Efecto de los extractos de Cordyceps takaomontana cultivados en medios
sintéticos en la actividad de lacasas de Pleurotus ostreatus
Proyecto de grado
Por
ALEJANDRA JIMÉNEZ RAMÍREZ
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Departamento de Ingeniería Química
Efecto de los extractos de Cordyceps takaomontana cultivados en medios sintéticos en la actividad de lacasas de Pleurotus ostreatus
Efecto de los extractos de Cordyceps takaomontana cultivados en medios
sintéticos en la actividad de lacasas de Pleurotus ostreatus
Proyecto de grado
Por
ALEJANDRA JIMÉNEZ RAMÍREZ
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Aprobado por:
Asesora, Rocío Sierra Ramírez, Ph.D.
Co-Asesor, Juan Sebastián Chiriví Salomón, M.Sc. Jurado, Pablo Ortiz Herrera, Ph.D.
Director del Departamento, Óscar Álvarez Solano, Ph.D.
Departamento de Ingeniería Química Marzo 2017
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ABSTRACT
Effect of the extracts of Cordyceps takaomontana cultured on synthetic media in the laccase activity of Pleurotus ostreatus (March 2017).
Alejandra Jiménez Ramírez, Universidad de los Andes, Colombia
Co-Advisors: Juan Chiriví, M.Sc, Rocío Sierra Ramírez, Ph.D.
Nowadays, agro-industrial wastes are considered as potential raw material for the production of biofuels. These wastes are mainly constituted by lignocellulosic material, which has a complex structure due to the presence of lignin. This is why, a pre-treatment is required for cellulose and hemicelulose hydrolysis, which are more accessible biopolymers for fermentable sugar sourcing. The use of white-rot fungi as pre-treatment agent is one of the best alternatives due to its operating conditions, environmental impact and safety with respect to the usual chemical treatment. Among these fungi, Pleurotus ostreatus produce laccases, enzymes capable of phenolic compounds reduction. Several projects are seeking to enhance its activity, and the extracts of Cordyceps spp. caught especial attention due to the presence of several bioactive compounds, which can take action in different metabolic pathways. In the following project, the effects of extracts of the entomopathogenic fungus Cordyceps takaomontana on the production of Pleurotus ostreatus cassava are evaluated. The cultures of Cordyceps takaomontana were performed in two culture media: Sabouraud agar with dextrose and yeast extract (SDAY) and the same substrate supplemented with sodium selenite (SDAY-SS). The extraction of metabolites was made from polar (methanol and water) and non-polar (n-hexane) solvents. These extracts were combined with Pleurotus ostreatus inoculum and then added in a semisolid rice husk medium. The effect of the metabolites on laccase activity was determined by the glucose concentration and ABTS reduction by spectrophotometry techniques. We demonstrated that the aqueous extracts significantly influence the laccase activity, and is independent of the substrate (SDAY and SDAY-SS) used for the culture of Cordyceps takaomontana. The average enzyme activity reached a value of 8831 U / L, which was above the control for approximately 3500 U / L. We suggested that the presence of polar
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and bioactive compounds, such as nucleosides, is taking action about the fungal growing, laccase production or laccase efficiency. Temperature, light and humidity can be further studied, and an analysis of the bioactive compounds could clarify the mechanism of enhancing activity of the extracts of Cordyceps.
Key words: Pre-treatment of lignocellulosic material, laccases, nucleosides, SDAY, SDAY-SS, entomopathogenic fungi.
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RESUMEN
Efecto de los extractos de Cordyceps takaomontana cultivados en medios sintéticos en la actividad de lacasas de Pleurotus ostreatus (Marzo 2017)
Alejandra Jiménez Ramírez, Universidad de los Andes, Colombia
Co-Asesores: Juan Chiriví, M.Sc., Rocío Sierra Ramírez, Ph.D.
Actualmente, los desechos agroindustriales se considera como materia prima potencial para la producción de biocombustibles. Estos residuos se constituyen principalmente por material lignocelulósico, el cual es de estructura compleja debido a la presencia de lignina. Por este motivo, se requiere un pre-tratamiento para la hidrólisis de celulosa y hemicelulosa, que son biopolímeros más accesibles para la obtención de azúcar fermentable. El uso de hongos de podredumbre blanca como agente de pre-tratamiento es una de las mejores alternativas debido a sus condiciones de operación, impacto ambiental y seguridad con respecto al tratamiento químico usual. Entre estos hongos, el Pleurotus ostreatus produce lacasas, enzimas capaces de reducir compuestos fenólicos. Varios proyectos buscan mejorar su actividad, los extractos de Cordyceps spp han llamado especialmente la atención debido a la presencia de varios compuestos bioactivos, que pueden actuar en diferentes vías metabólicas. En el siguiente proyecto, se evalúan los efectos de los extractos del hongo entomopatógeno Cordyceps takaomontana en la producción de lacasas de Pleurotus ostreatus. Los cultivos de Cordyceps takaomontana se realizaron en dos medios de cultivo: agar Sabouraud con dextrosa y extracto de levadura (SDAY) y el mismo sustrato suplementado con selenito de sodio (SDAY-SS). La
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extracción de metabolitos se realizó a partir de disolventes polares (metanol y agua) y no polar (n-hexano). Estos extractos se combinaron con inoculo de Pleurotus ostreatus y se agregaron en un medio semisólido de cascarilla de arroz. El efecto de los metabolitos en la actividad de las lacasas se determinó por la concentración de glucosa y reducción de ABTS mediante técnicas de espectrofotometría. Hemos demostrado que los extractos acuosos influyen significativamente en la actividad de las lacasas, y es independiente del sustrato (SDAY y SDAY-SS) utilizado para el cultivo de Cordyceps takaomontana. La actividad enzimática promedio alcanzó un valor de 8831 U/L, por encima del control aproximadamente 3500 U/L. Sugerimos que la presencia de compuestos polares y bioactivos como los nucleósidos, actúan sobre el crecimiento de los hongos, la producción de las lacasas o la eficiencia de las mismas. La temperatura, la luz y la humedad pueden estudiarse más a fondo, y un análisis de los compuestos bioactivos podría aclarar el mecanismo de crecimiento de actividad de los extractos de Cordyceps.
Palabras clave: Pre-tratamiento de material lignocelulósico, lacasas, nucleósidos, SDAY, SDAY-SS, hongos entomopatógenos.
