INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

El sabado t

ASPARTIL PROTEASAS DE Candida glabrata.

Tesis que como uno de los requisitos para obtener el grado de

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

PRESENTA:

BERENICE PARRA ORTEGA

MÉXICO, D. F. 2010

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Secretaría de Investigación y Posgrado

Sección de Estudios de Posgrado e Investigación

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología General y en el Laboratorio de Genética Microbiana del Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas-IPN bajo la dirección conjunta de la Dra. Ma. de Lourdes Villa Tanaca y del Dr. César H. Hernández Rodríguez.

Esta Tesis se llevó a cabo con el apoyo de CONACyT (14299 y 69984) y SIP-IPN (2008- 2350 y 2009-0402) CONACYT, Salud (2007-1 69984).

La sustentante recibió beca del Programa Institucional para la Formación de Investigadores (PIFI) durante el período ENERO 2006 - Diciembre 2009, del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) durante el período Enero 2006 - Diciembre 2009 (179539).

A MIS PADRES

Y HERMANOS

i . Í N D I C E

Índice General

Índice de figuras

Índice de tablas

Abreviaturas

Resumen

Abstract

I. INTRODUCCIÓN………..1

I. 1. El género Candida ... 1

I. 2. Candida glabrata……….………..….…1

I. 3. Mecanismos de patogenicidad………..…………...4

………..……….

I. 3. 2. Switching fenotípico y filamentación………..………..6

I. 3. 3. Interacción hospedero-patógeno………..………..7

I. 3. 4. Producción de enzimas extracelulares………..7

II. ANTECEDENTES………..10

II. 1. Aspartil proteasas vacuolares……….10

II. 2. Aspartil proteasas secretadas (Saps)……….11

II. 3. Aspartil proteasas ancladas a la membrana por un sitio GPI (Yaps)……13

II. 4. Relación evolutiva y funcional entre las aspartil proteasas……….….15

III. JUSTIFICACIÓN………..17

IV. OBJETIVOS………18

IV. 1. Objetivo general ... 18

IV. 2. Objetivos particulares………..18

V. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO………..19

VI. MATERIAL Y MÉTODOS………..20

VI. 1. Cepas utilizadas……….………..20

VI. 1. 1. Conservación de cepas………..20

VI. 2. Medios de cultivo……….…………..20

VI. 3. Identificación in silico de los genes codificantes de aspartil proteasas en el genoma de las especies patógenas del género Candida………..………..………..21

VI. 4. Análisis bioinformático de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de las aspartil proteasas detectadas……….……….…..24

VI. 5. Obtención de DNA total de levaduras………...…………..……….25

VI. 6. Amplificación de los genes CgYPS de C. glabrata………....……..26

VI. 7. Diversidad genética………...………..………...26

VI. 8. Reconstrucción filogenética……….……….………….28

VI. 9. Análisis de expresión……….……….…………..………29

VI. 9. 1. Condiciones ambientales para el análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata CBS138 mediante RT-PCR……….………..29

VI. 9. 1. a. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata bajo diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes tiempos

………..

VI. 9. 1. b. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata pre inoculada hasta fase logarítmica (6 h) y cambio diauxico (12 h) en cultivos de transición en diferentes fuentes de nitrógeno incubadas durante 6 h a 37ºC

………..

VI. 9. 1. c. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata preinoculada hasta fase logarítmica y estacionaria en cultivos de transición bajo diferentes fuentes de nitrógeno, en inanición por fuente de carbono y nitrógeno, a partir de un cultivo en fase logarítmica (9 h) y estacionaria (16

h)

………..

VI. 9. 1. d. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata en condiciones de estrés a la pared celular

……….…….

VI. 9. 2. Extracción de RNA total………..………..…...31

VI. 9. 3. Determinación de la concentración de RNA………..………….31

VI. 9. 4. Comprobación de la integridad de los RNAs………...……….32

VI. 9. 5. Análisis de expresión mediante RT-PCR………..……...32

VII. RESULTADOS……….33

VII. 1. Identificación y análisis in silico de los genes codificantes de aspartil proteasas en el genoma de las especies patógenas del género Candida……….33

VII. 1. 1. Análisis in silico de la secuencias aminocídicas de los genes codificantes de aspartil proteasas………...33

VII. 2. Análisis de la diversidad de las yapsinas (CgYPS) en una colección de aislados clínicos de C. glabrata………37

VII. 3. Reconstrucción filogenética…………....………....………38

VII. 4. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata……….….…45

VII. 4. 2. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata bajo diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes tiempos……….………48

VII. 4. 3. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata preinoculada hasta fase logarítmica (6 h) y cambio diauxico (12 h) en cultivos de transición

en diferentes fuentes de nitrógeno incubadas durante 6 h a 37ºC……….……52

VII. 4. 4. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata preinoculada hasta fase logarítmica y estacionaria en cultivos de transición bajo diferentes fuentes de nitrógeno, en inanición por fuente de carbono y nitrógeno, a partir de un cultivo en fase logarítmica (6 h) y estacionaria (16 h)………..….57

VII. 4. 5. Análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata bajo diferentes condiciones de estrés a la pared celular………...61

VIII. DISCUSIÓN………...67

IX. CONCLUSIONES.……..………..……….87

X. PROSPECTIVAS.……..………89

XI. BIBLIOGRAFIA.……..………...91

XII. APÉNDICE………..…….….113

ii. ÍNDICE DE FIGURAS

ii Fig. I-1. Relación filogenética entre 42 genomas de hongos secuenciados ... ………3 Fig. I-2. Switching fenotípico y filamentación de C. glabrata………..………..6 Fig. II-1. Representación esquemática de la localización de los CgYPS en el genoma de C.

glabrata………..………14

Fig. VII-1. Motifs de las aspartil proteasas secretadas de Candida spp………..…..35 Fig. VII-2. Motif de las aspartil proteasas ancladas a membrana mediante un sitio GPI (YPS) de Candida spp………..36 Fig. VII-3. Amplificación de un fragmento de los genes CgYPS de C. glabrata……….37 Fig. VII-4. PCR multiplex de los genes CgYPS de C. glabrata en 50 cepas obtenidas de aislados clínicos……….………38 Fig. VII-5. Sintenia de los genes SAP C. albicans (Cal), C. dubliniensis (Cdu) y C.

guilliermondii (Cgu)……….………..41

Fig. VII-6. Sintenia de los genes YPS de S. cerevisiae (Scer), C. glabrata (Cgl), C. albicans (Cal) y C. dubliniensis (Cdu)………...42 Fig. VII-7. Árbol filogenético de las aspartil proteasas secretadas (Saps) de las especies de Candida………43

