Producción de Fructosiltransferasa recombinante de

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Producción de Fructosiltransferasa recombinante de Aspergillus oryzae en Pichia pastoris y Escherichia coli

Diana Marcela León Castañeda

Trabajo de Grado

Presentado como Requisito Parcial para optar por el título Microbióloga Industrial

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Carrera Microbiología Industrial

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Aprobado

____________________________________

Concepción Judith Puerta Bula, Bact, PhD Decana Académica Facultad de Ciencias

____________________________________

Marcela Franco Correa, PhD

Directo de Carrera Microbiología Industrial

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Aprobado

________________________________

Carlos Javier Almeciga Díaz, QF. PhD Director

________________________________

Edwin Alexander Rodríguez Co – Director

_______________________________

José Salvador Montaña Lara PhD Evaluador

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NOTA DE ADVERTENCIA

ARTÍCULO 23 DE LA RESOLUCIÓN No.13 DE JULIO DE 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en

ellas el anhelo por buscar verdad y justicia”

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“The only way to be truly satisfied is to do what you believe is great work. And the only way to do great work is love what you do. If you haven’t found yet, keep looking. Don’t settle. As with all matters of the heart, you’ll know when you find it.”

Steve Jobs

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Agradecimientos

Agradezco infinitamente a la vida por darme la oportunidad de cambiar mi rumbo y de encontrar lo que me apasiona y me enamora, la investigación.

Agradezco a mi familia por todo su esfuerzo, su paciencia y su amor. En especial agradezco a mis padres porque sin ellos no hubiera logrado ser quien soy ahora. Agradezco a mi hermano porque me ayudó a salir de la monotonía y me llevó al camino de la risa y la simpatía; agradezco a Koko por su inocencia, su mirada noble y por la capacidad que tuvo para darme tranquilidad y paz.

Agradezco con especial cariño y aprecio a Juan David Orjuela por su paciencia, su apoyo, su espera, su sabiduría y sobre todo por su amor infinito.

Agradezco a Javier y a Alex por toda la paciencia, la sabiduría, por las risas, la ayuda y por la amistad formada, sin ellos no lo hubiera logrado.

Agradezco a Nata y a Juanito por ser la mejor compañía en nuestras incontables noches en vela. Agradezco a Angelita, a Auris y a Luis H. por sus consejos y por su ayuda incondicional.

Por último, agradezco a toda la familia del Instituto de Errores Innatos del Metabolismo por acogerme y hacerme sentir parte de ella.

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Contenido

Resumen ... 1

Introducción ... 2

1 Justificación y Planteamiento del problema ... 5

2 Marco Teórico ... 7

2.1 Prebióticos ... 7

2.1.1 Fructooligosacáridos ... 8

2.2 Pichia pastoris ... 10

2.3 Escherichia coli ... 10

2.4 Antecedentes ... 10

3 Objetivos ... 12

3.1 Objetivo General ... 12

3.2 Objetivos Específicos ... 12

4 Metodología ... 13

4.1 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9- FTasa ... 13

4.1.1 Transformación de E. coli DH5 con el vector pPIC9-FTasa ... 13

4.1.2 Transformación de P. pastoris GS115 con pPIC9-FTasa ... 13

4.1.3 Evaluación de clones pPIC9-FTasa obtenidos a escala de 100 mL ... 14

4.2 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9K- FTasa ... 15

4.2.1 Transformación de E. coli DH5 con el vector pPIC9K-FTasa ... 15

4.2.2 Transformación de P. pastoris GS115 con pPIC9K-FTasa ... 16

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4.3 Obtención de clones de E. coli BL21 transformados con el vector pPET21B-FTasa

... 17

4.3.1 Transformación de E. coli DH5 con el vector pPET21B-FTasa ... 17

4.3.2 Evaluación de clones obtenidos a escala de 100 mL ... 18

4.4 Evaluación de producción de fructosiltransferasa del mejor clon obtenido en los sistemas de expresión evaluados a escala de biorreactor ... 19

4.5 Cuantificación de biomasa, proteína y actividad ... 20

4.5.1 Cuantificación de biomasa... 20

4.5.2 Cuantificación de proteína ... 20

4.5.3 Cuantificación actividad enzimática FTasa ... 2120

4.6 Verificación de inserción del gen de FTasa en P. pastoris con el plásmido pPIC9 .. ... 21

4.7 Evaluación de la producción de la fructosiltransferasa en E. coli BL21 transformada (SDS-PAGE) ... 22

5 Resultados ... 23

5.1 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9- FTasa ... 23

5.2 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9K- FTasa ... 27

5.3 Obtención de clones de E. coli BL21 transformados con el vector pPET21B- FTasa ... 31

5.4 Evaluación de producción de fructosiltransferasa del mejor clon obtenido en los sistemas de expresión evaluados a escala de biorreactor. ... 3534

6 Discusión ... 37

7 Conclusiones ... 42

8 Recomendaciones ... 43

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Anexos ... 51

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Lista de figuras

Figura 1. Constructo pPIC9-FTasa ... 14 Figura 2. Constructo pPIC9K-FTasa ... 16 Figura 3. Constructo pPET21B-FTasa ... 18 Figura 4. Producto de la digestión con BamHI de una de las colonias de E. coli DH5 transformadas... 23 Figura 5. Productos de la digestión de pPIC9-FTasa con 1) SalI y 2) Pme II ... 24 Figura 6. Producto de la PCR realizada de tres clones transformados de P. pastoris GS115.

C. Control negativo,1. Clon 1, 2. Clon 2 y 3. Clon 3 ... 25 Figura 7. Evaluación de biomasa, proteína y actividad de FTasa en clones de P. pastoris GS115 transformados con pPIC9-FTasa. A) Evaluación de la Biomasa en función del tiempo B) Evaluación de la proteína producida en función del tiempo C) Evaluación de la actividad en función del tiempo... 26 Figura 8. Producto de la linealización de pPIC9K con BamHI y EcoRI ... 27 Figura 9. Plásmido pPIC9K ... 28 Figura 10. A. Producto de la digestión de pPIC9-FTasa, banda de FTasa seleccionada para la ligación con pPIC9K, B. Producto de la digestión de colonias E. coli DH5 pPIC9K- FTasa, banda de pPIC9K y FTasa señaladas ... 28 Figura 11. Colonias transformadas P. pastoris GS115 con el vector pPIC9K-FTasa A) 0 mg/mL geneticina B) 0,5 mg/mL geneticina C) 1 mg/mL geneticina D) 1,75 mg/mL

geneticina E) 4 mg/mL geneticina ... 29 Figura 12. Evaluación de biomasa, proteína y actividad de FTasa en clones de P.pastoris GS115 transformados con pPIC9K-FTasa. A) Evaluación de la Biomasa en función del tiempo B) Evaluación de la proteína producida en función del tiempo C) Evaluación de la actividad en función del tiempo... 31

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Figura 13. Evaluación de proteína y actividad de FTasa en clones de E. coli BL21

transformados con el vector pPET21B- FTasa en medio 2xTy. A. Evaluación de proteína en función del tiempo, B Evaluación de actividad en función del tiempo ... 32 Figura 14. Electroforesis de proteínas de clones 1 y 2 E. coli BL21 pPET21B- FTasa con sus tres réplicas y E. coli BL21 pPET21B (Empty) en medio 2xTy A. Hora 0, B Hora 12, C ... 33 Figura 15. Evaluación de proteína y actividad de FTasa en clones de E. coli BL21

transformados con el vector pPET21B- FTasa en medio mínimo. A. Evaluación de proteína en función del tiempo, B Evaluación de actividad en función del tiempo ... 3433 Figura 16. Evaluación de la actividad a diferentes concentraciones de sustrato y proporción muestra:sustrato en P. pastoris GS115 pPIC9K-FTasa a las 48 horas ... 3635