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NOMENCLATURA
ABTS 2,2 azino bis (3-etilbenzo tiazolin-6 sulfónico)
°C Grados Celsius
Cu Cobre
LAMFU Laboratorio de Micología y Fitopatología
rpm revoluciones por minuto
SDAY Sabouraud Dextrose Yeast Agar
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TABLA DE CONTENIDO
ABSTRACT ... 4
RESUMEN ... 6
NOMENCLATURA ... 8
LISTA DE FIGURAS ... 11
LISTA DE TABLAS ... 12
1. INTRODUCCIÓN ... 13
Pleurotus ostreatus y lacasas ... 14
Cordyceps takaomontana ... 16
Metabolitos ... 16
2. OBJETIVOS DEL PROYECTO ... 18
3. METODOLOGÍA ... 19
3.1. Obtención extractos de Cordyceps takaomontana ... 19
3.1.1. Cultivo de las cepas ... 19
3.1.2. Extracción... 20
3.2. Aplicación de extractos ... 21
3.2.1. Medio basal y de cultivo Pleurotus ostreatus ... 21
3.2.2. Preparación pre-inoculo ... 21
3.2.3. Preparación inoculo ... 22
3.2.4. Adición suplemento de cobre ... 22
3.3. Toma de muestras... 22
3.4. Diseño Experimental ... 23
3.5. Métodos Analíticos ... 23
3.5.1. ABTS ... 23
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 25
4.1. Glucosa ... 25
4.2. Actividad enzimática ... 26
4.2.1. Análisis estadístico ... 28
4.2.2. Análisis estadístico actividad enzimática máxima ... 29
4.2.3. Efecto del medio y el disolvente en la actividad enzimática ... 31
5. CONCLUSIONES ... 36
6. TRABAJO FUTURO ... 37
7. REFERENCIAS ... 37
ANEXOS... 40
ANEXO 1. Materiales y equipos. ... 40
ANEXO 2. Reactivos y medios de cultivo ... 41
ANEXO 3. Resultados cualitativos de la experimentación ... 43
ANEXO 4. Resultados actividad enzimática y glucosa ... 44
ANEXO 5. Análisis estadístico ... 47
ANEXO 6. Análisis estadístico actividad enzimática máxima ... 49
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Perfiles de actividad enzimática (eje izquierdo) y glucosa (eje derecho) para Pleurotus
ostreatus con sus diferentes medios de cultivo y disolventes de extracción. ... 27
Figura 2. Gráfica de control para la máxima actividad enzimática ... 31
Figura 3. Medio SDAY-Comparación máxima actividad enzimática con su respectivo control. ... 32
Figura 4.Medio SDAY SS-Comparación máxima actividad enzimática con su respectivo control. 33 Figura 5.Comparación de perfiles de actividad enzimática para Pleurotus ostreatus con sus diferentes medios de cultivo y disolventes de extracción. ... 36
Figura 6. Procedimiento experimental ... 43
Figura 7. Concentración de glucosa y actividad enzimática en cada medio (SDAY y SDAY-SS). . 44
Figura 8. Resultados diseño factorial y prueba de normalidad ... 47
Figura 9. Efecto de los factores en la media de actividad enzimática ... 48
Figura 10. Resultados diseño factorial y prueba de normalidad ... 49
Figura 11. Efecto de los factores en la media de actividad enzimática ... 50
Figura 12. Tamaño de partícula de la cascarilla de arroz: (Olave, 2015) derecha y este proyecto izquierda. ... 51
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Diseño experimental ... 23
Tabla 2.Materiales y equipos ... 40
Tabla 3.Reactivos para medio líquido SDYA ... 41
Tabla 4. Reactivos para medio Sabouraud Dextrose Yeast Agar (SDAY) ... 41
Tabla 5. Reactivos para medio Sabouraud Dextrose Yeast Agar con selenito de sodio (SDAY-SS) ... 42
Tabla 6. Reactivos para la preparación de medio basal ... 42
Tabla 7. Ajuste de los datos (R2) de concentración de glucosa SDAY ... 45
Tabla 8. Ajuste de los datos (R2) de concentración de glucosa SDAY-SS ... 45
Tabla 9. Ajuste de los datos (R2) de actividad enzimática SDAY ... 45
Tabla 10. Ajuste de los datos (R2) de actividad enzimática SDAY-SS ... 46
Tabla 11. Ajuste de los datos (R2) del medio de cultivo SDAY ... 46
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1. INTRODUCCIÓN
En todo el mundo, la población crece rápidamente y aumentan la demanda de energía. Los recursos fósiles limitados y los impactos ecológicos negativos por la explotación de petróleo, extracción, el transporte y el consumo dictan la necesidad de explorar y desarrollar fuentes alternativas de energía renovables. Entre una de las alternativa se encuentran los biocombustibles de celulosa, se basa en la eficiencia combinada de plantas para producir y almacenar carbono en forma de celulosa y otros biopolímeros tales como hemicelulosas y lignina en sus paredes celulares y de microbios para descomponer estos biopolímeros y convertir el azúcar resultante en bloques de combustibles renovables, precursores de combustible y productos químicos (Grigoriev, y otros, 2011). Sin embargo, el material lignocelulósico es resistente a los tratamientos biológicos, por lo que se requiere un pre-tratamiento para disminuir la cristalinidad de los complejos de lignina y celulosa lo que implica aumentar la susceptibilidad a la acción de las hidrolasas. El tratamiento con organismos lignocelulolíticos genera un menor impacto ambiental y mayor seguridad con respecto al tratamiento químico usual para reducir la complejidad de los componentes del material (Deswal, Gupta, Rishi, Nandal, & Kuhad, 2014).
Los organismos usualmente manipulados para el tratamiento de la biomasa lignocelulósica son algunos hongos del filo Basidiomycota aquellos que causan putrefacción en las plantas por medio de lacasas, enzima capaz de convertir compuestos fenólicos como la lignina en compuestos más simples (Grigoriev, y otros, 2011). En la Universidad de los Andes, el Departamento de Ingeniería Química ha desarrollado diversos proyectos en donde se evaluaron diferentes condiciones de producción de lacasas
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aprovechando que el Pleurotus ostreatus las produce (Sánchez, 2009). En la actualidad existen algunos mediadores ácido 2,2 azino bis (3-etilbenzo tiazolin-6 sulfónico) (ABTS, por sus siglas en inglés), el cual actúa en el proceso de óxido-reducción (REDOX) como mediador para la oxidación que realizan las lacasas a los múltiples hidrocarburos, favoreciendo la actividad catalítica de estas para degradar lignina (Sindhu, R, Binod, & Pandey, 2015). Adicionalmente, se determinó que la adición de compuestos cúpricos al cultivo mejoraba el crecimiento de Pleurotus ostreatus lo que representa un aumento de la actividad enzimática de las lacasas (Berdugo & Castañeda, 2014).
En efecto, el pre tratamiento biológico de la biomasa lignocelulósica es de gran interés dado que requiere baja energía y condiciones ambientales (Sun & Cheng, 2002). Con respecto a lo anterior, el uso de los hongos del género Cordyceps sensu lato se ha potencializado dado que poseen una alta cantidad de metabolitos, entre los cuales se encuentran los nucleósidos. Estos compuestos demuestran tener una capacidad de aumentar y promover la producción de ciertas hidrolasas, pues interfieren en diferentes rutas de síntesis y actividad (MacDonald, Suzuki, & Master, 2012). En el presente trabajo se abordará el efecto de los extractos del hongo Cordyceps takaomontana cultivados en SDAY-SS con el fin de caracterizar su actividad biológica como potenciador en la producción de lacasas en Pleurotus ostreatus.
