Anàlisi comparatiu de gens de virulència de soques del gènere Pseudomonas

Texto completo

(1)Facultat de Ciències Memòria del Treball de Fi de Grau. Anàlisi comparatiu de gens de virulència de soques del gènere Pseudomonas Miquel Joan Servera Lauder Grau de Biologia Any acadèmic 2014-15. DNI de l’alumne: 41616160Y Treball tutelat per Dra. Elena Isabel García-Valdés Pukkits Departament de Biologia, Microbiologia S'autoritza la Universitat a incloure el meu treball en el Repositori Institucional per a la NO seva consulta en accés obert i difusió en línea, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació Paraules clau del treball: Pseudomonas, soques, factors de virulència, relacions, gens, genomes..

(2)

(3) Índex. 1. Resum i Abstract........................................................................................................................pàg.1 2. Introducció................................................................................................................................pàg. 2 2.1. Introducció al gènere Pseudomonas.....................................................................pàg. 2 2.2. Els factors de virulència al gènere Pseudomonas ...............................................pàg. 5 3. Objectius...................................................................................................................................pàg. 8 4. Materials i mètodes..................................................................................................................pàg. 8 4.1. Soques emprades..................................................................................................pàg. 8 4.2. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front als factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1..................................................................................................pàg. 9 4.3. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front als factors de virulència de 16 altres soques del gènere Pseudomonas.....................................................................................pàg. 9 5. Resultats..................................................................................................................................pàg. 10 5.1. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC7588 front als factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1.................................................................................................pàg. 10 5.2. Representació gràfica de les dades de l’anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC7588 front als factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1....................................................pàg. 23 5.3. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC7588 front a 16 altres soques del gènere Pseudomonas......................................................................................................pàg. 24 5.4. Aplicació de l’algoritme “Unweighed Pair Group Method with Arithmetic Mean” (UPGMA) creat a partir de les dades recopilades de diferents soques...............pàg. 25 6. Discussió..................................................................................................................................pàg. 25 7. Conclusions.............................................................................................................................pàg. 28 8. Bibliografia..............................................................................................................................pàg. 28.

(4) Resum El gènere Pseudomonas està compost per un conjunt d’espècies adaptades a viure en ambients molt diversos. Aquest fet, juntament amb la baixa especificitat dels seus requeriments nutricionals, fa que sigui un gènere molt ubic. Un dels nínxols que inclou el gènere Pseudomonas és el d’ambients clínics, on l’espècie que rep més atenció és Pseudomonas aeruginosa. És un patogen oportunista causant de malalties com la fibrosi quística. En aquest treball es pretén realitzar un anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1 i els factors de virulència de dues soques de Pseudomonas stutzeri: Pseudomonas stutzeri A1501 (aïllada d’un camp d’arròs) i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 (d’origen clínic i soca tipus de l’espècie) per tal d’establir una relació entre les tres soques i, posteriorment, amb altres espècies de Pseudomonas els factors de virulència de les quals són coneguts. Per realitzar l’anàlisi es parteix d’una base de dades de 333 factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa. Per identificar aquests factors de virulència dins el genoma de les dues soques de Pseudomonas stutzeri s’envien a comparar (Local Blast) amb una base de dades nucleotídica que correspon amb els genomes complets de les dues soques de Pseudomonas stutzeri. Els resultats mostren una gran diferència entre els factors de virulència de les soques de Pseudomonas stutzeri i els factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa i que els factors de virulència més conservats són els més essencials, com els relacionats amb la motilitat i la regulació de l’expressió gènica.. Abstract The Pseudomonas genera is composed by a range of species adapted to a wide variety of environments. This, together with a low specificity in nutritional requirements, makes this genera very ubiquitous. One of the niches related to this genera is the clinical environment in which the most known specie is Pseudomonas aeruginosa. This specie is an opportunistic pathogen related to diseases like Cystic Fibrosis. The aim of this project is to carry out a comparative analysis of the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa and the virulence factors of two Pseudomonas stutzeri strains: Pseudomonas stutzeri A1501 (isolated from a rice field) and Pseudomonas stutzeri ATCC17588 (isolated from clinical environments and type strain of the specie) in order to establish a relationship between the three strains and, later, with other Pseudomonas strains which virulence factors are known. To carry out this analysis, we begin with a database with 333 virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. To identify these virulence factors in the genome of the strains of Pseudomonas stutzeri they are sent to compare (Local Blast) with a nucleotidic database which corresponds with the two whole genomes of the strains of Pseudomonas stutzeri. The results show a great difference between the virulence factors of the Pseudomonas stutzeri strains and the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. They also show that the most conserved virulence factors are those related to basic activities like motility and gene expression regulation.. 1.

(5) Introducció Introducció al gènere Pseudomonas Walter Migula, al 1894, descriu per primer cop gènere el Pseudomonas com a “Cèl·lules amb òrgans polars de locomoció”. Avui en dia, aquest gènere es descriu com bacteris en forma de vara recta o bé lleugerament corbada de 0.5-1.0 m de diàmetre i 1.5-5.0 m de llargària. La majoria d’espècies no acumulen grànuls de poli--hidroxibutirat però es pot donar acumulació de polihidroxialcanoats amb llargària monomèrica major a 4 carbonis si el creixement es dóna sobre alcans o gluconat. No produeixen prosteca i no s’envolten de beina. No es coneixen estadis vegetatius. Són Gram negatius. Són mòbils gràcies a un o varis flagels polars i rarament són immòbils. En algunes espècies es formen flagels laterals amb longitud d’ona curta. Són aerobis amb un metabolisme respiratori que estrictament usa oxigen com a acceptor final d’electrons. En alguns casos l’acceptor final pot ser el nitrat, permetent que es dóni creixement anaeròbic. No produeixen xantomonadines. Moltes, si no totes les espècies, no creixen en medi àcid (pH inferior a 4.5). La majoria d’espècies no requereixen factors de creixement orgànics. Els bacteris poden ser oxidasa-positius o negatius. Són catalasa-positius. Quimioorganotròfics. Hi ha soques de l’espècie que inclouen en la seva composició àcids grassos hidroxilats 3-OH 10:0 i 12:0, 2-OH 12:0 i ubiquinona Q-9. Estan distribuïts àmpliament a la natura. Algunes espècies són patògenes per als humans, animals i plantes. El contingut mol% G + C del DNA és 58-69. L’espècie tipus és Pseudomonas aeruginosa (Palleroni et al. 2004). Les espècies de Pseudomonas existeixen de manera individual, en parella, o bé formant cadenes curtes. La morfologia pot, ocasionalment, diferir de les descripcions generals. Els pilis són un objecte d’estudi intens en P. aeruginosa degut al seu paper en la patogènesi. El contingut baix en G+C dels gens codificadors de la pilina suggereix que han estat transmesos horitzontalment i, com a conseqüència, tenen un patró diferent en el maneig dels codons (Palleroni et al. 2004). El fet de que el gènere Pseudomonas sigui tan ubic, sembla conseqüència de els seus simples requeriments nutricionals, el rang de substrats que poden utilitzar com a font de carboni i de la gran adaptabilitat genètica i metabòlica. Es troben espècies en ambients aquàtics, terrestres, així com en teixit animal i vegetal. Essencialment, qualsevol hàbitat amb un rang de temperatura que oscil·li entre 4-420C, un rang de pH entre 4 i 8 i una font utilitzable de carboni, és colonitzable per Pseudomonas. No es troben espècies de Pseudomonas en ambients termòfils ni acidòfils. Les espècies de Pseudomonas són aeròbiques i, el requeriment d’oxigen, sembla ser la seva major limitació. Les espècies fitopatògenes es poden trobar generalment sobre plantes malaltes, en les que apareixen com a poblacions relativament homogènies quan les lesions són joves. La distribució a l’exterior de les plantes hoste no és gaire coneguda, tot i que pareix que també poden viure com a sapròfits (Palleroni et al. 2004). Hi ha espècies de Pseudomonas que tenen un paper important en la indústria alimentària. Són responsables del deteriorament de productes càrnics, aus de corral i peix, encara que l’aliment estigui refrigerat (Barrett et al., 1986). Algunes espècies es troben a l’aigua corrent i a les solucions de sanejament dels hospitals, que són medis oligotròfics (Van der Krooij, 1977). També poden suposar un problema degut a la seva capacitat de formació de biofilms. En la formació de biofilms hi juga un paper important el quorum-sensing on la detecció de la densitat poblacional exerceix un control sobre l’expressió de certs gens. Dues espècies rellevants del gènere són Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas stutzeri.. 2.

