Cultivo in Vitro de Anthurium Andreanum

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(1)Cultivo in vitro Anthurium andreanum. CULTIVO in vitro de Anthurium andreanum. MONOGRAFIA. PRESENTADO POR:. JUAN MANUEL SALGADO MEJÍA CODIGO: 9865300. DIRECTOR. JAIME NIÑO OSORIO. GRUPO DE INVESTIGACION BIOTECNOLOGÍA PRODUCTOS NATURALES. UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA JULIO 11 DE 2007 i.

(2) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. “Dedico esta monografía a todas las mujeres de mi tierra que como las de mi familia han luchado por educar a sus hijos y nietos dejando a un lado sus propios sueños, enriqueciendo cada vez más nuestra formación. Han hecho de mi vida un paraíso sin igual.” A todas ellas… Gracias desde lo más profundo de mi corazón.. ii.

(3) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. TABLA DE CONTENIDO. LISTA DE TABLAS ................................................................................................... ivi LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vii INTRODUCCION......................................................................................................... 1 JUSTIFICACION ......................................................................................................... 3 OBJETIVOS ................................................................................................................. 5 OBJETIVO GENERAL .....................................................................................5 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................5 MARCO REFERENCIAL ............................................................................................ 6 CAPITULO I. DESCRIPCION ................................................................................... 7 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 3. 4.. Clasificacion taxonómica ....................................................................7 Morfológia ..........................................................................................9 Arales .................................................................................................9 Araceae ..............................................................................................9 Aroideas ...........................................................................................10 Anthurium .........................................................................................11 Anthurium andreanum ......................................................................12 Marcadores quimiotaxonómicos .......................................................14 Distribución geográfica .....................................................................17. CAPITULO II. CULTIVO in vitro Anthurium andreanum ..................................... 19 5. 6. 7. 8. 9. 9.1. 9.2. 10. 10.1. 10.2. 10.3. 10.4.. Reseña histórica ..............................................................................19 Generalidades ..................................................................................19 Material vegetal ................................................................................23 Explantes .........................................................................................24 Regeneración directa .......................................................................25 Cultivo de esquejes ..........................................................................26 Cultivo de embriones zigóticos.........................................................26 Regeneración indirecta ....................................................................27 Cultivo de callos ...........................................................................28 Cultivo de yemas ..........................................................................32 Cultivo de embriones somáticos ...................................................32 Cultivo de tejidos transformados ..................................................35. iii.

(4) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. CAPITULO III. ASEPSIA Y ESTERILIZACIÓN .................................................... 36 11. Tipos de microorganismos a combatir .............................................38 11.1. Microorganismos endógenos .......................................................39 11.2. Gusanos microscópicos exógenos ...............................................40 CAPITULO IV. MEDIOS DE CULTIVO .................................................................. 42 12. 13. 14. 15. 15.1. 15.2. 15.3. 15.4. 15.5. 15.6.. Medio Murashige & Skoog (MS) ......................................................44 Medio Nitsch & Nitsch (NN)..............................................................44 Regulación del crecimiento ..............................................................46 Condiciones de cultivo .....................................................................47 Fotoperiodo ..................................................................................48 Temperatura .................................................................................49 Subcultivo .....................................................................................50 Establecimiento en campo ...........................................................50 Cuidados post-cosecha ................................................................50 Conservación de la calidad de la flor ............................................51. PROYECTO DE NEGOCIO..................................................................................... 53 CAPITULO V. CONSIDERACIONES..................................................................... 54 16. 17. 18. 18.1. 18.2. 18.3. 18.4. 19. 19.1.. Importancia de la especie ................................................................54 Antecedentes ...................................................................................55 Industria mundial ..............................................................................55 Países productores.......................................................................55 Oferta ...........................................................................................56 Demanda ......................................................................................56 Calidad .........................................................................................56 Requisitos para entrar a competir ....................................................57 Saber Como .................................................................................57. CAPITULO VI. METODOLOGÍA ............................................................................. 61 20.. Desarrollo del cultivo in vitro. ...........................................................61. CAPITULO VII. PROTOCOLOS DEL LABORATORIO. ..................................... 65 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 68 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 69 BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 70 ANEXOS. 75. iv.

(5) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Anexo 1. Propiedades medicinales importantes de la familia araceae..........76 Anexo 2. Aspectos botánicos de la familia araceae .......................................78 Anexo 3. Medio de cultivo MS (1962) .............................................................78 Anexo 4. Medio de Cultivo SH (1972) .............. ¡Error! Marcador no definido. Anexo 5. Medio de cultivo NN (1956). ............................................................79 Anexo 6. Medios nutritivos usados en Spirodela polyrhiza. (Appenroth, 2003) .......................................................................................................................79 Anexo 7. Medio para la inducción de yemas de Anthurium desde explantes de raíz por Chen et al., (1997).............................................................................80 Anexo 8. Coloraciones presentadas por las diferentes variedades de Anthurium andreanum en cultivos Holandeses (Reinert, 1977) .....................80 Anexo 9. Componentes solucion micronutrientes MS (mg/ 200mL) .............80 Anexo 10. Componentes solucion de vitaminas MS (mg/200mL) ..................80 Anexo 11. Componentes solucion de Fe-EDTA MS (mg/200mL) ..................80 Anexo 12. Materiales ......................................................................................81 Anexo 13. Reactivos .....................................................................................82. v.

(6) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. LISTA DE TABLAS Tabla 1. Cultivo tradicional de Anthurium. ................................................... 19 Tabla 2. Origen de los explantes y respuesta obtenida en el cultivo in vitro. 24 Tabla 3. Tipos de Regeneración directa e indirecta desde diferentes tipos de explantes. ................................................................................. 25 Tabla 4. Efecto del tipo de explante y genotipo de Anthurium andreanum sobre la formación de callos en medio ½MS suplementado con TDZ y 0.5 mg/L de BA después de 8 semanas de cultivo (TeChato et al., 2006) ......................................................................... 30 Tabla 5. Agentes esterilizantes más comunes............................................. 37 Tabla 6. Resultados y parámetros importantes en la obtención de tejidos vegetales in vitro en Anthurium andreanum .................................. 45 Tabla 7. Efecto del medio de cultivo sobre la formación de callos a partir de explantes de hojas y segmentos nodales de Anthurium.. ....... 46 Tabla 8. Reguladores de crecimiento empleados en el cultivo in vitro de Anthurium. ..................................................................................... 47 Tabla 9. Resultados del tratamiento con BA (Paull, 2000) .......................... 51 Tabla 10. Concentración más rentable para alargar el tiempo de vida de los Anthurium en la flor de corte significativamente. .......................... 52 Tabla 11. Composición de la solución nutriente (mmol/L) ............................. 62. vi.

(7) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representación en forma de pirámide de la clasificación taxonómica de Anthurium andreanum. ............................................ 8 Figura 2. Inflorescencia Anthurium acutibacca (A) (Mora et al., 2003); Espádices típicos del género en el caso de Dracontium (B) (Roger y Barabe, 2001); inflorescencia de Anthurium obtusilobum (C) (Mora et al., 2003). .............................................. 10 Figura 3. Planta completa de Anthurium andreanum..................................... 12 Figura 4.Diferentes órganos de Anthurium andreanum: hoja -A-, espádice B- y flor completa -C- respectivamente. ......................................... 13 Figura 5. Flavonoides de la familia Araceae. ................................................. 15 Figura. 6. Estructura del pinellosido 1 [1-O-β-D-glucopiranosil(2S,3R,4E,11E) - 2 - (20R - hydroxyhexadecenoilamino) - 4,11octadecadiene-1,3-diol]. ................................................................ 15. Figura 7. Sitosterol (Sustancia CCS-1) presente en las hojas de Culcasia scandens P. Beauv ........................................................................ 15 Figura 8. Saponina triterpénica Henderagenina aislada de Homalomena occulta (Lour.) Schott. .................................................................... 16 Figura 9. 13-Feniltridecanoato de metilo aislado de T. flagelliforme .............. 16 Figura. 10. Diagrama de los procesos in vitro organizados y desorganizados. ............................................................................ 20. Figura 11. Esquema de un proceso in vitro mixto o medianamente organizado.. ................................................................................... 22 Figura 12. Diagrama de Regeneración directa (organogénesis) (Reinert, 1977 y Pierik, 1990). ...................................................................... 26 Figura 13. Diagrama de regeneración indirecta.. ........................................... 28 Figura 14. Inducción de callos sobre explantes de hojas luego de los tratamientos de irradiación............................................................. 29 Figura 15. Callos formados en los explantes de hoja de cada uno de los fenotipos luego de 8 semanas de cultivo en medio ½MS suplementado con TDZ y BA. ........................................................ 30 vii.