Pleurotus ostreatus y lacasas
En los últimos años, los hongos de podredumbre blanca han atraído cada vez más atención, ya que sus enzimas ligninolíticos tienen la capacidad de degradar compuestos recalcitrantes y colorantes sintéticos (Hou, Zhou, Wang, Du, & Yan, 2004) . Entre estos se encuentran los hongos del género Pleurotus los cuales ocupan la tercera posición en la
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producción de hongos comestibles, debido a su capacidad para colonizar y degradar una amplia variedad de sustratos que contienen celulosa, hemicelulosa y lignina detrás de las especies del género Agaricus y Lentinula (Fernandes, Barrosa, Martins, Herbert, & Ferreira, 2015). El cultivo Pleurotus se ha incrementado en las últimas cinco décadas, alcanzando el 14,2% de la producción total de hongos comestibles en el mundo en el año de 1997.
La composición química de Pleurotus ostreatus es muy variable y depende del estado de desarrollo y la cepa utilizada; la variabilidad es ocasionada por diferencias en el contenido de humedad, temperatura y la presencia de nutrientes. Sin embargo, las condiciones de cultivo del micelio de este hongo se encuentran entre un rango de temperatura de 0 y 35 °C, el rango de pH entre 5,5 y 6,5 y el contenido de humedad de estar entre el 50 y el 80% (Garzón & Cuervo, 2008).
La lacasas pertenecen al grupo de enzimas llamadas oxidasas de cobre azul capaces de oxidar los fenoles y aminas aromáticas mediante la reducción de oxígeno molecular para agua; estas se han encontrado en plantas, hongos, bacterias e insectos (Hou, Zhou, Wang, Du, & Yan, 2004). La lacasa es una enzima importante en los sistemas de ligninolíticas fúngicas implicadas en la degradación de la lignina (Gianfreda, Xu, & Bollag, 1999). Entre las aplicaciones recientes de las lacasas se encuentran la producción de etanol, análisis de drogas, biorremedación, clarificación del vino entre otras (Mayera & Staplesb, 2002).
En la Universidad de los Andes, el Departamento de Ingeniería Química ha desarrollado diversos proyectos en donde se evaluaron diferentes condiciones de producción de lacasas aprovechando que el Pleurotus ostreatus las produce (Sánchez,
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2009). De acuerdo a los resultados obtenidos por Berdugo y Castañeda (2004) se determinó que la adición de compuestos cúpricos (5Mm) al cultivo mejoraba el crecimiento de Pleurotus ostreatus lo que representa un aumento de la actividad enzimática de las lacasas.
Cordyceps takaomontana
El género Cordyceps sensu lato se encuentra compuesto por hongos entomopatógenos del filo Ascomycota que forma cuerpo fructífero de los insectos hospedadores y más de 750 especies se han conocido hasta ahora. Entre ellos, la especie Cordyceps takaomontana que ha sido utilizado como material en bruto o componentes activos biológicos extraídos de los cuerpos fructíferos por métodos biotecnológicos (Lee, Hwang, & Yun, 2009).
La caracterización molecular de los genes de tipo de apareamiento y estudios culturales demostró recientemente heterotalismo en la especie Cordyceps takaomontana. (Zhang & Liang, 2013). La especie Cordyceps takaomontana presenta un crecimiento miceliar rugoso de color blanco en superficie y envés, en contacto con aire torna a un color rosado dado por oxidación. Este hongo se relaciona principalmente como patógeno de lepidópteros (mariposas) (Bunyapaiboonsri, y otros, 2011)
Metabolitos
Los metabolitos son compuestos producto del metabolismo celular que de acuerdo a su función y tiempo de producción, se clasifican en primarios y secundarios. A diferencia de los metabolitos primarios, los secundarios no son esenciales en el crecimiento y multiplicación celular, pero desempeñan funciones importantes, una de ellas por ejemplo,
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es la de actuar como defensas químicas contra otros organismos patógenos o depredadores (Borges, Díaz, San Juan, & Gómez, 2010).
En el estudio de metabolómica de la especie Cordyceps pruinosa (Oh, Hyun, G, Chun Y.J, & Vhoi, 2014), los metabolitos detectados podrían dividirse en varias clases, incluyendo alcoholes, aminoácidos, ácidos orgánicos, purinas, azúcares, ácidos grasos, esteroles, y pirimidinas. Extractos de especies del género Cordyceps han sido utilizados como fuente de metabolitos, entre los que se encuentra la cordycepina, adenosina, guanina, citosina, entre otros. Estos son nucleósidos, que al haber participado en algunas reacciones bioquímicas y en la incorporación de enzimas, pasan a ser metabolitos que posiblemente fomenten la producción de lacasas en el hongo de Pleurotus ostreatus.
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2. OBJETIVOS DEL PROYECTO
Teniendo en cuenta la importancia del pre-tratamiento del material lignocelulósico para la producción de biocombustibles y habiéndose realizado en proyectos anteriores del grupo de investigación el pre-tratamiento biológico con el hongo Pleurotus ostreatus se quería evaluar cambios en el medio que mejoren la capacidad del hongo en producir enzimas lacasas, teniendo en cuenta lo anterior, se planteó como objetivo principal de este proyecto: Evaluar el efecto de los extractos de Cordyceps takaomontana cultivados en medios sintéticos en la actividad de lacasas de Pleurotus ostreatus.
Para cumplir con el objetivo plateado se definieron los siguientes objetivos secundarios:
1. Analizar los extractos crudos de Cordyceps takaomontana en los medios de cultivo SDAY y SDAY-SS como promotores de la producción de lacasas en Pleurotus ostreatus.
2. Probar la actividad biológica de estos extractos crudos y nucleósidos en Pleurotus ostreatus y su productividad de lacasas de acuerdo al tipo de disolvente usado en la extracción de metabolitos.
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3. METODOLOGÍA
El desarrollo del proyecto consta de tres etapas, en primer lugar se encuentra la obtención de extractos con metabolitos de Cordyceps takaomontana, en segundo lugar consiste en la inoculación de los extractos en los cultivos de Pleurotus ostreatus y finalmente las mediciones correspondientes de la actividad enzimática y glucosa por espectrofotometría.
3.1. Obtención extractos de Cordyceps takaomontana
La cepa de Cordyceps takaomontana utilizada corresponde al cultivo LC 004 que se encuentra en el cepario del Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes del Departamento de Ciencias Biológicas (LAMFU) y aprobada para su uso en el Departamento de Ingeniería Química.