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Resumen

Los fructooligosacáridos (FOS) son los prebióticos más empleados en la actualidad y su producción empleando fructosiltransferasas (FTasa) derivadas de plantas, hongos y bacterias ha sido ampliamente reportada. De igual forma, la expresión heteróloga de FTasa de Aspergillus sp. en sistemas de expresión fácilmente manipulables ha surgido como una alternativa para la producción eficiente de dicha enzima. En este trabajo, se evaluó en diferentes sistemas de expresión la producción de la FTasa recombinante de Aspergillus oryzae N74. Los sistemas de expresión empleados fueron Pichia pastoris GS115 y Escherichia coli BL21(DE3). En P. pastoris GS115 se emplearon los vectores pPIC9- FTasa y pPIC9K-FTasa, mientras que en E. coli BL21(DE3) se empleó el vector pPET21B- FTasa. El mejor sistema de expresión fue seleccionado para evaluar la producción de la enzima a escala de 1,7 L. A escala de 100 mL los mayores valores de actividad de FTasa se observaron en Pichia pastoris GS115 transformada con pPIC9K-FTasa, logrando valores de 73.4 U/mL, lo cual fue significativamente más alto que lo obtenido en Pichia pastoris GS115 pPIC9-FTasa o en E. coli BL21(DE3). El clon 2 de Pichia pastoris GS115 pPIC9K- FTasa fue evaluado a escala de 1,7 L logrando una actividad máxima de entre 350 y 380 U/mL. En conclusión, se establece que el uso de Pichia pastoris GS115 con el plásmido pPIC9K puede ser una alternativa para la producción heteróloga a nivel industrial de la enzima fructosiltransferasa de Aspergillus oryzae N74.

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Introducción

El término probiótico acuñado por Elie Metchnikoff hace más de una década, hace referencia a microorganismos vivos que al ser administrados en dosis adecuadas le confieren un beneficio al hospedero (FAO/WHO). El uso de los mismos ha aumentado desde su invención y se han utilizado diversos grupos microbianos dentro de los que destacan las bacterias (Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp y Streptomyces thermophilus) así como las levaduras (Saccharomyces boulardii) (Douglas & Sanders, 2008; Sanders, 2008; Hill et al., 2014).

Aunque se ha reportado que el uso de probióticos aporta diversos beneficios a nivel gastrointestinal (disminución de la duración, la incidencia y presentación de infecciones intestinales) y extraintestinal (inducción sobre la regulación inmunitaria, regulación de respuestas alérgicas, disminución de presentación de dermatitis alérgica, entre otros) (Kukkonen et al., 2007) estos han tenido problemas dado que deben enfrentarse a diversos obstáculos que hacen que la viabilidad disminuya así como su estabilidad. Algunos de los problemas mencionados son la disminución de viabilidad por estrés asociada al oxígeno y al paso a través de las distintas barreras físicas y químicas desde la ingestión, baja resistencia a influencias medioambientales, no liberación de los microorganismos en un sitio específico, entre otros (Farnworth & Champagne, 2016;Vos et al., 2010).

Ante las dificultades reportadas en el uso de los probióticos, los prebióticos surgen como una alternativa para suplir a los primeros. Según la Asociación Científica Internacional de probióticos y prebióticos (2008), los prebióticos se definen como compuestos selectivamente fermentables por la composición de y/o actividad de la microbiota gastrointestinal, proporcionándole al hospederos beneficios para la salud. En otras palabras es el ingrediente nutricional que promueve el crecimiento o actividad de un número limitado de géneros bacterianos para generar un beneficio en el hospedero (Douglas &

Sanders, 2008).

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El uso de prebióticos en la actualidad se debe al creciente número de reportes sobre las cualidades de los mismos, como su asociación con la mejora en la función del colon aumentando la cantidad de ácidos grasos de cadena corta, incrementando la expresión de proteínas de unión y modulación del sistema inmune, así como la reducción de síntomas alergénicos, el aumento de la absorción de calcio e inclusive la reducción de la incidencia de tumores (Pietro et al., 2002; Roberfroid et al., 2010).

Los tipos de prebióticos más conocidos son las cadenas cortas de ß–fructanos que corresponden a los fructooligosacáridos (FOS), otros son los galactooligosacáridos, la inulina y lactulosa (Valcheva & Dieleman, 2016). Los fructooligosacáridos están constituidos por una subunidad de D-glucosa y una o más subunidades de D-fructosa unidas por enlaces ß-2-1 (Kaplan & Hutkins , 2000).

La producción de FOS a partir del uso de fructosiltransferasas (FTasas) ha sido ampliamente reportada. Los hongos productores de FTasas que se han descrito en la literatura son Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium frequentans, entre otros (Hirayama et al., 1989; Lateef et al., 2012; Usami et al., 1991; Wei et al., 2014). La producción de FTasas a partir de hongos filamentosos aunque resulta ser prometedora presenta grandes dificultades de reología que se expresan en una reducción significativa en los rendimientos de producción, es por ello que surge la alternativa de la síntesis de dicha enzima en sistemas de expresión que mejoren los rendimientos. Algunos de los sistemas de expresión en los que se ha reportado la producción de la FTasa recombinante han sido Pichia pastoris y Escherichia coli (Heyer & Wendenburg, 2000; Chuankhayan et al., 2010;

Yang et al., 2016).

Díaz & Beltrán (2012) y Botero (2014) reportaron la producción de FTasa recombinante de Aspergillus Oryzae N74 en Pichia pastoris GS115, sin embargo los resultados de las actividades en cada estudio no son favorables ya que estas son inferiores a las reportadas por la enzima nativa. Debido a las bajas actividades reportadas se hace necesario la

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así como el uso de nuevos sistemas de expresión, es por ello que en éste trabajo se evaluará en diferentes sistemas de expresión la producción de FTasa recombinante de Aspergillus oryzae N74..

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1 Justificación y Planteamiento del problema

Debido a la creciente demanda de prebióticos surge la necesidad de la búsqueda de nuevas alternativas que puedan producir este tipo de compuestos con altos rendimientos. Los prebióticos pueden obtenerse ya sea naturalmente o sintéticamente. Una de las formas de producción de fructooligosacáridos (prebióticos más empleados) es mediante la utilización de Fructosiltransferasas (E.C. 2.4.1.9). Según Sangeetha et al. (2005) éstas son las enzimas involucradas en la producción microbiana de FOS (hongos y bacterias). Sin embargo, ésta enzima puede ser producida también por plantas, como lo reporta Alméciga-Díaz et al., (2011). Algunos de los organismos que se destacan en la producción de fructosiltransferasa son Betavulgaris L., Heliantus tuberosus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporum, Zymomonas sp. y Bacillus sp. (Guío et al., 2009).

La producción de fructosiltransferasa a partir Aspergillus sp. ha sido ampliamente reportada como es el caso de Aspergillus oryzae N74 dado que las actividades obtenidas por ésta enzima son considerablemente altas (Caicedo et al., 2009; Guío et al., 2012; Muñiz- Márquez et al., 2016; Sánchez et al., 2008), sin embargo en el cultivo de hongos filamentosos existen diversos problemas de reología que disminuyen el rendimiento de la producción de la enzima, aumentando los tiempos y costos de producción (Posch A et al., 2013), por ello la síntesis de fructosiltransferasa heteroróloga de Aspergillus sp. en sistemas de expresión con pocos problemas en reología ha aumentado. Los sistemas de expresión reportados han sido predominantemente levaduras como Pichia pastoris y Kluveromyces lactis (Spohner et al, 2016; Yang et al., 2016) y bacterias dentro de las que se encuentra Escherichia coli (Heyer & Wendenburg, 2000).

La producción heteróloga de FTasa de Aspergillus oryzae N74 en Pichia pastoris GS115 ha sido reportada por Díaz & Beltrán (2012) y Botero (2014), sin embargo se han obtenido actividades enzimáticas inferiores a las reportadas por la enzima nativa lo que evidencia que no hay una mejora al expresarla en otros sistemas de expresión bajo las condiciones de cada estudio. Se ha sugerido que lo anterior puede deberse a la falta de conocimiento sobre

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las condiciones óptimas de producción, nuevos vectores o inclusive nuevos sistemas de expresión.