Fig. VII-8. Árbol filogenético de las aspartil proteasas ancladas a membrana mediante un sitio GPI (Yps) de Candida spp………...44 Fig. VII-9. Árbol filogenético, motifs y matriz de similitud e identidad de PrA……….44 Fig. VII-10. Análisis de expresión in vitro de los genes CgYPS de C. glabrata en YPD y YNB suplementado con glucosa y diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes tiempos………49-51 Fig. VII-11. Análisis de expresión in vitro a partir de un cultivo de transición en fase logarítmica (LOG) y cambio diauxico (CD) de los genes CgYPS de C. glabrata incubada a 37º C durante 6 horas en diferentes fuentes de nitrógeno y en inanición por fuente de carbono……….……….54-56 Fig. VII-12. Análisis de expresión in vitro a partir de un cultivo de transición en fase logarítmica (LOG) y estacionaria (EST) de los genes CgYPS de C. glabrata incubada a 37ºC

ii durante 6 horas en diferentes fuentes de nitrógeno y en inanición por fuente de carbono……….….58-60 Fig. VII-13. Análisis del daño a la célula mediante diferentes concentraciones de compuestos que inhiben la pared celular a diferentes niveles………...61 Fig. VII-14. Análisis de expresión in vitro de los genes CgYPS de C. glabrata bajo diferentes

condiciones de estrés a la pared

celular………..63-65

iii. ÍNDICE DE TABLAS

iii Tabla II-1. Comparación entre los factores de virulencia de C. albicans y C.

glabrata………...5 Tabla VI-1. Cepas de Candida glabrata utilizadas en este trabajo………..23 Tabla VI-2. Oligonucleótidos usados en el PCR multiplex y RT-PCR………..27 Tabla VI-3. Condiciones de reacción para la amplificación por PCR de cada uno de los genes CgYPS de C. glabrata para el análisis RT-PCR y análisis de diversidad………..……28 Tabla VII-1. Número de aspartil proteasas secretadas (Saps), yapsinas (Yps) y aspartil proteasas vacuolares (PrA) detectadas en Candida spp………..33 Tabla VII-2. Sitios de unión a factores de trascripción detectados en las regiones reguladoras de los genes CgYPS de C. glabrata……….……….…………46 Tabla VII-3. Sitios de unión a factores de trascripción detectados en las regiones reguladoras de los genes SAP1-10 de C. albicans……….47 Tabla VII-4. Genes CgYPS5 que se expresan en cada condición probada en C. glarata preinoculada hasta fase logarítmica (9 h) y cambio diauxico (16 h)………...53 Tabla VII-5. Genes CgYPS que se expresan en cada condición probada en C. glarata preinoculada hasta fase logarítmica (9 h) y estacionaria (16 h)………....57 Tabla VII-6. Genes CgYPS que se expresan en cada condición de estrés a la pared celular de C.glabrata...62

iv

iv. ABREVIATURAS

ASP: Asparagina,

BSA: Albúmina sérica bovina

CgYPS: Genes codificantes de yapsinas de C. glagrata EST: Estacionaria

GLN: Glutamina

GLU: Glutamina (MINA) LC: Localización celular LOG: Logarítmica

MM: Masa Molecular

(NH4)2SO4 S/G: (NH4)2SO4 sin glucose NG: Presencia de N-glicosilaciones PEP: Peptona

PEP4: Gen codificante de la aspartil proteasa vacuolar PEP S/G: Peptona sin glucosa

PI: Punto isoeléctrico

PrA: Aspartil proteasa vacuolar PRO: Prolina

PS: Péptido señal

Sap: Aspartil proteasas secretadas

SAP: Gen codificante de aspartil proteasas secretadas S/N: Sin nitrógeno

Yps: Yapsinas (Aspartil proteasas secretadas)

YPS: Gen codificante de yapsinas (Aspartil proteasas secretadas)

v. RESUMEN

v

v. RESUMEN

El género Candida ha sido dividido en dos clados: el clado CTG, que incluye levaduras en las que CTG codifica para serina en lugar de leucina (C.

albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis y C. lusitaniae); el clado WGD abarca levaduras que han sufrido una duplicación de su genoma (Saccharomyces spp. Kluyveromices spp. y C. glabrata). C. albicans es la especie que se aísla con mayor frecuencia de infecciones humanasseguida de C. glabrata que esta filogenéticamente más relacionada a la levadura no patógena S.

cerevisiae.

Recientemente, los genomas de varias especies patógenas del género Candida han sido liberados. En este trabajo se detectaron los genes codificantes de apartil proteasas presentes en el genoma de estas especies y se realizó un análisis in silico para determinar el arreglo de motif, localización celular, péptido señal, glicosilaciones, sintenia, localización en el genoma, filogenia, análisis de sintenia, etc. Estos análisis permitieron clasificar a las aspartil proteasas en tres superfamilias, aspartil proteasas vacuolares (PrA), aspartil proteasas secretadas (Sap) y aspartil proteasas unidas a un sitio GPI (Yps). Cada superfamilia de aspartil proteasas alberga varios miembros, excepto para PEP4 que fue observada como un gen unicopia en todas las especies estudiadas. No se detectaron genes SAP en el clado WGD, sin embargo, un total de 12 genes CgYPS fueron detectados en el genoma de C. glabrata. Probablemente, la familia genética de genes CgYPS de C. glabrata evolucionaron como factores de virulencia en la transición comensal-patógeno oportunista, con una expansión equivalente a la familia de genes SAP de C. albicans.

El análisis de la secuencia promotora de cada gen CgYPS de C. glabrata reveló una frecuencia y distribución particular de cada sitio putativo de unión a un factor determinado. El análisis de expresión de los genes CgYPS de C. glabrata bajo diferentes fuentes de nitrógeno, inanición por fuente de carbono y nitrógeno y estrés a la pared celular, se estimó mediante RT-PCR. Estos análisis revelan una expresión diferencial de los genes CgYPS de C. glabrata. La expresión transcripcional de los genes CgYPS sugieren un papel en la degradación de proteínas y péptidos para la obtención de fuente de nitrógeno y carbono, en la autofagia, recambio proteico, maduracin de otras proteínas así como en la síntesis y mantenimiento de la pared celular.

vi

vi. ABSTRACT

The genus Candida has been divided in: the CTG clade includes yeast that encodes CTG as serine instead of leucine (C. albicans, C. dubliniensis, C. tropi- calis, C. parapsilosis and C. lusitaniae); and the WGD clade includes yeast that has undergone genome duplication (Saccharomyces spp., Kluyveromices spp. and C. glabrata). C. albicans is the most frequently isolated species from human infections followed by C. glabrata which is more phylogenetically related to non- pathogenic yeast Saccharomyces cerevisiae.