(8) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Figura 16. Callos formados desde el nodo de la variedad Sonat empleando el medio ½MS y WPM con TDZ y BA después de 6 semanas de cultivo. (Te-Chato et al., 2006). ...................................................... 31 Figura 17. Posición de los callos formados sobre un explante de hoja sano (A) y otro en el que se realizaron heridas (B) en la variedad de Anthurium Valantino luego de 6-7 semanas de cultivo(Te-Chato et al., 2006). ................................................................................... 31 Figura 18. Embriones irradiados después de dos meses de cultivo. Brotes formados después de la irradiación (Puchooa, 2003). ................... 34 Figura 19. Principales fuentes de infección. .................................................. 36 Figura 20. Imagen de una planta atacada por nematodos. ........................... 41 Figura 21. Desarrollo de las raíces cuando intentan evadir la presencia del nematodo (1). Fotomicrografía de un nematodo (2); las letras A, B y C representan la cabeza y el estileto, la válvula o apertura para poner los huevos y la cola respectivamente. Fotomicrogafía de un huevo de Nematodo (3). ............................. 41 Figura 22. Cambio progresivo en el tamaño del recipiente de cultivo Anthurium durante el establecimiento ex vitro ............................... 48 Figura 23. Planos de un laboratorio de micropropagación a gran escala. .... 59 Figura 24. Esquema para la propagación de plantas usado en los laboratorios Twyford Ltda (Reinert, 1977). .................................... 61 Figura 25. Esquema de posibles rutas in vitro a seguir para la obtención de plántulas completas de Anthurium andreanum (Dufour, 2005). ..... 63 Figura 26. Preparación general de un litro de medio de cultivo (MS) (Niño., 2003). ............................................................................................ 65 Figura 27. Solución de macronutrientes medio MS (1962). STOCK 1 ........... 66 Figura 28. Solución micronutrientes medio MS (1962). STOCK 2 ................. 66 Figura 29. Solución vitaminas MS (1962). STOCK 3 ..................................... 67 Figura 30. Solucion de Fe-EDTA medio MS (1962). STOCK 4 ..................... 67. viii.

(9) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. INTRODUCCION. El Anthurium andreanum es una angiosperma (Hesse, 2006) clasificada dentro de las monocotiledóneas (Appenroth, 2003), igualmente perteneciente a la familia Araceae (Te Chato et al., 2006). Los hábitat vegetativos de esta familia son muy variados, encontrándose especies epifitas, litófitas e hidrófilas (Stergios and Dorr, 2004; Álvarez et al., 2006; Nie et al., 2006). Los integrantes del género Anthurium presentan una filotaxis muy característica, tanto en hojas, inflorescencias así como raíces y tallos (Roger y Barabe, 2001). Sus hojas son acorazonadas (Álvarez, 2006) y mantiene el patrón del sistema vascular típico del género, raíces aéreas (Williams et al., 1980) y tallos herbáceos (Álvarez, 2006). Algunas especies como el Anthurium andreanum presentan una flor muy particular que esta constituida por un espádice y una espata. El primero corresponde a la inflorescencia, con forma de bastón y compuesta por 300 flores verdaderas diminutas; mientras que la segunda corresponde a una hoja modificada o desdiferenciada. La espata presenta coloraciones vistosas, superficial brillantes y con un tiempo de vida muy razonable con respecto a otras especies (García, 1992; Roger y Barabe, 2001). Las anteriores cualidades hacen que la especie tenga una demanda mundial muy pronunciada y haga de ella uno de los principales productos agrícolas en determinadas naciones (Adelheid et al., 1992; Pérez, 1997). Holanda, Venezuela, Jamaica, Estados Unidos, Las Islas Mauricio, son algunos ejemplos de países productores de Anthurium andreanum. Su principal uso se centra en la parte ornamental (García, 1992). Integrantes de la familia e incluso del mismo género han presentado actividad biológica notable (Okoli, 2004). Enfermedades como el cáncer (Choo et al., 2005; Manpreet et al., 2006; Kaur et al., 2006) y respuestas fisiológicas como la inflamación (Chen et al., 2003), muestran unas de las tantas aplicaciones que tienen los diferentes tipos de extractos vegetales. Adicionalmente existen especies empleadas en actividades artesanales (Plowden et al., 2003). Los sistemas de producción no varían de los convencionales, es decir, manejan las mismas variables climáticas y genéticas, donde la diferencia la hace el tipo de tecnología empleada para el desarrollo de la producción vegetal. Los países con menores recursos económicos y tecnológicos, 1.

(10) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. recurren a las técnicas de cultivo manual en campo también denominado in situ (Reinert, 1977). Los más desarrollados tecnológicamente, realizan una mezcla de producción de invernadero para obtener clones, híbridos, mutantes; en fin, especímenes con valor agregado (Puchooa, 2003). De esta manera pueden controlar los diferentes factores biológicos, logrando el crecimiento y desarrollo de especies vegetales (Teixeira, 2005). Estos factores están constituidos por variables físicas como la luz, humedad, altura sobre el nivel del mar (Pierik, 1990; Pataky, 2001; Buldewo, 2002) y variables químicas como los nutrientes y los reguladores (Adelheid et al., 1992; Vargas et al., 2004). Además se presentan necesidades biológicas de la planta que el cultivador tiene que manejar, como la reproducción y conservación de la especie. De esta manera aparece el cultivo in vitro de tejidos vegetales como una tecnología en cuanto al desarrollo científico e investigativo, encaminado al conocimiento del reino vegetal (Reinert, 1977). La manipulación de los factores climáticos y recursos genéticos permiten, mejorar cuidadosamente las especies o modificarlas de tal manera que puedan suplir nuestras necesidades (Barz et al., 1976). La contaminación microbiana se convierte en la principal falla del sistema (Reinert, 1977). Cualquier microorganismo desplazará el tejido apoderándose del medio (Roca, 1993; Norman, 1994; Uchida et al., 2003). Otro motivo de fracaso es la ausencia de totipotencia del tejido vegetal escogido para sembrar. La totipotencia es una de los requisitos de esta técnica y se define como la capacidad que presentan los organismos vegetales para tener disponible la información genética necesaria para desarrollar otro individuo de las mismas características y su mejor representación es el fenómeno de génesis denominado embriogénesis somática. Cada célula somática, es decir, que no tiene ninguna relación con las reproductoras, esta en la capacidad de convertirse en una plántula completa (Adelhied, 1992; Pérez, 1998). El presente documento pretende referenciar y combinar en lo más posible los diferentes eventos relacionados con la técnica del cultivo de tejidos vegetales, haciendo hincapié en el establecimiento de un protocolo de producción de forma teórica. Asimismo se tabula y reseña información muy valiosa sobre experiencias en el cultivo de esta especie y sobre el comportamiento de la familia.. 2.

