BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA. Facultad de Ciencias Químicas. Licenciatura en Químico Farmacobiólogo. Instituto de Fisiología

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Texto completo

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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA

DE PUEBLA

Facultad de Ciencias Químicas

Licenciatura en Químico Farmacobiólogo

Instituto de Fisiología

Laboratorio de Neuropsiquiatría

Tesis:

EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE ANFETAMINA EN EDAD

INFANTIL SOBRE LA MORFOLOGÍA NEURONAL DE ÁREAS DEL

SISTEMA LÍMBICO A EDADES PRE-PÚBER, PÚBER Y

POST-PÚBER EN LA RATA

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

LICENCIADO EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

PRESENTA

Hiram Tendilla Beltrán

DIRECTOR DE TESIS

Dr. Gonzalo Flores Álvarez

ASESOR INTERNO

Dr. Israel Camacho Ábrego

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Agradecimientos

A mi mamá, mi papá y mi hermano que siempre me han apoyado y se han esforzado por darme más de lo necesario.

A Indi por ser mi persona más especial.

Al Dr. Gonzalo por permitirme trabajar en su laboratorio y brindarme su confianza y apoyo.

A los doctores Israel, Rubén, Alfonso y Laura por su tiempo y dedicación a la revisión de este trabajo.

A Luis, Rubén, Israel, Blanca, César y María Elena por su ayuda que fue fundamental para este trabajo, pero sobre todo por su amistad.

A mis amigos, compañeros, maestros y todos los que de alguna manera hicieron esto posible.

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i

Índice general

Índice de tablas y figuras ... iii

Abreviaturas ... v 1. Introducción ... 1 1.1 Anfetamina... 2 1.1.1. Farmacodinamia ... 2 1.1.2. Farmacocinética ... 2 1.3. Sistema dopaminérgico... 3

1.4. Anfetamina utilizada en niños ... 5

1.5 Neurodesarrollo ... 7

1.6. Sistema límbico... 9

1.6.1. Corteza media prefrontal ... 10

1.6.2. Hipocampo dorsal ... 11

1.6.3. Núcleo accumbens ... 11

1.6.4. Amígdala basolateral ... 11

1.7. Modulación dopaminérgica del sistema límbico ... 12

2. Planteamiento del problema ... 14

3. Justificación ... 14 4. Hipótesis ... 15 5. Objetivos ... 15 5.1. Objetivo general ... 15 5.2. Objetivos específicos ... 15 6. Diagrama de trabajo ... 16 7. Desarrollo experimental ... 17 7.1. Animales ... 17 7.2. Tratamiento ... 17

7.3. Validación de la dosis de anfetamina utilizada ... 17

7.4. Actividad motora en campo cerrado ... 18

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ii

7.6. Análisis morfológico ... 20

8. Resultados ... 23

8.1. Actividad motora en campo cerrado ... 23

8.2. Corteza media prefrontal capa V ... 24

8.2.1. Densidad de espinas dendríticas ... 24

8.2.2. Longitud dendrítica total ... 25

8.2.3. DP 38 ... 26

8.2.4. DP 50 ... 27

8.2.5. DP 62 ... 28

8.3. Núcleo accumbens ... 29

8.3.1. Densidad de espinas dendríticas ... 29

8.3.2. Longitud dendrítica total ... 30

8.3.3. DP 38 ... 31

8.3.4. DP 50 ... 32

8.3.5. DP 62 ... 33

8.4. Amígdala basolateral ... 34

8.4.1. Densidad de espinas dendríticas ... 34

8.4.2 Longitud dendrítica total... 35

8.4.3. DP 38 ... 36

8.4.4. DP 50 ... 37

8.4.5. DP 62 ... 38

8.5. Hipocampo dorsal región CA1 ... 39

8.5.1. Densidad de espinas dendríticas ... 39

8.5.2 Longitud dendrítica total... 40

8.5.3. DP 38 ... 41 8.5.4. DP 50 ... 42 8.5.5. DP 62 ... 43 9. Discusión ... 44 10. Conclusión ... 48 11. Perspectivas ... 48 12. Referencias ... 49

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iii

Índice de tablas y figuras

Tabla 1. Etapas del desarrollo cerebral……….. 8

Figura 1. Mecanismo de acción de la anfetamina ... 3

Figura 2. Síntesis, liberación y metabolismo de la dopamina. ... 4

Figura 3. Mecanismo de la dopamina en el TDAH ... 7

Figura 4. Línea del tiempo comparativa del desarrollo cerebral entre humanos y ratas. ... 9