Recently, the genomic sequence of several pathogenic species of Candida species has been liberated. In this work, the encoding genes of aspartic proteases were detected in the genome of the Candida species and in silico analyses were realized to determine the motif arrangement, cell location, signal peptide, glycosilation, phylogeny, sinteny, genome location, etc. These analyses classified the aspartic proteases in tree superfamilies: vacuolar aspartic proteases (PrA), secreted aspartic proteases (Sap) and aspartic proteases anchored to GPI site (Yps). Each aspartil protease superfamilly harbored several members, except for PEP4 that was observed as a unicopy gen in all studied species. No SAP genes were detected WGD clade,,nevertheless a total of 12 CgYPS genes were detected in the C. glabrata genome. Probably, C. glabrata CgYPS gene family evolved as virulence factors in the comensal-opportunistic pathogen transition, in an equivalent expansion of C. albicans SAP gene family

The promoter sequence analysis of each CgYPS of C. glabrata revealed a particular frequency and distribution of putative transcription factors. The expression analyses of CgYPS C. glabrata genes under different nitrogen source, carbon or nitrogen source inanition and cell wall stress was estimated by RT-PCR assays. These analyses allowed the recognition of differential expression of CgYPS genes of C. glabrata. The transcriptional expression of these CgYPS genes suggest roles in degradation of proteins and peptides to get nitrogen or carbon sources, in autophagy, protein turnover, maturation of other proteins, and the synthesis and maintenance of the cell wall.

I. INTRODUCCIÓN

Página 1

I. INTRODUCCIÒN

I. 1. El género Candida

El género Candida comprende un grupo de levaduras de origen polifilético cuya principal característica era la ausencia de un ciclo sexual. Existen más de 150 especies de Candida, pero sólo nueve provocan candidiasis en el ser humano y en animales. Dentro de estas tenemos a C. albicans, C. guillermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. keyfir, C. lusitaniae, C. glabrata y C. dubliniensis.

La especie que se aísla con mayor frecuencia es C. albicans seguida de C.

tropicalis y C. glabrata, dependiendo del sitio de aislamiento y del tipo de padecimiento.

Recientemente en varios países del mundo se ha reportado un cambio en la epidemiología de las infecciones causadas por Candida, dichos cambios se caracterizan por un aumento progresivo del género con una predominancia de C.

albicans, seguida de especies de Candida no Candida albicans (CNCA) (Méan et al., 2008; Pfaller y Diekema, 2007; Almirante et al., 2005; Manzano-Gayosso et al., 2000).

I. 2. Candida glabrata

C. glabrata es una levadura haploide oportunista que ha sufrido una evolución reductiva ya que ha perdido varios de los genes involucrados con la asimilación de carbohidratos (sacarosa y galactosa), genes del metabolismo de nitrógeno, azufre y fosfato, así como genes de la biosíntesis de las vitaminas tiamina, piridoxina y ácido nicotínico (Byrne y Wolfe, 2005; Wolfe, 2006).

I. INTRODUCCIÓN

Página 2 A pesar de que C. glabrata se encuentra filogenéticamente más relacionada a Saccharomyces cerevisiae (una levadura no patógena) que a las otras especies patógenas del género (Diezman et al., 2004; Fitzpatrick et al., 2006; Scannell et al., 2007) (Fig. I-1), actualmente del 15 al 20% de infecciones sistémicas son causadas por esta especie (Almirante et al., 2005; Manzano-Gayosso et al., 2000;

Trick et al., 2002; Mean et al., 2008). Se aísla principalmente de pacientes con cáncer y de pacientes que han sido trasplantados y tratados con fluconazol como profilaxis antifúngica (Safdar et al., 2001; Bodey et al., 2002). La mortalidad asociada con C. glabrata en infecciones sistémicas es de alrededor del 50% en pacientes con cáncer y del casi 100% en pacientes trasplantados (Anaissie et al., 1992; Goodman et al., 1992; Krcmery et al., 1998). Estas cifras se explican principalmente por el uso indiscriminado de antifúngicos y por la resistencia innata de C. glabrata a diversos azoles (Sobel, 2006). En México se ha reportado que el 12% de las vulvovaginitis y el 13.4% de las infecciones sistémicas por Candida se deben a C. glabrata (Buitrón et al., 2002; Manzano-Gayosso et al., 2000).

Página 3 Fig. I-1. Relación filogenética entre 42 genomas de hongos secuenciados. El árbol fue reconstruido por máxima verosimilitud usando secuencias concatenadas de 153 genes que están universalmente presentes en los 42 genomas mostrados. Los porcentajes de bootstrap se muestran para todos los nodos. Los principales clados formados son nombrados incluyendo el complejo de S. cerevisiae, el grupo que comparte una duplicación de su genoma completa (whole- genome duplication, WGD), el grupo genético de especies que comparten variaciones en el código genético (CTG) (Scannell et al., 2007).

I. 3. Mecanismos de patogenicidad

I. INTRODUCCIÓN

Página 4 A pesar de la importancia de esta levadura como patógeno oportunista, el conocimiento sobre la patogénesis y los mecanismos de defensa por parte del hospedero contra esta levadura es limitado y se ha establecido que son muy diferentes a los determinados en C. albicans. En el 2007, Li et al., describieron de manera comparativa las diferencias que existen entre los factores de virulencia de ambas levaduras (Tabla II-1).

I. 3. 1. Adherencia

Se ha demostrado que C. glabrata presenta menor adherencia a células epiteliales gingivales que C. albicans y C. tropicalis (Biasoli et al., 2002), esto tal vez se deba a que C. glabrata no forma hifas, las cuales son indispensables en la adherencia de C. tropicalis. Por otro lado, C. glabrata cuenta con una familia de 20 adhesinas epiteliales, codificadas por los genes subteloméricos EPA, que le confieren la capacidad de adherencia, ya que se ha visto que mutantes en EPA1 disminuyen su adherencia a células epiteliales HEp2 de manera considerable (Cormack et al., 1999; Castaño et al., 2006). La expresión de estos genes está controlada por una regulación negativa llamada silenciamiento subtelomérico que depende de la estructura de la cromatina. C. albicans, C. dubiliensis y C. tropicalis también poseen varias proteínas de pared celular que promueven la adherencia a la célula a estas proteínas se les ha denominado ALS (adhesinas) (Hoyer et al., 2001).

Además, comparado con C. albicans, C. glabrata demuestra poseer cuatro veces más hidrofobicidad en su superficie celular lo cual aumenta al doble la tendencia a adherirse a superficies como la dentadura y superficies acrílicas (Luo y Samaranayake, 2002).

Página 5 Tabla II-1. Comparación entre los factores de virulencia de C. albicans y C.

glabrata (Modificada de Li et al., 2006).