(11) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. JUSTIFICACION. El conocimiento de las plantas y su funcionamiento, adquiere cada vez mayor importancia. En último término, la supervivencia del género humano depende, y probablemente dependerá siempre, de la abundancia de los vegetales. Las plantas constituyen el único medio de cual disponen los organismos vivos. Para estudiar las plantas se emplean métodos experimentales tan precisos como los usados en la física; a fin de comprender las interrelaciones que son la esencia de su vida, hay que enfocarse en un nivel y de una manera característica de las ciencias biológicas (Barceló et al., 1984). La diversidad en los hábitos de los vegetales hace difícil el empleo sistemas de clasificación basados en características morfológicas y anatómicas (Williams et al., 1980); además, existe evidencia con soporte farmacológico acerca de la potente actividad antiinflamatoria en algunas de estas plantas medicinales estimulando el desarrollo de nuevas investigaciones sobre sus extractos vegetales. Se ignora la naturaleza química de los núcleos activos de las sustancias químicas desconocidas las cuales son responsables de la actividad biológica que presentan los perfiles de los extractos de hoja u otros tejidos vegetales (Okoli, 2004). Un ejemplo son las lectinas. Su aplicación más importante tiene que ver con las investigaciones en cáncer. La actividad antiinsecticida de muchas lectinas vegetales ha sido documentada en ensayos in vitro y estudios con plantas transgénicas. Esto puede ser de gran potencial económico en el control de plagas debido a que las lectinas son producto del metabolismo primario, sus genes son buenos candidatos para conferir resistencia a los insectos en alimentos transgénicos (Manpreet et al., 2006). Además, el cultivo de tejidos se ha incrementado de una manera importante como una herramienta para la propagación masiva de vegetales, la recuperación de plantas libres de enfermedades específicas y la producción de híbridos somáticos (Barz et al., 1976). La aplicación de esta técnica está concentrada en los cultivos de Orquídeas, Anthurium andreanum y Anthurium scherzerianum, Lily, Pelargonium, varios tipos de Begonias, Freesia y algunos alimentos producidos de bulbos, tallos subterráneos o tubérculos (Reinert, 1977). El sector privado esta involucrado en un grado muy limitado en la propagación comercial de plantas importantes para el mercado ornamental (tradicional) pero esta mas comprometido en la propagación masiva de tejidos de plántulas de Anthurium (MRC, 2001). Es así como la innovación del sistema de propagación para esta especie puede ser 3.

(12) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. importante para una aplicación comercial (Vargas et al., 2004). La aplicación mas extensa y visible para el cultivo de tejidos vegetales hasta ahora ha sido la propagación clonal rápida. Los cultivadores ornamentales identifican esta práctica como micropropagación o simplemente cultivo de tejidos. El propósito de la propagación clonal es la obtención de plantas con cualidades uniformes y alta calidad. El cultivo de tejidos es más rápido que los procedimientos tradicionales generalmente conocidos. La selección de líneas celulares, la críopreservación, los bancos de germoplasma y la obtención de metabolitos secundarios para la farmacología mediante el cultivo de tejidos vegetales in vitro se ha convertido en uno de los soportes tecnológicos de la ingeniería genética y la biotecnología. En el campo de la investigación aplicada el cultivos in vitro debe convertirse en una alternativa a los métodos tradicionales de propagación y mejoramiento vegetal ya que presentan ventajas en lo que respecta a: ahorro de tiempo, ya que muchos procesos pueden ser acelerados en el laboratorio; economía de espacio y mano de obra, pues se trabaja en áreas pequeñas y relativamente con poco personal dando como resultado una disminución considerable de los costos que implica el trabajar directamente en el campo en condiciones naturales. Los cultivos in vitro que hace unos 20 años era muy complicado montarlos, hoy en día están a nuestro alcance y existe el personal calificado para trabajar en este campo; si a esto se le agrega la gran capacidad de los investigadores, solo resta esperar que las instituciones privadas y oficiales apoyen de manera efectiva a los grupos de trabajo para que se puedan implementar programas que permitan la utilización de nuestros recursos humanos y naturales en beneficio de nuestro país (Pacheco et al., 1987).. 4.

(13) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. OBJETIVOS. OBJETIVO GENERAL. •. Establecer una metodología para la micropropagación in vitro de Anthurium andreanum documentando el estado del arte del cultivo in vitro.. OBJETIVOS ESPECIFICOS. •. Definir una metodología del cultivo in vitro de Anthurium andreanum para su micropropagación a gran escala.. •. Considerar la importancia de los metabolitos secundarios producidos por Anthurium en condiciones de cultivo in vitro.. •. Proyectar una propuesta de negocio sobre la propagación in vitro masiva de Anthurium andreanum.. 5.

(14) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. MARCO REFERENCIAL. 6.

(15) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. CAPITULO I. DESCRIPCION. 1. CLASIFICACION TAXONÓMICA Biota Dominio Eukaryota Reino Plantae Subreino Viridaeplantae Phylum Tracheophyta Subphylum Spermatophytina Infraphylum Angiospermae Clase Liliopsida Subclase Aridae Superorden Aranae Orden Arales Familia Araceae Subfamilia Photoideae Género Anthurium Especie Anthurium andreanum. VARIEDADES: Linden ex André (Adelheid, 1992); Schott (Werbrouck, 1996); Tropical, Avoclaudia, Avonette, Avanti Casino, Lunette, Avoanneke, Limbo, Scorpion, Acrópolis, Fantasia, Cuba, Merengue, Uranus, Paradise, Champion (Murguia, 1996); Alii (Chen, 1997); New Pahoa Red, Marian Seefurth, Tatsata Pink, Kalapana, Oshiro Red, Lavender Lady, Mickey Mouse, Oshiro White, Tropic Mist, Rainbow, Blush Oishi, Kozohara, Blush Bride, Nitta, Ozaki, Red Obake, Bettina (Paull, 2000); Sarah (Landrum,2005); Plew Thien Phuket, Valantino, Sonat (Te Chato et al., 2006). 7.

(16) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. En la figura 1 se puede observar los diferentes niveles desde lo general hasta lo particular) de la clasificación taxonómica de las variedades de Anthurium andreanum.. Eukaryota Plantae Angiospermas Monocotiledoneas Arales Araceae Aroideas, Pothoideae Anthurium Anthurium andreanum Acrópolis Alii Avanti Casino Avoanneke Avoclaudia Avonette Bettina Blush Bride Blush Oishi Champion Cuba Fantasia Kalapana Kozohara Lavender Lady Linden ex André Limbo Lunette Merengue Marian Seefurth Mickey Mouse New Pahoa Red Nitta Oshiro Red Oshiro White Ozaki Paradise Plew Thien Phuket Rainbow Red Obake Sarah Schott Scorpion Sonat Tatsata Pink Tropic Mist Tropical Uranus Valantino. Figura 1. Representación en forma de pirámide de la clasificación taxonómica de Anthurium andreanum. Constituye una propuesta propia de este trabajo para posteriores representaciones.. 8.

(17) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. 2. MORFOLÓGICA. 2.1. Arales. Arales es un orden de plantas angiospermas (Jiři and Herman, 2004; Hesse, 2006; Nie et al., 2006) y monocotiledóneas (Murguía, 1996; Adelheid et al., 1992), que esta comprendido por las familias Araceae y Lemnaceae. El orden incluye finas hierbas, matorrales trepadores (Nie et al., 2006; García, 1992), plantas de pantano como el género Symplocarpus (Nie et al., 2006) y formas acuáticas flotantes como la Spirodela polyrhiza (Appenroth, 2003) y las del género Pistia, muchas de las cuales habitan en el trópico.. 2.2. Araceae. La familia Araceae está constituida por un número cercano a los 115 géneros; Álvarez, (2006) reduce el número a 100, estimando alrededor de 2000 especies, nativas principalmente del trópico americano y el oeste de la India, mientras que Williams et al., (1980) reportaron 110 géneros y el mismo número de especies en la familia. Jiři and Herman, (2004); Hesse, (2006); Nie et al., (2006) la consideran una de las familias más grandes de las angiospermas y aumentan a 3300 el número de especies de hierbas y enredaderas dentro de 105 géneros propuestos. Según la descripción de García, (1992) la familia Araceae comprende un número de plantas trepadoras epífitas caulescentes con rizomas o tubérculos; hojas pecioladas, enteras, lobuladas o partidas; inflorescencias simples o espadiciformes envueltas en la base por lo menos por una espata. Esta familia es reconocida por varias especies silvestres y muchas especies de invernadero y follajes ornamentales. La diversidad de hábitos vegetativos de la familia Araceae hace difícil la clasificación de sus especies mediante sistemas de observación de los caracteres anatómicos y morfológicos (Williams et al., 1980). Según Hesse, (2006), existen posibilidades de clasificación morfológica mediante la observación de la distribución sistemática de los caracteres del polen. La inflorescencia esta constituida por un bastón central adaptado para la polinización empleando como vehículo los insectos. Esta formada por una espiga simple o espádice, uno por cada flor, sobre los cuales se encuentran dispuestas numerosas y diminutas flores. En algunas ocasiones, la estructura 9.