Figura 5. Regulación dopaminérgica del sistema límbico ... 13

Figura 6. Actividad motora en campo cerrado ante ambiente novedoso ... 19

Figura 7. Localización de las áreas de interés ... 21

Figura 8. Análisis de Sholl ... 22

Figura 9. Actividad motora en campo cerrado………... 23

Figura 10. Densidad de espinas dendríticas CmPF V……….. 24

Figura 11. Longitud dendrítica total CmPF V………... 25

Figura 12. Arborización CmPF V DP 38………... 26

Figura 13. Número de orden CmPF V DP 38……….. 26

Figura 14. Arborización CmPF V DP 50………... 27

Figura 15. Número de orden CmPF V DP 50……….. 27

Figura 16. Arborización CmPF V DP 62………... 28

Figura 17. Número de orden CmPF V DP 62……….. 28

Figura 18. Densidad de espinas dendríticas NAcc………. 29

Figura 19. Longitud dendrítica total NAcc………. 30

Figura 20. Arborización NAcc DP 38……… 31

Figura 21. Número de orden NAcc DP 38……… 31

Figura 22. Arborización NAcc DP 50………. 32

Figura 23. Número de orden NAcc DP 50……… 32

Figura 24. Arborización NAcc DP 62………. 33

Figura 25. Número de orden NAcc DP 62……… 33

Figura 26. Densidad de espinas dendríticas ABL………... 34

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iv

Figura 28. Arborización ABL DP 38………... 36

Figura 29. Número de orden ABL DP 38……….. 36

Figura 30. Arborización ABL DP 50……….. 37

Figura 31. Número de orden ABL DP 50……….. 37

Figura 32. Arborización ABL DP 62……….. 38

Figura 33. Número de orden ABL DP 62……….. 38

Figura 34. Densidad de espinas dendríticas HD CA1……… 39

Figura 35. Longitud dendrítica total HD CA1………... 40

Figura 36. Arborización HD CA1 DP 38……… 41

Figura 37. Número de orden HD CA1 DP 38………... 41

Figura 38. Arborización HD CA1 DP 50……….. 42

Figura 39. Número de orden HD CA1 DP 50………... 42

Figura 40. Arborización HD CA1 DP 62……… 43

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v

Abreviaturas

ABL Amígdala basolateral

ANOVA Análisis de varianza

AMPc Monofosfato de adenosina cíclica

ANF Anfetamina

ATV Área tegmental ventral

CmPF Corteza media prefrontal

CPF Corteza prefrontal

CTL Grupo control

DA Dopamina

DAT-1 Transportador de dopamina tipo 1

DP Día postnatal

DSM-V Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales, quinta edición

EEM Error estándar de la media

HD Hipocampo dorsal

LDT Longitud dendrítica total

MAO Monoamino oxidasa

MFD Metilfenidato

NA Noradrenalina

NAcc Núcleo accumbens

NAT Transportador de noradrenalina

PBS Buffer de fosfatos salino

SNc Sustancia nigra pars compacta

SNC Sistema nervioso central

TVMA2 Transportador vesicular de monoaminas tipo 2

TDAH Trastorno por déficit de atención e hiperactividad

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1

1. Introducción.

La anfetamina (ANF) es un psicoestimulante considerado un agonista indirecto dopaminérgico, utilizado ampliamente tanto de manera terapéutica como recreativa (Heal y cols., 2013). En los niños la ANF es una sustancia que se utiliza para el tratamiento de algunas patologías psiquiátricas tales como la narcolepsia y trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH), en el cual incluso es el tratamiento de primera elección a pesar de la falta de información pre-clínica y clínica que demuestren sus efectos a largo plazo (Faraone y Wilens, 2003; Tripp y Wickens, 2009; Sharma y Couture, 2014). La controversia en torno al uso de la ANF en niños es debido a que ha demostrado que la exposición a psicoestimulantes durante el neurodesarrollo puede afectar de manera importante este proceso, el cual es indispensable la generación de redes neuronales adecuadas para el correcto funcionamiento del cerebro en el individuo (Kolb y

cols., 2012). Además se ha demostrado que la exposición a ANF durante el neurodesarrollo induce cambios anatómicos y fisiológicos en el sistema límbico (Robinson y Kolb, 1999; Flores y cols., 2011), el cual es crítico en el sistema nervioso central (SNC) debido a que es el encargado de la respuesta fisiológica y psicológica de la información externa e interna del individuo, y en base a ello generar emociones, motivaciones, almacenar y evocar recuerdos, y finalmente así guiar la conducta (Vertes, 2006; Sokolowski y Corbin, 2012). Una alteración de este sistema puede conllevar a condiciones psiquiátricas como una conducta de abuso de sustancias, depresión mayor y cuadros esquizofreniformes (Pierce y Kumaresan, 2006; Hutson y cols., 2014).

En este trabajo se estudiarán los efectos cronológicos de la ANF a dosis bajas administrada en ratas sanas en edad pre-púber, sobre la morfología neuronal de cuatro áreas del sistema límbico, la corteza media prefrontal (CmPF), el núcleo accumbens (NAcc), el hipocampo dorsal (HD) y la amígdala basolateral (ABL), teniendo como finalidad describir si existen cambios inducidos por la ANF en las neuronas de estas zonas en la misma edad de la administración, edad pre-púber, así como a edad púber y post-púber.

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1.1. Anfetamina.

Desde que comenzó a sintetizarse en 1927 por el químico estadounidense Gordon A. Alles la 1-fenilpropan-2-amina (ANF) se ha usado ampliamente tanto para usos terapéuticos como recreativos. Este psicoestimulante posee un grupo fenilo y un grupo amino en su estructura por ello es considerado un simpáticomimético debido a su homología estructural con neurotransmisores como la dopamina (DA) y la noradrenalina (NA). Además este compuesto posee un centro quiral por lo cual existen dos enantiómeros activos la d-anfetamina y la l-anfetamina (Heal y cols., 2013).

1.1.1. Farmacodinamia.

La ANF es un simpáticomimético de acción indirecta ya que aumenta la concentración extracelular de la DA mediante la inhibición del transportador de dopamina tipo 1 (DAT-1), el transportador vesicular de monoaminas tipo 2 (TVMA2), y la inhibición de la monoamino oxidasa (MAO), que subsecuentemente reduce el metabolismo de la DA en el citosol. Además la ANF a dosis elevadas induce la liberación de DA que no está en vesículas por medio de la acción reversa del DAT-1 y por la estimulación de la liberación de DA vesicular, e incrementa la disponibilidad de la NA a través del bloqueo del transportador de NA (NAT) y la inhibición de la MAO (Bahena-Trujillo y cols., 2000; Sulzer y cols., 2005; Heal y cols., 2013; Hutson y cols., 2014). Después de una administración aguda de ANF (0.5 mg/kg), el flujo de DA y NA en el NAcc y la CmPF de la rata incrementa, conduciendo a una mayor neurotransmisión de DA y NA en la vía mesocorticolímbica (Hutson y cols., 2014) (figura 1).

1.1.2. Farmacocinética.

La ANF atraviesa la barrera hematoencefálica y no es metabolizada ni por la MAO ni por la catecol-o-metil transferasa (COMT) por lo que su acción es prolongada. Su metabolismo es hepático por enzimas del citocromo P450, generando por oxidación dos metabolitos activos: la 4-hidroxianfetamina y la norefedrina;

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mientras que por desaminación se produce la fenilacetona la cual se oxida formando ácido benzoico que finalmente se conjuga con glicina formando ácido hipúrico. Del 30 al 50% de la dosis de ANF administrada se elimina por vía renal en forma activa (Flores, 1997). Ya se ha determinado la farmacocinética de la ANF en ratas jóvenes, similar a la dosis terapéutica utilizada en niños con TDAH, administrada vía subcutánea, encontrando una vida media aproximada de 1 h (Diaz Heijtz y cols., 2003).

Figura 1.Mecanismo de acción de la anfetamina. La ANF durante los primeros minutos de su

administración bloquea el DAT-1 y el TVMA2 aumentando así la disponibilidad de la DA en la sinapsis. También disminuye el catabolismo de la DA inhibiendo la MAO y estimula la liberación de DA que no está almacenada en vesículas induciendo la acción reversa del DAT-1 cuando la exposición es prolongada. Modificado de Heal y cols., 2013.

