Efecto del ph en la actividad enzimática Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología

Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

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• pH

– También afecta la forma y por lo tanto la tasa de reacción, cada enzima tiene un pH óptimo.

– Éste está entre pH 6 - 8 para la mayoría de las enzimas. – Sin embargo, las enzimas digestivas en el estómago están

diseñadas para trabajar mejor a pH 2 mientras las del intestino tienen un óptimo a pH 8, ambas se ajustan a su medio ambiente.

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Aminoácidos

no polares Polares Ácidos bases

Las cadenas laterales (grupos R) en aminoácidos pueden ser:

y éstos determinan el comportamiento en agua

Alanina Leucina Valina Isoleucina

Glicina Serina Treonina Asparagina Glutamina

Ác. aspártico Ác. glutámico Cisteína Tirosina

Lisina Argenina Histidina

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De los 20 amino ácidos, 13 tienen dos grupos ionizables, los grupos alfa-carboxilos y los alfa-amino. Los 7 amino ácidos restantes tienen tres grupos

ionizables, debido a que su grupo R también puede ser ionizado.

El pH del ambiente del amino ácido y el pK de los grupos ionizables determinarán la carga asociada con un amino ácido.

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Aminoácidos más comunes en el sitio activo

Cisteina Serina Histidina Aspartato Glutamato Lisina

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Ionización de las cadenas laterales

Forma que predomina debajo del pKa

Forma que predomina arriba del pKa

pKa 3.9 Aspartato 1 3162 4.1 Glutamato 1 1995 Histidina 6.0 1 25 CH₂ COOH CH2 COO CH₂ CH₂ COO CH₂ CH₂ COOH CH₂ N NH H CH2 N NH

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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Cisteina 8.4 10 1 Tirosin a 10.1 500 1 CH₂ SH CH₂ S CH2 O CH₂ OH Forma que predomina debajo del pKa Forma que predomina arriba del pKa pKa

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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Lisina 10.5 Arginina 12.5 1260 1 125890 1 CH₂ CH₂ CH₂ CH₂ NH₃ CH₂ CH₂ CH₂ CH₂ NH₂ CH₂ CH₂ CH₂ NH C NH₂ NH₂ CH₂ CH₂ CH₂ NH C NH NH₂

Forma que predomina debajo del pKa

Forma que predomina arriba del pKa

pKa

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Los grupos ionizables en las proteinas frecuentemente tienen valores de pK_a perturbados los cuales corresponden al de la identificación del residuo

La perturbación en los pK_a es el resultado del hecho de que los grupos ionizables están frecuentemente en un ambiente más hidrofóbico dentro de la proteina y están

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La Quimotripsina es una enzima digestiva que pertenece a la superfamilia de las serin

proteasas. Utiliza un residuo activo de serina para llevar a cabo la hidrólisis en el C-terminal de los aminoácidos aromáticos de otras proteínas. La Quimotripsina es una proteas que enlaza el C-terminal de fenilalanina, triptofano y tirosina en cadenas de péptidos. Tiene especificidad por los aminoácidos aromáticos debido a su bolsa hidrofóbica.

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pH Influences Chymotrypsin Activity

5 6 7 8 9 10 11 pH R e la tive A ct ivi ty A d a p te d f ro m D re ssl e r & P o tt e r (1 9 9 1 ) D isco v e ri n g E n z y m e s, p .1 6 2

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C

h

a

rg

e

R

e

la

y

in

A

c

tiv

e

S

ite

Ser 195 His 57 Asp 102 H–O–CH₂ O C–O= -Active Ser H–N N C C C H H CH₂ Ser 195 His 57 Asp 102 -_O_–CH 2 O C–O–= H N N–H C C C H H CH₂ A d a p te d f ro m A lb e rt s e t a l (2 0 0 2 ) M o le cu la r B io lo g y o f th e C e ll (4 e ) p .1 5 8

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Imidazole on Histidine Is Affected by pH

H–N

N

C

H

H+

pH 6

pH 7

+

H–N

N

–H

C

H

Inactive + _Ser 195 His 57 Asp 102 H–O–CH₂ O C–O= - H–N N–H C C-H C CH₂ H

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

A d a p te d f ro m D re ssl e r & P o tt e r (2 0 0 0 ) D isco v e ri n g E n z y m e s, p .1 6 3

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El efecto de pH sobre la cinética enzimática en solución

K1 K2 − + − − + −    ←   →     ←   →  + + + + 2 E E E H H H H

donde: E- denota la forma activa de la enzima

E y E2- son formas inactivas obtenidas por protonación y desprotonación del sitio activo.

El equilibrio ácido base entre las tres especies E, H+, y E-, requiere 1 K e e h = − + 2 2 K e e h = − − +

Si e0 denota la concentración total de enzima

− − ₊ + = 2 0 e e e e la fracción activa 0 e e y − − ₌

y está dado por

− − − − + + ≡ ₂ e e e e y + − − − + − − + + = h e K e K e h e y 2 1 + + − + + = h K K h y 2 1 1 1

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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Tomando logaritmos       + + − = + ₊ − h K K h y 2 1 1 log log

Vmax esta definida como: V_max = e₀k_cat , además sabemos que

0 e e y − − ₌ , por lo tanto + + − + + = = h K K h e k y e k V _cat cat 2 1 0 0 max 1

Por lo tanto graficando log Vmax versus pH debe exhibir el mismo comportamiento que

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Estimación de pK₁ y pK₂ más importantes del sitio activo de

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POLYMATH Results

06-26-2007

Nonlinear regression (L-M)

Model: vmax = kcat*0.003/(1+pH/pk1+pk2/pH)

Variable Ini guess Value 95% confidence

kcat 2.0E+04 1.998E+04 29.947656 pk1 4.2 3.3031477 0.0064151 pk2 6.2 8.4916206 0.0164501

Nonlinear regression settings Max # iterations = 64 Precision R^2 = 0.9999999 R^2adj = 0.9999999 Rmsd = 6.776E-05 Variance = 5.624E-08 General Sample size = 7 # Model vars = 3 # Indep vars = 1 # Iterations = 7

Estimación de pK₁ y pK₂ más importantes del sitio activo por

regresión no-lineal + + − + + = = h K K h e k y e k V _cat cat 2 1 0 0 max 1

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Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai. 2004. Kinetics of tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and Microbial Technology 35: 488–493.