(6) Pseudomonas aeruginosa és un bacteri patogen oportunista ubic amb múltiples nínxols en l’ésser humà, incloent el pulmó. Per a establir una infecció, P. aeruginosa fa ús d’una sèrie de factors de virulència, incloent lipopolissacàrids, fosfolipases, exoproteases, fenazines, vesícules de la membrana externa, factors de secreció de tipus III, flagels i pilis. Aquests factors no només fan malbé les cèl·lules epitelials sinó que també indueixen canvis en la fisiologia i funció de les cèl·lules així com la seva forma, la permeabilitat de la membrana i la síntesi de proteïnes. Tot i que aquests factors són importants en l’inici de la infecció, molts es desregulen o perden la funció durant el curs de la infecció crònica. Pseudomonas stutzeri va ser descrita per primera vegada per Burri i Stutzer al 1895. Tot i les diferències fenotípiques amb la soca tipus del gènere, la semblança entre les seqüències de rRNA demostren que la inclusió de P. stutzeri en el gènere Pseudomonas és correcte (Lalucat et al. 2006). El treball realitzat en els darrers anys ha donat lloc a l’agrupament de diferents soques en variants genòmiques anomenades genomovars. Les soques pertinents a cada genomovar tenen característiques fenotípiques semblants (Lalucat et al. 2006). Algunes soques tenen especial interès degut a propietats metabòliques específiques. Algunes soques han demostrat ser transformables i això ha donat lloc a estudis intensos de la seva capacitat de transformació. P. stutzeri es distribueix àmpliament en l’ambient ocupant diversos nínxols ecològics incloent teixit humà (Lalucat et al. 2006). Pseudomonas stutzeri és reconegut, com totes les Pseudomonas, com un membre de la classe Gammaproteobacteria. Les cèl·lules tenen forma de vara, de 1 o 3 m de llargària i 0.5 m de gruixa. Tenen un únic flagel en posició polar. Sota certes condicions poden desenvolupar un o dos flagels laterals que es caracteritzen per un moviment en longitud d’ona curta. S’ha suggerit que aquests flagels intervenen en el procés de formació d’eixams “swarming” i en la mobilitat per contraccions “twitching motility” sobre superfícies sòlides, tot i que els pilis de tipus IV també poden tenir un paper en aquests processos. Entre altres característiques fenotípiques, són bacteris Gram negatius, catalasa i oxidasa positius i tenen un metabolisme estrictament respiratori. A més, P. stutzeri es defineix com desnitrificant. Es diferencien d’altres espècies del mateix gènere en que no produeixen pigments fluorescents, sense oblidar que no són les úniques dins el grup. Abans dels avanços en els mètodes genòmics per a la identificació de bacteris P. stutzeri fou confós amb altres espècies degut a la semblança fenotípica. P. stutzeri pot viure en ambients oligotròfics, amb ions d’amoni o nitrat i una única molècula orgànica com a font de carboni i energia. Algunes són diazotròfiques i aquesta característica és rara dins el gènere Pseudomonas. Cap soca tolera condicions acídiques i no creixen sota un pH de 4.5. Té un metabolisme respiratori on l’oxigen és l’acceptor final d’electrons. Tot i així, totes les soques poden utilitzar nitrat com un acceptor alternatiu d’electrons donant lloc a un procés de desnitrificació. Tenen la capacitat de degradar oxidativament compostos aromàtics mitjançant mono- i dioxigenases. Una característica fenotípica d’aquesta espècie és la capacitat amilolítica. Les espècies de Pseudomonas són quimiotàctiques i són atretes per un ampli espectre de compostos orgànics. Tot i així, la maquinària que permet dur a terme aquests processos roman inexplorada. Una característica és que també són atretes per compostos que són incapaces de metabolitzar (OrtegaCalvo et al. 2006; Lalucat et al. 2006). Les espècies de Pseudomonas tenen un ampli rang d’adhesines que tenen un paper en la unió al substrat i això duu a la formació de biofilms. Tant els flagels com els pilis semblen ser importants en la colonització de superfícies biòtiques i abiòtiques, particularment en la formació inicial de microcolònies (Lalucat et al. 2006). El concepte de genomovar va ser definit com un taxó provisional per a Pseudomonas stutzeri per a classificar soques genotípicament similars dins l’espècie. Dues soques que es classifiquen fenotípicament com a membres de l’espècie s’inclouen en la mateixa genomovar quan la comparació DNA-DNA dona valors de semblança superior al 70%. Al contrari, quan dues soques comparades tenen un valor de semblança igual o inferior al 50% es classifiquen en genomovars diferents. Les nostres dues soques de Pseudomonas stutzeri es classifiquen a la genomovar 1.. 3.

(7) Figura I. Relacions entre diferents genomovars del gènere Pseudomonas. (M. Gomila, Comunicación personal). Un dels factors que afavoreix la ubiqüitat de l’espècie és el fet de que és altament transformable. També pot ser un dels factors que afavoreixi el procés de diversificació que es dóna dins la mateixa espècie. Aproximadament un terç de les soques que pertanyen a l’espècie tenen la capacitat de transformar-se. És una capacitat que ha estat molt estudiada en els darrers vint anys. S’ha demostrat que P. stutzeri es pot transformar a partir de DNA associat a partícules minerals al laboratori, a partir de DNA unit a sediments marins autoclavats i DNA adsorbit en sòl estèril (Lalucat et al. 2006). P. stutzeri es pot transformar a partir de DNA cromosòmic i de DNA plasmídic. El DNA que s’inclou en el genoma en el procés de transformació pot ser de la mateixa espècie o por provenir d’una espècie distinta (Lalucat et al. 2006). S’ha demostrat el rol que tenen els pilis de tipus IV en el procés de transformació. Pseudomonas stutzeri és una espècie associada als ambients clínics. Tot i així, en la majoria dels casos les infeccions ocorren en pacients immunodeprimits, revelant el baix grau de virulència de l’espècie. S’han fet estudis de la sensibilitat de P. stutzeri front a diferents antibiòtics. Aquests estudis revelen que P. stutzeri és sensible a més antibiòtics que P. aeruginosa. Aquesta major sensibilitat es va explicar pel fet de que la prevalença de l’espècie als hospitals és molt més baixa que la prevalença de P. aeruginosa i que, per tant, ha estat exposada a menys antibiòtics. Tot i aquests resultats, s’han aïllat soques resistents de P. stutzeri per a quasi totes les famílies d’antibiòtics i això suposa que l’espècie té un ampli rang de mecanismes de resistència a agents antimicrobians dels quals se n’han descrit dos. Un mecanisme es basa en alteracions en les proteïnes de la membrana externa i de la composició de lipopolisacàrids. L’altre es basa en la presència de -lactamases que hidrolitzen les penicil·lines, cefalosporines i monobactames (Lalucat et al. 2006). El genoma de Pseudomonas stutzeri A1501 fou seqüenciat per Yongliang Yan et al. al 2008 aïllada d’un camp d’arròs (Yongliang Yan et al. 2008). Els resultats obtinguts revelen que es composa per un únic cromosoma circular de 4,567,418 pb. Codifica 4,146 probables proteïnes, 59 gens de tRNA i quatre operons de rRNA. Conté 42 còpies de seqüències 4.

(8) repetides (formant part d’un 1.35% del genoma) que s’agrupen en 10 tipus diferents que codifiquen per transposases. Conté quatre regions amb un contingut atípic de CG que estan flanquejades per gens de tRNA que, juntament amb una estructura típica d’illes genòmiques, suggereix que el material genètic ha estat transferit recentment dins la soca. També hi ha una cinquena regió amb gens nif que també es podria considerar una illa genòmica. La mida del genoma és més petita que la d’altres espècies de Pseudomonas. L’espècie a la que més s’assembla és a Pseudomonas aeruginosa tot i que la majoria de gens codificadors de factors de virulència presents a P. aeruginosa no són presents a P. stutzeri A1501 com els sistemes de secreció de tipus III i IV, sistemes de síntesi de molècules involucrades en el quòrum sensing, la síntesi d’alginat, sideròfors i rutes biosintètiques d’antibiòtics. El genoma de la soca ATCC 17588 de Pseudomonas stutzeri fou estudiat per Ming Chen et al. al 2011 i és la soca tipus de l’espècie. Consisteix en un únic cromosoma circular de 4,547,930 pb amb un contingut mitjà de GC del 63.9%. No es varen detectar plàsmids. El genoma conté 4,217 gens codificadors de proteïnes, 58 gens codificadors de tRNA i 12 gens codificadors de rRNA. El genoma és un poc més petit que el de P. stutzeri A 1501 però és molt semblant. Les dues soques comparteixen 3,255 gens i 614 gens són exclusius de la soca ATCC 17588. Més de la meitat d’aquests gens codifiquen proteïnes de funció desconeguda. Conté gens involucrats en la desnitrificació, la degradació de benzoat/catecol, quimiotaxis i altres funcions com la soca A 1501 però, no conté gens per a la fixació de nitrogen.. Els factors de virulència a Pseudomonas La patogenicitat és la capacitat o habilitat d’un organisme de causar una malaltia. La virulència és la mesura quantitativa de la capacitat de causar una malaltia, és a dir, una mesura de la patogenicitat (Chen et al., 2012). Els factors de virulència són proteïnes extracel·lulars, la majoria enzims, produïdes per patògens que contribueixen en la invasió i colonització dels teixits i en l’establiment i al manteniment de la malaltia (Brock, 10ª Edició, 2004.). Hi ha dos tipus de factors de virulència. Per una banda, tenim els que estan involucrats en les infeccions agudes. Aquests es troben o bé en la superfície de l’organisme o bé són secretats. Els pilis, la exotoxina A, la fosfolipasa C i l’exoenzim S són factors de virulència que pertanyen a aquest primer grup. Per altra banda trobem els factors involucrats en la infecció crònica. Entre aquests hi trobem els sideròfors i la producció d’una pseudocàpsula d’alginat en el cas de pacients malalts de fibrosi quística. Per regular tots aquests factors de virulència trobem dos tipus de sistemes de regulació. Per una banda trobem el sistema regulatori transcripcional de dos components i el sistema de quorum sensing. Aquests dos mecanismes són necessaris per a la supervivència i la proliferació dels microorganismes dins l’hoste. Un dels factors de virulència que empra Pseudomonas és l’alginat. L’alginat és una biomolècula d’elevat pes molecular composta per polímers d’àcid L-gulurònic i D-mannurònic amb enllaços -1,4. Un cas molt estudiat és el de la producció d’alginat per Pseudomonas aeruginosa en casos de fibrosi quística. La infecció dels pulmons causa el reclutament de cèl·lules inflamatòries al lloc d’infecció, on alliberen espècies reactives d’oxigen que causen mal al teixit. L’alginat sembla protegir al patogen dels radicals lliures a més de brindar protecció front als fagòcits ja que, tot i la seva presència, els anticossos que juguen un paper en la resposta fagocítica no són capaços d’intervenir en la resposta immune contra el patogen. També protegeix al patogen de la deshidratació i antibiòtics i a més proporciona adherència a les cèl·lules epitelials formant un biofilm (Ryder et al., 2007). Un altre factor de virulència descrit és l’exoenzim-S (ADP-ribosyltransferase). És un factor associat a l’habilitat del patogen de creuar barreres epitelials i passar al torrent sanguini a partir del qual pot distribuir-se a la resta de l’organisme de l’hoste. És el responsable de la disrupció de la organització normal del citoesquelet, de la destrucció de les immunoglobulines G i A, de la despolimerització dels 5.