3.1.1. Cultivo de las cepas
Para la preparación de los inóculos de Cordyceps takaomontana se realizaron suspensiones con 1 mL de agua destilada estéril suplementada al 0.10%(v/v) con Tween 80 en el subcultivo ajustado a una concentración de 106 conidios/mL. Este inóculo fue agregado a cinco erlenmeyers que contenían 150 mL de medio líquido Sabouraud y dextrosa con 1% (p/v) de extracto de levadura (SDYA). Se dejó en crecimiento por 7 días y se continuó el pase a los medios sólidos. Este paso previo se realiza con la intención de permitir la germinación de los conidios y favorecer el crecimiento micelial.
Pasados los siete días se agregó este inóculo a 10 cajas de Petri de cada medio de cultivo: SDYA y SDYA con 5 ppm de selenito de sodio (SDYA-SS).
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La obtención del micelio del hongo se realizó en una cámara de flujo laminar mediante un proceso de raspado con una espátula para separarlo del medio de cultivo. El micelio recuperado se almacenó en tubos de fondo cónico de 50 mL. Posteriormente, los tubos se liofilizaron durante 24 horas y se pulverizaron manualmente para su posterior utilización en la extracción con disolvente.
3.1.2. Extracción
Para la extracción de nucleósidos presentes en el micelio, se utilizó la técnica de extracción con agua a temperatura ambiente (ATWE) (Yang, Li, & O, 2008). Asimismo, los diferentes componentes presentes en Cordyceps takaomontana se obtiene usando como disolvente polar metanol y como disolvente no polar n-hexano (Oh, Hyun, G, Chun Y.J, & Vhoi, 2014). A continuación se tomaron 50 mg de micelio pulverizado por tipo de medio (SDAY y SDAY-SS), los cuales se separaron en tubos de reacción de fondo cónico, Con dichos tubos se realizaron las extracciones con los tres tipos de disolvente
Para las extracciones con metanol y hexano se agregaron 1 mL de disolvente dentro de los tubos de reacción de fondo cónico, los cuales se maceraron hasta obtener una mezcla entre el disolvente y el micelio haciendo uso de un taladro adaptado con puntas plásticas. Después se sonicaron durante 5 minutos y se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min. Finalmente, se filtraron los sobrenadantes obtenidos por un poro de 0.22 μm y fueron
recolectados en diferentes tubos de reacción de fondo cónico de 1 mL.
Para la extracción con agua, se macero hasta obtener la mezcla entre el disolvente y el micelio y posteriormente se incubaron los tubos de reacción de fondo cónico a una temperatura de 33°C durante 18 horas. Posteriormente se sonicaron durante 5 minutos y se
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centrifugaron a 1300 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se filtró por un poro de 0.22 μm y se almacenó en nuevos tubos de de reacción de fondo cónico.
Por último, todos los extractos se secaron en un baño seco y se almacenaron a -80°C hasta el momento de aplicarlo sobre el medio de Pleurotus ostreatus.
3.2. Aplicación de extractos
Para determinar el efecto de los extractos sobre Pleurotus ostreatus se siguieron los siguientes pasos:
3.2.1. Medio basal y de cultivo Pleurotus ostreatus
La cepa de Pleurotus ostreatus que se utilizará para las pruebas actividad se encuentra en el laboratorio del Grupo de Diseño de Procesos y Productos (GDPP) del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Los Andes. Se mantuvo un subcultivo en Agar Extracto de Malta (AM) a 4°C y conservado por medio de la técnica de micelio deshidratado en papel filtro hasta el momento de preparar el inóculo. El medio basal fue preparado según lo indicado en el trabajo realizado por Berdugo y Castañeda.
3.2.2. Preparación pre-inoculo
La preparación del pre-inoculo consiste en la realizar una solución SDY (Sabouraud con dextrosa y extracto de levadura) la cual se esterilizada en el autoclave para su posterior uso. Después se agregó 1 mL de SDY en tubos de ensayos estériles, al mismo tiempo se adicionaron 3 plugs de Pleurotus ostreatus y se incubaron durante 3 días a 33°C, se le
adicionaron 330 μL de cada uno de los extractos (metanol, hexano y agua) con sus
respectivos controles (agua y hexano) y se dejaron 2 días más en la incubadora hasta su inoculación.
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3.2.3. Preparación inoculo
Se utilizó como medio para el crecimiento de Pleurotus ostreatus cascarilla de arroz la cual fue molida hasta que se obtuviera un polvo fino (Berdugo & Castañeda, 2014). Se pesaron 5.7 g de cascarilla y se pusieron en tarros de mermelada los cuales se esterilizaron mediante un ciclo largo y un ciclo corto de autoclave. Adicionalmente, se agregaron 17.5 mL de medio basal al frasco de mermelada con cascarilla de arroz. La anterior configuración se realizó escalando el modelo realizado en la Universidad de los Andes y Javeriana (Gonzalez, y otros, 2013).
Finalmente, se agregó el pre-inoculo al frasco de mermelada con el medio basal. Las muestras se almacenan en el Equipo de agitación para hongos en el Laboratorio 418 del Departamento de Ingeniería Química a 25°C.
3.2.4. Adición suplemento de cobre
Se ha reportado que la adición de cobre (Cu) al medio favorece el crecimiento de Pleurotus ostreatus por lo que se consideró en el presente trabajo utilizarlo. Las concentraciones recomendadas de este elemento se encuentran entre 0 a 5 mM (Gonzalez, y otros, 2013) con un mejor crecimiento a 5 mM (Berdugo & Castañeda, 2014). Para ajustar la concentración a los 19 mL de medio basal que ya se tiene en las muestras se adicionaron 95 μL de una solución de CuSO4 1M.
3.3. Toma de muestras
La toma de muestras se realizará durante 27 días tomando dos muestras semanales de 130 μL, 20 μL destinados a la prueba de glucosa y 100 μL a la prueba ABTS utilizadas para
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3.4. Diseño Experimental
Se realizará un diseño de tres factores, el medio de cultivo Cordyceps takaomontana y el tipo de disolvente. El primer factor es el medio de cultivo que tiene dos niveles correspondientes SDYA, SDYA-SS; el segundo factor es el tipo de disolvente y sus niveles son metanol, hexano y agua. Se tiene como resultado un diseño factorial 23. Se tiene un total de 6 experimentos por triplicado, siendo un total de 18 muestras más 6 controles (3 de Pleurotus ostreatus sin extracto y 3 del hongo con los disolventes), en la Tabla 1 se observa el diseño experimental planeado.
Tabla 1. Diseño experimental
Experimento Medio de cultivo Disolvente de extracción
1 SDAY Metanol
2 SDAY Hexano
3 SDAY Agua
4 SDAY-SS Metanol
5 SDAY-SS Hexano
6 SDAY-SS Agua
7 Control Agua sin extracto
8 Control Hexano Hexano sin extracto
3.5. Métodos Analíticos
Para el análisis de resultados se van a realizar pruebas de actividad enzimática de ABTS y concentración de glucosa. La primera para determinar de forma espectrofotométrica la cantidad de lacasas producida al oxidar el ABTS y la segunda para determinar el uso de lignina como fuente de carbono al agotar la glucosa.