Dada la falta de estudios sobre la existencia de un sistema de expresión que sea eficiente, económico y fácil de manipular para la producción de fructosiltransferasa recombinante a partir de Aspergillus sp, se hace necesaria la evaluación de la producción de la enzima en sistemas de expresión en los que se obtenga un mejor rendimiento en la producción de la proteína, así como en su actividad, es por ello que Pichia pastoris surge como una alternativa para la producción de la enzima heteróloga así como el uso de un sistema bacteriano, es decir Escherichia coli.

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2 Marco Teórico

2.1 Prebióticos

Los prebióticos se definen como los ingredientes nutricionales que promueven el crecimiento o la actividad de un número limitado de géneros bacterianos para el beneficio del hospedero (Douglas & Sanders, 2008). Valcheva & Dieleman (2016) aportan a la definición de prebióticos la descripción del ingrediente nutricional, ya que éste debe ser un alimento no digerible que genere un efecto benéfico al hospedero. Adicionalmente se establece que el efecto positivo se debe a la estimulación selectiva del crecimiento y/o la actividad de un número limitado de bacterias en el colon mejorando la salud del hospedero.

De acuerdo con las definiciones anteriores se puede decir que los prebióticos ayudan a mejorar la microbiota intestinal, es decir ayudan a mantener la normobiosis, entendiendo normobiosis como la microbiota intestinal normal en la que la población de microorganismos con un potencial benéfico para la salud del hospedero predomina (Roberfroid et al., 2010). Un ejemplo en el cual se reporta el cambio en la composición de la microbiota al consumir prebióticos es en el estudio de Bounik et al., (2004) ya que en éste se dan dosis de fructooligosacáridos (FOS) y galatooligosacáridos (GOS) y se establece la presencia en muestras fecales de Bifidobacterium sp. después del consumo de los prebióticos previamente mencionados. Adicionalmente, se ha evidenciado el aumento de la población de F. prausnitzii, Roseburia spp. y Eubacterium spp., así como la producción elevada de ácidos grasos de cadena corta (Scott et al., 2014)

Los prebióticos reducen el riesgo de infecciones y gastroenteritis así como la incidencia de los síntomas alérgicos como el eczema atípico, incrementa la absorción de calcio en huesos de mujeres posmenopáusicas, inhibe la síntesis de colesterol, entre otras (Roberfroid et al., 2010).

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Los FOS son los prebióticos más usados en la actualidad, sin embargo también existen en el mercado la inulina, los galactooligosacáridos, la lactulosa, la hemicelulosa, entre otros (Kolida et al. 2002).

2.1.1 Fructooligosacáridos

Los fructooligosacáridos (FOS) son oligosacáridos conformados por una subunidad de D- glucosa y entre una o más subunidades de D-fructosa unidos por un enlace ß 2-1 (Kaplan &

Hutkins, 2000). Los FOS más conocidos son 1-questosa (GF2), nistosa (GF3) y 1- ß fructofuranosilnistosa (GF4).

Los FOS se pueden encontrar naturalmente en el banano, la cebolla, el ajo, el trigo, miel, entre otros y pueden ser obtenidos a partir de materiales vegetales ricos en inulina, degradación de inulina o sintetizado a partir de sacarosa mediante la utilización de enzimas como la fructosiltransferasa (Roberfroid, 1993; Sangeetha et al., 2005).

La producción dominante de bifidobacterias se da por el consumo de FOS. Sin embargo, en un estudio se reportó la producción de este género bacteriano empleando inulina, la diferencia radica en los productos obtenidos después de la fermentación ya que el mayor producto de fermentación de la inulina y de los FOS, fueron el butirato para el primero y el lactato y acetato para el último (Rossi et al., 2005; Sarup et al., 2016).

2.1.1.1 Fructosiltransferasas (E.C. 2.4.1.9)

Según Sangeetha et al., (2005) las fructosiltransferasas (FTasa) son enzimas responsables de la producción microbiana de FOS (hongos y bacterias), sin embargo hay reportes en los que se demuestra que las plantas también son capaces de sintetizar dicha enzima (Alméciga-Díaz et al., 2011).

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La FTasa hidroliza una molécula de glucosa proveniente de una de sacarosa y realiza un enlace ß 1-2 a partir de la glucosa hidrolizada en otra molécula de sacarosa (Sprenger et al., 1995)

Se ha reportado la producción de fructosiltransferasa en muchos casos en Aspergillus sp.

dado que la actividad de la enzima producida por éste hongo ha sido alta (Muñiz-Márquez et al., 2016).

Producción de fructosiltransferasa recombinante

La producción de FTasa recombinante de Aspergillus sp. en Pichia pastoris ha sido reportada por pocos autores. Yang et al. (2016) reporta la producción de la expresión heteróloga de ésta enzima de Aspergillus niger en Pichia pastoris GS115 en la cual hay una producción considerable de la actividad (367 U/mL). Así mismo, Díaz y Beltrán (2012) junto con Botero (2014) reportan la producción de la enzima proveniente de Aspergillus oryzae N 74, pero en estos casos las actividades (0,04 U/mL y 3,7 U/mL respectivamente) son bajas con respecto a lo reportado por la enzima nativa (165,24 U/mL) por lo que sugieren el estudio de nuevas condiciones para el mejoramiento de los resultados.

Pichia pastoris no ha sido el único sistema de expresión reportado, Heyer & Wendenburg (2000) en su estudio emplea a Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli para la expresión de la fructosiltransferasa de Aspergillus sydowi IAM2544, sin embargo no obtiene niveles significativamente mayores a los evidenciados a partir de la expresión recombinante en plantas de papa. Chuankhayan et al. (2010) también emplea a Escherichia coli como sistema de expresión para la producción de fructosiltransferasa de Aspergillus japonicus, en su estudio se evidencia la producción de fructooligosacáridos 1-kestosa, nistosa y 1-ß fructofuranosilnistosa.

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2.2 Pichia pastoris

Pichia pastoris es una levadura metilotrófica considerada uno de los microorganismos más empleados para la producción eficiente de proteínas recombinantes a gran escala dado que es considerada uno de los mejores sistemas de expresión, por su fácil manipulación genética y cultivo, además de llevar a cabo modificaciones postraduccionales (Cereghino et al., 2002). Se han reportado alrededor de 200 proteínas heterólogas expresadas en Pichia pastoris, en donde se han evaluado nuevas cepas, vectores y técnicas para el mejoramiento de los rendimientos de producción de proteínas recombinantes (Cregg et al., 2000).

2.3 Escherichia coli

Escherichia coli es una bacteria Gram negativa empleada en la expresión de proteínas por su relativa simplicidad, su bajo costo, su corto tiempo de replicación, el grado de conocimiento sobre los mecanismos genéticos y el gran número de herramientas compatibles disponibles para emplearla en biotecnología. La variedad de plásmidos disponibles y las cepas mutantes han aumentado la posibilidad de aplicaciones de ésta bacteria para la expresión de proteínas recombinantes (Sorensen & Kusk, 2005).

2.4 Antecedentes

La evaluación de la producción de fructooligosacáridos a partir de la fructosiltransferasa de Aspergillus oryzae N74 fue reportada inicialmente por Sanchéz et al. (2006). En su estudio se evidencia una alta actividad de la enzima así como altos rendimientos sobre la producción de fructooligosacáridos y sugieren que la enzima nativa puede ser usada para la producción comercial de FOS, es por ello que en el 2008, Sánchez et al. evalúa la producción de la fructosiltransferasa en un biorreactor con agitación mecánica y posteriormente Rodríguez et al., (2011) clona el gen y modela la estructura de la fructosiltransferasa para poder realizar un estudio con la enzima recombinante en otros

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Díaz & Beltrán (2012) evalúan la producción recombinante de la fructosiltransferasa en Pichia pastoris limitando el oxígeno y el sustrato y obtienen los mejores resultados de actividad con un 25% de oxígeno disuelto y 1,3% de metanol (0,04 U/mL). Así mismo, Botero (2014) caracterizó los niveles de producción de fructosiltransferasa empleando el gen optimizado para Pichia pastoris GS115 para el cual se modificó el uso de los codones para la expresión en el sistema previamente mencionado. En sus resultados obtiene un aumento de la actividad enzimática con respecto al trabajo realizado por Días & Beltrán (2012) y evidencia los mejores valores de actividad a 45 ºC, pH 4 y 1,7 M Sacarosa durante 4 horas de reacción (3,7 U/mL). Cabe resaltar que en los dos trabajos mencionados se empleó el plásmido pPIC9 el cual ha sido reportado en la expresión de otras proteínas como Iduronato 2-sulfato sulfatasa (IDS) empleando en gen nativo y optimizado en el mismos sistema de expresión, Pichia pastoris GS115 (Díaz, 2011; Pimentel, 2013).