Factor C. glabrata C. albicans Referencia

Sitio de infección Oral, vaginal, sangre y tracto

urinario

Oral, vaginal, sangre y tracto

urinario

Fidel et al., 1999

Mortalidad en infecciones sistémicas

Alta Alta Abi-Said et al., 1997;

Krcmery, 1999 Virulencia en modelos

animales

Baja Alta Arendrup et al., 2002

Adherencia a queratinocitos orales

Baja Alta Nikawa et al., 1995;

Biasoli et al., 2002 Adherencia a material dental Alta Baja Luo y Samaranayake, 2002

Presencia de genes SAP Ausente Presente Kaur et al., 2005;

Kantarcioglu y Yucel, 2002 Actividad de proteasas

extracelulares

Baja Alta Chakrabarti et al., 1991

Actividad de fosfolopasa Baja Alta Samaranayake et al., 1994

“Switching” fenotípico Presente Presente Brockert et al., 2003 Filamentación Pseudohifa en

respuesta a limitación por N

Hifa verdadera y pseudohifa

Lachke et al., 2002; Csank y Haynes, 2000 Inducción de IL-8 en

queratinocitos orales

Débil Fuerte Schaller et al., 2002

Inducción de GM-CSF en queratinocitos orales

Fuerte Débil Schaller et al., 2002; Li et al., 2007

Resistencia s la -defensina humana

Parcialmente resistente

Susceptible Joly et al., 2004; Feng et al., 2005

Resistencia a histatinas Alta Baja Helmerhorst et al., 2005

Resistencia a azoles Alta Baja Sanglard et al., 1999

Moléculas de adherencia 20 genes EPA Proteínas ALS Castaño et al., 2005; Hoyer et al., 2001

Número de genes YAP 11 2 Albrecht et al., 2006; Kaur

et al., 2007 Formación de biopeliculas Forma Forma Castaño et al., 2006

I. INTRODUCCIÓN

Página 6 I. 3. 2. Switching fenotípico y filamentación

Otro de los factores de virulencia claramente descritos en C. albicans es la capacidad para modificar su morfología macro y microscópica. C. albicans es capaz de producir colonias de diferentes formas así como sufrir cambios dimórficos bajo condiciones ambientales en las que se induce la formación de hifas y tubos germinales. C. glabrata forma pseudohifas en respuesta a limitaciones por fuente de nitrógeno (Csank y Haynes, 2000) (Fig. II-1A) y se observa en colonias de diferente color en cajas que contienen sulfato de cobre (Lachke, et al., 2002) (Fig. II-1B), sin embargo, no se ha demostrado que este cambio morfológico tenga un papel importante en la virulencia o si son importantes para la adaptación rápida de C. glabrata a diferentes ambientes de estrés en el hospedero, como se ha sugerido.

Fig. I-2. “Switching” fenotípico y filamentación de C. glabrata. A) C. glabrata ATCC2001 exhibe un crecimiento de psudohifas en respuesta a la inanición por fuente de nitrógeno. a) C. glabrata ATCC2001 incubada a 37ºC por dos semanas en medio de Lee solido; b y c) Colonias crecidas en medio solido con inanición por fuente de nitrógeno (SLAD); d) cadenas de pseudohifas de C.

glabrata observadas en el perímetro de las colonias mostradas en b y c. B) Fenotipos de morfología colonial de C. glabrata observados en cajas con CuSO4.

A)

B)

Página 7 I. 3. 3. Interacción hospedero-patógeno

Existen pocos datos acerca de la interacción o de la respuesta del hospedero hacia C. glabrata. Se ha demostrado in vitro que el epitelio oral y vaginal tienen la habilidad de inhibir el crecimiento de C. albicans (Steele et al., 1999, 2000, 2001; Barousse et al., 2001). Un fenómeno similar ha sido observado en C. glabrata (Steele et al., 2000). Tanto cultivos primarios de epitelio oral, como líneas celulares derivadas de mucosa oral, inhibieron el crecimiento de C. glabrata por arriba del 67.9 %. Sin embargo, el mecanismo que emplea la célula para inhibir el crecimiento de la levadura es aún desconocido. Así mismo, se han estudiado la inducción de expresión de citocinas en mucosa oral en epitelio humano reconstituido en un modelo in vitro y a diferencia de C. albicans, que parece inducir varias citocinas proinflamatorias, quimiocinas (IL-1, IL-8), el factor de necrosis tumoral y el factor estimulante de colonias de granulocitos (GM-CSF), C. glabrata únicamente aumenta la expresión del GM-CSF (Schaller et al., 2002).

Por otro lado, recientemente se analizó la interacción de C. glabrata con macrófagos mediante un modelo de cultivo tisular y se demostró que levaduras ingeridas por macrófagos presentan cambios globales en el metabolismo y aumento en la expresión de algunos genes codificantes de aspartil proteasas extracelulares unidas a glicosilfosfatidil inositol GPI (Kaur y col., 2007).

I. 3. 4. Producción de enzimas extracelulares

Diversas especies fúngicas secretan proteasas cuando crecen en un medio que contiene proteínas como única fuente de nitrógeno (Togni et al., 1991; Hube et al., 1994). Las proteasas secretadas por hongos patógenos son aspartil proteasas de la familia de la pepsina (A1), serín proteasas de la subfamilia de las subtilisinas (S8A) y metaloproteasas de dos familias diferentes (M35 y M36). La

I. INTRODUCCIÓN

Página 8 producción, secreción, o expresión de enzimas, es considerada como un importante factor de virulencia del género Candida. Dentro de estas enzimas encontramos fosfolipasas, lipasas y aspartilproteasas (Pichová, 2001; Gilfillan y col., 1998; Naglik y col., 2003b).

Las fosfolipasas son enzimas que hidrolizan uno o más ésteres en los glicerolfosfolípidos. En C. albicans se ha descrito la presencia de 4 fosfolipasas secretadas: la fosfolipasa A, B, C y D (Barrett-Bee et al., 1985: Banno et al., 1985;

Pugh y Cawson, 1977; Cole et al., 1990; Ibrahim et al., 1995). En el caso de C.

glabrata la producción de este tipo de enzimas no se ha comprobado contundentemente ya que, aislados de candidosis oral y de candidosis vulvovaginal son incapaces de producir o secretar fosfolipasas (Samaranayake et al., 1984; Kantarcioglu y Yucel, 2002). Por otro lado, en infecciones mucosas, 41%

de los aislados de C. glabrata obtenidos de infecciones sanguíneas son capaces de producir fosfolipasas (Ghannoum, 2000). Sin embargo, los niveles de actividad de fosfolipasas (fosfolipasa B y lisofosfolipasa) son mayores en cepas aisladas de candidemia persistente que aquellas no persistentes y fueron más elevados en C.

glabrata que en otras especies del genero Candida (Ghannoum, 2000).

En cuanto a las aspartil proteasas, también denominadas proteasas ácidas por tener su actividad óptima en pH ácidos, se caracterizan por la presencia de un péptido señal en el extremo amino, al menos un residuo aspártico en el sitio activo y cuatro cisteínas que ayudan al establecimiento de la estructura tridimensional de la proteína (Hube y Naglik 2001). De acuerdo con su localización celular, las aspartil proteasas pueden ser clasificadas en vacuolares, secretadas (Saps) y ancladas a la membrana mediante un sitio glicosil fosfatidil inositol (GPI) en su extremo carboxilo terminal (YPS) (Krysan et al., 2005; Albercht et al., 2006).