1.3. Sistema dopaminérgico.

La DA es el neurotransmisor catecolaminérgico más importante del SNC, participando en la regulación de diversas funciones como la conducta motora, las emociones y la afectividad. Es sintetizada a partir del aminoácido L-tirosina en el citoplasma de la célula (figura 2).

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Figura 2.Síntesis, liberación y metabolismo de la dopamina. La tirosina hidroxilasa (TH) es una

oxidasa que utiliza la L-tirosina y el oxígeno como sustratos y la tetrahidrobiopterina (BH4) y el Fe 2+

como cofactor hidroxilando al aminoácido para formar DOPA que es descarboxilada por la L-amino aromático descarboxilasa (LAAD) usando como cofactor el piridoxal fosfato para finalmente obtener DA. Esta se almacena en vesículas para su liberación, la cual una vez efectuada tiene efecto en autorreceptores (indicados en rojo) y en heterorreceptores (indicados en negro) y es recapturada por el DAT-1 (indicado en azul). La DA es metabolizada en el citosol por la monoamino oxidasa A (MAO-A) en ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) y este en el exterior de la célula es convertido a ácido homovalínico (HVA) por la enzima catecol-O-metiltransferasa (COMT). Tomado y modificado de Bahena-Trujillo y cols., 2000.

Se han identificado 5 subtipos de receptores de DA, todos acoplados a proteínas G y divididos en dos familias farmacológicas denominadas D1 y D2. Los receptores

de la familia D1 (subtipos D1 y D5) están acoplados a proteínas Gs, estimulando la

formación de AMPc como principal mecanismo de transducción. Los subtipos pertenecientes a la familia D2 (D2, D3 y D4) inhiben la formación de AMPc, activan

canales de K+ y reducen la entrada de Ca2+ a través de canales dependientes de voltaje, todo esto mediado por proteínas Gαi y Gαo (Bahena-Trujillo y cols., 2000).

Las neuronas dopaminérgicas se localizan en el mesencéfalo, en el área tegmental ventral (ATV) y la sustancia nigra pars compacta (SNc), las cuales

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tienen eferencias hacía diversas áreas del SNC incluyendo el caudado, el putamen, el NAcc, la amígdala, el hipocampo y la corteza cerebral. Se debe resaltar que la SNc proyecta principalmente al estriado dorsolateral, y por lo tanto está implicada en el control motor, mientras que el ATV lo hace principalmente hacia el estriado ventromedial involucrada así en funciones afectivas y cognitivas (Tripp y Wickens, 2009).

Para su liberación la DA se almacena en vesículas a través del TVMA2. En ausencia de un potencial de acción, una pequeña cantidad de DA vesicular es liberada al espacio sináptico por la terminal presináptica, esto constituye una fuente continua de DA que actúa sobre autorreceptores D2-D3 generando una

inhibición de la retroalimentación en la misma neurona inhibiendo así la liberación de DA. Cuando un potencial de acción llega a la terminal presináptica se induce la liberación de una gran cantidad de DA vesicular al espacio sináptico; esto forma una fuente fásica de DA que actúa sobre receptores de las familias D1 y D2 en la

terminal postsináptica. La cantidad de DA liberada consecuencia del potencial de acción depende de la acción inhibitoria producida por la estimulación de los receptores D2-D3 por la fuente continua de DA. La acción de la DA en los

receptores postsinápticos se termina después de su recaptación a la terminal presináptica por el DAT-1 (Sharma y Couture, 2014).

1.4. Anfetamina utilizada en niños.

La ANF es comúnmente utilizada en los niños para tratar condiciones psiquiátricas como el TDAH y la narcolepsia, incluso para para el TDAH es uno de los tratamientos de primera elección junto con el metilfenidato (MFD) (Heal y cols., 2013; Sulzer y cols., 2014). Dado que el TDAH es un trastorno común en niños caracterizado por una falta de atención, impulsividad o hiperactividad persistentes (Asociación Americana de Psiquiatría, DSM-V, 2013), con una incidencia del 3 al 5 % en niños en edad escolar (6 a 12 años de edad) de acuerdo a cifras del Instituto Nacional de Psiquiatría (Vásquez y cols., 2010), existe una controversia en torno

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al uso de ANF como terapéutica en los infantes ya que algunos estudios que afirman que no es un factor de riesgo para desarrollar una conducta de abuso de sustancias en la adolescencia y la adultez, e incluso genera un efecto protector hacia esta conducta (Faraone y Willens, 2003); pero también existen reportes de efectos negativos en niños tratados con ANF, afectando el crecimiento y aumentando el riesgo de desarrollar una conducta de abuso de sustancias durante la adolescencia y la etapa adulta (Berman y cols., 2009).

Se ha planteado la hipótesis de que cuando un individuo esta aburrido o fatigado, se secreta una cantidad muy pequeña de DA fásica, esto conlleva a una activación insuficiente de receptores postsinápticos dopaminérgicos, en la CPF, el estriado y el cerebelo, generando que el individuo se distraiga fácilmente o sea impulsivo; mientras que bajo condiciones de estrés, se libera gran cantidad de DA, produciendo una sobrestimulación de estos receptores en las mismas zonas, lo que conduce a atención y respuestas erróneas. Una estimulación moderada de estos receptores postsinápticos de DA favorece la atención guiada, concentración y organización de pensamientos y acciones (figura 3) (Bahena-Trujillo y cols., 2000; Heal y cols., 2013; Sharma y Couture, 2014).

Varios estudios han reportado una disminución de los niveles normales en la densidad de receptores de DA en distintas regiones del cerebro en pacientes con TDAH. Además se han encontrado polimorfismos en genes que codifican para el receptor de dopamina D4, D5 y DAT-1 en estos pacientes y están asociados a una disfuncionalidad del sistema dopaminérgico (Tripp y Wickens, 2009).

Debido a que los niños experimentan etapas críticas del neurodesarrollo, proceso el cual se ha descrito es muy sensible a estímulos como las experiencias sensoriales, las motoras y la exposición a sustancias psicoestimulantes como la ANF, la cual afecta de manera importante el desarrollo cerebral (Kolb y cols., 2012), es importante revisar este proceso ante la exposición de ANF.

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Figura 3. Mecanismo de la dopamina en el TDAH. DA indicada en círculos amarillos. A)

Liberación mínima de la fuente continua de DA estimulando autorreceptores (indicados en rojo), B) Inhibición de la retroalimentación y de la liberación de DA, C) Liberación abundante DA, fuente fásica, consecuencia de un potencial de acción, D) Estimulación de heterorreceptores (indicados en negro y morado) generando la sintomatología del TDAH, E) Recaptura de DA mediante el DAT-1 (indicado en azul) insuficiente. Esto sucede principalmente en CPF, el estriado y el cerebelo. Tomado y modificado de Sharma y Couture, 2014.