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3 Objetivos

3.1 Objetivo General

Evaluar en diferentes sistemas de expresión la producción de FTasa recombinante de Aspergillus oryzae N74

3.2 Objetivos Específicos

1. Evaluar y seleccionar los clones de Pichia pastoris GS115 y de Escherichia coli BL21(DE3) transformados con pPIC9-FTasa ó pPIC9K-FTasa y con pPET21B-FTasa, respectivamente

2. Evaluar la producción de fructosiltransferasa en el mejor sistema de expresión a escala de biorreactor (Pichia pastoris GS115 pPIC9K-FTasa)

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4 Metodología

4.1 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9- FTasa

4.1.1 Transformación de E. coli DH5 con el vector pPIC9-FTasa

Inicialmente se llevó a cabo la transformación de P. pastoris GS115 empleando el plásmido pPIC9 ya que el uso del mismo había sido reportado con el fin de producir FTasa recombinante; cabe resaltar que en éste trabajo se intentó insertar dos veces el constructo al genoma haciendo que ésta sea la diferencia principal con respecto a los trabajos previamente realizados. El constructo pPIC9-FTasa utilizado fue obtenido a partir del trabajo realizado por Botero (2014). Para obtener la cantidad suficiente del constructo para la transformación de Pichia pastoris el plásmido pPIC9-FTasa fue transformado en E. coli DH5 competente mediante el protocolo de choque térmico (Ausubel et al., 1999). A las colonias resultantes se les realizó una extracción de DNA mediante el protocolo de minipreparación (Ausubel et al., 1999) y posteriormente se confirmó la presencia del plásmido mediante restricción empleando las enzimas BamHI y EcoRI. Se visualizó en una electroforesis de gel de agarosa al 1%.

4.1.2 Transformación de P. pastoris GS115 con pPIC9-FTasa

A partir de la purificación de pPIC9-FTasa se llevaron a cabo dos digestiones por separado con las enzimas SalI y PmeI para linealizar el constructo en cada reacción (Figura 1). Los productos de las digestiones se utilizaron para transformar Pichia pastoris GS115 competente mediante el protocolo de electroporación (Moreno, 2012) permitiendo que se insertara en dos sitios el constructo al genoma de la levadura. Las células transformadas se sembraron en agar MD (1,34% YNB, 4x10^-5% biotina, 2% dextrosa) durante 72 horas a 30ºC. A partir de las colonias obtenidas después del tiempo de incubación se realizó un banco de trabajo con 15% glicerol y se almacenó a -80ºC.

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Figura 1. Constructo pPIC9-FTasa. Se encuentran señalados los cortes realizados para la confirmación (BamHI y EcoRI) y linealización del constructo en cada reacción para llevar a

cabo la doble inserción al genoma de la levadura (PmeI y SalI)

4.1.3 Evaluación de clones pPIC9-FTasa obtenidos a escala de 100 mL

A partir del banco de trabajo se tomaron tres viales de tres clones diferentes y se inoculó por triplicado en 10 mL de medio YPD (Extracto de levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%) y se incubó durante 24 horas a 150 rpm y 30ºC. Después del tiempo de incubación, todo el contenido se inoculó en 90 mL de medio BMG (Buffer fosfato de potasio pH 6.0, 1.34% YNB, 4X10^-5% biotina, 1% glicerol) y se incubó durante 24 horas a 30ºC y 150 rpm.

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potasio pH 6.0, 1.34% YNB, 4X10^-5% biotina, 0.5% metanol). Se incubó durante 120 horas a 30ºC y 150 rpm. Cada 24 horas se tomaron alícuotas de 1 mL y se agregó 500 de metanol filtrado como inductor para mantener una concentración de 0,5% (v/v).

Los clones se evaluaron mediante la medición de biomasa, proteína total y actividad de la enzima fructosiltransferasa.

4.2 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9K- FTasa

4.2.1 Transformación de E. coli DH5 con el vector pPIC9K-FTasa

Después de transformar a P. pastoris GS115 con el plásmido pPIC9 se empleó a pPIC9K.

El plásmido pPIC9K fue digerido inicialmente con la enzima BamHI. Posteriormente, se precipitó el producto de la digestión con isopropanol y se realizó una segunda digestión con EcoRI para obtener el fragmento de pPIC9K requerido para la ligación con el gen de la FTasa ya que no se podía realizar una doble digestión por incompatibilidad de los buffers empleados en cada reacción. El producto de las dos digestiones se visualizó en una electroforesis de agarosa al 1%. Por otro lado, el gen FTasa fue obtenido a partir de la digestión de pPIC9-FTasa con la enzima BamHI y EcoRI, y se visualizó en una electroforesis de agarosa al 1%. Del gel de agarosa se tomó la banda correspondiente al gen de la FTasa y se purificó con el estuche Wizard ® SV Gel (Promega) de acuerdo a las condiciones del fabricante.

Una vez obtenido el gen de la FTasa proveniente del constructo pPIC9-FTasa y el plásmido pPIC9K linealizado se llevó a cabo la ligación empleando Ligase T4 (Novagen) y el producto de la ligación se utilizó para transformar E. coli DH5 competente mediante el protocolo de choque térmico (Ausubel et al., 1999) (Figura 2). A las colonias obtenidas después del tiempo de incubación se les realizó una extracción de DNA mediante el protocolo de minipreparación (Ausubel et al., 1999) y posteriormente se confirmó el

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producto de la transformación mediante restricción empleando la enzima BamHI y EcoRI.

La visualización se realizó mediante electroforesis de gel de agarosa al 1%.

Figura 2. Constructo pPIC9K-FTasa. Se encuentran señalados los cortes realizados para la confirmación (BamHI y EcoRI) y linealización (BamHI) del constructo mencionado.

4.2.2 Transformación de P. pastoris GS115 con pPIC9K-FTasa

A partir de la purificación de pPIC9K-FTasa se llevó a cabo la digestión con BamHI para linealizar el constructo. El producto de la digestión se utilizó para transformar Pichia pastoris GS115 competente mediante el protocolo de electroporación (Moreno, 2012). Las células transformadas se sembraron en agar MD (1,34% YNB, 4x10^-5% biotina, 2%

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mediante la siembra de 100 de la suspensión celular en agar YPD (Extracto de levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%, agar 15 g/L) con diferentes concentraciones de geneticina (0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 1.75, 2, 3, 4 mg/mL). A partir de las colonias que crecieron a 4 mg/mL se realizó un banco de trabajo (15% glicerol) que se almacenó a -80ºC.

4.2.3 Evaluación de clones obtenidos a escala de 100 mL

A partir del banco de trabajo se tomaron tres viales de tres clones diferentes y se inoculó por triplicado en 10 mL de caldo YPD (Extracto de levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%) y se incubó durante 24 horas a 150 rpm y 30ºC. Después del tiempo de incubación los 10 mL de cada clon evaluado por triplicado se inocularon en 90 mL de medio BMG (Buffer fosfato de potasio pH 6.0, 1.34% YNB, 4X10^-5% biotina, 1% glicerol) y se incubó durante 24 horas a 30ºC y 150 rpm. Posteriormente, se centrifugó el cultivo a 4000 rpm por 15 minutos a 4ºC descartando el sobrenadante y resuspendiendo la biomasa en 100 mL del medio BMM (Buffer fosfato de potasio pH 6.0, 1.34% YNB, 4X10^-5% biotina, 0.5%

metanol). Se incubó durante 120 horas a 30ºC y 150 rpm. Cada 24 horas se tomaron alícuotas de 1 mL y se agregó 500 de metanol filtrado como inductor para mantener una concentración de 0,5% (v/v).

