RESUMEN
Antecedentes: El plasma sanguíneo bovino es un residuo de centrales de sacrificio que causa un impacto ambiental negativo cuando es vertido en cuerpos de agua naturales; sin embargo tiene po- tenciales aplicaciones biotecnológicas como fuente de nitrógeno en cultivos microbianos. La hidrólisis enzimática de las proteínas del plasma utilizando endoproteasas conduce a la producción de péptidos de diferentes tamaños con varias aplicaciones en la industria. Si bien se han realizado estudios sobre la hidrólisis de plasma bovino diluido, no se ha re- portado en la literatura disponible el modelamiento de la cinética cuando se emplea el plasma con altas concentraciones de proteínas. Objetivo: El obje- tivo de este trabajo fue modelar matemáticamente la cinética de la reacción de hidrólisis del plasma sanguíneo bovino con elevados contenidos de pro- teína. Métodos: Se utilizó como sustrato el plasma deshidratado con diferentes contenidos proteicos (entre 36 y 73 g/L); la concentración de proteína se determinó por el método de Biuret. Para su hidrólisis se utilizó Alcalasa 2,4L FG
®. La reacción se llevó a cabo durante una hora en biorreactor de vidrio de 2 L a pH alcalino. Se calculó el grado de hidrólisis por el método de pH-estato empleando un titulador automático; para el modelamiento se utilizó la función lsqcurvefit de Matlab versión R2015b. Resultados: El máximo grado de hidróli- sis alcanzado fue de 17,4% para plasma con 36 g/L de proteína y una dosis de 0,10 g Alcalasa/g de proteí- na. El modelo planteado describió adecuadamente el comportamiento de los datos experimentales
obtenidos. Conclusiones: El modelo matemático propuesto demostró ser una potente herramienta para estimar el grado de hidrólisis en función del tiempo para el plasma con alta concentración de proteína. Estos resultados son de gran utilidad al momento de diseñar procesos de aprovechamiento de la sangre bovina, en particular, la utilización del plasma con proteína hidrolizada como fuente de nitrógeno para fermentaciones industriales.
Palabras clave: Plasma sanguíneo bovino, en- doproteasa alcalina, hidrólisis enzimática, cinética, grado de hidrólisis.
ABSTRACT
Background: Bovine blood plasma is a waste from slaughterhouses, which causes a negative environmental impact when it is discharged into natural water streams. However, the plasma has potential biotechnological applications as a nitro- gen source for microbial cultures. The enzymatic hydrolysis of plasma proteins using endoproteases leads to the production of peptides of different sizes with several industrial applications. Although some research efforts on the hydrolysis of dilute plasma have been done, the modeling of the kinetics when using plasma with high protein concentration has not been reported in the available literature.
Methods: Dried plasma was used as substrate with different protein content (between 36 and 73 g/L). Protein concentration was determined by the Biuret’s method. For its hydrolysis, Alcalase 2,4L FG® was used. The reaction was accomplished during one hour in a 2-L glass bioreactor at alka-
MODELAMIENTO DE LA CINÉTICA DE HIDRÓLISIS DE LAS PROTEÍNAS DEL PLASMA SANGUÍNEO BOVINO CON
ENDOPROTEASA ALCALINA BACTERIANA
MODELING OF THE HYDROLYSIS KINETICS OF THE PROTEINS FROM BOVINE BLOOD PLASMA USING BACTERIAL ALKALINE ENDOPROTEASE
Pedro J. BARRAGÁN Ph.D.(c)
1, Óscar J. SÁNCHEZ Ph.D.
2*, Sandra MONTOYA Ph.D
3.
1 Profesor Asociado, Integrante Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria, Departamento de Ingeniería, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.
2 Profesor Asociado, Director Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria, Departamento de Ingeniería, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.
3 Profesora Asociada, Integrante Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria, Departamento de Ingeniería, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.
* Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: osanchez@ucaldas.edu.co
line pH. The degree of hydrolysis was calculated by the pH-stat method employing an automatic titrator. For modeling, the lsqcurvefit function of Matlab version R2015b was applied. Results: The maximum degree of hydrolysis (17.4%) was reached for the plasma with 36 g/L protein and an enzyme dosage of 0.10 g Alcalase/g protein. The proposed model appropriately described the behavior of the experimental data obtained. Conclusions: The proposed mathematical model demonstrated to be a powerful tool to estimate the degree of hydrolysis for the plasma with high protein concentration.