(9) filaments d’actina i contribueix a la resistència a macròfags (Rucks et al., 2002). La Exotoxina de Pseudomonas és una toxina secretada amb la capacitat de transposar un domini catalític dins cèl·lules de mamífers a través de receptors específics. Una vegada la toxina ha arribat al citoplasma s’inhibeix la síntesi de proteïnes degut a la interrupció de l’activitat de ribosilació de l’ADP del factor 2 d’elongació. Causa necrosi del teixit (Allured et al., 1985). La fosfolipasa-C és un enzim hidrolític que hidrolitza l’enllaç fosfodièster dels fosfolípids. La seva funció més característica com a factor de virulència és l’hemòlisi. Els llocs d’acció més comuns són el fetge i els ronyons de mamífers (Elleboudy et al., 2014). Els flagels també juguen un paper important en la virulència. Els flagels són essencials per a la motilitat del patogen i això, combinat amb la quimiotaxis, permet al patogen dirigir-se cap als substrats que siguin més convenients. En el cas de Pseudomonas, la presència i ús dels flagels es pot combinar amb la twitching motility. En el procés de la twitching motility hi juguen un paper important els pilis o fímbries de tipus IV. Aquests pilis també intervenen en l’adhesió a cèl·lules epitelials (Feldman et al., 1997). El nombre de flagels de P. aeruginosa ve controlat per la FleN, una proteïna putativa d’unió de ATP-GTP. L’alteració d’aquesta proteïna resulta en un descontrol en el nombre de flagels que donarà lloc a defectes de motilitat, important per a activitats com la quimiotaxis (Dasgupta et al., 2000). S’accepta que els flagels laterals participen en l’activitat de swarming (Shinoda i Okamoto, 1977). Els sideròfors són un altre factor de virulència present a Pseudomonas. Els sideròfors són agents quelants d’ions ferrosos que permeten als patògens obtenir ferro, indispensable per al seu creixement. Un d’aquests sideròfors presents a Pseudomonas és la pioquelina, el precursor de la qual és el salicilat. Pseudomonas conté gens que codifiquen per a la biosíntesi de salicilat i gens que codifiquen per a la transformació d’aquest a pioquelina. Un altre sideròfor present en Pseudomonas és la pioverdina (Gherinot, 1994). La producció d’antibiòtics també pot considerar-se com un factor de virulència ja que pot reduir possibles competències. Un antibiòtic produït per Pseudomonas és la fenazina. En el cas de Pseudomonas aeruginosa, el precursor de la fenazina és l’àcid shikímic. A partir de les fenazines es poden produir derivats amb activitat antibiòtica com la piocianina. La producció de la fenazina és un procés regulat pel quorum sensing (Mazzola et al., 1992).. Una gran part dels factors de virulència són proteïnes que han de ser secretades. Aquestes poden quedar adherides a la superfície del patogen, poden alliberar-se a la matriu extracel·lular o bé poden ser injectades al citosol d’una cèl·lula hoste. En bacteris Gram negatius, la secreció de proteïnes s’aconsegueix després de creuar una envolta formada per dues barreres hidròfobes, la interna (citoplasmàtica) i l’externa que delimiten una capa intermitja de peptidoglicà, el periplasma. S’han descrit sis classes de sistemes de secreció que s’anomenen des de “Type I Secretion System” o T1SS fins a “Type VI Secretion System” o T6SS. Més recentment s’han descrit dos sistemes de secreció més, el T7SS i el “fimbrial chaperone-usher pathway” (Bleves et al., 2010). El T1SS és un dels sistemes de secreció més simples. Requereix una proteïna de la membrana externa, un transportador ABC (ATP-binding cassette) que s’insereix a la membrana interna i aporta energia al procés i, finalment, una proteïna adaptadora que connecta els dos components anteriors. Els substrats del T1SS estan senyalats amb una senyal de secreció no escindible a l’extrem C-terminal. Les exoproteïnes es secreten en forma desplegada. El T2SS també rep el nom de “secreton” i és un dels sistemes utilitzats per bacteris Gram negatius més versàtils per secretar proteïnes extracel·lulars al medi que les envolta. És el que més facilitat té de promoure la translocació de la membrana externa d’una gran varietat de proteïnes multimèriques que es pleguen en el periplasma. El T2SS consta de 3 parts i el seu sistema de muntatge es considera 6.

(10) homòleg al dels pilis de tipus IV. La primera part és una plataforma proteica que forma la base i utilitza ATP com a motor. La segona part és un canal constituït per una estructura multimèrica inclosa en la membrana externa i, finalment, una estructura fimbrilar que s’anomena el pseudopili. El paper del pseudopili és empènyer les proteïnes a través del canal cap a l’exterior cel·lular amb la força de l’ATP que li proporciona el motor. El T3SS és un sistema que permet la injecció de proteïnes tòxiques, anomenades efectors, directament dins el citosol de la cèl·lula hoste. El contacte entre la cèl·lula bacteriana i la cèl·lula eucariota promou la translocació dels efectors en un mecanisme d’una passa. Molts d’aquests efectors de tipus III són proteïnes que imiten les proteïnes eucariotes i poden modificar la resposta de l’hoste. L’aparell del T3SS també es coneix com injectosoma i està relacionat amb el sistema d’assemblatge de flagels. El mecanisme és semblant al del secreton, a diferència de que el T3SS insereix els efectors a l’interior de la cèl·lula hoste en lloc de deixar-los a la matriu extracel·lular. Les subunitats proteiques del T4SS formen un canal en les membranes bacterianes i, freqüentment una estructura en forma de pili. És una eina fonamental en la transmissió horitzontal de material. El T4SS no només transfereix proteïnes sinó que també complexes nucleoprotèics i, per això, juga un paper important en la transferència horitzontal de gens. La transferència horitzontal de gens ha jugat un paper important en la evolució de Pseudomonas. S’han descrit transferències de factors de virulència i factors de resistència a antibiòtics (Juhas, 2014). En la majoria dels casos, els gens que codifiquen per al T4SS es localitzen en un únic operó però, el mecanisme de regulació no està descrit en Pseudomonas sinó que s’utilitzen models com Agrobacterium tumefaciens o Eschericha coli (Darbari et al., 2015). El T5SS és el sistema de secreció més senzill descrit fins ara. Permet la sortida de proteïnes grosses associades amb la virulència i l’adhesió. Consta d’un procés de dues passes. Primer, les proteïnes creuen la membrana interna a través de la maquinària de transport Sec. Després, es transporten a través de la membrana externa a través d’un canal format per un barril . Finalment, o bé les exoproteïnes romanen associades a la cara exterior de la membrana externa o bé són alliberades a la matriu extracel·lular per escissió proteolítica. Hi ha dos tipus de T5SS en bacteris Gram negatius: els autotransportadors (AT o T5aSS i T5cSS) i els “2-partner secretion” (TPS o T5bSS). Les proteïnes que es secreten a través d’autotransportadors tenen un únic pèptid senyal a l’extrem amino-terminal, un domini  de 12 làmines  a l’extrem C-terminal i, entre aquest dos un domini passatger que engloba el domini catalític de la proteïna. El pèptid senyal permet l’exportació de la proteïna a través de la membrana interna i després s’escindeix. Una vegada en el periplasma, l’extrem C-terminal s’insereix en la membrana externa i forma un barril  que permetrà o bé l’exposició del domini passatger a la superfície del bacteri o bé el seu alliberament a la matriu extracel·lular després de l’escissió per autoproteòlisi o per una proteasa específica. La diferència entre el T5aSS i el T5bSS és que els barrils  estan formats per un monòmer o per un homo-trímer (cada monòmer amb 4 làmines ) respectivament. El T6SS és un sistema de secreció els substrats del qual no tenen pèptid senyal. Els substrats s’anomenen Hcp (hemolysin-coregulated protein) i VgrG (valine-glycine repeat) i s’alliberen al medi extracel·lular. Hi ha evidències que suggereixen que les Hsp i VgrG que es secreten podrien considerarse com a components extracel·lulars que formarien part de la maquinària de la T6SS. Això és degut a que l’estructura de Hcp és homòloga al domini tubular de la coa del bacteriòfag T4 i que l’estructura de l’extrem amino-terminal de la VgrG s’assembla a les proteïnes gp5 i gp27 del bacteriòfag T4 que compondrien la punxa de la coa. Aquesta estructura permetria perforar la membrana cel·lular.. 7.

(11) Figura II. A. Estructura dels sistemes de secreció T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS. (Brock et al. 2009). Figura II. B. Representació esquemàtica dels diferents factors de secreció (Bleves et al., 2010).. Objectius -. Realitzar un anàlisi comparatiu dels factors de virulència presents a dues soques de Pseudomonas: una d’origen clínic anomenada Pseudomonas stutzeri ATCC17588 i una d’origen ambiental anomenada Pseudomonas stutzeri A1501 front als factors de virulència coneguts de Pseudomonas aeruginosa PAO1.. -. Establir relacions entre els factors de virulència d’aquestes dues soques i els factors de virulència d’altres espècies del gènere Pseudomonas, ja coneguts.. -. Clarificar la diferència entre la soca Pseudomonas stutzeri A1501 i la soca Pseudomonas stutzeri ATCC17588.. Materials i mètodes. Característiques de les soques emprades Pseudomonas aeruginosa PAO1 conté un cromosoma circular de 6.26 Mb amb un percentatge de GC del 66.6%. El seu genoma presenta 5,697 gens que codifiquen per 5,572 proteïnes. Conté 13 tipus de rRNA, 63 tipus de tRNA i 30 tipus d’altres RNA. El seu nombre de referència al National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) és NC_002516.2. Pseudomonas stutzeri A1501 conté un cromosoma circular de 4.57 Mb amb un percentatge de GC del 63.9%. El seu genoma presenta 4,119 gens que codifiquen per 4,093 proteïnes. Conté 12 tipus de rRNA i 60 tipus de tRNA. El seu nombre de referència al National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) és NC_009434.1. Pseudomonas stutzeri ATCC17588 o bé Pseudomonas 8.