Se ha descrito la presencia de aspartil proteasas en levaduras, hongos patógenos y no patógenos, entre estos se encuentran Aspergillus oryzae (Kunihira

Página 9 et al., 2002), Rhizopus sp., Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, S. cerevisiae y en algunas especies del género Candida (Cawley et al., 2003; Naglik et al., 2003a).

II. ANTECEDENTES

Página 10

II. ANTECEDENTES

II. 1. Aspartil proteasas vacuolares

En S. cerevisiae se ha descrito la presencia de una aspartil proteasa vacuolar a la que se le ha denominado PrA y es codificada por el gen PEP4 (Jones, 1991). Dicha proteína es de suma importancia ya que su actividad proteolítica aumenta en condiciones de estrés nutricional, en inanición (Rupp y Wolf, 1995), y en condiciones diversas como cambios de presión y pH (Hemmings et al., 1981). Incluso, se ha descrito que la ausencia de PrA podría derivar en la muerte celular en condiciones de inanición por fuente de nitrógeno (Stevens et al., 1982). También se ha visto su importancia en su auto-activación y en la maduración de otras hidrolasas vacuolares como la proteinasa B y la carboxipeptidasa Y (Jones, 1991). Así mismo, mutantes en PrA tienen disminuida la capacidad hidrolítica de la vacuola (Palmer 2007) debido al acúmulo de pre- proteínas inactivas en la misma (Rupp y Wolf 1995).

Mutantes deficientes en la CaPEP4 de C. albicans no presentan un fenotipo claro ya que la capacidad hidrolítica de la vacuola no se vio afectada lo que sugiere que el sistema proteolítico vacuolar de C. albicans es muy diferente al de S. cerevisae y probablemente la primera, posee un sistema proteolítico alternativo compensatorio de la deficiencia de Pep4 (Palmer, 2007). Por otro lado, utilizando microarreglos, se analizó la respuesta genómica al estrés ambiental de C. glabrata y se observó que el gen CgPEP4 de C. glabrata se induce en condiciones de estrés osmótico y de inanición por glucosa, este fenómeno es distinto a lo que ocurre en S. cerevisiae ya que en dicha levadura ocurre lo contrario en estrés osmótico y al parecer, cuando la levadura crece en un medio carente de glucosa como fuente de carbono no hay aumento ni disminución en la expresión (Gash et al., 2000; Roetzer et al., 2008).

I I . A N T E C E D E N T E S

Página 11

II. 2. Aspartil proteasas secretadas (Saps)

Las aspartil proteasas secretadas son sintetizadas como preproenzimas que siguen la ruta de secreción y por lo tanto en el extremo amino sufren un procesamiento por una peptidasa señal en el retículo endoplásmico, un segundo procesamiento por una subtilisina del tipo KEX2 en el aparato de Golgi y posteriormente son transportadas por vesículas a la superficie celular para posteriormente ser secretadas (Hube y Naglik, 2001).

Se ha detectado la presencia de Saps en varias especies del género Candida, 8 en C. dubliniensis (Loaiza-Loeza et al., 2007; 2009), 3 en C.

parapsilosis, 1 en C. lusitaniae (Pichova et al., 2001) y 4 en C. tropicalis (Monod et al., 1994; Togni et al., 1991; Zaugg et al., 2001). Sin embargo, el papel que desempeñan las Saps en la fisiología celular ha sido estudiado principalmente en C. albicans, y muy poco en las otras especies. Así mismo, la relación evolutiva que guardan las Saps de todas las especies, no ha sido estudiada.

El genoma de C. albicans alberga 10 aspartil proteasas secretadas (Sap1- 10) y se consideran como un importante factor de patogenicidad (Naglik et al., 2003a). Su producción es altamente regulada, son importantes en la degradación de proteínas como fuente de nitrógeno y están estrechamente relacionadas con otros factores de virulencia como la formación de hifas, la adherencia, cambios fenotípicos, evasión de la respuesta inmune del hospedero mediante la degradación de inmunoglobulinas y proteínas del complemento, el establecimiento de la infección, etc. (Staib, 1965; Chaffin et al., 1998; Hube, 1998; Naglik et al., 2003a, 2004, 2008). Diversos estudios demuestran que todas las aspartil proteasas de C. albicans pueden expresarse in vitro y presentan un patrón de expresión diferencial dependiendo de la condición ambiental en la que se encuentre la levadura (Schaller et al., 1998; 2003; Taylor et al., 2005; Naglik et al.,

Página 12 2008). Se ha visto que Sap1-8 están relacionadas con la hidrólisis de proteínas y el daño tisular (Taylor et al., 2005). La expresión de los genes SAP1-SAP3 está regulada de manera diferencial durante el cambio fenotípico ya que las isoenzimas codificadas por estos genes se expresan en la fase opaca de la levadura y no se expresan en la fase blanca cuando se utilizan levaduras WO-1 (Morrow et al., 1992; White et al., 1993). Utilizando epitelio humano reconstituido (RHE), oral y vaginal, se demostró que los genes SAP1-3 se expresan en la etapa de colonización epitelial y posteriormente durante el daño tisular cuando la infección es evidente, esto indica que las proteínas Sap1-Sap3 tienen un papel en el establecimiento de infecciones superficiales (Schaller et al., 1998; 2003; Copping et al., 2005). Sap1, Sap3 y Sap8 se expresan más comúnmente en infecciones orales que en vaginales (Naglik et al., 2003b).

Las proteasas Sap4-Sap6 se relacionan principalmente con infecciones sistémicas (Hube et al., 1997; Sanglard et al., 1997) y los genes SAP4-SAP6 se expresan únicamente durante la transición levadura-tubo germinativo en un pH de 5 a 7. Al igual que la Sap2, las Sap4-Sap6 son estables a pH neutro, esta diferencia en el pH óptimo de las isoenzimas puede ser esencial para la levadura cuando infecta mucosa vaginal (pH ácido) o la cavidad oral (pH neutro). Otros estudios indican que el principal gen SAP trascrito durante la formación de tubo germinativo a pH neutro es SAP6 (White y Agabian 1995). Al parecer, del grupo Sap4-6, sólo Sap5 es requerida para facilitar la colonización, la penetración e infección de la mucosa por C. albicans (Naglik et al., 2008; Lermann y Morschhäuser, 2008). La expresión del gen SAP8 se induce fuertemente a 30ºC sugiriendo que este gen puede expresarse preferentemente durante infecciones superficiales y es expresado en forma eficiente a temperaturas fisiológicas tanto en infecciones humanas (Naglik et al., 2003b) como animales (Ripeau et al., 2002).