1.5 Neurodesarrollo.

El neurodesarrollo es un proceso dinámico y complejo de interacción entre el individuo y el ambiente que determina las conexiones neuronales el cual comprende siete etapas como se muestra en la tabla 1 (Kolb y Gibb, 2011).

Se ha descrito una extrapolación temporal de los sucesos del neurodesarrollo humano en rata (figura 4). Tanto en el humano como en la rata la neurogénesis está completa para el día del nacimiento (exceptuando al hipocampo, núcleo en el cual se siguen formando neuronas a lo largo de la vida); por otro lado mientras que en el humano la migración celular está completa para el nacimiento, en la rata este proceso se extiende hasta el día postnatal (DP) 6. Posteriormente las células deben diferenciarse en el fenotipo correcto, formar conexiones, y después ocurre

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una poda sináptica en base a experiencias, proceso crítico para la correcta formación de las redes neuronales (Clancy y cols., 2007; Kolb y Gibb, 2011; Kolb y

cols., 2013).

Tabla 1. Etapas del desarrollo cerebral

Se ha demostrado que la exposición a ANF produce grandes cambios en la estructura de las células de la CmPF y NAcc en ratas adultas (Robinson y Kolb, 1997; Robinson y Kolb, 1999; Kolb y cols., 2003; Robinson y Kolb, 2004). Un trabajo previo en nuestro laboratorio reportó alteraciones en la densidad de receptores de DA y el DAT-1 en el NAcc en ratas expuestas prenatalmente a ANF y evaluadas a etapas pre-púber y post-púber (Flores y cols., 2011); pero poco se sabe sobre los efectos de la exposición a ANF en edad pre-púber, equivalente a la edad infantil en los humanos.

Se ha descrito que la exposición a ANF y otros psicoestimulantes afectan significativamente las estructuras que pertenecen al sistema límbico (Robinson y Kolb, 1999; Castellanos y cols., 2002) por lo cual es importante describir dicho sistema y como es que estas sustancias actúan sobre él.

1.- Nacimiento celular (neurogénesis, gliogénesis) 2.- Migración celular

3.- Diferenciación celular

4.- Maduración celular (crecimiento dendrítico y axonal) 5.- Sinaptogénesis

6.- Muerte celular y poda sináptica 7.- Mielogénesis

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Figura 4. Línea del tiempo comparativa del desarrollo cerebral entre humanos y ratas.

Mientras que la migración celular en el humano está casi completa al momento del nacimiento en la rata se completa aproximadamente al día 6 postnatal (DP) periodo durante el cual también comienza la sinaptogénesis. La poda sináptica comienza antes de la pubertad y continúa hasta la etapa adulta. Tomado y modificado de Andersen, 2003; Kolb y Teskey, 2010 y Kolb y cols., 2013.

1.6. Sistema límbico.

El hecho de que se hayan demostrado alteraciones en la CPF y el NAcc debido a la exposición de ANF y otros psicoestimulantes (Robinson y Kolb, 1997; Carmona y cols., 2009; Flores y cols., 2011), incluso bajo condiciones terapéuticas (Díaz Heijtz y cols., 2003; Berman y cols., 2009), así como la desregulación del ATV núcleo dopaminérgico (Sulzer y cols., 2005), todas estas áreas pertenecientes al sistema límbico (MacLean, 1954), nos lleva a la revisión de dicho sistema.

La importancia de las redes neuronales del sistema límbico recae en su acción reguladora en base a la respuesta fisiológica, conductual y psicológica, de la información que integran tanto externa como interna, permitiendo al individuo tener conciencia de uno mismo y crear un contexto de cómo se relaciona con el mundo exterior. A través de su papel en la formación de recuerdos y la integración de estos con sensaciones fisiológicas y estados emocionales, la función límbica conduce a la toma de decisiones basada en emociones que permite la adaptación al ambiente en base a experiencias previas. Además el sistema límbico abarca los núcleos neuronales del placer y la recompensa, llevando a la motivación que

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finalmente guía la conducta (Morgane y cols., 2005; White y cols., 2008; Sokolowski y Corbin, 2012).

El sistema límbico se puede dividir en regiones corticales y subcorticales. La porción cortical (lóbulo límbico) incluye a la amígdala, al hipocampo, al giro parahipocampal y el giro del cíngulo, además de la corteza orbital y media prefrontal. Dentro de las regiones subcorticales se encuentran el núcleo septal, el NAcc, los cuerpos mamilares, el hipotálamo, el núcleo anterior del tálamo y el mesencéfalo límbico (White y cols., 2008).

La organización cerebral del sistema límbico se puede estudiar en base a dos principios complementarios: el primero de ellos es modulador, el cual depende de la función especializada de diferentes áreas del sistema cada una con un conjunto de neuronas que efectúa sus propias y únicas funciones. El segundo principio es que funciones complejas, como los sentimientos, la motivación, etc., que emergen de conexiones entre estas áreas formando a través de circuitos neuronales (Morgane y cols., 2005).

Las regiones de interés del sistema límbico para este estudio son la CmPF, el NAcc, la ABL y el HD.

1.6.1. Corteza media prefrontal.

La CmPF es una región heterogénea del cerebro de la rata, que incluye la corteza prelímbica, corteza infralímbica , la corteza anterior del cíngulo y la corteza insular agranular, así como áreas orbito-frontales entre otros subnúcleos; la cual desarrolla funciones complejas como la memoria de trabajo, así como la atención, la cognición, las emociones y el control ejecutivo (Sokolowski y Corbin, 2012).

La AC proyecta al NAcc vía proyecciones glutamatérgicas y es parte de la CmPF implicada en el procesamiento de las emociones. Proyecciones adicionales

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descienden de la CmPF al NAcc, la amígdala y otros núcleos límbicos involucrados en la regulación de la conducta de búsqueda-recompensa (Morgane y cols., 2005; Vertes, 2006).

1.6.2. Hipocampo dorsal.

El HD está involucrado con la integración de información multimodal y es responsable de la formación de memorias declarativas antes que la información sea transferida a otras regiones. La formación de memorias es a través la experiencia emocional, especialmente vía conexiones glutamatérgicas con la amígdala (White y cols., 2008). Existen proyecciones hipocampales (CA1) hacia la CmPF que se ha demostrado tienen un papel en funciones mnemónicas (Vertes, 2006).