(18) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. completa del espádice se encuentra envuelta por una hoja floral o mejor llamada espata que se extiende por debajo del mismo. Las flores son hermafroditas o por el contrario unisexual, con frecuencia están reducidas a los órganos sexuales. En este último caso las flores femeninas suelen estar en la parte inferior del espádice y las masculinas por encima de ellas. Presentan un ovario usualmente entero con uno o varios lóculos, fruto en forma de baya con una o varias semillas (García, 1992). El fruto puede ser una baya de color brillante (muchas veces encerrada en el espádice), raramente esta seca y asemeja la textura del cuero. Esta se rompe para poner en libertad la semilla. Estas bayas son globulosas y de color amarillo o rojo; con 0.5 cm de longitud y contienen entre una y dos semillas de 0.03 cm y de color rojo (Murguía, 1996).. A. B. C. Figura 2. Inflorescencia Anthurium acutibacca (A) (Mora et al., 2003); Espádices típicos del género en el caso de Dracontium (B) (Roger y Barabe, 2001); inflorescencia de Anthurium obtusilobum (C) (Mora et al., 2003).. 2.3. Aroideas. Las Aroideas son una de las subfamilias mejor conocidas de las que presentan diferencias con respecto al polen de las angiospermas, donde se ha observado un desarrollo poco común de las formas y estructuras (Hesse, 2006). Las subfamilias (Gymnostachydoideae, Orontioideae, Pothoideae, Monsteroideae, Lasioideae, Calloideae así como la nueva subfamilia Zamioculcas y Gonatopus) comparten el síndrome estructural con desarrollo común característico para casi todos los pólenes de angiospermas (Jiři and Herman, 2004; Hesse, 2006). Los estudios morfológicos tradicionales han precisado un vínculo cerrado entre las Aroideas flotantes tales como la Pistia y los patos enlutados (Spirodela polyrhiza) (Rothwell et al., 2004).. 10.

(19) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. 2.4. Anthurium. El género mas grande de la familia Araceae es el Anthurium (600-1000); seguido de Philodendron (275 especies); Arisaema (150 especies), los cuales se creé son polinizados por caracoles; Homalomena (140 especies); Rhaphidophora (100 especies); Amorphophallus (100 especies) [algunas especies producen inflorescencias por encima de 1 m de altura]; Pothos (75 especies); Alocasia (70 especies). Los Anthurium son perennes y por esta razón permanecen vivas durante el invierno (Murguía, 1996; Álvarez, 2006; Buldewo, 2002), presentan una vida productiva de varios años (Murguía, 1996), son herbáceas epífitas (Murguía, 1996; Álvarez, 2006), monocotiledóneas (Murguía, 1996) y de hábitat trepador (Álvarez, 2006). Las especies descritas como plantas de follaje de Anthurium, Dieffenbachia, Philodendron y Syngonium (Buldewo, 2002), Xanthosoma, Spathiphyllum, Epipremnum, Aglaonema (Álvarez, 2006) son cultivadas popularmente en los interiores de las casas, oficinas y jardines alrededor del mundo por su inflorescencia llamativa, larga y duradera (Pataky, 2001; Buldewo, 2002). Los géneros han sido agrupados diferentemente dentro de un número de subfamilias o tribus. En los estudios realizados por Williams et al., (1980), las clasificaciones fueron ordenadas de acuerdo con las modificaciones del sistema clásico de Engler’s, en el cual son reconocidas 8 subfamilias y 31 tribus. Estas especies pueden ser terrestres, acuáticas o epífitas. Algunas de ellas son herbáceas o maderables, con pocas hojas, que en forma de flecha ascienden desde su origen en la raíz. Las trepadoras, se aferran con sus raíces aéreas al tronco de los árboles, mientras que otras tienen soportes verticales y despliegues muy largos en los cuales se encuentran hojas alternadas alrededor del tallo, secas en algunas ocasiones y que son sostenidas temporalmente; con vainas semicoloreadas ubicadas en la base del pecíolo. El género Anthurium es posiblemente uno de los mas complejos en la familia Araceae (Prakash, 2005; Te-Chato et al., 2006). A él pertenecen plantas tropicales americanas y comprende alrededor de unas 600 especies que, según Matsumoto, (1998) asciende a 1000. Prakash, (2005) confirma este último número. Asimismo, Stergios y Dorr, (2004) aumentan el número de especies a 1100; mientras que Álvarez, (2006) considera 1500 especies todas ellas de la familia Araceae; de las cuales mas de 600 tuvieron sus origenes en el trópico americano (Stergios y Dorr, 2004), siendo plantas de follaje muy populares. Es también uno de los géneros más importantes en la horticultura mundial (Vargas et al., 2004), considerados como flores especiales junto con las orquídeas, aves del paraíso y heliconias (Murguía, 1996). 11.

(20) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. 2.5. Anthurium andreanum. Figura 3. Planta completa de Anthurium andreanum por Uchida et al., (2003). El sistema radical se encuentra bastante desarrollado y junto con la flor evidencian el estado adulto de la planta.. Según la descripción morfológica de Murguía, (1996) la raíz es fibrosa y cilíndrica de consistencia carnosa, no se profundiza mucho en la tierra, es blanca y produce varias raíces adventicias. El tallo es monopódico, simple, herbáceo cuando la planta esta joven y semileñoso cuando es adulto, llegando a crecer hasta 1.5 m. Esta planta crece en promedio hasta 60 cm de altura (Álvarez, 2006). Las hojas son grandes y anuales, de 30 cm de longitud por 20 cm de ancho, de pecíolo largo y color verde brillante, ápice agudo y base en forma de cono: el borde es liso, con una disposición alternada en el tallo. De acuerdo con Paull, (2000) las floras tropicales tienen frecuentemente inflorescencias, flores insconspicuas y las brácteas; son pintorescas y de gran colorido haciendo la flor muy atractiva. García, (1992) se refiere a ellas como espadiciformes envueltas en la base por lo menos por una espata. Se describe el Flamingo Lily o Anthurium andreanum, como una especie que crece alrededor de 60 cm de altura, epifito en estado natural (Buldewo, 2002) y que florece todo el año (Murguía, 1996). Tiene un aro constituido por espata de color rojo salmón en forma de corazón de alrededor de 5-8 cm de longitud y un espádice de aproximadamente 9.5 cm de longitud. La espata se considera como una hoja modificada. Sus híbridos producen espatas coloreadas que van desde el blanco, verde, rosado, rojo salmón, rojos y vinotinto (Murguía, 1996; Paull, 2000). Numerosos cultivos presentan esta lujosa vestimenta coloreada de rojo, naranja (Álvarez, 2006), rosado, 12.

(21) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. coral y blanco, que corresponden o se clasifican en tres categorías: estándar (coloreada y en forma de corazón simple), el obaki (bicoloreadas de verde con algún otro color en su mayoría producido por antocianinas) el tipo tulipán (Prakash, 2005). Su textura va de lisa hasta rugosa (Buldewo, 2002). Se dice que los híbridos las producen de colores variables y su tamaño varía entre 5 y 8 cm de longitud. El espádice presenta coloraciones amarillas, blancas, verdes y rojizas, soportando 300 flores verdaderas en cada uno (Buldewo, 2002; Murguía, 1996; Álvarez, 2006). Las flores son unisexuales, con frecuencia están reducidas a los órganos reproductivos. Las flores femeninas verdaderas suelen estar en la parte inferior del espádice y las masculinas por encima de ellas; presentan un ovario usualmente entero con uno o varios lóculos, fruto en forma de baya con una o varias semillas (García, 1992). Tanto las flores machos y hembras florecen a destiempo; en la hembra ocurre primero, seguido después por los machos al día siguiente. Por lo tanto el polen madura el tercer día, es mas efímero y de vida muy corta (Hesse, 2006). Las hojas tienen forma de corazón con una vena o vascularidad central principal y muchas laterales que se encuentran adheridas a los pecíolos largos; subtallos mediante los cuales están adheridas las hojas al tallo (Álvarez, 2006).. A. B. C. Figura 4. Diferentes órganos de Anthurium andreanum: (A) hoja, (B) espádice y (C) flor completa respectivamente.. Murguía, (1996) propone una forma de flecha que ascienden desde su origen en la frontera entre raíz y tallo principal. La planta produce de 3 a 8 hojas por año dependiendo de su nutrición, ambiente y variedad (Murguía, 1996). La secuencia de hoja, flor y nueva hoja, se mantiene a través de toda la vida de la planta, y el intervalo entre cada nacimiento de una nueva hoja se acorta o alarga dependiendo de los cambios en las condiciones ambientales (Murguía, 1996). La identificación de todos estos cultivos ha llegado ha ser el mayor punto de duda de sus similitudes en la morfología de la planta. Debido a esto, los 13.