These results are very useful when designing processes for the utilization of bovine blood, par- ticularly, by using plasma with hydrolyzed protein as a nitrogen source for industrial fermentations.
Keywords: Bovine blood plasma, alkaline en- doprotease, enzymatic hydrolysis, kinetics, degree of hydrolysis.
INTRODUCCIÓN
La sangre bovina es un subproducto de la in- dustria cárnica con un importante valor biológico representado en su contenido de proteínas. En particular, el uso de la fracción plasmática (sangre sin la fracción corpuscular) se ha extendido en ali- mentación humana y animal para la formulación de embutidos, pudines, panes, galletas y bebidas refres- cantes, entre otros (1-3). También se ha utilizado en la preparación de medios para el crecimiento de cultivos iniciadores homolácticos y producción de probióticos (4, 5), pero esta alternativa industrial ha sido poco explorada en la industria alimentaria.
Para el aprovechamiento de este residuo, la hidrólisis enzimática parcial de sus proteínas tiene un gran potencial en la preparación de medios de cultivo a base de plasma. Debido al uso potencial del plasma, existe hoy en día gran interés por modelar el com- portamiento de sistemas que involucran reacciones de hidrólisis enzimática con el fin de dimensionar equipos industriales, pronosticar comportamientos dinámicos, controlar tiempos de proceso y otras variables cinéticas para su aprovechamiento (1, 6).
El objetivo de este trabajo fue realizar un estudio cinético de la hidrólisis enzimática de soluciones de proteínas del plasma sanguíneo bovino (PSB), con diferente contenido de proteína y dosis de enzima.
Si bien se han reportado estudios sobre la hidrólisis de plasma bovino diluido (1, 5), no se ha encontrado en la literatura disponible el modelamiento de la cinética cuando se emplea el plasma con altas con-
centraciones de proteínas. Esta condición es crucial al momento de plantear el aprovechamiento del plasma como fuente de nitrógeno en fermentacio- nes industriales, especialmente en cultivos lácticos.
MATERIALES Y MÉTODOS El plasma sanguíneo bovino fue suministrado por la empresa Frigodán Ltda. de la ciudad de Bogotá, que tiene una presentación en polvo de partícula fina con un contenido proteico mayor al 70% (p/p). Se realizó la determinación de proteína del concentrado en polvo de PSB suministrado y de los preparados proteicos elaborados por el método de Biuret (1940). Para la hidrólisis de proteínas se utilizó una serina endoproteasa, la subtilisina A (EC 3.4.21.62), enzima bacteriana denominada comercialmente como Alcalasa 2.4 L FG® (No- vozymes, Dinamarca) grado alimenticio con una actividad específica declarada de 2,4 AU/g. Las condiciones de reacción se definieron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante: temperatura de 61°C y un pH de 8,5. El estudio cinético de la hidrólisis enzimática de las proteínas del PSB fue llevado a cabo en un reactor de vidrio de 2 L con camisa de recirculación de agua. Para el control y registro del pH se utilizó titulador automático con agitador magnético TL7000 (SI Analytic, Alemania) con electrodo combinado de vidrio; el titulador automático empeló una solución estandarizada de NaOH al 1,5304 N con agitación constante. Para el control y registro de la temperatura, el titulador se acopló a un baño termostatado RE 420S (Lauda, Alemania).
El contenido de proteína del PSB se varió a través de la preparación de soluciones con 36, 53 y 73 g/L.