(12) stutzeri LMG1119 conté un cromosoma circular de 4.55 Mb amb un percentatge de GC del 63.9%. El seu genoma presenta 4,181 gens que codifiquen per 4,051 proteïnes. Conté 12 tipus de rRNA i 59 tipus de tRNA. El seu nombre de referència al National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) és NC_015740.1.. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 en front als factors de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1 Es va fer servir una base de dades de factors de virulència del genoma de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (NC_002516.2 com a nombre de referència a l’NCBI) creada per la Dra. García-Valdés al laboratori de Microbiologia a partir dels treballs de Potvin, Winstanley i Wolfgang (Potvin et al. 2003; Winstanley et al. 2009; Wolfgang et al. 2003) que inclouen 333 factors de virulència. Per a identificar aquests factors de virulència en els genomes de Pseudomonas stutzeri A1501 (NC_009434.1 com a nombre de referència a l’NCBI) i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 (NC_015740.1 com a nombre de referència a l’NCBI) es va utilitzar el programa BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, T. A. 1999). El que es feia era crear una base de dades local, un “local blast”, comparant la seqüència nucleotídica del factor de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1 amb al genoma sencer de les dues soques. Cada factor s’enviava a comparar (Local Blast) amb una base de dades nucleotídica que corresponia amb el genoma sencer de la soca desitjada. Hi havia una base de dades nucleotídica per a cada soca. Les dades obtingudes de la realització del local blast s’introduïen i organitzaven a una fulla de càlcul de Microsoft Excel (2010 Microsoft Corporation versió 14.0.7153.5000). El criteri establert per a determinar que un factor de virulència era present a alguna de les dues soques va ser que hi hagués al menys un 75% de solapament i un 65% d’identitat entre les dues seqüències comparades. Els factors de virulència que compleixen aquest criteri es varen marcar de color verd i, al contrari, els que no compleixen el criteri es marcaren de color vermell. Per a la representació gràfica de les dades es va utilitzar el mateix programa Microsoft Excel (2010 Microsoft Corporation versió 14.0.7153.5000).. Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front a 16 altres soques del gènere Pseudomonas Per a la realització de l’”Unweighed Pair Group Method with Arithmetic mean” (UPGMA) es varen fer servir dades de diferents soques de bacteris del Virulence Factors Data Base de l’Institute of Pathogen Biology de Pequín, Xina (http://www.mgc.ac.cn/VFs/). Les soques utilitzades eren: Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14, Pseudomonas aeruginosa LESB58, Pseudomonas entomophila L48, Pseudomonas protegens, Pseudomonas koreensis, Pseudomonas fluorescents SBW25, Pseudomonas mendocina ymp, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas putida F1, Pseudomonas putida GB-1, Pseudomonas putida W619, Pseudomonas syringae DC3000 (patògen de la tomàtiga), Pseudomonas syringae B728a (patògen del blat de moro) i Pseudomonas syringae 1448A (patògen dels fesols). Es varen descarregar les dades en format Microsoft Excel i es varen transformar en una matriu on, en cas d’haver-hi presència del factor de virulència s’assignava un 1 a la cel·la i, en cas contrari, un 0. Una vegada feta la matriu, s’introduïen les dades en format FASTA al programa online DendroUPGMA (S. García-Vallvé i P. Puigbò, 2002. http://genomes.urv.cat/UPGMA/index.php?entrada=Example2) que, a partir d’aquestes dades, crea una matriu amb tots els coeficients de Jaccard (que indica la similitud entre les diferents variables) a partir de la qual construeix el dendrograma.. 9.

(13) Resultats Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front als factors de virulència de Pseudomonas aerugiosa PAO1 L’anàlisi de les dades ha permès obtenir els següents resultats: La següent taula recopila totes les dades de cada un dels 333 factors de virulència de cada una de les dues soques, introduïdes una per una a la base de dades local “local blast”. Es va realitzar un total de 666 local blasts i es varen introduir les dades una per una a la taula d’esxel. A la primera columna es mostra la categoria en que s’agrupa el factor de virulència. La segona columna correspon al nom del gen o el seu locus tag. La tercera columna mostra el nombre de nucleòtids que té la seqüència del factor de virulència a Pseudomonas aeruginosa PAO1, la qual s’introdueix al local blast per comparar amb el genoma de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588. El “valor de solapament” mostra el valor de solapament que s’ha obtingut entre la seqüència de Pseudomonas aeruginosa PAO1 i la seqüència de Pseudomonas stutzeri ATCC17588, és a dir, la llargària, en nucleòtids, de la seqüència que coincideix a les dues espècies comparades. El “% de solapament” indica el percentatge coincident dins la seqüència total del factor de virulència de Pseudomonas aeruginosa PAO1. El “valor d’identitat” indica el nombre de nucleòtids idèntics dins la seqüència coincident i, finalment, el “% d’identitat” indica el percentatge de nucleòtids idèntics dins la seqüència coincident.. Valor Nº Grups majoritaris de Gens/Locus solapament nucleòtids factors de virulència tag (*) de ATCC17588 a PAO1 i PAO1. AdherènFlagels cia. % Valor % Identitat Solapament identitat de ATCC17588 ATCC17588 i ATCC17588 i i PAO1 PAO1 PAO1. Valor solapament de A1501 i PAO1. % Solapament A1501 i PAO1. Valor identitat A1501 i PAO1. % % Identitat Identitat ATCC17588 A1501 i i A1501 PAO1. fliF. 1797. 654. 36,39. 550. 84. 654. 36,39. 551. 84. 99,82. flgD. 714. 239. 33,47. 200. 83. 22. 3,08. 21. 95. 10,50. flgB. 408. 119. 29,17. 101. 84. 73. 17,89. 64. 87. 63,37. flgC. 441. 134. 30,39. 117. 87. 168. 38,10. 152. 90. 76,97. flgF. 750. 174. 23,20. 148. 85. 537. 71,60. 445. 82. 33,26. flgG. 786. 761. 96,82. 669. 84. 764. 97,20. 669. 87. 100,00. flhA. 2124. 2074. 97,65. 1726. 83. 2074. 97,65. 1733. 83. 99,60. 10.

(14) flhB. 1137. 568. 49,96. 465. 81. 477. 41,95. 396. 83. 85,16. flhF. 1290. 290. 22,48. 236. 81. 290. 22,48. 236. 81. 100,00. fliP. 768. 347. 45,18. 306. 88. 347. 45,18. 306. 88. 100,00. fliQ. 270. 189. 70,00. 162. 85. 189. 70,00. 162. 85. 100,00. fliR. 777. 170. 21,88. 151. 88. 170. 21,88. 150. 88. 99,34. fliD. 1425. 19. 1,33. 19. 100. 19. 1,33. 19. 100. 100,00. flgE. 1389. 215. 15,48. 184. 85. 115. 8,28. 93. 80. 50,54. flgK. 2052. 105. 5,12. 93. 88. 47. 2,29. 44. 93. 47,31. flgL. 1320. 19. 1,44. 19. 100. 22. 1,67. 22. 100. 86,36. fliE. 330. 221. 66,97. 187. 84. 221. 66,97. 188. 85. 99,47. flgH. 696. 296. 42,53. 252. 85. 342. 49,14. 297. 86. 84,85. fliG. 1017. 983. 96,66. 847. 86. 983. 96,66. 850. 86. 99,65. fliM. 972. 935. 96,19. 821. 87. 935. 96,19. 823. 88. 99,76. fliN. 474. 255. 53,80. 222. 87. 255. 53,80. 222. 87. 100,00. flgI. 1110. 1046. 94,23. 864. 82. 1017. 91,62. 865. 85. 99,88. flgJ. 1203. 265. 22,03. 223. 84. 288. 23,94. 247. 85. 90,28. fliJ. 444. 33. 7,43. 33. 100. 33. 7,43. 33. 100. 100,00. fliO. 453. 178. 39,29. 147. 82. 179. 39,51. 147. 82. 100,00. fleN. 843. 752. 89,21. 622. 82. 788. 93,48. 657. 83. 94,67. fliC. 1467. 118. 8,04. 101. 85. 359. 24,47. 300. 83. 33,67. fliI. 1356. 1163. 85,77. 1000. 85. 1163. 85,77. 1005. 86. 99,50. flgM. 324. 21. 6,48. 21. 100. 40. 12,35. 36. 90. 58,33. PA1103. 807. 536. 66,42. 428. 79. 537. 66,54. 431. 80. 99,30. PA1441 pilQ. 1283 2145. 306 245. 23,85 11,42. 253 195. 82 79. 306 92. 23,85 4,29. 253 79. 82 85. 100,00 40,51. 510. 16. 3,14. 16. 100. 24. 4,71. 22. 91. 72,73. 507. 18. 3,55. 18. 100. 18. 3,55. 18. 100. 100,00. 1701. 650. 38,21. 534. 82. 821. 48,27. 672. 81. 79,46. 1701. 650. 38,21. 534. 82. 821. 48,27. 672. 81. 79,46. fimT Pilis de fimU tipus IV pilB pilB. 11.

