1
Inhibición enzimática y actividad
antioxidante de polifenoles de frutilla
nativa Chilena tras digestión
in vitro
Samanta Thomas Valdés, MSc ,PhD
Escuela de Nutrición y Dietética
Declaración de Intereses:
3
Introducción
Fragaria chiloensis spp. chiloensis f. patagonica
Elevado contenido de POLIFENOLES
Retamales et al (2005) HortScience, 40:1633–1634; Simirgiotis et al (2009) Food Chemistry, 113, 377–385
Atribuciones de polifenoles
In
t
r
o
d
u
c
c
ió
n
Fotoreceptores
Agente antimicrobiano
Pigmentos
Repelentes
Anti-inflamatorio
Antioxidante
Inhibición enzimática
5
Biodisponibilidad y
procesos de metabolización
• Tamaño molecular
• Polimerización
• Glicosilación
• Solubilidad
• Conjugación con matriz alimentar
• Actividad enzimática
• Factores relacionados al indivíduo
• Microflora intestinal
• Otros
Métodos de digestión in vitro
Minekus et al (2014) Food & Function 5:1113-1124; Carbonell-Capella et al (2014) Comp Rev Food Sci Food Safety 13:155-171
• Describir el perfil de compuestos fenólicos de la frutilla F. chiloensis
spp. chiloensis f. patagonica tras la digestión in vitro
• Relacionar el perfil de fenólicos con su capacidad antioxidante in vitro
y en modelo celular, y con inhibición enzimática
7
Preparación de los extractos
Extracto PEE
Extracto Metanólico
Thomas-Valdés et al (2018) Food Res Int 105:10–18
Simulación Intestinal
PEE
Fluido gátrico (30 min)
Ajuste del pH 4.5 con NaOH
Amiloglucosidasa
(30 min)
Centrifugado
(10 min)
Ajuste pH 6.9 con NaOH ,
α-amilasa
(45 min)
Sobrenadante mantenido a -80
o
C para demás analisis
Fluido intestinal (30 min)
Adición de lipasa y extracto biliar
(pH 7.5) (30 min)
Centrifugado
(10 min)
Sobrenadante mantenido a -80
oC
para demás analisis
Minekus et al (2014) Food & Function 5:1113-1124; USP 23-NF 18, 1995
Simulación Gástrica
Controles
1) Enzimas inactivadas
por temperatura
2) Estándares
Cianidina-3-hexosido,
(+)-Catequina, Ácido
clorogénico,
Ácido elágico
Quercetina-3-rutinosido
Digestión
in vitro
Cartridge C18
9
Análisis de los extractos
Fenoles totales
Flavonoides totales
DPPH
FRAP
TEAC
Ánion superóxido
9
Simirgiotis & Schmeda-Hirschmann (2010) J Food Comp AnalInhibición enzimática
α-glucosidasa:
p-nitrofenil-D-glucopiranosido
• Costamagna et al (2016) Food Chem 190: 392
α-amilasa:
almidón
• Tan et al (2017) Food Chem 214: 259
Lipasa pancreática:
p-nitrofenil palmitato
11
Citotoxicidad
Células AGS confluentes
PEE
0-500 μg/mL
Viabilidad
celular
Cheli & Baldi (2011) J Food Sci. 76:197
11
Citoprotección
Células AGS
confluentes
PEE
overnight
Agente agresor
(H
2O
2)
Viabilidad celular
13
Perfil de compuestos fenólicos
Tiempo
ACN
1% HCOOH
0
5
95
60
25
75
70
60
40
75
5
95
Bomba: LC-20AT pump
Columna: 100 RP 18-5 μ, 250 × 4.6 mm,25 °C
Flujo: 1mL/min
Vol. inyección: 20 μL
Espectros UV-vis: 200 to 600 nm
Espectro masa: m/z 150 - 2000 amu
Ionización: modo negativo
Gas nebulizador: Nitrogeno, 27.5 psi, 365 °C
Flujo: 8 L/min
Colisión: helio
Identificación tentativa: tR, espectro UV-visible y patrón MS/MS
fragmentación comparado a literatura o con estándares
13
RESULTADOS
Fenólicos y flavonoides totales
Muestras
TP
(g GAE/kg muestra)
% rec.