Para la reacción hidrolítica se utilizaron dosis de enzima de 0,05, 0,06 y 0,10 g/g de proteína para un total de seis ensayos de hidrólisis (ver Tabla 1). Cada ensayo se realizó por duplicado y tuvo una duración de una hora con registros de grado de hidrólisis cada 5 min. Para suspender la reacción hidrolítica se calentó el hidrolizado hasta 90°C, inactivando así la enzima. Para el seguimiento y control de la hidrólisis se recurrió a la determinación del grado de hidrólisis (GH), el cual representa la porción de enlaces peptídicos hidrolizados (h) sobre el número total de enlaces (h
tot). El GH se calculó con base en la ecuación 1:
(Ecuación 1)
donde h es el número de enlaces peptídicos hidro- lizados y h
totel número total de enlaces peptídicos presentes en la proteína nativa; h y h
totse expresan en meq/g. En la literatura aparece reportado para proteínas de la sangre un valor de h
tot=8,3 meq/g (7). El método seleccionado para calcular el GH fue el de valoración del protón o método de pH- estato (8, 9). Este método consiste en mantener constante el pH del medio de reacción con adición de una solución básica (hidróxido de sodio 0,1 N);
a medida que la hidrólisis avanza en medio alcalino, el grupo carboxilo terminal se disocia por completo y los protones formados se reparten de acuerdo con el equilibrio de protonación de los grupos -amino liberados. La base agregada para mantener constante el pH neutraliza únicamente los protones que son sustituidos por el catión de la base (1, 9). Conside- rando lo anterior, el GH se calculó con la ecuación 2:
(Ecuación 2) donde B es el volumen (mL) de base consumida, N
Bes la normalidad de la base (meq/L), es el grado de disociación de los grupos -NH2 y MP es la masa de proteína (g). El grado de disociación se puede hallar por la ecuación 3:
(Ecuación 3) Para calcular el pK a la temperatura de estudio se utilizó la ecuación 4 (10):
(Ecuación 4) Para el modelamiento de la cinética se utilizó un modelo matemático basado en el mecanismo de acción enzimática (1, 11), que establece una relación exponencial entre la velocidad de la reacción, la con- centración inicial de sustrato (proteínas en el PSB)
y de enzima (Alcalasa) con dos parámetros de ajuste a y b como se aprecia en la ecuación 5 diferencial:
(Ecuación 5) A fin de determinar los parámetros de este modelo, se utilizó la función lsqcurvefit de Matlab versión R2015b, la cual resuelve problemas de ajuste de datos de ecuaciones no lineales.
RESULTADOS
En la figura 1 se presenta la curva del grado de hidrólisis alcanzado en función del tiempo durante la reacción de una solución de plasma con 73 g/L de proteína y la enzima Alcalasa con una dosificación de 0,05 g/g de proteína (por razones de espacio no se presentan todas las gráficas correspondientes a los seis ensayos realizados con la desviación es- tándar de cada punto cinético). Precisamente, esta solución de plasma (ver Tabla 1) es la que coincide con la concentración promedio del plasma fresco entero recién separado de su fracción corpuscular.
En el caso de los tres preparados proteicos de 36 g/L de proteína (ensayos 1 al 3), con dosis progre- sivas de enzima, se observa un aumento del GH reflejándose una relación de proporcionalidad (ver Tabla 1). En contraste, con aumentos progresivos de la concentración de proteína en los preparados de PSB a una misma dosis de enzima, el GH se reduce estableciéndose una relación inversamente proporcional. Este comportamiento, sin embargo, no es igual en el caso de los preparados proteicos correspondientes a los ensayos 2 y 4. El mayor grado de hidrólisis alcanzado al final del proceso (17,4%) correspondió al ensayo 3, en donde la concentración inicial de proteína fue de 36 g/L con una dosis de Alcalasa de 0,10 g/g de proteína (Ver figura 2).
Figura 1. Perfil del grado de hidrólisis con el tiempo con una concentración inicial de proteína de 73 g/L y dosis
de Alcalasa de 0,05 g/g de proteína. La curva continua fue calculada por el modelo matemático utilizado.
DISCUSIÓN
Se observa, al inicio de la reacción, un aumento del GH en el tiempo con una estabilización poste- rior al final del proceso. En las figuras presentadas se observan también los resultados del modelo matemático aplicado representado por las ecua- ciones (2) a (5). Evidentemente, la curva calculada empleando el modelo presenta un muy buen ajuste frente a los datos experimentales (marcadores en las figuras). Reflejando la importancia que tiene el manejo de la relación enzima-sustrato en la reacción hidrolítica para la obtención de GH que conduzcan a fragmentos de péptidos de interés. En general, los grados de hidrólisis alcanzados en este trabajo son mayores que los GH reportados para soluciones de PSB de menor concentración proteica y están en un rango entre 10,0% y 17,4%. Por ejemplo, el GH obtenido en el trabajo (1) utilizando el mismo montaje experimental para una concentración ini- cial de proteína de PSB de 4 g/L (una concentración significativamente inferior a las utilizadas en este estudio) con una dosis de Alcalasa de 0,389 AU/L, fue del 13,3%. Estos resultados indican que el efecto de inhibición por sustrato no es tan marcado como se indica en la literatura disponible.