I I . A N T E C E D E N T E S

Página 13 II. 3. Aspartil proteasas ancladas a la membrana por un sitio GPI

(Yapsinas)

Existe controversia acerca de la clasificación de Sap9 y Sap10 de C.

albicans ya que diversos autores establecen que estas proteínas son aspartil proteasas secretadas (Naglik et al., 2003a), pero otros autores las describen como yapsinas (YPS) ya que son aspartil proteasas que presentan un sitio glicosil fosfatidil inositol (GPI) de anclaje a membrana por lo que no se secretan (Alberch et al., 2006; Monod et al., 1998). Estas últimas características estructurales son compartidas con las yapsinas Yps1-Yps4, Yps6 y Yps7 (aspartil proteasas) de S.

cerevisiae. La Sap9 se encuentra anclada a la membrana celular principalmente y la Sap10 se encuentra anclada tanto a la membrana como a la pared celular (Albercht et al., 2006). La función de estas proteasas, al igual que en S. cerevisiae, parece estar asociada con la integridad de la pared celular y la división celular, mientras que en C. albicans son esenciales en la patogenicidad cuando la levadura está en contacto con tejido epitelial (Krysan et al., 2005; Alberch y col, 2006).

En C. glabrata, también se ha reportado la presencia de yapsinas. En el 2004, Weig y col. realizaron un análisis in silico de los genes codificantes para proteínas putativas GPI de C. glabrata, este análisis reveló la existencia de 106 proteínas putativas GPI, de estas, nueve proteínas fueron aspartil proteasas que parecen sufrir una modificación GPI, lo que implica que estas proteínas se encuentran ancladas a la membrana y no se secretan extracelularmente. Hasta el momento, únicamente existe una publicación acerca del papel que pueden desempeñar las Yps de C. glabrata. En dicho trabajo, se detectaron 11 CgYPS (Fig. I-1) y se analizó la interacción de C. glabrata con macrófagos mediante un modelo de cultivo tisular (Kaur et al., 2007). También se estudió el perfil de trascripción de estos genes en levaduras ingeridas por macrófagos lo que reveló

Página 14 cambios globales en el metabolismo y un aumento de la expresión de los 11 genes (Fig. II-1). Esta familia de genes se requiere para la integridad de la pared celular, la adherencia a células de mamíferos y la supervivencia y virulencia en macrófagos. Algunas mutantes nulas en algunos de los genes codificantes de aspartil proteasas de C. glabrata disminuyen su capacidad de sobrevivencia en macrófagos y de causar daño a ratones. Además, se demostró que juegan un importante papel en el procesamiento de otras proteínas como Epa1, una adhesina de la pared celular, (Kaur et al., 2007).

E

M A

YPScg2 YPScg3 YPScg11

YPScg7

YPScg4 YPScg5 YPScg6 YPScg8 YPScg9 YPScg10

YPScg1

Fig. II-1. Representación esquemática de la localización de los CgYPS en el genoma de C.

glabrata. Las letras en mayúsculas hacen referencia al cromosoma en el que se encuentran los genes CgYPS.

Por otro lado, en nuestro grupo de trabajo se determinó si las yapsinas de C. glabrata se expresan durante la interacción entre las levaduras y las células epiteliales (HeLa) del hospedero. Los diversos genes CgYPS mostraron una expresión diferencial durante la infección del cultivo celular. Así, CgYPS1, CgYPS2, CgYPS4, CgYPS5, CgYPS8, CgYPS9 y CgYPS11 aumentaron su expresión en presencia de las células HeLa. Sin embargo, CgYPS2, CgYPS5, CgYPS9 y CgYPS11 mostraron expresión significativa tanto en las levaduras no adheridas como en las adheridas. Esto podría indicar que las células epiteliales,

I I . A N T E C E D E N T E S

Página 15 no necesariamente a través de un contacto directo o adherencia, juegan un papel en la inducción de la expresión de estos genes. Por otra parte, los genes CgYPS1, CgYPS4, y CgYPS8 pudieron asociarse al proceso de adherencia ya sea por la degradación o interacción con moléculas de la superficie celular de las células epiteliales, o bien madurando sus propias proteínas o precursores que participan en la interacción levadura-células HeLa. Los genes CgYPS3, CgYPS6 y CgYPS10 se expresaron en células adheridas, no adheridas y medio MEM (Minimun Essential Medium), esto sugiere que su expresión puede ser dependiente de alguno de los componentes del medio de cultivo y/o la temperatura. CgYPS7 y CgYPS12 no se expresaron en ninguna de las condiciones probadas por lo que podrían ser más importantes en otro tipo de procesos celulares como la síntesis y mantenimiento de la pared celular (Moreno-Mendoza 2009; Parra-Ortega et. al., 2009b).

II. 4. Relación evolutiva y funcional entre las aspartil proteasas

El hecho de que en C. glabrata no existen aspartil proteasas secretadas y que C. albicans posee una familia 8, y que, de manera contraria, C. albicans posee únicamente 2 Yps y C. glabrata 11 miembros de esta familia, sugiere una diversificación evolutiva paralela, pero independiente de ambas familias de aspartil proteasas. Las diferencias y semejanzas observadas actualmente en estas familias de proteasas, el papel que desempeñan, la manera en cómo influyen en los mecanismos de infección y cómo sobreviven dentro del huésped y en ambientes hostiles de estos dos grupos de levaduras, que se adaptaron a la vida como comensales y patógenos oportunistas de manera independiente, son un tema muy interesante.

Estudios recientes demostraron, mediante la construcción de mutantes nulas, que las yapsinas de S. cerevisiae son requeridas para la integridad de la

Página 16 pared celular y parecen ser importantes en la homeostasis de las glucanas, principalmente la YPS1 y la YPS7. La única mutante que no parece tener relación con la pared celular o con la función de otras yapsinas fue la mutante yps3 (yps3) (Krysan et. al., 2005).

Se ha visto que SAP9 de C. albicans y la CgYPS1 de C. glabrata, pueden complementar los defectos en la pared celular causados por la mutante yps1 de S. cerevisiae. Una diferencia importante entre el gen SAP9 y CgYPS1 es que SAP9 complementa la mutante yps1 solamente cuando se expresa bajo el promotor heterólogo constitutivo, mientras que CgYPS1 complementa la mutación bajo su propio promotor (Krysan et al., 2005). Al igual que YPS1, la expresión de SAP9 aumenta durante la fase estacionaria y en respuesta a la perturbación de la pared celular (Monod et al., 1998; Copping et al., 2005). Además, se ha visto que Sap9 y Yps1p confieren resistencia a la caspofungina, un inhibidor de la síntesis de 1,3glucanas (Lesage et al., 2004). Por otro lado, la especificidad de Yps1p y Sap9 es similar, ya que se ha demostrado que inhibidores de Yps1p impiden la actividad de Sap9 (Cawley et al., 2003).