TF
(g CE/kg muestra)
% rec.
PEE
PEE-ND
301.1 ± 14.0
a214.1 ± 9.0
aPEE-DG
290.8 ± 15.5
b96.6
84.7 ± 8.2
b39.6
PEE-DI
171.7 ± 16.0
c59.0
19.5 ± 0.3
c23.0
Control enzima inactivada temperatura
PEE-ND
301.1 ± 14.0
a214.1 ± 9.0
aPEE-DG
229.1 ± 20.6
b76.1
131.9 ± 3.8
b61.6
PEE-DI
87.8 ± 7.1
c38.3
81.3 ± 4.9
c61.6
15
Actividad Antioxidante
In vitro
Muestras
DPPH
(SC
50µg/mL)
FRAP
(mmol TE/kg muestra)
TEAC
(mM TE/kg muestra)
Ánion Superóxido
(SC
50, µg/mL)
PEE
PEE-ND
5.27 ± 0.97
a2550.72 ± 21.68
a3692.62 ± 100.77
a13.11 ± 0.64
aPEE-DG
12.56 ± 1.16
b1400.11 ± 30.06
b2241.89 ± 67.30
b23.09 ± 1.10
bPEE-DI
17.11 ± 0.98
c1250.70 ± 6.88
c1570.77 ± 82.17
c47.23 ± 0.56
cControl enzima inactivada temperatura
PEE-ND
5.27 ± 0.97
a2550.72 ± 21.68
a3692.62 ± 100.77
a-
PEE-DG
13.19 ± 0.35
b1594.16 ± 5.47
b1887.02 ± 90.45
b-
PEE-DI
17.68 ± 1.03
c1476.40 ± 13.44
c1324.68 ± 37.38
c-
ND: no digerido; DG: digestión gástrica; DI: digestión intestinal; PEE: extracto enriquecido en polifenoles
RESULTADOS
Citotoxicidad
R
u
b
u
s
g
e
o
id
e
s
•
Todos los extractos analizados no presentaron citotoxicidad contra células AGS, con
17
RESULTADOS
Citoprotección frente H
2
O
2
Giampieri et al (2014) Food & Function, 5, 1939–1948 Avila et al (2017) Oxidative Medicine and Cellular Longevity 13p.
RESULTADOS
Inhibición enzimática
Muestras
α-Glucosidasa
(IC
50µg/mL)
α-Amilasa
(% inhibición en 100
µg/mL)
Lipasa pancreatica
(% inhibición a 50 µg/mL o
IC
50)
PEE-ND
0.80 ± 0.06
aInactivo
41.36 ± 0.30
aPEE-DG
1.16 ± 0.02
bInactivo
30.09 ± 1.20
bPEE-DI
1.82 ± 0.08
cInactivo
4.30 ± 0.60
cCompuestos de referencia
Acarbosa
120.86 ± 1.99
28.48 ± 0.29
-
Orlistat
-
-
0.04 ± 0.00
19
RESUTADOS
Estadística
Fenólicos totales
Flavonoides totales
Coeficiente de Pearson
p valor
Coeficiente de Pearson
p valor
DPPH
-0.876
< 0.01
-0.723
< 0.05
FRAP
0.865
< 0.01
-0.543
> 0.05
TEAC
0.945
< 0.01
-0.748
< 0.05
Ánion Superóxido
-0.798
< 0.05
-0.755
< 0.05
α-Glucosidasa
-0.723
< 0.05
0.100
> 0.05
Lipasa pancreatica
0.817
< 0.01
-0.202
> 0.05
19
Identificación tentativa compuestos fenólicos
300
600
600
PEE-ND
PEE-GD
PEE-ID
21
Comp Rt (min) [M-H]- MS/MS Identificación tentativa PEE
ND DG DI 1 10.2-11.9 783.73 481.00, 300.76 Bis HHDP hexosido 1 X X X 2 15.3 783.13 481.10, 300.90 Bis HHDP hexosido2 X X X 3 17.5-17.6 783.44 480.91, 300.75 Bis HHDP hexosido 3 X X X 4 20.2-21.4 577.30 451.10, 425.18, 289.40 (epi)C-(epi)C dimero X X X 5 21.8 467.47 303.80, 285.80 DHQ hexosido X X X 6 23.6 288.77 244.79, 205.16 (epi)catequina X X X 7 24.2-24.5 483.90 270.89 Pelargonidina derivativo X X X 8 25.0-26.1 633.00 463.00, 300.87 HHDP galoil hexosido 1 X X X 9 26.9 599.32 435.95, 303.00 DHQ hexosido pentosido X X X 10 27.3 633.96 463.10, 300.78 HHDP galoil hexosido 2 X X X 11 28.3 451.15 286.80 Cianidina hexosido X X 12 32.5 449.05 284.77 K hexosido 1 X X X 13 33.1-33.9 635.64 465.14, 301.00 HHDP galoil hexosido 3 X X X 14 34.0 611.61 447.97, 284.91 K dihexosido X X X