Los clones se evaluaron mediante la medición de biomasa, proteína total y actividad de la enzima

4.3 Obtención de clones de E. coli BL21(DE3) transformados con el vector pPET21B-FTasa

4.3.1 Transformación de E. coli con el vector pPET21B-FTasa

El plásmido empleado para la transformación de E. coli fue pPET21B. El constructo pPET21B-FTasa fue construido por el Dr. Oscar Sánchez (Purdue University, USA). La transformación de E. coli BL21(DE3) competente se llevó a cabo mediante el

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pPET21B-FTasa y pPET21B (plásmido vacío como control). De las colonias transformantes con el constructo pPET21B-FTasa y pPET21B se realizó un banco de trabajo y se almacenó a -80ºC (15% glicerol) (Figura 3).

Figura 3. Constructo pPET21B-FTasa

4.3.2 Evaluación de clones obtenidos a escala de 100 mL

Inicialmente se realizó una evaluación en el medio 2xTy (Triptona 1,6%, Extracto de levadura 1%, NaCl 0,5%), para lo cual se realizó un pre-inóculo tomando tres viales de tres clones diferentes, se inoculó por triplicado en 10 mL del medio anteriormente mencionado y se incubó durante 24 horas, a 150 rpm y 37ºC. Después del tiempo de incubación todo el

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Una vez alcanzada la absorbancia requerida, se adicionó IPTG 0,5 mM para inducir la producción de la enzima recombinante, se incubó durante 24 horas a 37ºC y 150 rpm, y se tomaron alícuotas de 3 mL cada 12 horas. Los clones se evaluaron mediante la medición de proteína total y actividad enzimática. Se sonicaron las células para lisarlas ya que E. coli no secreta las proteínas y las mantiene intracelularmente (Ver Anexo).

Por otro lado, a partir del banco de trabajo se tomaron tres viales de los tres clones empleados anteriormente y se inoculó por triplicado en 10 mL de caldo LB suplementado con ampicilina (0,5% Extracto de levadura, 1% Triptona, 0,5% NaCl, Ampicilina 100 ) y se incubó durante 24 horas, a 150 rpm a 37ºC (Pre-inóculo). Después del tiempo de incubación todo el contenido de cada clon evaluado por triplicado se inoculó en 90 mL de medio mínimo (K2HPO4 1,323 % (p/v), KH2PO4 0,265 % (p/v), NaCl 0,204% (p/v), (NH4)2SO4 0,41 % (p/v), MgSO47H2O 0,05% (p/v), FeCl3 0,0026 % (p/v), Ampicilina (0,1 mg/mL) Tiamina (0,01 mg/mL), Glucosa 2% (p/v), Elementos traza 0,286% (v/v)) y se incubó durante 8 horas a 37ºC y 150 rpm. Posteriormente, se indujo con IPTG (1 mM) y se muestreo cada 3 horas durante 6 horas tomando alícuotas de 3 mL. Los clones se evaluaron mediante la medición de proteína total y actividad enzimática. Se sonicaron las células para lisarlas ya que E. coli no secreta las proteínas y las mantiene intracelularmente (Ver Anexo)

4.4 Evaluación de producción de fructosiltransferasa del mejor clon obtenido en los sistemas de expresión evaluados a escala de biorreactor (1,7 L)

Con los resultados obtenidos en la evaluación de la producción de la fructosiltransferasa a escala de 100 mL en los sistemas de expresión se escogió el clon que presentara la mejor actividad y mayor producción de la enzima para evaluarlo a escala de 1,7 L empleando el biorreactor Bioengineering® a KFL2000 de 3,7 L. Para realizar el preinóculo se tomaron dos viales del banco de trabajo del clon escogido (P. pastoris GS115 pPIC9K-FTasa), se inocularon en 9 mL de medio YPD por separado y se incubaron a 30ºC, 150 rpm durante 48 horas. Luego, estos fueron adicionados a 90 mL del medio MGli (1.34% YNB, 4X10^-5% biotina, 1% glicerol) y se incubó durante 24 horas a 30ºC y 150 rpm. Después del tiempo

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[KH₂PO4 25,74 g/L, (NH₄)₂SO₄ 3 g/L, K₂SO₄ 8.58 g/L, CaSO_4.2H2O 0,60 g/L, MgSO₄.7H₂O 7,02 g/L, Glicerol 4% (p/v), biotina 4x10^-5 %, PTM4 0,1% (CuSO₄.5H₂O 2 g/L, NaCI 0,08 g/L, MnSO₄. H₂O 3 g/L, Na₂MoSO₄. H₂O 0,2 g/L, H₃BO₃ 0,02 g/L, CaSO4.2H2O 0,5 g/L, CoCl2.6H2O 0,92 g/L, ZnCl 7 g/L, FeSO4.7H2O 22 g/L, H2SO4

0,1%)], para obtener un volumen efectivo de trabajo de 1650 mL.

Se adicionó una solución de trazas minerales, biotina (4x10^-5% (p/v)) y antiespumante (Se adicionó antiespumante cada 24 horas). Durante la etapa de crecimiento las condiciones se mantuvieron a 600 rpm, 28ºC con un pH de 5 hasta alcanzar una concentración de biomasa de 60 g/L, posteriormente se incubó durante 115 horas a 900 rpm, 28ºC y pH 5 manteniendo una concentración de 0,5% metanol en el tiempo de incubación (Inductor). Se tomaron muestras de 15 mL cada 24 horas y se evaluó la biomasa, proteína total y la actividad enzimática.

4.5 Cuantificación de biomasa, proteína y actividad

4.5.1 Cuantificación de biomasa

La cuantificación de biomasa para todos los cultivos realizados fue determinada por turbidimetría registrando la absorbancia a 600 nm. La expresión de biomasa en g/L fue calculada por medio de la ecuación reportada por Córdoba-Ruiz et al., (2009):

4.5.2 Cuantificación de proteína

La cuantificación de proteína en todos los cultivos se evaluó mediante el método de ácido Biniconico (BCA) en placa de ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific). La lectura se llevó a cabo en un espectrofotómetro a 595 nm realizando para

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4.5.3 Cuantificación actividad enzimática FTasa

La cuantificación de la actividad enzimática de los cultivos a escala de 100 mL se llevó a cabo según lo recomendado por Sánchez et al. (2008) tomando 900 de sacarosa al 66,7%

(p/v) en buffer fosfato 0.5 M, pH 5,5 y 100 de muestra para cuantificar la cantidad de glucosa liberada por hidrólisis de la sacarosa. La mezcla se incubó durante 4 horas a 60ºC.

La reacción se detuvo incubando los tubos durante 10 minutos a 90ºC para inactivar la enzima.

A escala de 1,7 L se llevó a cabo un estudio en la hora en la que se reportó la actividad más alta obtenida en el mejor sistema de expresión a escala de 100 mL (Hora 48), en este se analizó y seleccionó la mejor condición para la evaluación de la actividad enzimática. Para esto se llevaron a cabo ensayos en los que se cambió la concentración del sustrato (25 y 40% de sacarosa) y la cantidad de muestra y sustrato empleado (100 de la muestra-900 de sustrato y 300 de muestra- 700 de sustrato). La mejor condición en la que se presentó la actividad más alta fue escogida para evaluarla a escala de 1,7 L (100 de la muestra - 900 de sustrato al 25%).

La cantidad de glucosa liberada se cuantificó con el estuche Glucosa oxidasa/peroxidasa (Bio-systems®) de acuerdo con las condiciones del fabricante. La concentración de Glucosa producida (mg/mL) fue determinada mediante la siguiente ecuación:

La unidad enzimática (U) se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 mg de glucosa por hora bajo las condiciones de ensayo.

