al estrés hídrico en coníferas. Desde el año 2000 se han logrado importantes avances en el conocimiento de los mecanismos por los cuales las plantas controlan distintos caracteres de interés, debido en gran parte a la mejora de las técnicas de secuenciación de DNA y la obtención a raíz de ello de genomas completos de diferentes plantas; la primera especie vegetal secuenciada fue Arabidopsis thaliana (Lin et al., 1999; Mayer et al., 1999; Salanoubat et al., 2000; Tabata et al., 2000; Theologis et al., 2000), seguida por Oryza sativa (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002), y Vitis vinífera (Velasco et al., 2007), siendo Populus trichocarpa la primera especie forestal secuenciada por completo (Tuskan et al., 2006).. 10.

(35) Introducción. En los últimos años se ha producido una nueva revolución en las técnicas de secuenciación, tras la aparición de los secuenciadores de segunda generación y de las nuevas plataformas de secuenciación 454-FLX (Roche), SOLiD (Applied Byosistem), Illumina (Solexa) e Ion Torrent (Life Tecnologies). La mayor ventaja de estas técnicas es que a partir de una única muestra de ADNc se puede obtener una robusta colección de secuencias consenso para genes completos con una buena proporción de transcritos poco representados. Los primeros resultados de estas técnicas de secuenciación empiezan a incorporarse a la información obtenida durante la última década mediante métodos tradicionales de secuenciación. Recientemente se han desarrollado los denominados secuenciadores de tercera generación, basados en la secuenciación de una única molécula de ADN., con los que se prevé la obtención de secuencias altamente fiables con un menor coste, lo que se traducirá en la disponibilidad de numerosas secuencias para un número mayor de especies.. Sin embargo, la complejidad del genoma de las coníferas, especialmente de las pináceas, con un elevado porcentaje de secuencias altamente repetitivas y con un gran tamaño (28.9 pg/C para P. pinaster y 28.6 pg/C para P. pinea (Zonneveld, 2012), que equivale a más de 100 veces el genoma de Arabidopsis y más de tres veces el humano) continúa dificultando la obtención del genoma completo de una especie modelo de esta división.. Por este motivo, la mayor parte de los proyectos de genómica desarrollados hasta fechas recientes en coníferas se han encaminado a la caracterización del transcriptoma; la obtención de numerosas ESTs (Expressed Sequenced Tags) se presentó como una eficiente aproximación para la caracterización de parte del genoma, contribuyendo rápidamente al conocimiento de caracteres de interés en la especie estudiada, así como a la obtención de nuevas herramientas moleculares para la mejora genética (Kirst et al., 2003). El número de ESTs de gimnospermas ha ido aumentando de manera considerable hasta alcanzar 1.204.091 secuencias en las bases de datos del GenBank (3 de Diciembre de 2012) de las cuales casi el 89% pertenecen a la familia de las pináceas. Centrándonos en las especies estudiadas en esta tesis, el número de ESTs de P. pinaster alcanza 34.911 mientras que únicamente han sido depositadas 327 secuencias de P. pinea, lo que demuestra el escaso conocimiento genómico sobre esta especie.. La gran cantidad de información redundante observada entre las secuencias hace necesario un procesado de las mismas; se han habilitado diferentes bases de 11.