(15) Prot. Adhe. Probable adhesin. AntiAlginat fagocitosi. pilE. 426. 20. 4,69. 20. 100. 28. 6,57. 26. 92. 76,92. pilF. 759. 84. 11,07. 74. 88. 84. 11,07. 74. 88. 100,00. pilM. 1065. 469. 44,04. 390. 83. 489. 45,92. 403. 82. 96,77. pilN. 597. 151. 25,29. 120. 79. 179. 29,98. 141. 78. 85,11. pilO. 623. 323. 51,85. 257. 79. 131. 21,03. 109. 83. 42,41. pilP. 525. 51. 9,71. 43. 84. 51. 9,71. 45. 88. 95,56. pilV. 558. 54. 9,68. 46. 85. 30. 5,38. 29. 96. 63,04. pilW. 825. 60. 7,27. 52. 86. 61. 7,39. 52. 85. 100,00. pilX. 588. 21. 3,57. 21. 100. 21. 3,57. 21. 100. 100,00. pilY1. 3486. 64. 1,84. 56. 87. 94. 2,70. 78. 82. 71,79. pilY1. 3486. 64. 1,84. 56. 87. 94. 2,70. 78. 82. 71,79. pilY2. 348. 23. 6,61. 22. 95. 23. 6,61. 22. 95. 100,00. pilZ. 357. 317. 88,80. 284. 90. 317. 88,80. 287. 90. 98,95. pilA. 450. 19. 4,22. 19. 100. 19. 4,22. 19. 100. 100,00. pilD. 873. 152. 17,41. 133. 87. 152. 17,41. 132. 86. 99,25. cupA1. 552. 24. 4,35. 23. 95. 24. 4,35. 23. 95. 100,00. cupA4. 1362. 22. 1,62. 22. 100. 22. 1,62. 22. 100. 100,00. cupB6. 1146. 21. 1,83. 21. 100. 23. 2,01. 22. 95. 95,45. cupC1. 618. 17. 2,75. 17. 100. 19. 3,07. 19. 100. 89,47. cupE4. 789. 19. 2,41. 19. 100. 20. 2,53. 20. 100. 95,00. pilC. 1125. 101. 8,98. 85. 84. 102. 9,07. 85. 83. 100,00. cupB5. 3057. 19. 0,62. 19. 100. 20. 0,65. 20. 100. 95,00. znuA. 924. 190. 20,56. 154. 81. 190. 20,56. 157. 82. 98,09. PA2407. 954. 21. 2,20. 21. 100. 29. 3,04. 27. 93. 77,78. alg44. 1170. 23. 1,97. 22. 95. 23. 1,97. 22. 95. 100,00. alg8. 1485. 20. 1,35. 20. 100. 20. 1,35. 20. 100. 100,00. algX. 1425. 22. 1,54. 21. 95. 22. 1,54. 21. 95. 100,00. algK. 1428. 21. 1,47. 21. 100. 20. 1,40. 20. 100. 95,24. 12.

(16) alfF. 651. 25. 3,84. 24. 96. 25. 3,84. 24. 96. 100,00. algI. 1563. 66. 4,22. 58. 87. 66. 4,22. 58. 87. 100,00. algJ algE. 1176 1473. 22 25. 1,87 1,70. 22 24. 100 96. 21 25. 1,79 1,70. 21 24. 100 96. 95,45 100,00. algG. 1632. 20. 1,23. 20. 100. 30. 1,84. 27. 90. 74,07. algW. 1170. 449. 38,38. 382. 85. 449. 38,38. 382. 85. 100,00. mucC. 456. 18. 3,95. 18. 100. 23. 5,04. 22. 95. 81,82. pchD. 1644. 33. 2,01. 30. 90. 38. 2,31. 34. 89. 88,24. pchC. 756. 21. 2,78. 21. 100. 21. 2,78. 21. 100. 100,00. pchF. 5430. 22. 0,41. 22. 100. 27. 0,50. 26. 96. 84,62. pvdD. 7347. 19. 0,26. 19. 100. 19. 0,26. 19. 100. 100,00. pvdD. 7347. 19. 0,26. 19. 100. 19. 0,26. 19. 100. 100,00. pvdF. 828. 19. 2,29. 19. 100. 19. 2,29. 19. 100. 100,00. pvcA. 987. 20. 2,03. 20. 100. 20. 2,03. 20. 100. 100,00. pvcB. 876. 19. 2,17. 19. 100. 22. 2,51. 21. 95. 90,48. pvcC. 1503. 31. 2,06. 28. 90. 31. 2,06. 28. 90. 100,00. pvcD. 648. 23. 3,55. 22. 95. 23. 3,55. 22. 95. 100,00. pchA. 1431. 20. 1,40. 20. 100. 20. 1,40. 20. 100. 100,00. pchB. 306. 18. 5,88. 18. 100. 18. 5,88. 18. 100. 100,00. Àc. Aerug.. pchE. 4317. 37. 0,86. 34. 91. 37. 0,86. 34. 91. 100,00. Abs. Hemo.. phuR. 2295. 19. 0,83. 19. 100. 37. 1,61. 34. 91. 55,88. aprA. 1440. 32. 2,22. 29. 90. 32. 2,22. 29. 90. 100,00. aprA. 1440. 32. 2,22. 29. 90. 32. 2,22. 29. 90. 100,00. aprI aprF. 396 1446. 20 20. 5,05 1,38. 20 20. 100 100. 20 20. 5,05 1,38. 20 20. 100 100. 100,00 100,00. aprD. 1782. 42. 2,36. 39. 92. 42. 2,36. 38. 90. 97,44. aprE. 1299. 18. 1,39. 18. 100. 19. 1,46. 19. 100. 94,74. lasA. 1257. 22. 1,75. 22. 100. 22. 1,75. 22. 100. 100,00. Piochelina. Pioverdina. Captació de ferro. Paerucumarina. Salicilat. Proteasa Proteases alcalina. lasA. 13.

(17) lasB. T2SS. Sistemes de secreció Sistema de secreció xcp (T2SS). T3SS. lasB. 1497. 25. 1,67. 24. 96. 25. 1,67. 25. 100. 96,00. PA0683. 1146. 19. 1,66. 19. 100. 19. 1,66. 19. 100. 100,00. PA0684. 594. 20. 3,37. 20. 100. 17. 2,86. 17. 100. 85,00. PA0685. 2412. 21. 0,87. 21. 100. 30. 1,24. 28. 93. 75,00. PA0686. 1410. 419. 29,72. 335. 79. 326. 23,12. 263. 80. 78,51. PA0687. 1215. 32. 2,63. 32. 100. 32. 2,63. 32. 100. 100,00. PA1382. 2280. 18. 0,79. 18. 100. 18. 0,79. 18. 100. 100,00. PA2672. 591. 22. 3,72. 21. 95. 17. 2,88. 17. 100. 80,95. PA2673. 426. 18. 4,23. 18. 100. 18. 4,23. 18. 100. 100,00. PA2674. 411. 18. 4,38. 18. 100. 28. 6,81. 26. 92. 69,23. PA2675. 435. 18. 4,14. 18. 100. 25. 5,75. 23. 92. 78,26. PA2676. 1188. 18. 1,52. 18. 100. 18. 1,52. 18. 100. 100,00. PA2677. 1728. 69. 3,99. 65. 94. 66. 3,82. 62. 93. 95,38. xcpU. 519. 56. 10,79. 50. 89. 56. 10,79. 50. 89. 100,00. xcpQ. 1977. 299. 15,12. 255. 85. 299. 15,12. 256. 85. 99,61. xcpQ. 1977. 299. 15,12. 255. 85. 299. 15,12. 256. 85. 99,61. xcpS. 1218. 404. 33,17. 347. 85. 404. 33,17. 347. 85. 100,00. xcpT. 447. 399. 89,26. 348. 87. 399. 89,26. 348. 87. 100,00. xcpV. 390. 46. 11,79. 42. 91. 46. 11,79. 41. 89. 97,62. xcpW. 714. 77. 10,78. 67. 87. 77. 10,78. 67. 87. 100,00. xcpX. 1002. 36. 3,59. 35. 97. 36. 3,59. 35. 97. 100,00. xcpY. 1149. 26. 2,26. 25. 96. 26. 2,26. 25. 96. 100,00. xcpZ. 525. 19. 3,62. 19. 100. 23. 4,38. 22. 95. 86,36. pscO. 477. 19. 3,98. 19. 100. 21. 4,40. 21. 100. 90,48. pscP. 1110. 20. 1,80. 20. 100. 20. 1,80. 20. 100. 100,00. pscQ. 930. 18. 1,94. 18. 100. 18. 1,94. 18. 100. 100,00. pscR. 654. 53. 8,10. 48. 90. 53. 8,10. 48. 90. 100,00. pscT. 789. 19. 2,41. 27. 93. 29. 3,68. 27. 93. 100,00. pscU. 1050. 20. 1,90. 20. 100. 20. 1,90. 20. 100. 100,00. 14.

(18) ABCtransporter. pscB. 423. 18. 4,26. 18. 100. 19. 4,49. 19. 100. 94,74. pscD. 1299. 19. 1,46. 19. 100. 19. 1,46. 19. 100. 100,00. pscE. 204. 18. 8,82. 18. 100. 16. 7,84. 16. 100. 88,89. pscF. 258. 25. 9,69. 24. 96. 25. 9,69. 24. 96. 100,00. pscG. 348. 18. 5,17. 18. 100. 21. 6,03. 21. 100. 85,71. pscH. 432. 18. 4,17. 18. 100. 18. 4,17. 18. 100. 100,00. pscI. 339. 18. 5,31. 18. 100. 19. 5,60. 19. 100. 94,74. pscJ. 747. 24. 3,21. 23. 95. 25. 3,35. 24. 96. 95,83. pscK. 627. 19. 3,03. 19. 100. 23. 3,67. 23. 100. 82,61. pscL. 645. 25. 3,88. 24. 96. 25. 3,88. 24. 96. 100,00. popN. 867. 25. 2,88. 24. 96. 25. 2,88. 24. 96. 100,00. pscC. 1803. 26. 1,44. 25. 96. 26. 1,44. 25. 96. 100,00. pcrV. 885. 25. 2,82. 24. 96. 25. 2,82. 24. 96. 100,00. pcrD. 2121. 45. 2,12. 40. 88. 72. 3,39. 66. 91. 60,61. pcrG. 297. 22. 7,41. 21. 95. 22. 7,41. 21. 95. 100,00. pcrH. 504. 18. 3,57. 18. 100. 18. 3,57. 18. 100. 100,00. cupA2. 747. 18. 2,41. 18. 100. 22. 2,95. 21. 95. 85,71. cupA5. 714. 20. 2,80. 20. 100. 20. 2,80. 20. 100. 100,00. cupB2. 747. 20. 2,68. 20. 100. 20. 2,68. 20. 100. 100,00. cupB4. 741. 19. 2,56. 19. 100. 19. 2,56. 19. 100. 100,00. cupC2. 714. 18. 2,52. 18. 100. 18. 2,52. 18. 100. 100,00. PA1697. 1323. 20. 1,51. 20. 100. 59. 4,46. 53. 89. 37,74. PA1692. 267. 17. 6,37. 17. 100. 19. 7,12. 19. 100. 89,47. cupA3. 2619. 20. 0,76. 20. 100. 20. 0,76. 20. 100. 100,00. cupB3. 2535. 20. 0,79. 20. 100. 25. 0,99. 24. 96. 83,33. cupC3 pstA. 2520 1677. 19 803. 0,75 47,88. 19 693. 100 86. 19 829. 0,75 49,43. 19 694. 100 85. 100,00 99,86. PA5074. 1578. 495. 31,37. 400. 80. 268. 16,98. 221. 82. 55,25. PA3936. 819. 23. 2,81. 23. 100. 23. 2,81. 23. 100. 100,00. 15.