1.6.3. Núcleo accumbens.

Este núcleo juega un papel importante en el circuito límbico ya que es responsable de conductas motivadas y dirigidas a objetivos, como la expresada por los adictos en la búsqueda compulsiva de sustancias (Fernández-Espejo, 2000).

La inervación dopaminérgica del NAcc proviene del ATV y está relacionada con el refuerzo y la recompensa. Se piensa que la conducta dirigida a objetivos es regulada a través de aferencias glutamatérgicas originadas en la ABL, el hipocampo y la CmPF, convergiendo en neuronas espinosas medianas del NAcc. Las eferencias GABAérgicas del NAcc son transmitidas a través de proyecciones al pálido ventral, que es responsable de la ejecución motora de estas conductas dirigidas a objetivos. (Fernández-Espejo, 2000; Morgane y cols., 2005).

1.6.4. Amígdala basolateral.

La ABL tiene abundantes relaciones reciprocas con la neocorteza y los núcleos frontales. Proyecta eferencias glutamatérgicas hacia el NAcc y la CmPF, influyendo en conductas complejas como la memoria, el procesamiento emocional

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y la regulación de la ansiedad (Morgane y cols., 2005; Chen y cols., 2011; Bringas y cols., 2013).

1.7. Modulación dopaminérgica del sistema límbico.

La amígdala, el hipocampo y la CmPF envían proyecciones glutamatérgicas (excitatorias) al NAcc. El NAcc tiene eferencias GABAérgicas (inhibitorias) al pálido ventral (PV) el cuál es el encargado de la ejecución motora de la conducta dirigida a objetivos del NAcc; el PV envía proyecciones GABAérgicas al tálamo dorsomedial y este envía proyecciones glutamatérgicas a la CmPF cerrando así el circuito (Pierce y Kumaresan, 2004).

Se han clasificado tres tipos de sistemas dopaminérgicos, basados en estudios de histofluorescencia (Fuxe, 1965): sistemas ultracortos, sistemas de longitud intermedia y sistemas largos; este último grupo incluye a las neuronas del ATV que forma la vía mesolímbica (Bahena-Trujillo y cols., 2000). Las neuronas dopaminérgicas del ATV inervan al NAcc, amígdala, hipocampo, CmPF y al pálido ventral formando así la vía mesocortícolímbica (figura 5). Ante una sobre estimulación en cambios en la transmisión dopaminérgica juegan un papel crítico en la modulación del flujo de la información a través del circuito límbico. Si el NAcc está sobre estimulado por dopamina (debido a la administración de ANF) directamente por el ATV o indirectamente por la estimulación del ATV a la CmPF que a su vez estimula vía eferencias glutamatérgicas al NAcc este inhibirá mediante eferencias GABAérgicas al PV y por lo tanto este no podrá ejercer su acción inhibitoria sobre el tálamo dorsomedial el cual sobreexcitará a la CmPF llevando al individuo a desatención, impulsividad y falta de memoria (Morgane y

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Figura 5. Regulación dopaminérgica del sistema límbico. Interacciones dopaminérgicas,

glutamatérgicas y GABAérgicas entre la corteza media prefrontal (CmPF), núcleo accumbens (NAcc), pálido ventral (PV), área tegmental ventral (ATV), hipocampo y tálamo dorsomedial. La CmPF, el hipocampo y la amígdala tienen eferencias glutamatérgicas hacia el NAcc este proyecta hacia el PV el cual regula al tálamo dorsomedial que posee neuronas con actividad espontánea que cierran el circuito proyectando hacia la CmPF. Tomado y modificado de Morgane y cols., 2005 y Pierce y Kumaresan, 2006.

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2. Planteamiento del problema.

La administración de ANF en niños está indicada para el tratamiento de algunas condiciones psiquiátricas tales como el TDAH y la narcolepsia, a pesar de la falta de información sobre sus consecuencias a largo plazo, incluso se han descrito asociaciones contradictorias entre el consumo de ANF durante la infancia y el abuso en el uso de sustancias en edades posteriores (adolescencia y edad adulta), por ello aún existe la controversia si la anfetamina administrada en los niños afecta el desarrollo del cerebro del individuo y su función óptima en la adolescencia y la adultez (Díaz Heijtz y cols., 2003; Faraone y Wilens, 2003; Bertman y cols., 2008).

3. Justificación.

Se han demostrado modificaciones morfológicas persistentes en la CmPF y el NAcc debido a la administración crónica de ANF en dosis escaladas llegando hasta 8 mg/kg en ratas adultas (Robinson y Kolb, 1997; Robinson y Kolb, 2004), sin embargo solo existe un trabajo el cual evalúa los cambios en la morfología de la CPF y el NAcc en ratas a edad púber, después de un tratamiento continuo con ANF en dosis de 1 mg/kg/día durante el periodo pre-púber (Diaz Heijtz y cols., 2003). Pero se desconoce si existen cambios morfológicos a edades pre-púber o si estos cambios son persistentes hasta la edad post-púber.

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4. Hipótesis.

La administración diaria de ANF a una dosis de 1 mg/kg vía subcutánea en ratas sanas a edad pre-púber del DP 21 al 36 producirá cambios persistentes hasta la edad post-púber sobre la estructuras del sistema límbico.

5. Objetivo.

5.1. Objetivo general.

Evaluar el efecto de la administración de anfetamina (1 mg/kg) por 15 días sobre morfología neuronal de áreas del sistema límbico y en la conducta motora de la rata sana a edades pre-púber (DP 38), púber (DP 50) y post-púber (DP 62).

5.2. Objetivos específicos.

- Evaluar el efecto del tratamiento sobre la actividad motora a campo cerrado ante ambiente novedoso de la rata a edades DP 38, 50 y 62.

- Determinar el efecto producido por el tratamiento en la arborización dendrítica, número de orden, longitud dendrítica total y densidad de espinas dendríticas en edades DP 38, 50 y 62, en neuronas:

 Piramidales de la corteza media prefrontal capa V.

 Piramidales del hipocampo dorsal región CA1.

 Piramidales de la amígdala basolateral.

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6. DIAGRAMA DE TRABAJO

Ratas macho SD DP 21 n=60 Anfetamina Control DP 38 n=10 Administración (DP 21 al 36) de PBS (1 ml/kg)

Actividad motora en campo cerrado

Perfusión y extracción cerebros Técnica de Golgi-Cox Trazado y análisis neuronal Administración (DP 21 al 36) de sulfato de d-anfetamina (1mg/kg) DP 50 n=10 DP 62 n=10 DP 38 n=10 DP 50 n=10 DP 62 n=10

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7. Desarrollo experimental.