(36) Genes implicados en la respuesta molecular a estrés hídrico en Pinus pinaster Ait.. datos que emplean distintas técnicas de alineamiento para obtener una secuencia consenso que represente cada gen. Entre ellas PlantGDB, (Duvick et al., 2008) hace alineamientos individualizados por especie; en la última versión para Pinus pinaster (177a del 25 de mayo de 2010) obtiene 15.648 posibles unigenes a partir de 35.139 ESTs empleadas en el alineamiento. Llama la atención el número de transcritos únicos obtenidos en la última actualización de Pinus sylvestris (versión 187a, de 1 de febrero de 2012): 73.609 unigenes desde 76.256 ESTs, frente a Pinus taeda (157a, de 1 de febrero de 2007), para el que se obtuvo un número de unigenes ligeramente inferior, 72.829 pero a partir de 329.584 ESTs, lo que da una idea del alto grado de redundancia en las genotecas obtenidas para esta especie.. Otra base de datos destacable es la PGI (Pine Gene Index database; http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html) la cual contiene un catálogo de posibles transcritos únicos para un género concreto a partir de una colección de ESTs de diferentes. En la última actualización para Pinus sp (Pine 9.0, de 26 de marzo de 2011) obtuvieron 77.195 genes únicos a partir de 452.256 ESTs, números muy similares a los obtenidos para P. taeda en PlantGDB.. La base de datos EuroPineDB se centra en tres de las especies de mayor importancia en el ámbito mediterráneo (P. pinaster, P. sylvestris y P. pinea) (Anexo II). La especie con mayor peso en esta base de datos es P. pinaster que presenta secuencias procedentes de distintos experimentos, entre ellas las producidas en la presente tesis, e incluye los primeros resultados obtenidos mediante técnicas de secuenciación masiva. Gracias a ello el número de secuencias válidas asciende considerablemente hasta 877.523, de las que se obtienen 55.332 unigenes. Esta base de datos incluye también dos genotecas de P. sylvestris que contienen 2466 secuencias de las que se obtienen 679 unigenes. P. pinea únicamente aporta 266 unigenes, obtenidos a partir de 306 ESTs empleadas en el alineamiento. EuroPineDB ha evolucionado en los últimos años a una nueva base de datos, SustainPineDB, que incorpora los resultados del proyecto europeo Sustainpine dedicado exclusivamente al estudio de P. pinaster. La última versión de esta base de datos (SustainPineDB v.2.0, del 16 de abril de 2012) incorpora numerosos resultados procedentes de secuenciadores de segunda generación alcanzando 2.905.300 secuencias que dan como resultado 92.478 unigenes para esta especie. Esto supone casi 77.000 unigenes más que los obtenidos en PlantGDB a partir únicamente de las ESTs disponibles, lo que da una idea de la importancia que empiezan a tener las técnicas de secuenciación masiva en las investigaciones con coníferas. 12.

(37) Introducción. El rápido avance de las técnicas de secuenciación convierte la caracterización funcional de los genes en el cuello de botella actual en la investigación molecular con gimnospermas. Entre el 35 y el 40% de las secuencias contenidas en las bases de datos no muestran homología con genes previamente descritos, y la anotación de aquellos que presentan homología generalmente se basa en la información descrita para angiospermas. Dado que angiospermas y gimnospermas divergieron hace 300 millones de años (Magallóan y Sanderson, 2005) muchos genes podrían estar implicados en procesos diferentes a los descritos en especies modelo. Es por tanto necesaria la utilización de gimnospermas como especies modelo para el estudio de la actividad de muchos genes identificados en esta división. 1.2.1. Las especies modelo utilizadas en este trabajo. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento de la respuesta molecular al estrés hídrico en coníferas hemos escogido como especies de estudio dos pinos mediterráneos, P. pinaster y P. pinea.. El pino rodeno, marítimo o negral, Pinus pinaster Aiton, se distribuye por la cuenca occidental del Mediterráneo, costa atlántica de la Península Ibérica y suroeste de Francia. En España es la conífera más abundante, ocupando más de 1.500.000 ha debido, en gran medida, a su empleo en la reforestación de grandes superficies. De hecho, algo más del 50% de la superficie ocupada serían el resultado de repoblaciones llevadas a cabo entre los años 1940 y 1982 (Alía et al., 1995) mientras que el resto corresponderían a poblaciones naturales (Alía y Martín, 2009). (Figura 1.3).. A pesar de presentar una distribución natural relativamente reducida, P. pinaster presenta una elevada diversidad genética. A finales de los años ochenta se identificaron hasta 18 razas geográficas en función de la composición en terpenos, que quedaban agrupadas en tres grandes grupos: el atlántico, el mediterráneo occidental y el magrebí (Baradat y Marpeau-Bezard, 1988). Estudios posteriores con marcadores moleculares establecieron seis grandes grupos dentro de la especie: zona francesa continental (Landas), Córcega, zona del noroeste y centro de España, zona sur de España, Marruecos y Túnez (Bucci et al., 2007; Eveno et al., 2008).. 13.