(19) PA0325. 930. 27. 2,90. 26. 96. 27. 2,90. 26. 96. 100,00. PA1569. 1371. 20. 1,46. 20. 100. 20. 1,46. 20. 100. 100,00. PA1144. 1335. 20. 1,50. 20. 100. 20. 1,50. 20. 100. 100,00. PA0811. 1248. 20. 1,60. 20. 100. 20. 1,60. 20. 100. 100,00. PA4887. 1317. 28. 2,13. 28. 100. 28. 2,13. 28. 100. 100,00. exoS. 1361. 17. 1,25. 17. 100. 18. 1,32. 18. 100. 94,44. exsB. 414. 21. 5,07. 21. 100. 21. 5,07. 21. 100. 100,00. exsC. 438. 19. 4,34. 19. 100. 24. 5,48. 23. 95. 82,61. spcS. 351. 25. 7,12. 23. 92. 25. 7,12. 23. 92. 100,00. toxA. 1917. 22. 1,15. 22. 100. 21. 1,10. 21. 100. 95,45. phzC2. 1218. 24. 1,97. 23. 95. 25. 2,05. 24. 96. 95,83. phzD2. 624. 19. 3,04. 19. 100. 19. 3,04. 19. 100. 100,00. phzE2. 1884. 23. 1,22. 23. 100. 23. 1,22. 23. 100. 100,00. phzA1. 488. 21. 4,30. 21. 100. 21. 4,30. 21. 100. 100,00. phzB1. 489. 22. 4,50. 21. 95. 18. 3,68. 18. 100. 85,71. phzF2. 837. 22. 2,63. 22. 100. 22. 2,63. 22. 100. 100,00. 2160. 24. 1,11. 24. 100. 24. 1,11. 24. 100. 100,00. pilG. 408. 368. 90,20. 314. 85. 368. 90,20. 315. 85. 99,68. pilH. 366. 366. 100,00. 304. 83. 366. 100,00. 304. 83. 100,00. pilI. 537. 293. 54,56. 229. 78. 293. 54,56. 229. 78. 100,00. "Twitching pilI Transport motility" pilJ. 537. 293. 54,56. 231. 78. 293. 54,56. 229. 78. 99,13. 2049. 1041. 50,81. 915. 87. 1041. 50,81. 915. 87. 100,00. pilT. 1035. 638. 61,64. 585. 91. 638. 61,64. 582. 91. 99,49. pilU. 1149. 1149. 100,00. 1003. 87. 1127. 98,09. 983. 87. 98,01. fimV. 2760. 180. 6,52. 150. 83. 180. 6,52. 150. 83. 100,00. algB. 1350. 608. 45,04. 521. 85. 602. 44,59. 516. 85. 99,04. fleR. 1422. 489. 34,39. 400. 81. 549. 38,61. 447. 81. 89,49. pfeR. 918. 31. 3,38. 29. 93. 32. 3,49. 30. 93. 96,67. Major facilitator superfamily. Exoenzim S. Exotox. A Toxines Fenazina. Trans. Tox. PA4143. Prot. Trans. "TwocompoRegulació nent system". 16.

(20) phoB. 690. 669. 96,96. 596. 89. 669. 96,96. 595. 88. 99,83. phoP. 678. 431. 63,57. 391. 84. 461. 67,99. 390. 84. 99,74. pilR. 1338. 941. 70,33. 781. 82. 941. 70,33. 783. 83. 99,74. rocA1. 630. 19. 3,02. 19. 100. 19. 3,02. 19. 100. 100,00. fleS. 1209. 107. 8,85. 95. 88. 107. 8,85. 95. 88. 100,00. pfeS. 1341. 45. 3,36. 41. 91. 38. 2,83. 36. 94. 87,80. phoQ. 1347. 174. 12,92. 146. 83. 174. 12,92. 146. 83. 100,00. pilS. 1593. 254. 15,94. 212. 83. 254. 15,94. 212. 83. 100,00. rocS1. 3639. 58. 1,59. 50. 86. 58. 1,59. 50. 86. 100,00. PA1157. 711. 274. 38,54. 230. 83. 274. 38,54. 229. 83. 99,57. algU. 582. 571. 98,11. 463. 81. 571. 98,11. 463. 81. 100,00. fliA. 744. 394. 52,96. 337. 85. 398. 53,49. 346. 86. 97,40. pvdS. 564. 22. 3,90. 22. 100. 22. 3,90. 22. 100. 100,00. rpoS. 1005. 848. 84,38. 711. 83. 848. 84,38. 710. 83. 99,86. mucA. 585. 56. 9,57. 52. 92. 56. 9,57. 52. 92. 100,00. exsA. 837. 19. 2,27. 19. 100. 19. 2,27. 19. 100. 100,00. fleQ. 1473. 719. 48,81. 607. 84. 719. 48,81. 609. 84. 99,67. lasR. 720. 22. 3,06. 21. 95. 17. 2,36. 17. 100. 80,95. mexT. 1044. 513. 49,14. 419. 81. 513. 49,14. 420. 81. 99,76. mvfR. 999. 20. 2,00. 20. 100. 24. 2,40. 23. 95. 86,96. pchR. 891. 25. 2,81. 24. 96. 25. 2,81. 24. 96. 100,00. psrA Reguladors de la ptxR transcripptxS ció rhlR. 702. 206. 29,34. 187. 90. 206. 29,34. 186. 90. 99,47. 939. 22. 2,34. 22. 100. 22. 2,34. 22. 100. 100,00. 1023. 19. 1,86. 19. 100. 19. 1,86. 19. 100. 100,00. 726. 19. 2,62. 19. 100. 19. 2,62. 19. 100. 100,00. toxR. 780. 24. 3,08. 23. 95. 24. 3,08. 23. 95. 100,00. vfr. 645. 606. 93,95. 502. 82. 606. 93,95. 496. 81. 98,80. pcrR metE. 435 2301. 19 730. 4,37 31,73. 19 619. 100 84. 19 730. 4,37 31,73. 19 618. 100 84. 100,00 99,84. Sigma factors. Factors inespecífics. 17.

(21) exoY. 1137. 18. 1,58. 18. 100. 18. 1,58. 18. 100. 100,00. pauC. 1494. 1113. 74,50. 954. 85. 1113. 74,50. 954. 85. 100,00. migA. 900. 23. 2,56. 22. 95. 23. 2,56. 22. 95. 100,00. arsR. 351. 22. 6,27. 21. 95. 17. 4,84. 17. 100. 80,95. pyrB. 1005. 599. 59,60. 522. 87. 602. 59,90. 522. 86. 100,00. HxcX. 966. 26. 2,69. 25. 96. 26. 2,69. 25. 96. 100,00. rhlI. 606. 19. 3,14. 19. 100. 19. 3,14. 19. 100. 100,00. birA. 3738. 152. 4,07. 134. 88. 44. 1,18. 41. 93. 30,60. crc. 780. 765. 98,08. 648. 84. 765. 98,08. 649. 84. 99,85. ftsX. 1008. 287. 28,47. 242. 84. 287. 28,47. 243. 84. 99,59. cif. 960. 26. 2,71. 24. 92. 26. 2,71. 24. 92. 100,00. cbpD. 1170. 20. 1,71. 20. 100. 20. 1,71. 20. 100. 100,00. pheA. 1098. 1016. 92,53. 878. 86. 1016. 92,53. 878. 86. 100,00. clpV1. 2709. 213. 7,86. 178. 83. 113. 4,17. 93. 82. 52,25. chpA. 7419. 1126. 15,18. 925. 82. 1126. 15,18. 926. 82. 99,89. PA1442. 522. 86. 16,48. 74. 86. 86. 16,48. 74. 86. 100,00. PA2858. 2493. 135. 5,42. 117. 86. 347. 13,92. 276. 79. 42,39. PA2831. 1128. 20. 1,77. 20. 100. 19. 1,68. 19. 100. 95,00. PA2650. 810. 21. 2,59. 21. 100. 21. 2,59. 21. 100. 100,00. PA1181. 3363. 38. 1,13. 35. 92. 38. 1,13. 34. 89. 97,14. PA4115. 1386. 1219. 87,95. 1044. 85. 1219. 87,95. 1047. 85. 99,71. PA4564. 465. 377. 81,08. 317. 84. 377. 81,08. 321. 85. 98,75. PA2972. 579. 116. 20,03. 105. 90. 116. 20,03. 106. 91. 99,06. PA4692. 1014. 174. 17,16. 143. 82. 103. 10,16. 87. 84. 60,84. cyaB. 1392. 874. 62,79. 762. 87. 874. 62,79. 761. 87. 99,87. estA. 1941. 41. 2,11. 37. 90. 41. 2,11. 37. 90. 100,00. exsD. 831. 22. 2,65. 22. 100. 21. 2,53. 21. 100. 95,45. fbp. 1011. 1002. 99,11. 882. 88. 1001. 99,01. 881. 88. 99,89. algD. 1311. 19. 1,45. 19. 100. 19. 1,45. 19. 100. 100,00. 18.