3.5.1. ABTS
Para la medición de lacasas se hará uso de (ABTS) ya que en la reacción redox donde la lacasa oxida diversos hidrocarburos este actúa como mediador. Para la medición se
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tomaron Se toman 50 µL de cada una de las muestras que contiene la enzima, 950 µL de ABTS 1mM en buffer acetato 20mM a pH 5.0. Posteriormente, se mide la absorbancia con una longitud de onda de 436 nm cada minuto durante 10 minutos. La actividad enzimática por muestra se determina como lo indica la Ecuación 1.
𝑈 𝐿 =
𝑚 ∗ 𝑉𝑡[𝑚𝐿] ∗ 𝐹𝑑 𝑡[𝑚𝑖𝑛] ∗ 𝜀[𝑚𝑀−1𝑐𝑚−1] ∗ 𝑉
𝑚[𝜇𝐿] 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1
Donde 𝑚 es la pendiente de la curva asociada a la absorbancia de cada muestra, 𝑉𝑡 es el volumen total de la celda, 𝑉𝑚 es el volumen de la muestra que contiene las lacasas, 𝜀 es el coeficiente de extinción molar a 436nm (29.3 nM-1 cm-1), 𝑡 es el tiempo en minutos y
finalmente, 𝐹𝑑 es el factor de dilución.
3.5.2. Glucosa
En un comienzo Pleurotus ostreatus tiene como fuente de carbono la glucosa, a medida que pasa el tiempo se disminuye la cantidad libre y se espera que utilice como nueva fuente la lignina presente en la cascarilla de arroz. Se utilizará un kit de glucosa Spinreact para establecer la cantidad de glucosa presente en cada una de las muestras; adicionando 10 µL de cada una de estas a 1 mL del kit de glucosa en una celda de vidrio. Posteriormente se incuba por 10 min a una temperatura de 33°C para que ocurra la reacción. El principio del método consiste en que la glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno, producido se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxígeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa (POD), tal como se muestra en las Ecuaciones 2 y 3.
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𝛽 − 𝐷 − 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝑂2+ 𝐻2𝑂 𝐺𝑂𝐷 → Á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜 + 𝐻2𝑂2 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2
𝐻2𝑂2+ 𝐹𝑒𝑛𝑜𝑙 + 𝐴𝑚𝑝𝑖𝑟𝑜𝑛𝑎 𝑃𝑂𝐷
→ 𝑄𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎 + 𝐻2𝑂 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3
La intensidad de color formado se mide a una longitud de onda de 505nm en espectrofotómetro. La cual, es proporcional a la concentración de glucosa en la muestra, la cual se calcula con la Ecuación 4.
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑃𝑎𝑡𝑟ó𝑛 ∗ 100 = 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 [ 𝑚𝑔
𝑑𝐿] 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 4
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con el objetivo de comprender el efecto de los distintos tratamientos empleados para la producción de lacasas se realizaron las gráficas de la actividad enzimática y concentración de glucosa correspondiente a cada medio con sus respectivos disolventes y su control respectivo, teniendo en cuenta las desviaciones asociadas a cada tratamiento.
4.1. Glucosa
Con los resultados de absorbancia se calculó la concentración de glucosa, se evaluó el cambio de concentración con respecto al día de toma de muestra para los distintos medios de cultivo y disolventes de extracción. La concentración de glucosa disminuye con respecto al tiempo de toma de muestra, esto se debe a que el Pleurotus ostreatus lo consume como fuente de carbono. Con los resultados de glucosa en la Figura 1 se tiene para todos los experimentos una reducción de la concentración en promedio para todos los experimentos de 309±53 mg/dL en la primera toma de muestras a 123±46 mg/dL el día de mayor actividad y finalmente a 51±23 mg/dL en el último día de toma. Se observa en promedio
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una reducción mayor en la concentración de glucosa antes de la máxima actividad enzimática. En el último día de toma de muestras se reportaron en algunos experimentos un alza en la concentración de glucosa. Lo anterior, es resultado del rompimiento de celulosa en monómeros de glucosa; al degradar la lacasa la lignina se expone la estructura interna de la cascarilla y se ve favorecida la producción de celulasas al tener expuesta celulosa y hemicelulosa en el medio (da Luz, y otros, 2012).
4.2. Actividad enzimática
Con los resultados obtenidos se realizaron gráficas de actividades enzimáticas con sus respectivas desviaciones y líneas de tendencia, para evaluar el efecto de los extractos de Cordyceps takaomontana cultivados en medios sintéticos para la producción de lacasas usando diferentes tipos de disolvente como se observa en la Figura 1.
Los resultados obtenidos en la Figura 1, demuestra que las actividades enzimáticas son mayores en el medio de cultivo de SDAY suplementado con selenito de sodio en el día de máxima actividad enzimática para los disolventes metanol y hexano. Con respecto a los controles, en primer lugar se encuentra que para el medio de cultivo SDAY presenta actividades aproximadamente iguales para los disolventes de metanol y hexano mientras que presenta menores actividades enzimáticas respecto al agua. En segundo lugar, para el medio de cultivo SDAY-SS presenta actividades enzimáticas similares respecto al metanol, mientras que presenta menores actividades enzimáticas respecto a los disolventes de hexano y agua. De igual manera, es posible establecer que los disolventes polares tienen un valor más alto de actividad enzimática con respecto a disolvente no polar.
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Figura 1. Perfiles de actividad enzimática (eje izquierdo) y glucosa (eje derecho) para Pleurotus
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4.2.1. Análisis estadístico
Se analizó el diseño experimental teniendo los resultados de la actividad enzimática de cada uno de los tratamientos aplicando pruebas adecuadas a su distribución. El diseño factorial se realizó con el software estadístico Mitnitab con un nivel de confianza del 95%.Así se puede determinar la significancia de los factores (medio de cultivo, disolvente de extracción, día de toma de muestra) involucrados en el proceso.
Los resultados obtenidos de la simulación, presenta diferencias en el disolvente de extracción y día de tomas de muestra con un p-value de 0.036 y 0.005 respectivamente; sin embargo no se encontraron diferencias estadísticas entre los medios de cultivos SDAY y SDAY con selenito de sodio para los extractos de Cordyceps takaomontana ( p-value=0.065). Por otro lado, se observa que no existen interacciones representativas entre los factores medio de cultivo-disolvente de extracción y medio de cultivo-días con un p-value de 0.587 y 0.7 respectivamente. Finalmente, se observó que la interacción entre disolvente de extracción-días presenta una significancia de 0.03 lo que implica que estos dos factores tienen una relación con respecto a la actividad enzimática.