(22) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. cultivadores han tenido que identificarlos principalmente basándose en el color de la espata, la cual rara vez esta disponible en los estados juveniles del desarrollo de la planta (Prakash, 2005).. 3. Marcadores quimiotaxonómicos. Las investigaciones fitoquímicas basadas en información etnofarmacológica son consideradas generalmente como un enfoque efectivo en el descubrimiento de agentes antiinfecciosos a partir de plantas superiores (Williams et al., 1980). La mayoría son producto del metabolismo secundario; el hecho de que la presencia de estos compuestos químicos sea común en determinadas especies, establece que pertenezcan a la misma filogenia. Meija and Soukup, (2004) consideran los ácidos como posibles marcadores quimiotaxonómicos al estudiar las relaciones filogenéticas mediante la determinación de los ácidos de lípidos presentes en las semillas de varios géneros de la subfamilia Aroidea, los cuales contenían como componente mayoritario (5-16%) acido 13-feniltridecanoico del total de los ácidos de la semilla. Además se considera que más de la mitad de los géneros en la subfamilia contienen ácidos ω-fenilalcanoicos y ω-fenilalquenoicos en los lípidos de sus semillas. Según Choo et al., (2005); el extracto acuoso crudo fue capaz de reducir el crecimiento in vitro de células linfoidales de Typhonium flagelliforme. La planta ha sido recomendada para el uso en terapias contra el cáncer. Asimismo, los tubérculos comestibles propios de los géneros representan una importancia económica; debida a la diversidad de usos dentro de las diferentes culturas de los trópicos y que hasta el momento no se ha estudiado profundamente la constitución química de sus principios activos (Williams et al., 1980). El interés no es solo medicinal; también puede servir con fines quimiotaxonómicos puesto que la presencia de los metabolitos secundarios puede permitir diferenciar o emparentar las diferentes especies de Araceae. Fue así como 8 especies del género Cryptocoryne (trompetas de agua), pertenecientes a la familia Araceae se investigaron fitoquímicamente (Franke et al., 2005). De esta manera, el estudio realizado por William et al., (1981) móstró que los flavonoides C-glucósidos son los constituyentes mas característicos de la familia Araceae. De acuerdo con los resultados, los flavonoides puede ser marcadores quimiotaxonómicos confiables (Franke et al., 2005).. 14.

(23) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. HO OH. OH. OH. O. OH. O HO HO. OMe. HO OH. O. OH. O. OH HO. OH. HOHO. OMe OH. O. OH HO. O. OH. 2’’-O-glucosilvitexina. O. O. O. OH. O. 6’-Sinapoyl-2’’-O-glucosilvitexina. Figura 5. Flavonoides de la familia Araceae.. Entre los fitocompuestos de Pinellia ternata (Thumb) Breit que han sido caracterizados se incluyen alcaloides, aceites volátiles y polisacáridos; que muestran una actividad pronunciada en bioensayos preliminares. Tambien se logró el aislamiento de un nuevo cerebrósido antimicrobiano denominado pinellosido 1 (Chen et al., 2003). O HN. OH O HO HO. O OH. OH. Figura 6. Estructura del pinellosido 1 [1-O-β-D-glucopiranosil- (2S,3R,4E,11E) - 2 - (20R - hydroxyhexadecenoilamino) - 4,11-octadecadiene-1,3-diol] (Chen et al., 2003).. CH3 H3C CH3. CH3 CH3. CH3. HO. Figura 7. Sitosterol (Sustancia CCS-1) presente en las hojas de Culcasia scandens P. Beauv (Okoli, 2004).. Se realizaron estudios mediante TLC de rizomas de Homalomena occulta (Lour.) Schott. Se encontró una saponina que no se había reportado en otros géneros de Aráceas y que por esta razón debería considerársele como un marcador quimiotaxonómico (Elbandy et al., 2004). 15.

(24) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. OH HO. HOOC O. HO. OH. O. O HO. OH. CO. O. HOOC CH2OH. O. O HO. O. OH. Figura 8. Saponina triterpénica Henderagenina aislada de Homalomena occulta (Lour.) Schott.. Un ejemplo de la variedad de funciones celulares dentro de la familia son los idioblastos cristalinos; células especializadas que acumulan grandes cantidades de calcio en la forma de oxalato de calcio cristalino en especies como Pistia stratiotes (Nakata, 2003). Las especies del género Dieffenbachya son reconocidas por su causticidad (atacan los tejidos orgánicos) y se caracterizan químicamente por la presencia de células numerosas e inusuales (los idioblastos) en las hojas, pecíolos y tallos (Castro et al., 2004). La fracción polar de Typhonium flagelliforme presenta actividad citotóxica baja, el extracto acuoso crudo fue capaz de reducir in vitro el crecimiento de células linfoidales. Aunque el efecto sobre el crecimiento celular fue bajo, la planta ha sido recomendada para el uso en terapias contra el cáncer. Entre los compuestos identificados se encuentra el 13-feniltridecanoato de metilo (Choo et al., 2001). COOCH3. Figura 9. 13-Feniltridecanoato de metilo aislado de T. flagelliforme. Así mismo, los frutos de malva de los miembros de la familia Araceae pueden tener antocianinas tales como cianidina y perlagonidina-3-rutinosido que se presentan en la espata de especies como el Anthurium andreanum, posiblemente empleada por la planta como coloración atractiva con el fin de lograr la dispersión de sus semillas (Williams et al., 1980). El mecanismo de acción de estos pigmentos es evidente en la espata y espádice de los miembros de la familia; induciendo la visita de polinizadores, principalmente moscas (Williams et al., 1980; Murguía, 1996) y escarabajos (Williams et al., 1980); esencialmente por los olores nauseabundos producidos por la inflorescencia que los atrapa por unos instantes hasta que logran escapar y 16.

(25) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. contribuyen a la polinización de otras plantas (Williams et al., 1980; Murguía, 1996). El pigmento presenta una coloración roja hasta el púrpura oscuro también en el pecíolo de las hojas de muchas especies y eventualmente, en la epidermis de la hoja. La selección natural logró entrar al canal de comunicación visual y emitir mensajes debido a las antocianinas de tipo cianidina presentes en la espata (Williams et al., 1980). Los estudios realizados por Alencar et al., (2005); Bainz et al., (2005) y Manpreet et al., (2006), describen otro tipo de marcador quimiotaxonómico denominado lectinas, las cuales son capaces de inducir la proliferación in vitro de linfocitos con la producción de interferón y oxido nítrico in vivo e in vitro e inducción de la apoptosis. Las lectinas están ampliamente distribuidas en la naturaleza (los 3 reinos) sirviendo como mediador en una variedad de eventos con importancia biológica reconocida. De hecho deben ser una pieza clave como referencia para la clasificación debido a que su relación filogenética con los demás organismos vivos debe ser muy antigua. Su empleo más importante se debe al potencial anticancerígeno que posee (ver anexo 1). 4. Distribución geográfica. Las especies de esta familia presentan gran variedad de hábitos vegetativos, en especial las de latitudes altas, las cuales son hierbas no maderables con tubérculos o rizomas bajo tierra, mientras que en el trópico y subtrópicos la familia esta representada en algunas ocasiones por especies trepadoras y epífitas, mientras que las especies epifitas, litofitas y acuáticas también pueden estar presentes (Williams et al., 1980; Buldewo, 2002; Reid, 2004; Vargas et al., 2004; Castro et al., 2004; Alvarez, 2006). El eje de diversidad o hábitat nativo incluye áreas muy elevadas de América central, Colombia, Venezuela, Ecuador en especial en la zona Norte de los Andes (Álvarez, 2006; Stergios y Dorr, 2004) y Perú. Las temperaturas bajas hacen que estas especies estén ampliamente distribuidas, especialmente en los hábitat húmedos (Álvarez, 2006). Muy pocas taxas se encuentran en zonas templadas. Symplocarpus, Lysichiton y Orontium son 3 de los géneros de Araceae que se ubican en la zona templada Norte (Nie et al., 2006). Asimismo, Arisarum vulgare (Araceae) es una planta tóxica que se extiende a lo largo de la costa del mediterráneo (Lamkadem et a., 2003). En Venezuela han sido registradas alrededor de 70 especies, es fácil encontrarlas en las cuestas húmedas de los Andes a diferentes elevaciones. Las representaciones del género se incrementan en la montaña y en la zona forestal nublada con respecto a la 17.