4.6 Verificación de inserción del gen de FTasa en P. pastoris con el plásmido pPIC9

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A los clones escogidos de P. pastoris GS115 transformados con pPIC9-FTasa se les realizó extracción de DNA genómico mediante el uso de nitrógeno líquido (Ver Anexos) , y se les realizó una PCR en la cual se utilizó el kit Safe-Green 2X PCR Bestaq Mastermix siguiendo las indicaciones del fabricante. El gen se amplificó con los siguientes cebadores:

Forward FTasa GGGTCACGCTACTTCTCCAG y Reverse FTasa

GCAATGTGCTGAGTCTCCAA. El producto de la PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Las condiciones en las que se llevó a cabo la PCR se encuentran en al Tabla 1

Tabla 1. Condiciones de PCR para amplificación de gen de FTasa

Etapa Temperatura (ºC) Tiempo

Denaturación Inicial 94 5 minutos

Denaturación 94 10 segundos

Anillamiento 55 40 segundos

Extensión 72 40 segundos

Extensión Final 72 5 minutos

4.7 Evaluación de la producción de la fructosiltransferasa en E. coli BL21 transformada (SDS-PAGE)

Se realizó una electroforesis de proteínas de los tres clones evaluados con sus respectivas réplicas en geles de poliacrilamida al 10%. Las muestras se prepararon bajo condiciones reductoras y se corrió a 90 voltios, 60 mA durante 3 horas, posteriormente se tiñó con azul de Coomasie.

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5 Resultados

5.1 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9- FTasa

Para obtener la cantidad suficiente del constructo pPIC9-FTasa y poder transformar P.

pastoris fue necesaria la transformación con dicho vector en células competentes de E. coli DH5 . En la Figura 4 se evidencia el plásmido extraído mediante miniprep y digerido con las enzimas BamHI y EcoRI. Se observa una banda alrededor de los 8,0 kb que corresponde al plásmido pPIC9 y otra de aproximadamente 2,0 kb que corresponde al fragmento del gen de la FTasa, lo que confirma la presencia del constructo en las células de E. coli DH5 transformadas.

Figura 4. Producto de la digestión de pPIC9-FTasa con BamHI y EcoRI de una de las colonias de E. coli DH5 transformadas

Así mismo, para la transformación de Pichia pastoris GS115 se llevó a cabo la linealización por separado con las enzimas de restricción SalI y PmeI del constructo pPIC9-

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Figura 5, en la cual se observa en cada reacción una banda de alrededor 9,1 kb, lo que se relaciona con el peso del constructo (Figura 1).

Figura 5. Productos de la digestión de pPIC9-FTasa con 1) SalI y 2) PmeI

Una vez confirmados los productos obtenidos a partir de las restricciones realizadas se llevó a cabo la transformación de células competentes de Pichia pastoris GS115, utilizando los dos productos simultáneamente. Esto tenía el objetivo de tratar de insertar en dos sitios diferentes el gen al genoma de la levadura y así lograr un aumento en la producción de la enzima, manifestado como un incremento en la actividad.

Para confirmar la presencia del constructo en las células transformantes se llevó a cabo una PCR en la cual se obtuvieron resultados esperados, ya que se observaron bandas amplificadas de alrededor de 250 bp en los tres clones que se escogieron para ser evaluados a escala de 100 mL (Figura 6).

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Figura 6. Producto de la PCR realizada de tres clones transformados de P. pastoris GS115.

C. Control negativo,1. Clon 1, 2. Clon 2 y 3. Clon 3

En la Figura 7 se evidencian los resultados de la evaluación de biomasa, proteína y actividad de FTasa en clones de P. pastoris GS115 transformados con pPIC9-FTasa. En ésta se observa que no hay una diferencia significativa en los tres clones evaluados con respecto a la producción de biomasa, ya que cada clon empezó con una biomasa de alrededor de 7 a 10 g/L y tuvo un comportamiento creciente siendo la hora 96 el tiempo en el que se produjo la mayor cantidad de biomasa en los tres clones (entre 19 y 22 g/L). El comportamiento de la producción de proteínas para los tres clones fue similar, exceptuando el pico del clon 3 en la hora 36. Para cada clon la hora 86 es el momento en el que se da la mayor producción de la proteína, los clones 1 y 3 son los que obtuvieron una mayor cantidad de la misma en dicha hora siendo 0,151 y 0,177 mg/mL, respectivamente. La actividad observada en los clones 1 y 3 presenta un comportamiento decreciente hasta la

10000 8000

6000 5000 4000 3500 3000 2500 2000 1500

1000 750

500

250

PM C 1 2 3

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una actividad creciente. El mejor valor de actividad observada fue por el clon 1 a las 72 horas con un valor de 0,265 U/mL. Cabe resaltar que el clon 3 en la hora cero tiene la actividad más alta de los tres clones en ese tiempo e inclusive éste resulta ser el valor más alto para el clon según los datos obtenidos. Sin embargo, en conjunto estos datos sugieren que los clones de P. pastoris GS115 transformados con pPIC9-FTAsa no están produciendo la enzima recombinante, o que ésta es producida en niveles muy bajos.

Figura 7. Evaluación de biomasa, proteína total y actividad de FTasa en extracto crudo en clones de P. pastoris GS115 transformados con pPIC9-FTasa. A) Evaluación de la Biomasa en función del tiempo B) Evaluación de la proteína total producida en función del

tiempo C) Evaluación de la actividad en función del tiempo

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5.2 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9K- FTasa

Así como en la obtención de clones en P. pastoris GS115 transformados con el vector pPIC9-FTasa fue necesario transformar E. coli DH5 , en éste caso también se realizó la transformación del constructo pPIC9K-FTasa inicialmente en el sistema de expresión bacteriano previamente mencionado. Cabe resaltar que la síntesis del constructo fue mediante la ligación del gen de la FTasa proveniente de pPIC9-FTasa y el plásmido pPIC9K, los cuales fueron previamente digeridos por las enzimas BamHI y EcoRI. En la Figura 8 se evidencia la presencia del vector en las bandas señaladas que corresponden a un valor entre 8,0 kb y 10 kb (Figura 9) lo que se relaciona con el peso del vector ya que es de 9,3 kb. En la figura 10 A se evidencia la banda de FTasa proveniente de pPIC9-FTasa empleada para realizar la ligación con el vector (banda aproximadamente entre 1,5 kb y 2 kb).

Figura 8. Producto de la linealización de pPIC9K con BamHI y EcoRI

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Figura 9. Plásmido pPIC9K

Figura 10. A. Producto de la digestión de pPIC9-FTasa, banda de FTasa seleccionada para la ligación con pPIC9K, B. Producto de la digestión de colonias E. coli DH5 pPIC9K-

FTasa, banda de pPIC9K y FTasa señaladas

Para confirmar que las células transformantes obtenidas tuvieran el constructo se realizó una extracción de DNA de las mismas, y posteriormente una restricción con BamHI y

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Después de visualizar colonias de E. coli DH5 transformantes, se llevó a cabo la extracción y purificación del constructo para transformar P. pastoris. Una vez obtenidas las colonias transformadas de la levadura en medio MD, se llevó a cabo la selección de los clones que tuvieran mayor resistencia a la geneticina debido a que esto indicó que había una mayor cantidad de copias del gen lo que garantizó que hubiera una mayor producción de la enzima extracelular, así como una actividad enzimática alta. En la Figura 11 se evidencia la disminución de la población de la levadura a medida que aumenta la concentración de geneticina. Cabe resaltar que se escogió la geneticina como agente selectivo de colonias con mayor producción de copias del gen debido a lo indicado por el manual de Pichia pastoris pPIC9K, así como porque dicho vector tiene resistencia al antibiótico previamente mencionado.

Figura 11. Colonias transformadas P. pastoris GS115 con el vector pPIC9K-FTasa A) 0 mg/mL geneticina B) 0,5 mg/mL geneticina C) 1 mg/mL geneticina D) 1,75 mg/mL

geneticina E) 4 mg/mL geneticina

A B C

D E

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La evaluación de biomasa, proteína y actividad de FTasa en clones de P. pastoris GS115 transformados con pPIC9K-FTasa a escala de 100 mL se puede evidenciar en la Figura 12.