(22) wbpX. 1383. 18. 1,30. 18. 100. 26. 1,88. 25. 96. 72,00. plcH. 2193. 20. 0,91. 20. 100. 20. 0,91. 20. 100. 100,00. hcnA. 314. 17. 5,41. 17. 100. 17. 5,41. 17. 100. 100,00. hcnB. 1395. 18. 1,29. 18. 100. 18. 1,29. 18. 100. 100,00. hcnC. 1254. 20. 1,59. 20. 100. 20. 1,59. 20. 100. 100,00. PA1095. 381. 46. 12,07. 40. 86. 18. 4,72. 18. 100. 45,00. PA1096. 297. 26. 8,75. 25. 96. 26. 8,75. 25. 96. 100,00. PA3350. 699. 20. 2,86. 20. 100. 27. 3,86. 26. 96. 76,92. PA3352. 471. 19. 4,03. 19. 100. 19. 4,03. 19. 100. 100,00. PA0028. 603. 20. 3,32. 20. 100. 24. 3,98. 23. 95. 86,96. PA2705. 1182. 1063. 89,93. 959. 90. 1128. 95,43. 1007. 89. 95,23. PA1941. 1896. 206. 10,86. 184. 89. 206. 10,86. 184. 89. 100,00. PA1897. 768. 20. 2,60. 20. 100. 20. 2,60. 20. 100. 100,00. PA4360. 474. 36. 7,59. 32. 88. 36. 7,59. 32. 88. 100,00. PA5002. 1419. 41. 2,89. 39. 95. 62. 4,37. 55. 88. 70,91. PA5271. 234. 87. 37,18. 71. 81. 87. 37,18. 72. 82. 98,61. PA0522. 1164. 1156. 99,31. 1005. 86. 1156. 99,31. 1002. 86. 99,70. PA3286. 1053. 303. 28,77. 259. 85. 303. 28,77. 259. 85. 100,00. PA5441. 2202. 21. 0,95. 21. 100. 21. 0,95. 21. 100. 100,00. PA3756. 501. 107. 21,36. 95. 88. 107. 21,36. 95. 88. 100,00. PA3826. 497. 173. 34,81. 148. 85. 173. 34,81. 145. 83. 97,97. PA1009. 558. 263. 47,13. 222. 84. 263. 47,13. 223. 84. 99,55. PA2895. 765. 26. 3,40. 25. 96. 20. 2,61. 20. 100. 80,00. lipA. 936. 318. 33,97. 262. 82. 318. 33,97. 264. 83. 99,24. gloA3. 531. 23. 4,33. 23. 100. 23. 4,33. 23. 100. 100,00. lecA. 369. 17. 4,61. 17. 100. 17. 4,61. 17. 100. 100,00. pepA. 1488. 689. 46,30. 612. 88. 689. 46,30. 611. 88. 99,84. lipH. 867. 38. 4,38. 35. 92. 38. 4,38. 35. 92. 100,00. magB. 1770. 21. 1,19. 21. 100. 25. 1,41. 24. 96. 87,50. 19.

(23) magD. 4551. 23. 0,51. 23. 100. 22. 0,48. 22. 100. 95,65. magE. 1650. 20. 1,21. 20. 100. 20. 1,21. 20. 100. 100,00. hasE. 1332. 20. 1,50. 20. 100. 20. 1,50. 20. 100. 100,00. pilK. 876. 176. 20,09. 145. 82. 176. 20,09. 145. 82. 100,00. mexZ. 633. 24. 3,79. 23. 95. 24. 3,79. 23. 95. 100,00. modA. 756. 57. 7,54. 48. 84. 52. 6,88. 48. 92. 100,00. nqrB. 1212. 685. 56,52. 583. 85. 685. 56,52. 571. 83. 97,94. nuoD. 1782. 21. 1,18. 21. 100. 21. 1,18. 21. 100. 100,00. mucB. 951. 113. 11,88. 98. 86. 113. 11,88. 97. 85. 98,98. narK2. 1407. 29. 2,06. 29. 100. 29. 2,06. 29. 100. 100,00. plcN. 2079. 19. 0,91. 19. 100. 21. 1,01. 21. 100. 90,48. ygdP. 480. 480. 100,00. 404. 84. 480. 100,00. 404. 84. 100,00. pyrF. 699. 495. 70,82. 402. 81. 495. 70,82. 397. 80. 98,76. pcr1. 279. 19. 6,81. 19. 100. 23. 8,24. 22. 95. 86,36. pcr2. 372. 17. 4,57. 17. 100. 19. 5,11. 19. 100. 89,47. pcr3. 366. 19. 5,19. 19. 100. 19. 5,19. 19. 100. 100,00. pcr4. 330. 17. 5,15. 17. 100. 17. 5,15. 17. 100. 100,00. pdtB. 1635. 21. 1,28. 21. 100. 21. 1,28. 21. 100. 100,00. pgm. 1548. 614. 39,66. 541. 88. 716. 46,25. 621. 86. 87,12. plcR. 624. 19. 3,04. 19. 100. 18. 2,88. 18. 100. 94,74. algC algA. 1392 1446. 1297 673. 93,18 46,54. 1125 575. 86 85. 1297 673. 93,18 46,54. 1123 575. 86 85. 99,82 100,00. purM. 1062. 926. 87,19. 820. 88. 926. 87,19. 816. 88. 99,51. algL. 1104. 29. 2,63. 27. 93. 29. 2,63. 27. 93. 100,00. ppk. 2211. 931. 42,11. 804. 86. 946. 42,79. 810. 85. 99,26. PA0622. 1161. 22. 1,89. 22. 100. 22. 1,89. 22. 100. 100,00. PA4548. 1095. 161. 14,70. 140. 86. 197. 17,99. 166. 84. 84,34. PA4100. 1680. 37. 2,20. 33. 89. 101. 6,01. 84. 83. 39,29. PA3001. 1386. 1049. 75,69. 941. 89. 1049. 75,69. 941. 89. 100,00. 20.

(24) PA0041. 10608. 26. 0,25. 25. 96. 26. 0,25. 25. 96. 100,00. PA0829. 942. 18. 1,91. 18. 100. 19. 2,02. 19. 100. 94,74. PA3404. 1356. 28. 2,06. 26. 92. 28. 2,06. 26. 92. 100,00. PA4144. 1416. 30. 2,12. 29. 96. 30. 2,12. 28. 93. 96,55. PA4974. 1449. 395. 27,26. 339. 85. 392. 27,05. 333. 84. 98,23. PA3498. 957. 19. 1,99. 19. 100. 27. 2,82. 25. 92. 76,00. phzG2. 648. 20. 3,09. 20. 100. 20. 3,09. 20. 100. 100,00. PA4142. 1257. 20. 1,59. 20. 100. 24. 1,91. 23. 95. 86,96. PA2583. 2979. 47. 1,58. 40. 85. 47. 1,58. 40. 85. 100,00. PA4098. 726. 22. 3,03. 22. 100. 22. 3,03. 22. 100. 100,00. PA3173. 741. 534. 72,06. 426. 79. 534. 72,06. 427. 79. 99,77. PA0151. 2388. 22. 0,92. 22. 100. 24. 1,01. 23. 95. 95,65. PA0048. 1374. 19. 1,38. 19. 100. 19. 1,38. 19. 100. 100,00. HxcT. 450. 65. 14,44. 62. 95. 65. 14,44. 61. 93. 98,39. HxcU. 450. 50. 11,11. 43. 86. 24. 5,33. 23. 95. 53,49. HxcV. 375. 39. 10,40. 37. 94. 50. 13,33. 44. 88. 84,09. HxcW. 642. 18. 2,80. 18. 100. 18. 2,80. 18. 100. 100,00. pvdL. 13029. 36. 0,28. 34. 94. 36. 0,28. 34. 94. 100,00. rcpA. 1251. 20. 1,60. 20. 100. 20. 1,60. 20. 100. 100,00. rsaL. 243. 16. 6,58. 16. 100. 16. 6,58. 16. 100. 100,00. gacA. 645. 500. 77,52. 418. 83. 500. 77,52. 420. 84. 99,52. rhlA. 888. 19. 2,14. 19. 100. 19. 2,14. 19. 100. 100,00. rhlB. 1281. 18. 1,41. 18. 100. 23. 1,80. 22. 95. 81,82. rpoN. 1494. 703. 47,05. 605. 86. 703. 47,05. 605. 86. 100,00. xcpP. 1509. 878. 58,18. 766. 87. 425. 28,16. 374. 88. 48,83. xqhA. 2331. 332. 14,24. 272. 81. 332. 14,24. 273. 82. 99,63. mucD. 1425. 359. 25,19. 309. 86. 365. 25,61. 314. 86. 98,41. ppkA. 3099. 74. 2,39. 64. 86. 74. 2,39. 64. 86. 100,00. sphC. 1329. 20. 1,50. 20. 100. 21. 1,58. 21. 100. 95,24. 21.

(25) dksA. 447. 337. 75,39. 341. 90. 377. 84,34. 339. 89. 99,41. tadA. 1265. 22. 1,74. 22. 100. 22. 1,74. 22. 100. 100,00. dapD. 1035. 792. 76,52. 688. 86. 792. 76,52. 691. 87. 99,57. popD. 888. 18. 2,03. 18. 100. 20. 2,25. 20. 100. 90,00. popB. 1173. 19. 1,62. 19. 100. 19. 1,62. 19. 100. 100,00. hasD. 1803. 45. 2,50. 42. 93. 45. 2,50. 41. 91. 97,62. cca. 1233. 593. 48,09. 473. 79. 593. 48,09. 474. 79. 99,79. galU. 840. 819. 97,50. 728. 88. 833. 99,17. 730. 87. 99,73. xphA. 528. 19. 3,60. 19. 100. 19. 3,60. 19. 100. 100,00. Taula I. Taula on es mostren totes les dades recollides del local blast de cada factor de virulència. Les files en verd corresponen als factors de virulència que compleixen el requisit de superar el 75% de solapament i el 65% d’identitat a cada comparació. (*) Es pot accedir als noms dels gens complets a la base de dades del Pseudomonas Genome Database (GL. Winsor et al. 2011. Pseudomonas Genome Database: improved comparative analysis and population genomics capability for Pseudomonas genomes. Nucleic Acids Res. 2011 Jan; 39 (Database issue): D596-600. Pubmed. http://www.pseudomonas.com/).. 22.