(26) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. abundancia y riqueza en especies (Stergios y Dorr, 2004). Inicialmente, Pataky, (2001); Álvarez, (2006), los ubican como nativos del Trópico Ecuatorial Suramericano; considera que fueron transportados por el hombre hasta climas fríos como el de Londres y luego reconquistaron el trópico, esta vez llegando a Hawaii (Murguía, 1996; Álvarez, 2006) y las islas Mauricio que se perfila como el tercer productor de Anthurium del planeta. Así mismo Murguía, (1996) describió algunas variedades Holandesas de Anthurium, demostrando la capacidad de adaptación y variabilidad de estas especies en climas fríos. En el parque Nacional Guaramacal ubicado en los Andes Venezolanos, El Anthurium es el género más abundante con 5 especies colectadas hasta la fecha. La presencia de Anthurium angustatum colectada por Humboldt y Bonpland en la parte superior de la región del Orinoco en la Amazonia Venezolana, no pudo ser confirmada (Stergios y Dorr, 2004). En estado natural, el Anthurium andreanum puede ser encontrado en zonas selváticas de montaña en alturas por encima de los 1000 m según Stergios y Dorr, (2004); alrededor de 2400 m de acuerdo con Buldewo, (2002). Esta es la especie mejor conocida de la familia. Según Álvarez, (2006) fue descubierto por Eduard André en 1870 durante su viaje entre Colombia y Ecuador. Las variedades de Anthurium andreanum nativos de Colombia empleados comercialmente como flores de corte (Murguía, 1996; Pataky, 2001), fueron introducidos en Hawaii procedentes de Londres en 1889. De acuerdo con Murguía, (1996) en las islas se empezaron a cultivar y después de muchas hibridaciones a partir de tonalidades rosa, se obtuvo una amplia gama de colores. Álvarez, (2006) propone que la introducción en Hawaii fue hecha por S.M. Damon, quien en su descripción dijo que tenía una espata con un casquillo color rosado. Las plantas fueron cultivadas en los estados de Damon, Moanalua y desde entonces han sido distribuidas paulatinamente entre los cultivadores mediante propagación vegetativa desde finales de 1930 y comienzos de 1940. Los cultivadores en Hawaii aprendieron como propagar los Anthurium a partir de semillas, generando un incremento en el cultivo y en la variación genética.. 18.

(27) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. CAPITULO II. CULTIVO in vitro Anthurium andreanum. 5. Reseña histórica. Según Pacheco et al., (1987) la técnica de cultivo in vitro de tejidos vegetales se inicio hacia 1939 con los trabajos de Phillip White, Roger Gautheret y Pierre Novecourt quienes lograron mantener viables, por tiempo indefinido algunas estructuras vegetales. Los primeros trabajos se enfocaron a la estandarización de técnicas de aislamiento de tejidos, al estudio de sus procesos fisiológicos y bioquímicos y a la determinación de medios de cultivo artificiales para mantener la viabilidad celular. La propagación mediante cultivo de tejidos en la horticultura comenzó con Morel y Martin’s en 1952, demostrando la eliminación del virus de Dalia empleando el cultivo de brotes de ápice. Según Puchooa, (2003) el método para la producción in vitro de plántulas de Anthurium andreanum fue desarrollado en principio por Pierik et al., (1974).. 6. Generalidades. Las referencias citas son de alguna técnica de cultivo in vitro en las que consideran el empleo de diferentes órganos provenientes de plantas adultas tal como se muestra en la tabla 1. Tabla 1. Cultivo tradicional de Anthurium.. 1 2 3 4 5. Tipo de órgano utilizado Germinación de semilla Segmentos de tallo División de brotes secundarios que aparecen en la base del tallo Segmentos nodulares Esquejes, estolones yemas y vástagos. Referencia Vargas et al., (2004) Te-Chato et al., (2006) Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Adelheid et al., (1992) Pierik, (1990). La industria de los Anthurium mantiene una amenaza latente del suministro continuo que los enfrenta a retos en búsqueda de alta tecnología por medio 19.

(28) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. de estudios sobre reproducción de plantas y cultivos (Puchooa, 2003). Los resultados de las investigaciones los encamina hacia métodos de propagación masiva y subsecuentemente estudios de mercado inteligente. El establecimiento e implementación de procedimientos de micropropagación (Te-Chato et al., 2006) y de nuevas técnicas son necesarias para mejorar las variedades cosechadas (Puchooa, 2003) apartándose de la reproducción vegetal tradicional mediante el uso del cultivo in vitro (Te-Chato et al., 2006). En las figuras 10 y 11 se presentan gráficamente las tres (3) rutas de regeneración de plántulas con respecto a la organización celular y denominadas: organizado, desorganizado y mezcla de ambos (organizado/desorganizado). El cultivo in vitro desorganizado se caracteriza por el fenómeno de desdiferenciación celular que resulta en la formación del callo como representación del desarrollo celular desorganizado.. CULTIVO in vitro. ORGANIZADO. DESORGANIZADO. Explante. Explante. Protocormo. Desdiferenciación Celular. Hojas. Callos. Hojas, rizoides. Raíces Planta idéntica a la descendencia (Planta élite). Agregados celulares Células Estabilidad genética muy baja. Figura 10. Diagrama de los procesos in vitro organizados y desorganizados. Adaptado de Pierik, (1990).. Adelantos biotecnológicos tales como la ingeniería genética y las mutaciones inducidas por irradiación puede llegar a ser parte clave de la investigación, esperando obtener nuevas características en la producción de Anthurium (MRC, 2001); la “reproducción de mutantes”, es por lo tanto prometedora como medio para la creación de variaciones adicionales. Lo que ocurre es que los agentes mutagénicos comúnmente usados, en realidad solamente 20.

(29) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. pueden alterar los genes presentes en el genotipo tratado o sea que modifican los mecanismos de expresión existentes. Esta puede ser una de las grandes ayudas en micropropagación y en un futuro trabajo in vitro de búsqueda para desarrollar variedades resistentes (Puchooa, 2003). Muchos cultivos de Anthurium son propagados asexualmente por medio de clones derivados de híbridos (Matsumoto, 1998). Se emplean mutágenos físicos como radiación ionizante (rayos X, rayos gamma y neutrones) y luz UV, y también una serie de agentes químicos son ejemplos comunes de técnicas de mutagénesis que tienen una alta eficiencia generando mutación en plantas, animales así como en bacterias. Adicionalmente, las consecuencias de estos tratamientos pueden ser predichas con mínima extensión (Puchooa, 2003). Los agentes mutagénicos han sido usados para inducir variaciones genotípicas útiles en las plantas durante 70 años (Pierik, 1990). A partir del nuevo material obtenido, en términos de variedad de cultivos, serán introducidos en la industria, a partir de experimentos para determinar los protocolos mas apropiados de propagación in vitro (MRC, 2001). La mezcla entre cultivo organizado y no organizado, que también puede denominarse mixto, se consigue desde explantes de tejido diferenciados tales como tejidos, órganos e incluso células, los cuales sufren una desdiferenciación celular (característica del cultivo no organizado). Luego de un periodo de acondicionamiento a las condiciones in vitro, se reinicia la expresión genética en cuanto a la formación de órganos como por ejemplo raíces adventicias sobre la superficie de un callo representado en la figura 11. Los procesos que implican una desdiferenciacion celular son mucho más dispendiosos debido a la variación en las condiciones de cultivo (medio de cultivo, regulación, factores físicos, etc.) y el incremento en los pasos intermedios de la propagación. El proceso organizado representado en la figura 10 es óptimo para trabajar con material de vidrio ordinario y en condiciones de propagación con fines comerciales. Los procesos desorganizado y mixto (figura 10 y 11) donde la estabilidad genética es muy baja y la descendencia no es completamente idéntica a las plantas élite, deben manejar protocolos muy bien establecidos y con materiales de alta calidad como el vidrio Pirex para evitar la influencia de factores externos sobre estados vulnerables como la desdiferenciación celular.. 21.