Así como en los resultados obtenidos por la transformación con el constructo pPIC9-FTasa el comportamiento de los tres clones evaluados en lo referente a biomasa es muy similar ya que todos comienzan con concentraciones de 0,4 a 0,6 g/L (concentración 10 veces menor a la evidenciada para el constructo pPIC9-FTasa). A diferencia del constructo pPIC9-FTasa las mayores concentraciones de biomasa se encuentran a las 120 horas con valores de 20 a 21 g/L, valores similares a los del constructo mencionado.

El comportamiento de la producción de la proteína es muy parecida entre los tres clones evaluados, teniendo una disminución de ésta desde la hora 48 hasta la 72. El clon que produjo una mayor cantidad de proteína fue el 2 (0,174 mg/mL), cabe resaltar que los otros clones evaluados producen valores muy similares de proteína.

Los resultados de actividad enzimática evidenciados en la Figura 12 muestran una elevada actividad desde el momento de inducción con metanol (tiempo cero) hasta la hora 48 para los tres clones, después de ésta hora la actividad disminuye significativamente. El clon que presenta mayor producción de actividad es el 3 (73,4 U/mL) en la hora 48, el clon 1 también presenta una actividad similar en ésta hora (69 U/mL), por el contrario el clon 2 obtiene una mayor actividad en la hora 24 (62,4 U/mL). Es importante resaltar que los resultados de actividad obtenidos con el vector pPIC9K son significativamente mayores a los obtenidos mediante el empleo del vector pPIC9-FTasa (hasta 310 veces mayor actividad).

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Figura 12. Evaluación de biomasa, proteína y actividad de FTasa en clones de P. pastoris GS115 transformados con pPIC9K-FTasa. A) Evaluación de la Biomasa en función del tiempo B) Evaluación de la proteína total producida en función del tiempo C) Evaluación

de la actividad en función del tiempo

5.3 Obtención de clones de E. coli BL21(DE3) transformados con el vector pPET21B- FTasa

A partir de los clones obtenidos después de la transformación de E. coli BL21(DE3) usando el vector pPET21B-FTasa se realizó la evaluación de la producción de la proteína total y la actividad en dos clones transformados con el constructo mencionado y se evaluó como control bajo las mismas condiciones a E. coli BL21(DE3) transformada con el vector vacío.

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Después de obtener los datos de los clones transformados con pPET21B-FTasa se les restó los valores obtenidos de actividad por con el vector vacío como corrección.

Figura 13. Evaluación de proteína y actividad de FTasa en clones de E. coli BL21(DE3) transformados con el vector pPET21B- FTasa en medio 2xTy. A. Evaluación de proteína total en función del tiempo teniendo en cuenta que el clon 3 es el control (transformado con

el plásmido vacío), B Evaluación de actividad en función del tiempo

Inicialmente se evaluaron los clones en medio 2xTy durante 24 horas. En la Figura 13 se observa la evaluación de actividad y proteína total, en el que se destaca que aunque el clon 1 produce proteína (valor máximo 2,2 mg/mL) la actividad disminuye desde la inducción llegando a ser cero a la hora 12. Por otro lado, se observa que el clon 2 produce menor cantidad de proteína que el control (Clon 3), sin embargo se observa una actividad de 0,022 U/mL a las 24 horas.

Para confirmar la producción de proteínas se llevó a cabo una electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) para E. coli BL21(DE3) pPET21B- FTasa en medio 2xTy (Figura 14) en donde se evidenció que en la hora cero hay una baja cantidad de proteína para los dos clones en todas sus réplicas (C1 y C2) y para el vector vacío (E). Así mismo en la hora 12 hay presencia de proteína en todas las réplicas de los dos clones así como en las bacterias

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partir de la medición de proteína mediante BCA ya que el clon 1 presenta la mayor cantidad de proteína a las 12 horas, sin embargo el clon 2 a esa hora presenta una producción de proteína menor al control a diferencia de lo observado en la electroforesis de proteína.

Figura 14. Electroforesis de proteínas de clones 1 y 2 E. coli BL21(DE3) pPET21B- FTasa con sus tres réplicas y E. coli BL21(DE3) pPET21B (Empty) en medio 2xTy A. Hora 0, B

Hora 12, C Hora 24

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Figura 15. Evaluación de proteína y actividad de FTasa en clones de E. coli BL21(DE3) transformados con el vector pPET21B- FTasa en medio mínimo. A. Evaluación de proteína total en función del tiempo teniendo en cuenta que el clon 3 es el control (transformado con

el plásmido vacío), B Evaluación de actividad en función del tiempo

Por otro lado, en la Figura 15 se evidencian los resultados obtenidos en la evaluación de proteína total y actividad de FTasa en clones de E. coli BL21(DE3) transformados con el vector pPET21B- FTasa en medio mínimo. El clon 2 produce proteína desde la hora 0, teniendo su valor máximo a las 3 horas con 1,3 mg/mL. Por otro lado, el clon 1 empieza a producir proteína a partir de la hora 3 desde la cual mantiene un comportamiento creciente hasta las 6 horas con un valor de 1,4 mg/mL.

El clon 2 es el único que presenta actividad desde las 3 horas hasta las 6 horas con un valor máximo de 0,026 U/mL, que representa una actividad muy baja con respecto a los datos obtenidos con P. pastoris GS115.

Por último, se tuvo problemas con la electroforesis de proteína de E. coli BL21(DE3) pPET21B- FTasa en medio mínimo por lo cual no se muestra en los resultados.

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5.4 Evaluación de producción de fructosiltransferasa del mejor clon obtenido en los sistemas de expresión evaluados a escala de biorreactor (1,7 L)

Debido a las actividades obtenidas por P. pastoris GS115 transformada con el vector pPIC9K-FTasa, se seleccionó éste sistema de expresión para llevar a cabo la producción de FTasa a escala de biorreactor durante 115 horas. Como las actividades entre los tres clones evaluadas no fueron significativamente diferentes se seleccionó al azar el clon 2.

Para evaluar la mejor condición en la cual se encontró la mayor actividad se evaluó la hora en la que se reportó la actividad más alta del sistema de expresión escogido a escala de 100 mL para escalarlo a 1,6 L a diferentes concentraciones de sustrato (25% y 40%) y proporción de muestra:sustrato (100 de la muestra-900 de sustrato y 300 de muestra- 700 de sustrato).

En la Figura 16 se observa la evaluación de la actividad a diferentes concentraciones de sustrato y proporción muestra:sustrato en P. pastoris GS115 pPIC9K-FTasa a las 48 horas.

Para cada uno de los clones evaluados se observa que no hay una gran diferencia entre las actividades si varia la proporción muestra:sustrato. Así mismo, el comportamiento observado al cambiar las concentraciones de sustrato no se ven significativamente alteradas, sin embargo a una concentración de 60% con una proporción de 100 de la muestra-900 de sustrato disminuye la actividad en todos los clones. Debido a lo anterior, se escogió evaluar la actividad a escala de biorreactor a una concentración de sustrato de 25% y una proporción muestra:sustrato 100-900 ya que reportó uno de los mejores datos en actividad y no requiere de altas concentraciones de reactivo.

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Figura 16. Evaluación de la actividad a diferentes concentraciones de sustrato y proporción muestra:sustrato en P. pastoris GS115 pPIC9K-FTasa a las 48 horas

Se empezó con la etapa de inducción cuando la biomasa tuvo una concentración de 54,35 g/L. En la Figura 17 se observan los resultados durante la fase de inducción obtenidos a partir de la evaluación de biomasa, proteína total, actividad de FTasa y %OD del clon 2 de P. pastoris GS115 transformada con pPIC9K-FTasa. Durante todo el cultivo el pH se mantuvo en 5,0 mientras que el metanol durante toda la fase de inducción se mantuvo en 0,5% (v/v) mediante el uso de un controlador automático. Por su parte la agitación se incrementó entre 400 y 900 rpm durante la fase de crecimiento en glicerol, y se mantuvo en 900 rpm durante toda la fase de inducción.