Las comparaciones entre los experimentos de cada réplica requiere determinar el tipo de distribución, para esto se realizó la prueba de normalidad usando el modelo de Anderson-Darling para observar el comportamiento de los datos. El valor del p-value para la distribución normal es <0.005 por lo que se rechaza la hipótesis nula y los resultados no siguen una distribución normal. Esto se puede explicar porque la actividad enzimática está siendo afectada por el día de toma de muestra, el cual no es constante dado que varía entre 3 y 4 días por lo que a medida que aumenta el tiempo de observación la actividad enzimática también aumenta. Asimismo, el comportamiento de los residuos de los datos no
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es uniforme y presenta mucha dispersión entre sí, lo que demuestra que existen diferencias representativas entre las varianzas de cada una de las réplicas mostrando de esta forma que no se cumple el criterio de homocedasticidad.
Se analizaron los efectos que tienen los factores involucrados en la actividad enzimática, donde se observa que el medio de cultivo SDAY-SS presenta ligeramente una actividad enzimática superior con respecto al medio de cultivo SDAY para el promedio de las réplicas de los tratamientos realizados. En cuanto al disolvente de extracción, se encuentra que el agua presenta una actividad media mayor seguida del metanol y por último el hexano. Finalmente, el factor del día de toma de muestra presenta un aumento constante con respecto al tiempo hasta llegar al día en el que se presente una máxima producción de lacasas, en este caso fue el día 19 y posteriormente decrece hasta el último día de experimentación (ANEXO 5).
4.2.2. Análisis estadístico actividad enzimática máxima
Se evaluó el diseño experimental de la actividad enzimática máxima en el día 19 como se encontró anteriormente, para determinar la influencia de los factores medio de cultivo y disolvente de extracción.
Los resultados obtenidos de la simulación, presenta diferencias en el disolvente de extracción con un p-value de 0.001 y para el medio de cultivo no se presentan diferencias significativas desde el punto de vista estadístico con un p-value de0.056. Finalmente no existen interacciones relevantes entre el medio de cultivo-disolvente de extracción con una significancia de 0.1.
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Las comparaciones entre los experimentos de cada réplica se determinó el tipo de distribución, para ello se realizó la gráfica de residuos cuatro en uno. Al tener un p-value de 0.552 se confirma que los datos siguen una distribución normal. Los residuos contra los ajustes y el orden demuestran una varianza constante y la no dependencia del tiempo de los residuos, por lo tanto no se viola ningún supuesto estadístico de esta distribución (ANEXO 6). De igual manera, se analizaron los efectos de los factores involucrados en el proceso encontrando lo mismo que en análisis estadístico anterior.
La gráfica de contorno de los datos de la máxima actividad enzimática se encuentra en la Figura 2. Esta herramienta permite visualizar la relación entre tres variables en dos dimensiones y tiene como fin representar los resultados experimentales al tomar los dos factores con todos sus niveles y relacionar si los resultados del análisis estadístico corresponden. Se observa que el disolvente de agua tiene una media de actividad mayor frente a los demás experimentos con independencia del medio de cultivo de los extractos crudos de Cordyceps takaomontana. De igual manera, se visualiza que existe una actividad enzimática mínima con el disolvente de extracción de hexano en el medio SDAY.
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Figura 2. Gráfica de control para la máxima actividad enzimática
4.2.3. Efecto del medio y el disolvente en la actividad enzimática
Para determinar cuál es el medio de cultivo de Cordyceps takaomontana con mayor actividad, se utilizó sobre los resultados de actividad el test de comparación múltiple de Tukey. Este test realiza agrupaciones y aquellos niveles cuyas medias no son significativamente distintas son denominados a un mismo grupo, cada grupo es representado por una letra. Los medios SDAY y SDAY-SS se encuentran en el mismo grupo lo que implica que no tienen diferencias significativas desde el punto de vista estadístico con una media de 5925 U/L y 6564 U/L, respectivamente. De acuerdo con los resultados obtenidos por (Olave, 2015), se encuentra el mismo resultado, el cual indica que los medios de cultivos SDAY y SDAY-SS se encuentran en un mismo grupo con actividades enzimáticas medias 5517.788 U/L y 3922.11 U/L respectivamente.
Los disolventes de extracción se dividen en dos grupos en el primero grupo se encuentra el agua con una media de 8831 U/L, en el segundo grupo se encuentran el metanol y el hexano con una media de 5712 U/L y 4159 U/L respectivamente. Lo que
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implica que desde el punto de vista estadístico el único disolvente que presenta una diferencia significativa es el agua. Estos resultados concuerdan con lo obtenido en los incisos 3.2, 3.2.1 y 3.2.2.
Por otro lado, es importante comparar estos resultados sin la adición de un extracto de Cordyceps takaomontana, es decir frente a un control. Para esto, se realizó una prueba T de una muestra para estimar la media de la máxima actividad enzimática de cada medio y cada disolvente para compararla con el promedio de la actividad enzimática máxima. Con la prueba, se puede determinar si el tratamiento es diferente respecto al control con el fin de conocer si el extracto tuvo un efecto benéfico en la producción de lacasas. Por último, se tiene que el control de metanol y agua es de 5237.77 U/L y el control de hexano de 3899.89 U/L.
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De acuerdo con la Figura 3, se concluye que el extracto tuvo un efecto benéfico sobre la producción de lacasas utilizando agua dado que la media está por encima del control y con un p-value de 0. Por otro lado, se tiene que para el disolvente metanol y hexano el control se encuentra sobre la línea media (muy cerca del promedio) y con un p-value de 0.509 y 0.634 respectivamente lo que representa que el extracto no tiene un efecto significativo sobre la producción de lacasas en el medio SDAY.
Figura 4.Medio SDAY SS-Comparación máxima actividad enzimática con su respectivo control.
De acuerdo con la Figura 4, se concluye que el extracto tuvo un efecto benéfico sobre la producción de lacasas utilizando agua dado que la media está por encima del control y con un p-value de 0.049. Por otro lado, se tiene que para el disolvente metanol y hexano el control se encuentra sobre la línea media con un p-value de 0.260 y 0.153
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respectivamente, lo que implica que el extracto no tiene un efecto significativo sobre la producción de lacasas en el medio SDAY-SS.
Los disolventes de agua y metanol presentan una respuesta mayor con respecto al disolvente de n- hexano. Lo anterior, podría explicarse por los nucleósidos que incrementan la producción de lacasas que están presentes en los metabolitos polares (Leger, Durrands, Cooper, & K., 1988). El hexano es utilizado en otros estudios como disolvente de metabolitos no polares (Oh, Hyun, G, Chun Y.J, & Vhoi, 2014), sin embargo en estudios de metabolómica de la especie Cordyceps nidus realizados en otra línea de trabajo del presente proyecto no explican la composición de los extractos hechos con hexano, dado que este siempre extraerá metabolitos no polares, por lo que de acuerdo con (Chiriví Salomón, 2015) se sugiere utilizar otro tipo de disolvente para asegurar la separación correcta de metabolitos.