(30) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Raíz. Hoja. Tallo. Semilla. Callo. Callo embriogénico. Callo organogénico. Embrión. Planta completa. Figura 11. Esquema de un proceso in vitro organizado/desorganizado. Adaptado de Pierik, (1990).. 22.

(31) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. La entropía del sistema debe ser controlada mediante la operación de factores externos de una manera muy cuidadosa. Esto es necesario debido a la expresión genética de los tejidos, para reconocer los factores fisicoquímicos que sobre ella actúan y así reproducir los resultados.. 7. Material vegetal. Las plantas aceptadas para la propagación deben ser examinadas en cuanto a infecciones con hongos, bacterias y virus. La carencia de síntomas en algunas plantas no es necesariamente un indicativo de bajos niveles de infección por microorganismos pero puede indicar cierta resistencia a un patógeno infectivo (Reinert, 1977). Además, entre el material vegetal empleado para originar cultivos de tejidos vegetales de Anthurium andreanum se encuentran las plantas élite cultivadas in vitro (Adelhied, 1992; Chen, 1997). En todos los trabajos se ha encontrado que hay una gran variación en los requerimientos de los diferentes genotipos. Los métodos para muchas otras variedades estan siendo trabajadas por establecimientos comerciales pero no están disponibles para uso general (Puchooa, 2003). Ejemplos de esto se pueden referenciar con el trabajo de Geier, (1986) quien concluyó que la edad de la planta élite y el fenotipo influye en la regeneración de la planta de Anthurium andreanum (Vargas et al., 2004). Existe un vástago o retoño tierno y escamoso como el de los espárragos que constituye un órgano especializado denominado turión similar a los zarcillos de la uva (Vitis vinifera) con las cuales la planta se soporta o sostiene a otras estructuras. Puede estar constituido por una serie de hojas modificadas, segmentos de hoja, hojas pequeñas, ápices de hoja o estípulas de hoja; todas provenientes de ramificaciones del tallo. Adelheid et al., (1992) empleo cuatro (4) variedades diferentes obtenidas previamente mediante el cultivo de yemas axilares in situ. El precultivo fue necesario, puesto que sin este paso se observa la formación del turión inducida por el estrés a menudo teniendo resultados irregulares. Dos de las tres colonias de precultivo fueron empleadas como material de inicio para los experimentos (Appenroth, 2003). El incremento frecuente en la edad del cultivo sugiere fuertemente el uso de cultivos jóvenes para propósitos de propagación para obtener florecimientos uniformes y plantas completas (Reinert, 1977).. 23.

(32) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. 8. Explantes. El explante usado generalmente se relaciona de alguna manera con yemas o brotes axilares o terminales (Reinert, 1977). El inoculo podrá consistir de un domo apical además de algún primordio de hoja, o pequeños segmentos de hoja (Reinert, 1977). La micropropagación de Anthurium ha sido llevada a cabo con varios tejidos incluyendo los explantes que se resumen en la tabla 2. Tabla 2. Origen de los explantes y respuesta obtenida en el cultivo in vitro TIPOS DE EXPLANTE Raíz Embriones somáticos primarios Cortes de raíz trasformada con A. tumefaciens transmitiendo el vector binario pCa2Att Semillas maduras completas Semillas germinadas Embriones zigóticos Brotes adventicios Callos. RESULTADO Regeneración de plantas completas Embriones somáticos secundarios Plantas completas resistentes a kanamicina Embriones zigóticos Callos Protoplastos Callos Embriones Regeneración directa Callos organogénicos. Hojas Callos embriogénicos Callos y brotes. REFERENCIA Chen, (1997) Adelhied, (1992) Chen, (1997) Matsumoto, (1998) Vargas et al., (2004) Adelhied, (1997) Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Pierik, (1990) Adelhied et al., (1992) Geier, (1986). La regeneración directa e indirecta depende de la obtención de plántulas desde un órgano sin pasar por el estadio de callo, o por el contrario desdiferenciandose en este tejido de carácter cicatrizal. En la figura 11 están expuestas las diferentes rutas posibles de regeneración indirecta, mientras que la tabla 3 recopila los diferentes tipos de explantes desde los cuales se ha logrado la obtención de plántulas completas. Este tipo de proceso es común con los resultados de diferentes estudios in vitro realizados por un gran número de investigadores alrededor del mundo. Los explantes de hoja son el punto de convergencia de muchos de los investigadores, es decir, con ellos se ha corroborado en mayor número la producción de plántulas completas.. 24.

(33) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Tabla 3. Tipos de Regeneración directa e indirecta desde diferentes tipos de explantes.. Explante Brotes axilares Brotes adventicios Hojas Cultivo de callos embriogénicos desde peciolos Embriones somáticos derivados de cortes de explante de hojas cultivadas in vitro Plántulas cultivadas in vitro Yemas Nudos e internudos Tallos Semillas Espádice Espata Raíz. Referencia Te-Chato et al., (2006) Adelheid et al., (1992) Vargas et al., (2004); Aldelheid, (1992) Musa, (1997); Geier, (1986); Aldelheid, (1992) Te-Chato et al., (2006); Chen, (1997) Puchooa, (2003); Adelheid et al., (1991) Adelheid et al., (1992); Geier, (1986) Musa, (1997) Chen, (1997); Aldelheid, (1992) Te-Chato et al., (2006); Adelheid et al., (1992) Te-Chato et al., (2006) Te-Chato et al., (2006) Chen, (1997) Adelheid et al., (1992) Chen, (1997) Chen, (1997). 9. Regeneración directa. Este tipo de regeneración es muy similar a la propagación vegetativa in vivo, se producen plantas completas o casi completas (embriones, semillas) y su descendencia es idéntica al material vegetal inicial (Pierik, 1990). Aunque es posible un incremento en el rango de plantas con regeneración regular y repetida, es deficiente un entendimiento completo del balance nutricional y hormonal (Reinert, 1977). En la figura 12 se observa de forma general las rutas o secuencia de los procesos para lograr la regeneración directa. Queda claro que se puede incluir la formación del sistema radical y posteriormente la formación de tallos y hojas o viceversa. Excluye cualquier tipo de desdiferenciación celular, es decir, no se observa en ningún momento del proceso la formación de callo. Además, la regeneración es más rápida de esta forma, sobre todo cuando el material es altamente totipotente. 25.

(34) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Explante. Organogénesis. Caulogénesis. Rizogénesis. Planta Completa. Figura 12. Diagrama de Regeneración directa (organogénesis) (Reinert, 1977 y Pierik, 1990).. Fue así como Te Chato et al., (2006) para establecer un sistema de regeneración para Anthurium andreanum cv. Rubrun, germinaron las semillas sobre un medio suplementado con 0.8 mg/L de benciladenina (BA). Después de 2 semanas el 74% de las semillas germinaron y 4 semanas después microcortes de estas fueron subcultivados, sobre un medio que contenía 1.6 mg/L de BA y 0.01 mg/L de ácido naftalenacético (ANA).. 9.1. Cultivo de esquejes. Aunque las técnicas de propagación vegetativa tales como los cortes de tallos y brotes secundarios, los cuales son tediosos y poco prácticos cuando se llevan a cabo a gran escala, se muestra promisorio el empleo de esta técnica in vitro. Los métodos de propagación vegetativa aplicados a estas plantas no muestran buenos resultados y las técnicas de cultivo de tejidos aparecen como una alternativa para incrementar la producción (Vargas et al., 2004).. 9.2. Cultivo de embriones zigóticos. Por medio del estudio realizado por Matsumoto, (1998) se logró la obtención de conocimientos nuevos y detallados de la embriogénesis in vivo; ambos son fundamentales y de aplicación valiosa, especialmente durante el estudio del género Anthurium en más de 100 años. De esta manera las semillas maduras completas originan embriones zigóticos bajo condiciones in vitro. 26.