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Como en los resultados obtenidos previamente al emplear P. pastoris GS115 la biomasa tiene un comportamiento creciente a lo largo del tiempo así como la proteína, alcanzando niveles máximos de 444 g/L a las 79 horas y 3,5 mg/mL a las 115 horas, respectivamente.

Por otro lado, se evidencia la actividad enzimática obteniéndose valores significativos dado que desde la hora cero se da la producción de la actividad hasta estabilizarse a las 19 horas y mantener un valor constante (entre 350 y 380 U/mL) excepto en la hora 55 en la que hay una disminución de la actividad.

Figura 17. Evaluación de biomasa, proteína total, actividad de FTasa y %OD en el clon 2 de P. pastoris GS115 transformada con pPIC9K-FTasa.

6 Discusión

Los FOS son considerados los prebióticos más ampliamente utilizados en el mercado ya que son fácilmente asimilables por los microorganismos debido a su tamaño dado que estos constituyen oligosacáridos de una subunidad de D-glucosa y una o más subunidades de D- fructosa unidos por enlaces ß 2-1 (Kaplan & Hutkins, 2000).

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El empleo de FTasas para la producción de FOS ha sido ampliamente reportada por diversos autores en los que se resalta la producción de la misma en hongos filamentosos ya que se han evidenciado altas actividades como es el caso de Aspergillus niger con una actividad de 24,5 U/mL (Lateef et al., 2012), Aspergillus oryzae con una actividad de 165,24 U/mL (Sánchez et al., 2008), Aspergillus japonicus con una actividad de 55,43 U/mL (Wang & Zhou, 2006), Penicillium purpurogenum con una actividad de 600 U/mL (Dhake & Patil, 2007), entre otros. Sin embargo, por la dificultad de escalado de cultivos de hongos filamentosos surge como una alternativa la producción de dicha enzima recombinante en otro sistema de expresión en el cual no se vea alterada la síntesis de la proteína y por ende la actividad de la misma.

La producción de proteínas recombinantes se ha reportado ampliamente en Pichia pastoris como es el caso de Yang et al.,(2013) en la cual se expresa -amilasa alcalina de Alkalimonas amylolytica. P. pastoris es considerada una de las especies más comunes de levaduras empleadas para la producción de proteínas recombinantes debido a que es un sistema de expresión fácilmente manipulable, crece en altas densidades de población, tiene la capacidad de secretar proteínas al medio, realiza modificaciones postraduccionales como glucosilaciones y regula la expresión de los genes mediante la inducción con metanol (Schutter et al., 2009). Por esta razón, Díaz & Beltrán (2012) junto con Botero (2014) llevaron a cabo la producción de FTasa de Aspergillus oryzae N74 en éste sistema de expresión.

En el estudio se reportó una actividad enzimática máxima de FTasa de P. pastoris pPIC9- FTasa y P. pastoris pPIC9K-FTasa a escala de 100 mL de 0,265 U/mL y 73,4 U/mL respectivamente. De acuerdo con los valores reportados por Díaz & Beltrán (2012) las actividades encontradas por este estudio a escala de 1,7 L son más altas (380 U/mL) dado que en su trabajo se obtuvo una actividad máxima de 0,04 U/mL. Por otro lado, la máxima actividad reportada por Botero (2014) que corresponde a 3,7 U/mL fue mayor que la obtenida para P. pastoris pPIC9-FTasa. Se sugiere que esto puede deberse a que toda la

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pPIC9-FTasa, P. pastoris pPIC9K-FTasa obtuvo una mejor actividad que la reportada por Botero (2014). Los resultados de las actividades de E. coli BL21(DE3) también fueron muy bajos (0,025 U/mL) con respecto a los de P. pastoris pPIC9K-FTasa es por ello que se decidió escoger un clon de P. pastoris pPIC9K-FTasa para evaluarlo a escala de 1,7 L.

En éste trabajo la máxima actividad obtenida fue de 380 U/mL, lo cual supera a la actividad enzimática de FTasa recombinante reportada por Díaz & Beltrán (2012), Botero (2014) y la actividad de la enzima nativa que corresponde a 165,24 U/mL (Sánchez et al., 2010). Esto puede deberse al uso del plásmido pPIC9K, ya que se caracteriza por ser de inserción múltiple lo que genera múltiples copias del gen de interés, haciendo que se amplifique la producción de la enzima y así mismo la actividad enzimática como lo reporta Yang et al.

(2016) al producir la enzima de Aspergillus niger YZ59 en Pichia pastoris GS115 usando como vector el plásmido pPIC9K. El uso de este vector puede ser el que genere las altas actividades expresadas en el estudio de Yang et al. (2016) ya que la máxima actividad encontrada es casi de 367 U/mL a escala de biorreactor con un volumen efectivo de trabajo de alrededor 2 L. Se sugiere que las diferencias reportadas de las actividades entre Yang et al. (2016) y éste trabajo pueden deberse a que las FTasas provienen de diferentes especies de Aspergillus sp., al uso del gen de la FTasa optimizado en éste trabajo, y también debido a que en el estudio realizado por Yang et al. (2016) se mantuvo un porcentaje de oxígeno disuelto de alrededor 30% y en éste trabajo aunque fluctuó, en casi todo de cultivo fue menor al 20 %. Esto puede haber sido una causa por la cual la actividad reportada en éste estudio haya sido mayor dado que Pimentel (2013) reporta en su estudio que la limitación de oxígeno favorece la producción de proteínas recombinantes en Pichia pastoris GS115 aunque Celik et al. (2012) reporte que las concentraciones ideales para Pichia pastoris corresponden a un %OD entre 20 y 30% para favorecer la oxidación de metanol a formaldehído.

Por otro lado, es importante tener en cuenta que la biomasa inicial con la cual empezó el cultivo de Yang et al. (2016) fue 111 g/L y la de este trabajo fue de 53,35 g/L y llegaron a alcanzar un valor máximo de biomasa de 215 g/L a las 180 horas y 444 g/L a las 115 horas

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estudio realizado, y esto puede deberse al porcentaje de oxígeno disuelto y al pH empleado en el estudio (pH 5) ya que el crecimiento de las levaduras se favorece a pH ácidos.

Por otro lado, la producción de proteínas recombinantes en sistemas bacterianos también se ha reportado. Yang et al., (2012) en su estudio clona y expresa la -amilasa de Bacillus subtilis JN16 en Escherichia coli. E. coli también es un sistema de expresión ampliamente utilizado para la producción de proteínas recombinantes ya que el grado de conocimiento sobre los mecanismos genéticos es alto, también por su bajo costo y simplicidad (Sorensen

& Kusk, 2005).

En éste trabajo se empleó a Escherichia coli BL21(DE3) como sistema de expresión bacteriano para la producción de FTasa recombinante de A. oryzae N74. Los resultados obtenidos son muy bajos con respecto a los reportados para P. pastoris pPIC9K-FTasa, ya que el clon 1 no tuvo actividad tanto en el medio 2xTy como en medio mínimo y el clon 2 reportó una actividad máxima de alrededor 0,025 U/mL en los dos medios utilizados, lo que quiere decir que la actividad producida puede ser producto de variaciones en la medición y no a la presencia de la proteína dado que tanto en el medio 2xTy como en el medio mínimo hay una baja producción de la misma. Cabe resaltar que los comportamientos obtenidos de la proteína utilizando medios y tiempos de inducción diferentes cambia la expresión de las proteínas (Figura 13 y Figura 15).

Actualmente hay pocos reportes sobre la producción de FTasa recombinante en Escherichia coli. Chuankhayan et al., (2010) reporta la expresión de FTasa de Aspergillus japonicus en Escherichia coli, en éste estudio se determinó el sitio activo de la proteína, así como la interacción entre donador y aceptor en la reacción enzimática, sin embargo no hay datos sobre la actividad de la enzima en el sistema de expresión bacteriano mencionado. Por su parte Heyer & Wendenburg (2001), en su estudio reportan la expresión heteróloga de FTasa de Aspergillus sydowi en E. coli, S. cerevisiae y una planta de papa (Solanum tuberosum), en donde se evidencia mayor producción de la enzima por mayor producción de FOS en la