7.1. Animales.

Se obtuvieron ratas hembras y sus crías de la cepa Sprague-Dawley provenientes del bioterio “Claude Bernard” de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Se discriminaron las crías hembras y solo se dejó a la madre con los machos (n=60). Las ratas se quedaron bajo condiciones controladas de temperatura, humedad, ciclo luz-oscuridad 12:12 h, comida y agua ad libitum. Al destete (DP 21) las ratas fueron separadas de su madre y se dispusieron de a 5 sujetos por caja de alojamiento. De manera aleatoria se seleccionaron 30 ratas que se administraron con ANF, teniendo así el grupo problema y 30 que se administraron únicamente con el vehículo, para generar el grupo control (CTL). De ambos grupos se trabajaron tres edades DP 38 (pre-púber), DP 50 (púber) y DP 62 (post-púber); para lo cual de manera aleatoria se seleccionaron 10 ratas para formar el grupo de cada edad, teniendo finalmente seis grupos.

7.2. Tratamiento.

Del DP 21 al 36 las ratas se pesaron cada dos días y se administraron por vía subcutánea, para el grupo problema sulfato de d-anfetamina a dosis de 1 mg/kg y para el CTL 1 ml/kg de buffer de fosfatos salino (PBS) 1x.

7.3. Validación de la dosis de anfetamina utilizada.

Se ha determinado la farmacocinética de la ANF en ratas jóvenes, para lo cual ratas de edad entre DP 23 a 26 recibieron una única inyección de ANF (0.5 mg/kg) y se les tomó muestra de sangre a diferentes tiempos (5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2h, 4h y 8h). Las muestras sanguíneas fueron centrifugadas a 4000 g por 10 min y almacenadas a -20 °C hasta su análisis. La concentración plasmática de ANF fue

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determinada por medio de cromatografía líquida y espectrofotometría de masas (Diaz Heijtz y cols., 2003).

Encontraron un nivel máximo en plasma de 85 ± 4 ng/mL de ANF durante el intervalo de 5 a 15 min después de la administración. El tiempo de vida media de la ANF fue aproximadamente de 1 h (Diaz Heijtz y cols., 2003). En niños con TDAH la dosis recomendada de D-anfetamina vía oral es de 0.4 a 0.6 mg/kg/día (Powers, 2000). Un trabajo previo ha reportado que una única dosis en el rango de 0.35 a 0.58 mg/kg, vía oral, de D-anfetamina resulto en un nivel máximo en plasma entre 64-84 ng/kg en niños con ADHD (Brown y cols., 1979). Basados en toda esta información este grupo de investigadores estimaron que una inyección única vía subcutánea de ANF (0.5 mg/kg) promovería concentraciones plasmáticas de ANF en ratas jóvenes correspondientes al rango clínico usado para niños con TDAH. Además un estudio realizado determino una curva dosis respuesta de ANF en ratas, con dosis de 0.125mg hasta 8 mg/kg de peso, donde pudieron observar que las dosis de 0,125mg/kg a 1 mg/kg produjeron sensibilización (Robinson y Kolb, 1999).

7.4. Actividad motora en campo cerrado

Esta prueba se realizó después del tratamiento una vez que las ratas alcanzaron la edad DP 38, 50 o 62. Para la realización de esta prueba se requirió transportar a las ratas del bioterio al laboratorio un día antes de que se efectuara, con la finalidad de que los animales se adaptaran al ambiente del laboratorio. La prueba comenzó a las 9:00 h con una duración de 120 min. Las ratas se colocaron individualmente en cajas de acrílico oscuras con dimensiones de 22 × 22 × 44 cm durante 120 min. Dichas cajas poseen 8 pares de fotodiodos ubicados en las paredes laterales a 3 cm de la altura de la base (figura 6), la interrupción de los haces de luz emitidos por los fotodiodos será tomado en cuenta como un movimiento que un actímetro contó por 12 intervalos de 10 min.

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19

Figura 6. Actividad motora en campo cerrado ante ambiente novedoso. Se esquematiza la

caja de acrílico con paredes oscuras que incluye los 8 pares de fotodiodos que al interrumpir el haz de luz que proyectan el actímetro lo contara como un movimiento.

7.5. Técnica de Golgi-Cox.

Inmediatamente terminada la prueba de actividad motora en campo cerrado, ante ambiente novedoso, se administraron las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico (60 mg/kg) vía intraperitoneal, para proceder a la perfusión con solución fisiológica por el ventrículo izquierdo con el fin de remover los eritrocitos de los vasos sanguíneos cerebrales.

Una vez concluida la perfusión se procedió a la extracción de los cerebros y se realizó la tinción de Golgi-Cox (Gibb y Kolb, 1998), para lo cual los cerebros fueron colocados de manera individual en solución de Golgi-Cox (K2Cr2O7 170mM, HgCl2

200mM, K2CrO4 200mM) y almacenados en recipientes oscuros durante 15 días,

para un cambio con solución de Golgi-Cox nueva y se dejaron por un lapso de 15 días inmersos en esta solución en oscuridad. Terminado este proceso los cerebros se colocaron en una solución de sacarosa al 30% durante 5 días. Pasado este periodo se procedió a cortar el tejido utilizando un vibratomo manual motorizado modelo MA752, los cortes fueron a 200 µm y se colocaron en laminillas

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20

previamente gelatinizadas. Una vez obtenidos los cortes se procedió a revelarlos mediante la siguiente técnica:

1. Sumergir 30 min en hidróxido de amonio (en oscuridad). 2. 10 lavados con agua destilada (en oscuridad).

3. Sumergir 30 min en fijador rápido de Kodak, diluido en agua 1:3 (en oscuridad).

4. 10 lavados con agua destilada (en oscuridad).

5. Deshidratar el tejido sumergiéndolo en concentraciones crecientes de alcohol:

- 10 min en alcohol al 75% - 10 min en alcohol al 90% - 30 min en alcohol absoluto

6. Aclarar el tejido sumergiéndolo 15 min en xileno. 7. Montar con resina sintética.

7.6. Análisis morfológico.

Se localizaron las regiones de interés mediante el atlas de referencias estereotáxicas del cerebro de rata (Paxinos y Watson, 1998) (figura 7) y se seleccionaron neuronas bien impregnadas, completas y aisladas que permitieran apreciar completamente el árbol dendrítico basilar (Kolb y cols., 1998). Por cada área de dibujaron 10 neuronas (5 de cada hemisferio) que cumplieran con los requisitos antes mencionados, con ayuda de un microscopio óptico marca Leica DM2000, el cual tiene acoplado una cámara lúcida que permite el trazo de la neurona, esto a 40x. Para la densidad de espinas dendríticas se trazó un segmento de 5.4 cm, equivalente a 10 µm, de la dendrita más distal de la misma neurona antes trazada, esto a 100x.