(35) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Su investigación tomó un camino que condujo a la ilustración de los estadios del desarrollo de Anthurium Scandens ssp con el empleo de un exámen de carencia de citoquininas con el fin de documentar los eventos claves en la maduración del embrión y el endospermo. Fue así como se documentó la mayoría de los eventos anatómicos en el desarrollo del embrión y el endospermo con el seguimiento de la polinización controlada en flores de Anthurium andreanum, usando un examen histoquímico para registrar los cambios fisiológicos durante la génesis, sobre todo para correlacionar la maduración del embrión con la habilidad para producir plantas desde los óvulos o por el cultivo de embriones (Matsumoto, 1998). 10. Regeneración indirecta. La regeneración indirecta tiene como características el crecimiento y desarrollo desorganizado y la posterior formación del callo. La estabilidad genética del cultivo es muy baja debido a que se emplean concentraciones muy altas de auxina y citoquininas para la obtención de la regeneracion indirecta (Pierik, 1990). La regeneración de plántulas de Anthurium andreanum se realiza mediante la formación de callos a partir de brotes adventicios y regeneración directa desde explantes de hoja (Vargas et al., 2004). Las plántulas fueron obtenidas con facilidad desde callos pero la regeneración desde embriones somáticos no pudo ser demostrada (Pierik, 1990). La figura 13 representa 3 rutas a partir de la desdiferenciacion para obtener plántulas mediante regeneración indirecta (recuadros oscuros). Dos de los procesos relacionan embriones somáticos desde fuentes diferentes: células y callos embriogénicos. La última ruta recurre con los procesos de organogénesis núcleo de la figura 12. Este tipo de proceso de regeneración se emplea para la obtención de protoplastos, los cuales son muy importantes en los estudios de transformación genética; transgénesis y mutación genética. Esto implica que la estabilidad genética sea muy baja y se puedan obtener resultados inesperados como nuevas variedades debido a cambios en la expresión genética, de tal manera que los genes que se expresan no son los mismos que en las plantas cultivadas in situ o por regeneración directa.. 27.

(36) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Explante. Desdiferenciacion celular. Callos embriogénicos. Callos. Callos friables. Callos organogénicos. Embriones somáticos. Protocormos, brotes y yemas adventicias, hojas, raíces, esquejes de tallo (En Anthurium). Agregados celulares. Células individuales. Embriones somáticos. Planta completa Protoplastos. Protoplastos. Figura 13. Diagrama de regeneración indirecta (Te-Chato et al., 2006; Chen, 1997; Adelheid et al., 1992).. En las variedades de Anthurium; Iris, Secale y Zingiber, las hojas, fueron usadas como material inicial, y las plantas fueron regeneradas indirectamente por medio de callos embriogénicos (Lin et al., 1997). Adelheid et al., (1992) afirmaron que la obtención de plántulas desde embriones formados en el cultivo de explantes provenientes del espádice (tabla 3) y partiendo de la transformación de callos mediante la inserción del plásmido de Agrobacterium tumefaciens y el de Agrobacterium rhizogenes son dos sistemas de transferencia genética que muestran ser promisorios en el cultivo in vitro para la obtención de plántulas Anthurium andreanum.. 10.1.. Cultivo de callos. Te-Chato et al., (2006) utilizó explantes constituidos por: nudos, tallos, hojas y además de brotes de 2 semanas de edad para la inducción de callos. Después de 8 semanas de cultivo en la oscuridad se formaron callos en cada explante de los tres (3) genotipos de Anthurium spp utilizados (Te-Chato et al., 2006). También se observa formación de callos en los explantes cultivados e irradiados por Puchooa, (2003).. 28.

(37) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Kuehnle, (1991) estableció un sistema de regeneración de hojas y pecíolos de variedades Hawaiianas de Anthurium andreanum mediante cultivo de callos (Vargas et al., 2004).. Figura 14. Inducción de callos sobre explantes de hojas luego de los tratamientos de irradiación con rayos gamma alrededor de toda la superficie de corte (Puchooa, 2003).. La proliferación de callos friable y la regeneración subsiguiente de plántulas en estudios sobre transformación genética y desarrollo de plantas transgénicas abren nuevas perspectivas en este cultivo. La innovación del sistema de propagación para esta especie puede ser importante para una aplicación comercial. Vargas et al., (2004) describieron los resultados preliminares para el establecimiento de un método alternativo para la regeneración de plantas de Anthurium andreanum cv. Rubrun a partir del cultivo de callos organogénicos. Te-Chato et al., (2006) realizaron cortes a manera de laceraciones en los explantes de tallo de tres variedades de Anthurium spp. Los explantes con cortes (heridas) y sin ellos fueron cultivados sobre medio Murashige & Skook (MS) a la mitad de la concentración (½MS) suplementado con 3% de sacarosa, 0.5 mg/L Thidiazuron (TDZ) y 0.5 mg/L de Benciladenina (BA). La formación de callos sobre los explantes con y sin laceraciones fue registrada y analizada estadísticamente. Entre todas las variedades estudiadas, Valantino tuvo la mas alta inducción de callos (83.73%) con diferencias significativas frente la variedad Sonat (78.67%) y la Plew Thien Phuket (45.60%); aunque el porcentaje es bajo tal vez pueda considerarse como una opcion. Las diferencias se pueden deber al metabolismo de la planta el cual afecta la división celular y diferenciación. También se ha reportado que el genotipo afecta la formación de callos en Anthurium (NMC, 2003). El tipo de callo obtenido de cada variedad también fue diferente en el estudio. Los callos de la variedad Sonat fueron de color amarillo claro mostrando estructuras embriogénicas mientras que las otras dos variedades produjeron callos meristemáticos nodulares (Te-Chato et al., 2006).. 29.

(38) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. Laceraciones sobre las hojas promueven la formación de callos en un 58.86%, mientras que en las no laceradas fue del 44.03%. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas (Te-Chato et al., 2006). En la figura 15 se muestran 3 detalles de los callos inducidos con TDZ y BA. Las figuras 15, 16 y 17 representan ejemplos de los resultados obtenidos mediante la aplicación del proceso de regeneración indirecta donde es fundamental la formación de callos. Existen evidencias y antecedentes claros de los fenómenos de diferenciación y desdiferenciación celular. Incluso se presentan características organogénicas en algunos de ellos. Tabla 4. Efecto del tipo de explante y genotipo de Anthurium andreanum sobre la formación de callos en medio MS a la mitad de concentración de macronutrientes (½MS) suplementado con 0.5 mg/L de TDZ y 0.5 mg/L de BA después de 8 semanas de cultivo (Te-Chato et al., 2006) EXPLANTE Y EFECTOS DEL GENOTIPO SOBRE LA FORMACIÓN DE CALLOS CON TDZ Y BA Variedades Formación de Callos Promedio Color del Callo Hoja Internudo Nudo (Variedad) Plew T. P. 45.3 50.3 41.2 45.6 Amarillo Sonat 77.6 83.6 74.8 78.7 Amarillo Claro Valantino 82.8 84.0 84.4 83.7 Amarillo Oscuro 68.6 72.6 66.8 Promedio (explantes). La figura 15.A muestra la formación de callo en los nudos de las hojas. La sección B muestra un callo con cierto grado de diferenciación celular debido a la coloración verde que evidencia los procesos de fotosíntesis incluso se proyectan brotes desde la superficie de los mismos, mientras que los callos amarillos de la sección C muestran un estado desdiferenciado reciente sobre la vascularidad principal de la hoja.. Figura 15. Callos formados en los explantes de hoja de cada uno de los fenotipos de Anthurium spp luego de 8 semanas de cultivo en medio ½MS suplementado con TDZ y BA.. 30.

(39) Cultivo in vitro Anthurium andreanum. La figura 16 permite observar la apariencia de los callos luego de un periodo de cultivo in vitro mas extenso. Se observan claramente las características embriogénicas (ver figura 11). Además su tiempo in vitro es muy extenso debido al alto grado de diferenciación que se presenta en la superficie de los callos (coloraciones, organogénesis). Como se observa en la apariencia de los callos formados sobre explantes de hoja en la figura 17 (Te-Chato et al., 2006).. Figura 16. Callos formados desde el nodo de la variedad Sonat empleando el medio ½MS y WPM con TDZ y BA después de 6 semanas de cultivo (Te-Chato et al., 2006).. La figura 17 muestra las características de la formación de callos en los diferentes cortes realizados. Es evidente que los cortes de la sección nodal producen mas callo que los cortes realizados en la vascularidad central. Además, se puede afirmar que los callos muestran actividad fotosintética y clorofílica (coloracion verde) (Te-Chato et al., 2006).. Figura 17. Posición de los callos formados sobre un explante de hoja sano (A) y otro en el que se realizaron heridas (B) en la variedad de Anthurium Valantino luego de 6-7 semanas de cultivo (Te-Chato et al., 2006).. 31.