Existen algunos trabajos que describen únicamente la relación filogenética entre las Saps de las especies patógenas del género Candida (Monod et al., 1998;

Hoyer et al., 2001; Zaug et al., 2001). Sin embargo, no se ha realizado un análisis filogenético que relacione cada tipo de aspartil proteasas entre todas las especies patógenas del género (Saps y Yps) que establezca si existe un ancestro común entre los dos tipos de aspartil proteasas y defina los posibles eventos evolutivos que han llevado a la gran diversidad funcional y numérica de las aspartil proteasas del género Candida. Determinar cuáles son las líneas evolutivas que existen entre estos dos tipos de proteínas y cuales son algunos de los eventos moleculares que han determinado dicha evolución, ayudará a entender por qué existe una familia proteica tan diversa en número y función entre las diferentes especies.

III. JUSTIFICACIÓN

III. JUSTIFICACIÓN

Las aspartil proteasas de Candida albicans, son importantes en la fisiología celular de la levadura ya que además de contribuir con el mantenimiento del pH, procesamiento y maduración proteica, procesos de autofagia y recambio proteico, mantenimiento y síntesis de la pared celular; se han descrito como importantes factores de patogenicidad y como posibles blancos moleculares para el diseño de antifúngicos. A pesar de la evidencia, la información del papel de este tipo de proteínas en las otras especies patógenas del género es escasa y en algunos casos no se ha estudiado.

Recientemente, los genomas de algunas de las especies patógenas del género han sido liberados, esto ofrece una gama de oportunidades para el análisis de las aspartil proteasas. Con el fin de aportar información sobre la distribución, evolución, función y regulación de los genes codificantes de aspartil proteasas, creemos que es importante analizar las secuencias codificantes y promotoras de dichos genes en todas las especies patógenas del género. Por otro lado, ya que C. glabrata es la segunda especie que se aísla con mayor frecuencia a partir de infecciones, creemos que es importante determinar los niveles de expresión de las aspartil proteasas de C. glabrata bajo diferentes condiciones ambientales y nutricionales.

IV. OBJETIVOS

IV. OBJETIVOS

IV. 1. Objetivo general

Estudiar la diversidad y evolución de las aspartil proteasas de especies patógenas del género Candida así como la expresión de los genes CgYPS (codificantes de aspartil proteasas) de C. glabrata, bajo diversas condiciones ambientales y nutricionales.

IV. 2. Objetivos particulares

• Localizar los posibles genes codificantes de aspartil proteasas en el genoma de las especies patógenas del género Candida mediante análisis bioinformático basado en BLAST, en la predicción de Motifs, localización subcelular, análisis de sintenia, aproximación filogenética y propiedades bioquímicas.

• Reconocer, comparar y analizar los principales sitios de unión a factores de trascripción en las regiones promotoras de los diferentes genes SAP de C.

albicans y CgYPS de C. glabrata detectados.

• Explorar la distribución y filogenia de la familia de los genes CgYPS localizados en el genoma de C. glabrata y en una población de cepas aisladas de casos clínicos.

• Determinar los niveles de expresión de los genes CgYPS mediante RT- PCR semicuantitativo bajo diferentes condiciones de crecimiento y nutricionales.

V. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO

V. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO

Mediante análisis in silico, determinar las características bioquímicas de las

aspartil proteasas de especies patógenas del género Candida

Análisis de la diversidad de las aspartil proteasas de C.

glabrata en una colección de aislados clínicos mediante

PCR multiplex Análisis de expresión mediante RT-PCR de

las aspartil proteasas de C. glabrata en diferentes condiciones ambientales (fuentes

de nitrógeno; inanición por fuente de N o C;

en diferentes tiempos y a partir de cultivos de transición pre incubados diferentes tiempos y bajo estrés a la pared celular

Reconstrucción filogenética Búsqueda de genes codificantes de aspartil proteasas en el genoma de Candida albicans, C. dubliniensis, C. guilliermondii, C. tropicalis,

C. parapsilosis y C. glabrata

Análisis de secuencias promotoras de las aspartil proteasas de C. albicans y

C. glabrata

VI. MATERIAL Y MÉTODOS

VI. MATERIAL Y MÉTODOS

VI. 1. Cepas utilizadas

Se trabajó con 52 cepas diferentes de Candida glabrata de aislados clínicos obtenidos en México (Hospital Civil de Guadalajara) e identificadas por morfología colonial y microscópica, con el sistema API ID 32C y por RAPD (Bautista y col., 2003). Se utilizó como testigo negativo la cepa tipo: C. albicans ATCC10231 y dos cepas tipo de C. glabrata CBS138 y BG6 donadas por el doctor Bernard Dujon (Institut Pasteur and Université Pierre et Marie Curie) (Tabla VI-1).

Para los análisis de expresión se utilizó la cepa tipo de C. glabrata CBS138, esta cepa fue la utilizada en el proyecto de secuenciación del genoma (http://www.genolevures.org/cagl.html#).

VI. 1. 1. Conservación de cepas

Las cepas de levaduras se cultivaron a 37ºC en agar YPD (Dextrosa, Extracto de Levadura y Peptona), se conservaron a mediano plazo a 4ºC en agua desionizada estéril, y a mediano y largo plazo a -20ºC y -70ºC en glicerol al 25%.

VI. 2. Medios de cultivo

Medio selectivo para Candida (Nickerson): Extracto de levadura, 1 g/l;

glicocola, 10 g/l; dextrosa, 10 g/l; indicador de sulfito de bismuto, 7 g/l; agar, 15 g/l a un pH final de 7.2. No requiere ser esterilizado.

Medio rico YPD: Extracto de levadura, 1%; peptona de gelatina, 2%;

dextrosa, 2%. pH final de 6.7. En medio sólido, agar bacteriológico, 1.5 %. Se esterilizó en autoclave a 120°C durante 15 min.

Medio rico YPD adicionado de 2 concentraciones distintas de diferentes compuestos que inducen estrés a la pared celular: Calcofluor

V I . M A T E R I A L Y M É T O D O S

Blanco (CB), a 250 y 500 g/mL; Rojo Congo (RC), 1 y 2 mg/mL; Cafeina (K), 7 y 14 mM; Acetato de caspofungina (Cas), 250 y 500 ng/mL; Zimoliasa, 100 y 200

g/mL.

Medios mínimos YNB: Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y sin sulfato de amonio, 0.17%; dextrosa, 2%. El medio se suplementó con diferentes fuentes de nitrógeno: glutamina, asparagina, glutamato y (NH4)2SO4, 0.5%; prolina y peptona, 2%; albúmina sérica bovina (BSA), 0.2%.