Ya trazadas las neuronas y los segmentos dendríticos se procedió a su análisis. Para las neuronas dibujadas se realizó el análisis de Sholl que consiste en diferenciar las dendritas según su orden dendrítico: las nacientes del soma se

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21

consideran de primer orden, las que se bifurcan de estas de segundo orden y así sucesivamente. Después se coloca una plantilla transparente de círculos concéntricos, en donde el círculo central coincide con el soma, y se cuentan las intersecciones de cada orden dendrítico con cada uno de los círculos (figura 8). De este análisis se estimó la arborización total, el número de orden y la longitud dendrítica total (LDT). Para los segmentos dendríticos se contó el número de espinas que hay en los 5.4 cm trazados para así estimar el número de total de espinas (Kolb y cols., 1998).

Se trazaron y analizaron un total de 2400 neuronas y 2400 segmentos dendríticos.

Figura 7. Localización de las áreas de interés. Se muestran en gris e indicadas con la punta de

flecha roja las regiones de interés. A) CmPF, B) NAcc C) ABL D) HD CA1. Tomado y modificado de Paxinos y Watson, 1998.

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Figura 8. Análisis de Sholl. Se muestra la diferenciación dendrítica basilar con colores diferentes

de acuerdo a su número de orden, y las intersecciones con los círculos concéntricos de la planilla sobrepuesta. Tomado y modificado de Kolb y cols, 1998.

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8. Resultados.

8.1. Actividad motora en campo cerrado.

Se ha reportado un aumento en la actividad motora en campo cerrado en ratas tratadas con ANF en etapa prenatal (Flores y cols., 2011) y postnatal (Díaz Heijtz y

cols., 2003). En la figura 9 se observa un aumento en los desplazamientos del grupo tratado con ANF de la edad DP 38 en comparación con su control (ANOVA dos vías;post-hoc Bonferroni, P < 0.05), sin observarse cambios significativos en las edades DP 50 y 62. No existen muchos reportes acerca de la actividad motora ante ambiente novedoso en ratas a edades pre-púber y púber, sin embargo Diaz Heijtz y cols. (2003) no reportaron cambios en la activad motora de ratas a edad púber tratadas con ANF (1 mg/kg) comparadas con las que solo fueron administradas con el vehículo.

A c t iv i d a d M o t o r a T o t a l E d a d M o v im ie n to s /1 2 0 m in DP 38 DP 50 DP 62 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 C T L A N F *

Figura 9. Actividad motora en campo cerrado. Se muestra el número total de movimientos

durante 120 minutos de ratas a edad DP 38, 50 y 62, tratadas con ANF comparadas con el grupo control (CTL). Los valores indican la media del total de movimientos durante 120 min ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni, *P < 0.05).

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24

8.2. Corteza media prefrontal capa V.

8.2.1. Densidad de espinas dendríticas.

Se ha reportado un aumento en la densidad de espinas dendríticas de neuronas piramidales de la CmPF V en ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL (Robinson y Kolb, 2004; Morshedi y cols., 2009), pero esto solamente en ratas adultas y con un tratamiento simulando un trastorno de adicción (administración crónica a dosis creciente). En la figura 10 se muestra un incremento en el número de espinas dendríticas en las ratas tratadas con ANF en comparación con el CTL en la edad DP 50 (ANOVA dos vías;post-hoc Bonferroni, P < 0.05). Además hay una disminución de la densidad de espinas dendríticas en la edad DP 50 comparada con la edad DP 38 en el CTL. (ANOVA dos vías;post-hoc Bonferroni,

P < 0.05). En la edad DP 38 y 62 no se encontraron cambios significativos entre el grupo tratado con ANF y el CTL. Díaz Heijtz y cols. (2003) reportaron un aumento en la densidad de espinas dendríticas en neuronas piramidales de la CmPF V en ratas a edad púber después de un tratamiento subcrónico con ANF a edad pre-púber. C m P F V D e n s id a d d e e s p i n a s d e n d r í t i c a s E d a d N ú m e r o d e e s p in a s /1 0m DP 38 DP 50 DP 62 0 2 4 6 8 1 0 C T L A N F * *

Figura 10. Densidad de espinas dendríticas de la CmPF V. Se muestra el número de espinas por

10 µm comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media del valor total del número de espinas por 10 µm ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni, *P < 0.05).

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8.2.2. Longitud dendrítica total.

La LDT de las neuronas piramidales de la CmPF V es capaz de ser afectada por psicotrópicos tales como la ANF (Robinson y Kolb, 2004). En la figura 11 se observa un aumento en las ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL a la edad DP 50 (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni, P < 0.05); en las edades DP 38 y 62 no se encontraron cambios significativos entre los grupos tratados con ANF y el CTL. Díaz Heijtz y cols. (2003) reportaron un aumento en la LDT de neuronas piramidales de la CmPF V en ratas púber después de un tratamiento subcrónico con ANF a edad pre-púber.

C m P F V L o n g it u d d e n d r ít ic a E d a d L o n g it u d (m ) DP 38 DP 50 DP 62 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 C T L A N F *

Figura 11. Longitud dendrítica total de la CmPF V. Se muestra la LDT (µm) de neuronas

piramidales de la CmPF V comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media de la LDT ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni, *P < 0.05).

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8.2.3. DP 38.

8.2.3.1. Arborización.

La figura 12 muestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la CmPF V en la edad DP 38, en donde no se encontraron cambios significativos.

A r b o r iz a c ió n D P 3 8 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m )

Figura 12. Gráfica de arborización dendrítica de la CmPF V a edad DP 38. Los valores indican la

media del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías).

8.2.3.2. Número de orden

La figura 13 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas piramidales de la CmPF V en la edad DP 38, en donde no se encontraron cambios significativos. N ú m e r o d e o r d e n D P 3 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m )

Figura 13. Gráfica de número de orden de la CmPF V a edad DP 38. Los valores indican la media

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8.2.4. DP 50.