Para determinar qué tipo de metabolitos pueden ser los candidatos en la potenciación de lacasas y al no contarse con un estudio de metabolómica de Cordyceps takaomontana se realizó una búsqueda bibliográfica de trabajos donde se lleven a cabo caracterizaciones en especies cercanas filogenéticamente para establecer una relación de estos metabolitos en Cordyceps takaomontana. En el estudio de metabolómica de la especie Cordyceps pruinosa (Oh, Hyun, G, Chun Y.J, & Vhoi, 2014) se encontró que entre los metabolitos polares solubles en agua y metanol se encuentran en común 19 compuestos los cuales sonisoleucina, valina, treonina, alanina, lisina, prolina, ácido succínico, ácido cítrico, asparagina, ácido aspártico, glucosa, glicerol, glicina, glucitol, adenosina, ácido fumárico, tirosina, xantina, y adenina.
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De igual manera, resultados obtenidos son contrarios a los reportados por (Dong, Liu, Lei, & Zheng, 2012) en donde reportan que el suplemento de selenito de sodio en los sustratos mejora de manera significativa en la producción de lacasas. Esta contradicción podría ser explicada dado que aunque los hongos usados (C. takaomontana y C. militaris) en el proyecto y en el reporte pertenecen al mismo género, la estructura genómica es diferente (Liu, Park, Kim, Kim, & Park, 2012).
Finalmente, se realizó una comparación con los datos obtenidos por (Olave, 2015) para los medios SDAY y SDAY-SS y los tres disolventes de extracción con sus respectivos controles como se observa en la Figura 5. Se encuentra que la actividad enzimática reportada por Olave presenta el mismo comportamiento ascendente con respecto al tiempo. Sin embargo, se observa que la actividad enzimática reportada (Olave, 2015) es menor comparando con la obtenida en este proyecto. Esto puede explicarse por medio de una modificación en la metodología la cual consistió en la disminución en el tamaño de partícula de la cascarilla de arroz (ANEXO 7).La reducción de tamaño de partículas lleva a un aumento de superficie específica y una reducción del grado de polimerización (DP). El incremento del área superficial específica, reduce DP, este es un factor que incrementa los rendimientos de la hidrólisis entre el 5–25% (dependiendo de la clase de biomasa, clase y duración de la molienda), también se disminuye el tiempo de digestión entre el 23–59% (Sánchez Riaño, Gutiérrez Morales, Muñoz Hernández, & Rivera Barrero, 2010). Por lo tanto se puede decir que el tamaño del sustrato es un factor relevante en la actividad enzimática del Pleurotus ostreatus.
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Figura 5.Comparación de perfiles de actividad enzimática para Pleurotus ostreatus con sus diferentes
medios de cultivo y disolventes de extracción.
5. CONCLUSIONES
El efecto de los extractos de Cordyceps takaomontana en la producción de lacasas de Pleurotus ostreatus, estadísticamente no depende del tipo de medio en el que sea cultivado, lo que es contrario a lo reportado por (Dong, Liu, Lei, & Zheng, 2012). Sin embargo, se establece que medio SDAY-SS es ligeramente mejor que el medio SDAY. Por otro lado, se encuentra que los disolventes polares (metanol y agua) mostraron mayor actividad enzimática con respecto al disolvente no polar (n-hexano), lo cual corresponde con lo reportado en la literatura. No obstante, según el análisis estadístico realizado el único
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disolvente que influye significativamente en la actividad enzimática es el agua con un valor de 8831 U/L con respecto al control 5237.77 U/L.
El consumo de glucosa es, según lo esperado, inversamente proporcional a la actividad enzimática de Pleurotus ostreatus, presentándose algunos picos de cuantificación de glucosa una vez ha disminuido está casi por completo. Esto se debe a que Pleurotus ostreatus, al delignificar, se puede alimentar de la celulosa presente en la cascarilla de arroz y por ende generar glucosa como subproducto temporal.
6. TRABAJO FUTURO
Para próximos proyectos acerca de la producción de metabolitos y actividad enzimática se recomienda la adición de extracto de Cordyceps takaomontana en SDAY y SDAY suplementado con selenito de sodio. Adicionalmente, monitorear la temperatura, condiciones de luz y humedad. Se recomienda realizar este crecimiento controlado con los extractos polares para determinar si a estas condiciones se tienen mayores valores de actividad a los reportados.
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ANEXOS
ANEXO 1. Materiales y equipos.
En la Tabla 2 se encuentran los materiales y equipos utilizados durante el proyecto.
Tabla 2.Materiales y equipos
Materiales y equipos Horas de utilización/Cantidad
Cámara de extracción 40 horas
Liofilizador 50 horas
Sonicador 50 horas
Centrífuga 10 horas
Driller 35 horas
Equipo de agitación 50 horas
Incubadora 50 horas
Espectrofotómetro 30 horas
Erlenmeyer de 150 mL 5
Erlenmeyer de 250 mL 1
Cajas de Petri 20
pHmetro 1
Tubos de fondo cónico x 15 mL 20
Tubos de fondo cónico x 50 mL 20
Tubos de reacción de fondo cónico 100
Micropipeta de 1000 μL 1
Micropipeta de 50 μL 1
Frascos de vidrio de 250 mL 28
Set de puntas azules (1000 µL) x 1000 unidades 1 Set de puntas amarillas (50 µL) x 1000 unidades 1
Jeringas de 10 mL 30
Filtros de 0.22 µm de poro 30
Set de maceradores de plástico 1
Taladro 1
Balanza 1
41
ANEXO 2. Reactivos y medios de cultivo
A continuación se presentan las composiciones de los diferentes medios de cultivo utilizados en el crecimiento de Cordyceps takaomontana y Pleurotus ostreatus con extracto.
El medio líquido SDYA donde se realizó el primer crecimiento de C. takaomontana por 7 días fue preparado para 5 erlenmeyers con 150 mL con las composiciones que se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3.Reactivos para medio líquido SDYA
Reactivo Composición (%) Cantidad (g o mL) Cantidad preparada (g o mL)
Sacarosa 4 40 g 35 g
Peptosa 1 10 g 7.5 g
Levadura 1 10 g 7.5 g
Agua destilada - 1000 mL 750 mL
El medio SDAY fue preparado para 10 cajas de petri con 20 mL cada una. Las cantidades se encuentran en la Tabla 4.
Tabla 4. Reactivos para medio Sabouraud Dextrose Yeast Agar (SDAY)
Reactivo Cantidad
Agua destilada 1000 mL
Agar Sabouraud 65 g
Para el medio SDAY con selenito de sodio se manejaron las mismas cantidades reflejadas en la Tabla 4 con la adición de 0.0005% p/v de selenito de sodio como se muestra en la Tabla 5.