Medio YNB con peptona de gelatina, sin fuente de carbono: Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, sin sulfato de amonio y sin dextrosa al 0.17%. El medio se suplementó con peptona al 2% como fuente de carbono y nitrógeno.

Medio YNB sin fuente de nitrógeno: Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y sin sulfato de amoniocon dextrosa al 2%.

VI. 3. Identificación in silico de los genes codificantes de aspartil proteasas en el genoma de las especies patógenas del género Candida

Para detectar los genes putativos codificantes de asparil proteasas (SAPS, YPS y PEP4) en el genoma de especies CNCA se realizaron las siguientes estrategias:

a) Utilizando las secuencias reportadas para los genes SAP1-10 de C.

albicans, SAPT1-4 de C. tropicalis, SAPD1-4 de C. dubliniensis, SAPP1-3 de C.

parapsilosis y los genes YPS de S. cerevisiae, reportados en la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se realizaron análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) contra el genoma de cada especie: S. cerevisiae, C.

glabrata y C. albicans se obtuvieron de las base de datos de cada genoma (http://www.yeastgenome.org), (http://cbi.labri.fr/Genolevures/elt/CAGL), y

(http://www.candidagenome.org), respectivamente. Las secuencias de C.

dubliniensis se obtuvieron del grupo de secuenciación de microorganismos del Instituto Sanger (http://www.sanger.ac.uk/sequencing/Candida/dubliniensis/). Las secuencias de C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. tropicalis y C. parapsilosis se obtuvieron de la base de datos del género Candida (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/candida_group/MultiHome.htmL).

b) Se realizó una búsqueda exhaustiva de los genes codificantes para aspartil proteasas utilizando directamente el buscador de la página de cada uno de los genomas secuenciados.

c) Con las secuencias obtenidas se realizaron nuevamente análisis BLAST (blastp, blastn, blastx y tblastn).

d) Se efectuaron análisis blastp y tblastn utilizando las posibles combinaciones de la secuencia motif típicas de aspartil proteasas: [LIVMFGAC]

[LIVMTADN] [LIVFSA] D [ST] G–[STAV] [STAPDENQ] {GQ} [LIVMFSTNC] {EGK}

[LIVMFGTA], en donde: – separa los diferentes aa a lo largo de la secuencia, [ ] representa a los aa permitidos en esa posición, { } corresponde a todos los aa permitidos en esa posición excepto el indicado. Cabe aclarar que esta es la firma reportada por la base de datos de Prosite. La base de datos de Softberry varía en las posiciones marcadas con el símbolo { } en los que, de acuerdo con esta base de datos, cualquier aminoácido está permitido.

e) Con el fin de comparar las diferencias que existen entre las secuencias promotoras de los genes codificantes de aspartil proteasas de C. glabrata y de C.

albicans, se realizó la búsqueda de las secuencias promotoras de cada gen utilizando la base de datos de los genomas de cada levadura.

Tabla VI-1. Cepas de Candida glabrata utilizadas en este trabajo.

V I . M A T E R I A L Y M É T O D O S

Clave Sexo Edad (años)

Origen Geográfico

Localización Corporal

Tipo de Padecimiento CGL1 F 30 Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL2 D.F. Vagina Cervicovaginitis

CGL3 F Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL4 Guanajuato Orina Diabetes

CGL5 F D.F. Vagina Cervicovaginitis

CGL6 F D.F. Vagina Cervicovaginitis

CGL7 F D.F. Vagina Cervicovaginitis

CGL8 F D.F. Vagina Cervicovaginitis

CGL9 F D.F. Vagina Cervicovaginitis

CGL10 F D.F. Vagina Cervicovaginitis

CGL11 M 72 D.F. Boca Carcinoma mandíbula

CGL12 F 36 Jalisco-D.F Boca VIH

CGL13 F 36 Jalisco-D.F. Expectoración Asintomático CGL14 F 29 Jalisco-D.F. Vagina Asintomático CGL15 F 32 Jalisco-D.F. Vagina Asintomático CGL16 F 37 Jalisco-D.F. Vagina Asintomático CGL17 F 23 Jalisco-D.F. Vagina Asintomático

CGL18 M 27 Jalisco-D.F. Orina Trasplante

CGL19 F Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL20 F Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL24 F Guanajuato Vagina cervicovaginitis

CGL25 F Guanajuato Vagina cervicovaginitis

CGL26 F Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL27 Guanajuato Orina Diabetes

CGL28 F Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL29 F Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL30 Alemania

CGL31 USA

CGL32 USA

CGL33 M 3 D.F. Faringe Infección respiratoria

CGL34 Alemania

CGL36 USA

CGL37 F 14 Guanajuato Vagina Cervicovaginitis crónica CGL38 M 7 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL39 45 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL40 28 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL41 65 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL42 F 45 Nuevo León Vagina Cervicovaginitis CGL43 57 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL44 62 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL45 55 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL46 38 Nuevo León Expectoración Infección respiratoria CGL47

CGL48 F 67 D.F. Boca Carcinoma orofaringe

CGL49 M 54 D.F Boca Carcinoma encía

CGL50 M 54 D.F. Boca Carcinoma encía

CGL51 M 63 D.F. Boca Carcinoma laringe

CGL52 Guanajuato Vagina Cervicovaginitis

CGL53 CGL54 CGL57 CGL58 BG6 CBS138

VI. 4. Análisis bioinformático de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de las aspartil proteasas detectadas

Las características moleculares que se buscaron fueron los siguientes:

a) La búsqueda de ORF, secuencias reverso complementaria, mapa de restricción, la traducción para obtener la secuencia predicha de aminoácidos de cada uno de los genes, fue realizado empleando el software DNAMAN versión 3.0 (Lynnon Biosoft, Vandreuil, Quebec, Canadá. 1994-1997).

b) Utilizando la base de datos del genoma, cuando fue posible, se determinó la localización cromosómica, la longitud del gen y el análisis de sintenia.

c) La determinación del punto isoeléctrico, tamaño molecular, predicción de regiones trasmembranales, se realizó con el programa Antheprot 2000 versión 5.2.

d) La predicción de “motif” CDD (secuencias de aminoácidos específicas dentro de una proteína) fue determinada con la base de datos Prosite, disponible en el servidor http://www.expasy.org y la base de datos de Softberry disponible en la página http://www.softberry.com. Este es un método para determinar la función de proteínas no caracterizadas y traducidas desde secuencias genómicas o de cDNA. Prosite, consta de una base de datos de secuencias de aminoácidos biológicamente significativas y patrones perfectamente formulados, de manera que con las herramientas computacionales apropiadas se pueda identificar a cuál de las familias de proteínas conocidas pertenece una proteína nueva de función desconocida (Falquet et al., 2002). Además, se realizó la búsqueda de modificaciones GPI utilizando los programas en línea big-PI predictor (http://mendel.imp.univie.ac.at/gpi/gpi_server.html) y GPI-SOM (http://gpi.unibe.ch/).