(38) Genes implicados en la respuesta molecular a estrés hídrico en Pinus pinaster Ait.. Figura 1.3 Área de distribución de Pinus Pinaster (fuente; Euforgen). Asociada a esta diversidad genética, P. pinaster muestra una gran valencia ecológica, desarrollándose en una gran diversidad de suelos y condiciones ambientales. Se encuentra en llanuras, regiones de costa y cadenas montañosas, alcanzando altitudes de aproximadamente 2000 m (Gil et al., 1990; Alía et al., 1990, 1991 y 1996) . Es capaz de sobrevivir bajo condiciones ambientales muy severas, mostrando una buena resistencia a la sequía y las heladas (Alía et al., 1996).. Por el contrario, el pino piñonero, Pinus pinea L., ocupa una mayor área de distribución, a lo largo de toda la orla mediterránea (Figura 1.4). Sin embargo, presenta una casi nula variabilidad genética, siendo un caso excepcional entre las especies forestales. Así, no se han descrito razas geográficas, ecotipos o cultivares. Los estudios con marcadores de ADN de cloroplasto (Vendramin et al., 2008) o isoenzimas (Fallour et al., 1997) han confirmado esta virtual ausencia de diversidad.. El hábitat de ambas especies solapa en gran medida, si bien P. pinea suele encontrarse en las zonas más cálidas, sometidas a sequías frecuentes, y sobre todo en los suelos con menor capacidad de retención de agua. De hecho, los pinares de P. pinea (puros o en mezcla con P. pinaster) están considerados como hábitat prioritario para su conservación por la Directiva Hábitat europea (1992/43/CEE), y la especie se utiliza ampliamente para la fijación de dunas, conservación de suelos y protección de cultivos agrícolas en zonas costeras.. 14.

(39) Introducción. Figura 1.4 Área de distribución de Pinus pinea (fuente; Euforgen). Numerosos trabajos han estudiado el comportamiento hídrico de Pinus pinaster en condiciones de sequía midiendo distintos parámetros ecosifiológicos, generalmente en ensayos con diferentes procedencias adaptadas a ambientes contrastados y en algunos casos en estudios intrapoblacionales (p. ej.(Hopkins, 1971; Alía et al., 1991; Correia et al., 2008). Un proceso común observado durante los periodos de sequía es la reducción de la tasa de crecimiento muchas veces acompañada de cambios en el balance entre el crecimiento radicular y aéreo. En un estudio con plántulas de cuatro meses de edad sometidas a una sequía prolongada se observó una clara correlación entre el diámetro, la altura y la distribución de biomasa de las plantas (Fernández et al., 2006). Se han descrito diferencias entre procedencias en cuanto al reparto de biomasa raíz-tallo, encontrando la mayor inversión en biomasa de raíz para procedencias del norte de África mientras que las procedencias españolas y francesas mostraron mayor inversión en biomasa aérea (Aranda et al., 2010). Este amplio grado de variación interpoblacional también se ha visto reflejado en otros caracteres como el contenido hídrico de la planta y el intercambio gaseoso (Fernandez et al., 1999, 2000), el ajuste osmótico (Nguyen-Queyrens y Bouchet-Lannat, 2003; Lopez et al., 2009), la discriminación isotópica (Guehl et al., 1995; Correia et al., 2008; Aranda et al., 2010; Corcuera et al., 2010) o el embolismo del xilema (Corcuera et al., 2011; Lamy et al., 2011). En algunos casos se han observado diferencias significativas en algunos de estos caracteres a escala intrapoblacional o incluso intrafamiliar (Sánchez-Gómez et al., 2010; de Miguel et al., 2012). 15.