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Tabla 5. Reactivos para medio Sabouraud Dextrose Yeast Agar con selenito de sodio (SDAY-SS)
Reactivo Cantidad
Agua destilada 1000 mL
Agar Sabouraud 65 g
Selenito de sodio 0001 g
El medio basal para Pleurotus ostreatus muestra en la tabla 2.4 las cantidades necesarias para preparar 1L. Se prepara una solución buffer que contiene el citrato y citrato de sodio dihidratado. Esta solución buffer se prepara con el objeto de tener un pH de 4.5, si no se ha alcanzado adicionar NaOH o HCl hasta obtenerlo. La tiamina solo es agregada al momento de servir ya que la temperatura degrada la tiamina al poner el medio en autoclave.
Tabla 6. Reactivos para la preparación de medio basal
Reactivo Cantidad
Glucosa 0.5 g
KH2PO4 2 g
MgSO47H2O 0.25 g
(NH4)SO4 0.9 g
CaCl2 0.1 g
KCl 0.5 g
Agua destilada 1000 mL
Tiamina 0.5 g
Citrato dihidratado 2.1 g
Citrato de sodio dihidratado 2.94 g
HCl 100 mL
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Medio basal y cultivo Medio basal y cascarilla
de arroz
Inóculo
0.5 mL Pleurotus ostreatus + 330 uL
extracto
Suplemento de cobre
90 μL solución CuSO4
1M
Toma de muestras
130 uL de medio 2 veces por semana
ANEXO 3. Resultados cualitativos de la experimentación
En la Figura 6 se presenta el procedimiento experimental cualitativo del proyecto.
Figura 6. Procedimiento experimental
Cultivo
Cordyceps takaomontana
Liofilización
Cordyceps takaomontana
Extracción
44
ANEXO 4. Resultados actividad enzimática y glucosa
Concentración Glucosa SDAY
Concentración Glucosa SDAY-SS
Actividad enzimática SDAY
Actividad enzimática SDAY-SS
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Se presentan los resultados de concentración de glucosa y actividad enzimática por medio para cada tipo de disolvente. Izquierda: Réplica 1. Centro: Réplica 2. Derecha: Réplica 3.
Para la Figura 7, se realizó una línea de tendencia para cada uno de los disolventes. En las Tablas 7, 8, 9 y 10 se encuentran el R2 de cada uno de los ajustes de los datos correspondientes a la concentración de glucosa y actividad enzimática con respecto al medio sintético de cultivo.
Tabla 7. Ajuste de los datos (R2) de concentración de glucosa SDAY
Concentración de glucosa SDAY
Disolvente Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Metanol 0.9483 0.9952 0.9378
Hexano 0.8248 0.9990 0.9843
Agua 0.9226 0.9263 0.9467
Control 0.9497 0.9924 0.9991
Control hexano 0.8821 0.9989 1.000
Tabla 8. Ajuste de los datos (R2) de concentración de glucosa SDAY-SS
Concentración de glucosa SDAY-SS
Disolvente Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Metanol 0.9548 0.9679 0.7681
Hexano 1.000 1.000 1.000
Agua 0.9996 0.9948 0.8501
Control 0.9497 0.9948 0.9991
Control hexano 0.8821 0.9885 0.8856
Tabla 9. Ajuste de los datos (R2) de actividad enzimática SDAY
Actividad enzimática SDAY
Disolvente Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Metanol 0.9263 0.9988 0.9687
Hexano 0.9936 0.8523 0.9521
Agua 0.8660 0.9258 0.8892
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Control hexano 1.000 0.9918 0.9459
Tabla 10. Ajuste de los datos (R2) de actividad enzimática SDAY-SS
Actividad enzimática SDAY-SS
Disolvente Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Metanol 0.9134 0.9836 0.9771
Hexano 0.9442 0.9633 0.9403
Agua 0.9420 0.9339 0.8986
Control 0.9327 0.9483 1.000
Control hexano 0.9916 0.9579 0.9459
De igual manera, se realizó un ajuste de los datos del promedio de las réplicas realizadas
para los medios sintéticos correspondientes a la concentración de glucosa y actividad
enzimática de la Figura 1 Los valores de R2 obtenidos para las líneas de tendencias que más
se ajustaban de acuerdo al tipo de disolvente se encuentran en las Tablas 11 y 12.
Tabla 11. Ajuste de los datos (R2) del medio de cultivo SDAY
Medio de cultivo SDAY
Metanol Hexano Agua
Actividad enzimática 0.9737 0.9689 0.8909
Control- actividad enzimática 0.9549 0.9581 0.9549 Concentración de glucosa 0.9748 0.9895 0.9317 Control- concentración de glucosa 0.9848 0.9497 0.9848
Tabla 12. Ajuste de los datos (R2) del medio de cultivo SDAY-SS
Medio de cultivo SDAY-SS
Metanol Hexano Agua
Actividad enzimática 0.9655 0.9476 0.9224
Control- actividad enzimática 0.9549 0.9581 0.9549 Concentración de glucosa 0.9191 0.8396 0.9827 Control- concentración de glucosa 0.9848 0.9497 0.9848
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ANEXO 5.Análisis estadístico
Se muestran todos los resultados de la prueba de normalidad del modelo de regresión y los supuestos d análisis de varianza que deben cumplirse. El supuesto de normalidad de residuos se ve en la figura 8 (izquierda) y la prueba de normalidad usando el modelo de Anderson-Darling en la Figura 8 (derecha). Las hipótesis que son puestas en esta prueba son:
𝐻0: 𝐿𝑜𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜𝑠 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑛𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙
𝐻1: 𝐿𝑜𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜𝑠 𝑛𝑜 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑛𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙
Figura 8. Resultados diseño factorial y prueba de normalidad
En la figura 8 estable que la distribución de los datos es dispersa y el resultado de la prueba de normalidad con una confianza del 95% se tiene un p-value<0.005 por lo que se rechaza la hipótesis nula y los residuos no presentan una distribución normal
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ANEXO 6. Análisis estadístico actividad enzimática máxima
Se muestran los resultados de la prueba de normalidad del modelo de regresión y los supuestos d análisis de varianza que deben cumplirse. El supuesto de normalidad de residuos se ve en la figura 10 (izquierda) y la prueba de normalidad usando el modelo de Anderson-Darling en la Figura 10 (derecha). Las hipótesis que son puestas en esta prueba son:
𝐻0: 𝐿𝑜𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜𝑠 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑛𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙
𝐻1: 𝐿𝑜𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜𝑠 𝑛𝑜 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑛𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙
Figura 10. Resultados diseño factorial y prueba de normalidad
En la figura 10 estable que la distribución de los datos es dispersa y el resultado de la prueba de normalidad con una confianza del 95% se tiene un p-value de 0.552 por lo que se rechaza la hipótesis nula y los residuos no presentan una distribución normal
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ANEXO 7. Tamaño de partícula de la cascarilla de arroz
Se muestran los tamaños de la cascarilla de arroz usado en el proyecto y por Olave (2015). Donde se puede observar el tamaño utilizado por Olave fue mayor con respecto al utilizado en este proyecto.
Figura 12. Tamaño de partícula de la cascarilla de arroz: (Olave, 2015) derecha y este proyecto izquierda.