Tabla 1. Grado de hidrólisis para diferentes concentraciones proteicas del plasma sanguíneo bovino y dosis de enzima.
Ensayo Concentración de proteína
(g/L)
Dosis de enzima (g de Alcalasa/g de
proteína)
Grado de hidrólisis (%)
1 36 0,05 12,66
2 36 0,06 13,35
3 36 0,10 17,41
4 53 0,06 15,11
5 53 0,10 16,59
6 73 0,05 10,08
CONCLUSIONES
Los niveles del grado de hidrólisis de las pro- teínas del PSB alcanzados son comparativamente más altos que los encontrados para soluciones de plasma con menos contenido proteico, lo que im- plica un gran potencial en el aprovechamiento de los péptidos formados como fuente de nitrógeno para medios nutritivos de fermentación. En este estudio se encontró que el modelo matemático propuesto puede ser usado para estimar el GH en el tiempo
en el caso de preparados proteicos del plasma bo- vino sanguíneo de alta concentración usando una proteasa alcalina comercial. Estos hidrolizados proteicos tienen el potencial de tener niveles altos de nitrógeno asimilable (particularmente grupos – NH
2terminales de los péptidos formados. La predicción del comportamiento de la hidrólisis en- zimática con modelos matemáticos, es crucial para el diseño de nuevo medios de cultivo de bajo costo para fermentaciones industriales como los basados en plasma sanguíneo.
Figura 2. Perfil del grado de hidrólisis con el tiempo con una concentración inicial de proteína de 36 g/L y dosis de Alcalasa de 0,10 g/g de proteína. La curva continua fue calculada por el modelo matemático utilizado.
En general, la hidrólisis con enzimas micro- bianas puede aplicarse también de manera exitosa en el aprovechamiento de otros residuos con altas concentraciones de proteína diferentes al plasma bo- vino como residuos del procesamiento de pescado, vísceras residuales del beneficio de aves y suero de leche, entre otros.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos al Fondo de Ciencia, Tecnología e Innovación del Sistema General de Regalías por la financiación del presente trabajo, así como a la Unidad Tecnológica de Alimentos de la Universidad de Caldas por el apoyo recibido.
REFERENCIAS
1. Figueroa OA, Zapata JÉ, Gutiérrez GA. Modelamiento de la Ci- nética de Hidrólisis Enzimática de Proteínas del Plasma Bovino.
Rev EIA Esc Ing Antioq. 2012; 17: 71-84.
2. Rodas González A, Leal M, Arias de Muñoz B, Huerta Leidenz N, Márquez Salas EJ. Adición de plasma y paquete globular en la formulación de jamones cocidos. Revista Científica. 1998; 8(001).
3. Montero PM, Durán M, Marrugo Y. Estimación de la digestibi- lidad in vitro de una bebida refrescante adicionada con proteína plasmática. Vitae. 2012; 19(1): S300-S2.
4. Stherland AD, Salas EM, Ferrer A, de Fernández GP. Prepara- ción de cultivos iniciadores homolácticos para ser utilizados en la fermentación de productos carnicos. Revista Científica. 1992;
2(2).
5. Hyun CK, Shin HK. Utilization of Bovine Blood Plasma Obtained from a Slaughterhouse for Economic Production of Probiotics. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1998;
86(1): 34-7.
6. Arantes GM. Uma perspectiva computacional sobre catálise enzimática. Química Nova. 2008; 31(2): 377-83.
7. Adler-Nissen J. Enzymic hydrolysis of food proteins: Elsevier Applied Science Publishers; 1986.
8. Benítez R, Ibarz A, Pagan J. Hidrolizados de proteína: procesos y aplicaciones. Acta bioquímica clínica latinoamericana. 2008;
42(2): 227-36.
9. Guadix A, Camacho F, Bravo V, Guadix A. Producción en re- actores de membrana de hidrolizados enzimáticos de proteínas lácteas para nutrición enteral. Universidad de Granada (en línea).
2002.
10. Steinhardt J, Beychok S. Interaction of proteins with hydrogen ions and other small ions and molecules. The proteins. 1964; 2:
139-304.
Enzymatic hydrolysis of whey proteins: I. Kinetic models. Bio- technology and Bioengineering. 1994; 44(4): 523-8.