15 35.1 594.82 462.90, 300.90 Ác. elagico pentosido hexosido X X X
16 35.8 432.69 268.76 Apigenina hexosido X X
17 38.5-38.6 464.91 300.68 Ác. elagico hexosido X X X
18 38.5-38.8 935.05 633.26, 301.39 Bis-HHDP galoil hexosido 1 X
19 38.9-39.0 633.84 464.91, 316.05 Miricetina rhamnosido derivativo X X X
Comp Rt (min) [M-H]- MS/MS Identificación tentativa PEE
ND DG DI
20 39.8-40.9 935.46 633.30, 301.49 Bis-HHDP galoil hexosido 2 X
21 43.7 933.91 631.04, 450.92, 300.80 Bis-HHDP galoil hexosido 3 X X
22 44.9-45.0 435.46 302.89, 150.70 DHQ pentosido 1 X X X 23 46.7 433.38 300.61 Q pentosido 1 X X X 24 47.0 579.47 447.05, 301.00 Q pentoside rhamnoside X X X 25 47.5 435.79 302.85, 150.80 DHQ pentoside 2 X X X 26 48.3-48.7 448.91 300.03 Q rhamnoside X X X 27 48.7-49.0 625.13 300.77 Q dihexoside X 28 49.3-49.7 435.22 302.88 DHQ pentoside 3 X X X 29 49.7 463.31 300.80 Q hexoside X X X 30 49.9-50.4 477.25 300.84 Q glucuronide X X X 31 55.0 433.89 300.82 Q pentoside 2 X X X 32 55.8-56.1 449.08 284.79 K hexoside 2 X X X 33 56.3 448.82 314.86 Isorh pentoside X X X 34 61.2 491.30 284.82 K acetyl hexoside X X X 35 67.9-68.2 593.55 446.98, 284.83 K rhamnoside hexoside X X X
23
Cambios en el perfil de compuestos fenólicos
Digestión gástrica
Digestión intestinal
Bis-HHDP galoil hexosido 1 (18)
Cianidina hexosido (11)
Bis-HHDP galoil hexosido 2 (20)
Apigenina hexosido (16)
Q dihexosido (27)
Bis-HHDP galoil hexosido 1 (18)
Bis-HHDP galoil hexosido 2 (20)
Bis-HHDP galoil hexosido 3 (21)
Q dihexosido (27)
• El contenido de fenólicos y flavonoides totales, y actividad antioxidante in vitro antes de la digestión
presentaron mayores concentraciones y actividad
• Los PEEs no presentaron efecto citoprotector significativo contra el estrés inducido por H
2O
2en células
AGS
• El efecto inhibidor contra enzimas digestivas relacionadas al síndrome metabólico (α-glucosidasa y
lipasa) fueron mayores antes de la digestión. Para α-glucosidasa, todos los PEEs mostraron valores de
IC
50menores que el inhibidor comercial acarbosa
• Un total de 35 compuestos fueron identificados tentativamente, tras la digestión simulada:
- DG 3 compuestos no fueron identificados: Bis HHDP galloil hexosido y quercetina dihexosido
- DI otros 3 compuestos no estaban hexosidos de cianidina, apigenina y Bis HHDP galloil
Conclusiones
25