(26) Representació gràfica de les dades obtingudes a l’anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 front als factors de virulència de Pseudomonas aerugiosa PAO1 S’han agrupat els resultats obtinguts en categories principals de factors de virulència segons la Virulence Factor Database de l’Institute of Pathogen Biology de Pequín, Xina (http://www.mgc.ac.cn/VFs/). Les columnes mostren el percentatge de solapament de les seqüències comparades. Les columnes blaves fan referència a la comparació entre la soca Pseudomonas stutzeri ATCC17588 i Pseudomonas aeruginosa PAO1 i, les columnes vermelles, a la comparació entre la soca Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas aeruginosa PAO1. Les barres d’error que es mostren sobre cada columna indiquen el valor del percentatge de solapament que ha assolit el factor de virulència que més i menys solapament presenta a cada categoria.. Figura III. Representació gràfica de les dades recollides a la Taula I. 23.

(27) Anàlisi comparatiu dels factors de virulència de Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC7588 front a 16 altres soques del gènere Pseudomonas. Entre cada una de les diferents soques s’ha calculat el coeficient de Jaccard. Aquest coeficient assigna un valor de 0 a 1 indicant cap semblança o una semblança total respectivament.. Taula II. Matriu de Jaccard obtinguda introduint les dades de la Virulence Factors Data Base al programa online DendrogramUPGMA .. 24.

(28) Unweighed Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA) creat a partir de les dades recopilades de diferents soques El primer dendrograma mostra les relacions d’identitat que s’estableixen entre les diferents soques agafades del Virulence Factors Data Base a partir dels factors de virulència que presenten. El segon dendrograma mostra les relacions que s’estableixen entre diferents soques a partir d’anàlisis taxonòmics: el “Multilocus Sequence Typing”, que indica les relacions entre les distintes espècies i permet comparar les mateixes agrupacions de les espècies.. Figura IV. A. Representació dels valors de l’UPGMA. Figura IV. B. Agrupaments taxonòmics del gènere Pseudomonas basats en l’anàlisi de seqüències multilocus (Mulet, 2010).. Discussió Els resultats recopilats a la Taula II mostren un alt grau de diferència entre les dues soques Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 i Pseudomonas aeruginosa PAO1. Només hi ha 30 factors de virulència que es puguin dir que compleixen el criteri establert 25.

(29) de presentar un 75% de solapament i un 65% d’identitat dels 333 que s’han comparat. Els factors de virulència que més semblança presenten són els relacionats amb la “Twitching motility” que permeten al bacteri desplaçar-se. És comprensible que s’hagin conservat degut a la importància de la capacitat motora en el procés d’infecció. Els gens més conservats són pilG, pilH i pilU que codifiquen per proteïnes relacionades amb aquest procés. Tenen una mitjana de solapament del 73.11%. El següent factor de virulència més semblant són els factors sigma. Els factors sigma són proteïnes que intervenen en el procés de transcripció i, degut a la seva importància, són uns dels factors mes conservats i tenen una mitjana de solapament del 49.78%. El factor sigma que més s’assembla és l’rpoS. Els flagels són el següent factor de virulència que més semblances comparteix. Són un altre sistema que permet la motilitat del bacteri, per tant, és comprensible que aquest factor de virulència estigui més conservat que altres degut a la seva importància. Els gens que es consideren semblants són els que formen part de l’estructura bàsica del flagel i, per tant, els que haurien d’estar més conservats. Aquests gens són: flgG (Flagella basal-body rod protein), flhA (Flagellar biosynthetic protein), fliG i fliM (Flagellar motor switch protein), flgI (Flagellar P-ring protein precursor), fleN (Flagellar synthesis regulator) i fliI (Flagellum-specific ATP synthase). Tenen una mitjana de solapament del 44.48%. El “two-component System” és un altre sistema de regulació de l’expressió gènica i és un motiu per a que sigui més semblant entre diferents soques que altres factors de virulència menys crucials. El gen que es pot afirmar que és compartit entre Pseudomonas aeruginosa PAO1 i les dues soques de Pseudomonas stutzeri és el phoB que codifica per un “Two-component response regulator”. Té una mitjana de solapament del 30.61%. La resta de factors de regulació no estan tant ben conservats entre les dues espècies i només es pot observar un únic gen compartit: l’vfr. Aquest fet podria reflectir que aquests darrers factors de regulació no tenen tant de pes a l’hora de regular l’expressió de factors de virulència. El sistema de secreció Xcp, que pertany al T2SS és el sistema de secreció que més semblances presenta tot i que són molt poques. Això podria ser degut a que és l’encarregat d’exportar toxines, lipases i altres enzims que faciliten el procés d’infecció de l’hoste per part del bacteri (F. Putker et al. 2013). El gen que es considera compartit és l’xcpT que codifica per una proteïna del sistema general de secreció. Té una mitjana de solapament del 19.55%. La “Major facilitator superfamily” també és un sistema de translocadors de membrana que es troben tant a procariotes com a eucariotes i, fins i tot, a arquees. Tot i així les semblances presents entre Pseudomonas aeruginosa PAO1 i les dues soques de Pseudomonas stutzeri són molt poques i no comparteixen cap gen. Té una mitjana de solapament de l’1.67%.El T2SS i el T3SS presenten molt poques semblances i la causa podria radicar en que són sistemes que no s’especialitzen tant en l’excreció de factors de virulència ni altres proteïnes que siguin crucials per a l’establiment d’una infecció. No hi ha cap gen d’aquests dos darrers grups que es pugui dir que comparteixen. El sistema de transport ABC és un altre factor de virulència que més semblances presenta entre les dues espècies, tot i que les semblances són molt poques. El sistema de transport ABC és un sistema que presenten tan organismes procariotes com organismes eucariotes per la qual cosa és un sistema bastant conservat (B. Singh et al. 2008). No hi ha cap gen d’aquest grup que comparteixin les dues espècies i podria ser degut a que només es conserven els gens que codifiquen per estructures bàsiques del sistema. La mitjana de solapament és del 21.24%. Els pilis de tipus IV són estructures implicades en l’adherència del bacteri a l’hoste en el procés d’infecció. Les semblances entre les dues espècies són molt poques i només hi ha un gen que es pugui dir que comparteixen: el pilZ, que codifica per una proteïna biosintètica de l’estructura. Encara que presenti molt poques semblances, és un dels factors de virulència que més en presenta i això podria explicar-se pel fet que forma part dels mecanismes d’adhesió que són indispensables per al procés d’infecció de l’hoste. La seva mitjana de solapament és del 15.55%. Un altre factor de virulència que forma part dels sistemes d’adhesió i que presenta més 26.

(30) semblances que altres factors de virulència és una probable adhesina. No es pot dir que les dues espècies comparteixin el gen però sí que la seqüència està millor conservada que en altres casos. Això pot tenir la mateixa explicació que en el cas dels pilis de tipus IV. Té una mitjana de solapament d’11.38%.L’alginat és una substància secretada principalment per evitar la fagocitosi i així facilitar la capacitat de colonització d’un teixit en el procés d’infecció. Les dues espècies comparades no comparteixen cap gen que codifiqui per a la producció d’alginat però sí que s’han trobat algunes coincidències entre els genomes comparats. Això podria indicar que encara es conserven els gens que codifiquen per a l’estructura d bàsica de la molècula i que la resta han anat diferint al llarg del temps. Té una mitjana de solapament del 5.59%. Els sistemes de captació de ferro tampoc comparteixen cap gen i són el grup que, en general, presenta menys coincidències en les seqüències comparades. Les proteases són un grup de factors important en el procés d’infecció ja que permeten la invasió del bacteri dins el teixit de l’hoste per mitjà de la disrupció de l’estructura de les proteïnes que formen l’esquelet de la cèl·lula. Tampoc hi ha cap gen que es pugui dir que les dues espècies comparades comparteixin i també hi ha poques coincidències en les seqüències comparades. Finalment, les toxines que presenta Pseudomonas aeruginosa PAO1 no són compartides amb les dues soques de Pseudomonas stutzeri i les coincidències dins les seqüències compartides són molt poques. La conclusió que podem extreure és que Pseudomonas aeruginosa PAO1 i Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 comparteixen al voltant d’un 9% dels factors de virulència i això explicaria la diferència en la prevalença de les malalties causades per les tres soques. Els casos de malalties nocosomials són molt més elevats en el cas de Pseudomonas aeruginosa que en Pseudomonas stutzeri. Cal remarcar que les dues espècies són patògens oportunistes que afecten normalment a pacients immunodeprimits. Els resultats fan pensar que per a que es doni una infecció per Pseudomonas stutzeri els casos d’immunodepressió han de ser molt més extrems que en els casos d’infecció per Pseudomonas aeruginosa ja que Pseudomonas stutzeri no presenta els factors de virulència que presenta Pseudomonas aeruginosa. Els resultats demostren que Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 també presenten certes diferències. Les dues soques s’assemblen entre si en un 93%. Pseudomonas stutzeri A1501 es sembla un 0.05% més a Pseudomonas aeruginosa PAO1 que Pseudomonas stutzeri ATCC17588. Pseudomonas stutzeri A1501 presenta més semblances amb Pseudomonas aeruginosa PAO1 que Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 en aquells factors de virulència on més coincidències es troben entre les dues espècies. Aquesta gran diferència entre els factors de virulència de les dues espècies queda reflectida la figura VII.A. Com es pot observar, les diferents soques de les mateixes espècies queden agrupades dins clústers molt propers, indicant que tenen factors de virulència molt semblants. En el dendrograma Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 són les que apareixen més llunyanes de Pseudomonas aeruginosa PAO1, cosa que recolza els resultats obtinguts en l’estudi. Pseudomonas syringae apareix encara més llunyana de Pseudomonas aeruginosa PAO1 que Pseudomonas stutzeri A1501 i Pseudomonas stutzeri ATCC17588 i això pot ser explicat pel fet que és un patògen de plantes i ha de fer servir factors de virulència adaptats a la infecció de vegetals.. 27.