8.2.4.1. Arborización.

La figura 14 muestra la arborización dendrítica de neuronas piramidales de la CmPF V en la edad DP 50, en donde se observa un aumento en la arborización dendrítica 12, 13, 16, 17, 18 (ANOVA dos vías, P < 0.05) y 14, 15 (ANOVA dos vías, P < 0.01) en las ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL.

A r b o r iz a c ió n D P 5 0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m ) * * * * ** ** *

Figura 14. Gráfica de arborización dendrítica de la CmPF V a edad DP 50. Los valores indican la

media del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías, **P < 0.01, *P < 0.05).

8.2.4.2. Número de orden.

La figura 15 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas piramidales de la CmPF V en la edad DP 50, encontrándose un aumento en la longitud del 4° y 5° orden dendrítico del grupo tratado con ANF comparado con el CTL (ANOVA dos vías, P < 0.05). N ú m e r o d e o r d e n D P 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m ) * *

Figura 15. Gráfica de número de orden de la CmPF V a edad DP 50. Los valores indican la media

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8.2.5. DP 62.

8.2.5.1. Arborización.

La figura 16 muestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la CmPF V en la edad DP 62, en donde no se encontraron cambios significativos.

A r b o r iz a c ió n D P 6 2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m )

Figura 16. Gráfica de arborización dendrítica de la CmPF V a edad DP 62. Los valores indican la

media del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías).

8.2.3.2. Número de orden.

La figura 17 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas piramidales de la CmPF V en la edad DP 62, en donde no se encontraron cambios significativos. N ú m e r o d e o r d e n D P 6 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m )

Figura 17. Gráfica de número de orden de la CmPF V a edad DP 62. Los valores indican la media

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8.3. Núcleo accumbens.

8.3.1. Densidad de espinas dendríticas.

Se ha reportado un aumento en la densidad de espinas dendríticas de neuronas espinosas medianas del NAcc en ratas adultas tratadas con ANF (3-8 mg/kg) comparadas con el CTL (Robinson y Kolb, 1997; Robinson y Kolb, 1999; Kolb y

cols., 2003; Robinson y Kolb, 2004). En la figura 18 se muestra la densidad de espinas dendríticas de neuronas espinosas medianas del NAcc de ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL a edades DP 38, 50 y 62; sin encontrarse cambios. Esto concuerda con lo reportado por Díaz Heijtz y cols. (2003) en donde no encontraron cambios significativos en ratas púberes tratadas con ANF a edad púber. N A c c D e n s id a d d e e s p in a s d e n d r ít ic a s E d a d N ú m e r o d e e s p in a s /1 0m DP 38 DP 50 DP 62 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 C T L A N F

Figura 18. Densidad de espinas dendríticas del NAcc. Se muestra el número de espinas por 10 µm

de neuronas espinosas medianas del NAcc comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media del valor total del número de espinas por 10 µm ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni).

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8.3.2. Longitud dendrítica total.

Varios trabajos han reportado el aumento en la longitud dendrítica de neuronas espinosas medianas del NAcc en ratas tratadas con ANF (3-8 mg/kg) en edad adulta. En la figura 19 se muestra la LDT de ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL sin observarse cambios significativos; lo cual concuerda con lo reportado por Diaz Heijtz y cols. (2003) que al tratar ratas a edad pre-púber con ANF no encontraron cambios en la longitud dendrítica de las neuronas espinosas medianas del NAcc de las ratas administradas con ANF comparadas con el CTL a edad púber. N A c c L o n g it u d d e n d r ít ic a t o t a l E d a d L o n g it u d (m ) DP 38 DP 50 DP 62 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 C T L A N F

Figura 19. Longitud dendrítica total de la NAcc. Se muestra la LDT (µm) de neuronas espinosas medianas del NAcc comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media de la LDT ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni).

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8.3.3. DP 38.

8.3.3.1. Arborización.

La figura 20 muestra la arborización dendrítica de neuronas espinosas medianas del NAcc en la edad DP 38, en donde se observa un aumento en la arborización dendrítica 4, 6, 7, (*P < 0.05) y 8 (****P < 0.0001) en las ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL. A r b o r iz a c ió n D P 3 8 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m ) * * **** *

Figura 20. Gráfica de arborización dendrítica del NAcc a edad DP 38. Los valores indican la media

del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías, ****P < 0.0001, *P < 0.05).

8.3.3.2. Número de orden.

La figura 21 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas espinosas medianas del NAcc en la edad DP 38, en donde no se encontraron cambios significativos. N ú m e r o d e o r d e n D P 3 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u dm

Figura 21. Gráfica de número de orden de la NAcc a edad DP 38. Los valores indican la media del

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32

8.3.4. DP 50.

8.3.4.1. Arborización.

La figura 22 muestra la arborización dendrítica de neuronas espinosas medianas del NAcc en la edad DP 50, en donde se observa una disminución en la arborización dendrítica 2 (ANOVA dos vías, P < 0.05) en las ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL.

A r b o r iz a c ió n D P 5 0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m ) *

Figura 22. Gráfica de arborización dendrítica del NAcc a edad DP 50. Los valores indican la media

del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías, *P < 0.05).

8.3.4.2. Número de orden.

La figura 23 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas espinosas medianas del NAcc en la edad DP 50, en donde se observa una disminución en la longitud del 2° orden dendrítico de las ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL (ANOVA dos vías, P < 0.05).

N ú m e r o d e o r d e n D P 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m ) *

Figura 23. Gráfica de número de orden de la NAcc a edad DP 50. Los valores indican la media del

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33

8.3.5. DP 62.

8.3.5.1. Arborización.

La figura 24 muestra la arborización dendrítica de neuronas espinosas medianas del NAcc en la edad DP 62, en donde se no observan cambios significativos.

A r b o r iz a c ió n D P 6 2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m )

Figura 24. Gráfica de arborización dendrítica del NAcc a edad DP 62. Los valores indican la media

del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías).

8.3.5.2. Número de orden.

La figura 25 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas espinosas medianas del NAcc en la edad DP 62, en donde no se encontraron cambios significativos. N ú m e r o d e o r d e n D P 6 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m )

Figura 25. Gráfica de número de orden de la NAcc a edad DP 62. Los valores indican la media del

(41)

34

8.4. Amígdala basolateral.

8.4.1. Densidad de espinas dendríticas.

Se ha reportado un incremento en la cantidad de sinapsis excitatorias en la ABL en ratas a edad púber que recibieron un tratamiento de sensibilización con ANF (8 mg/kg por tres días; y 2 mg/kg dos días) comparadas con las que solo fueron administradas con el vehículo (Rademacher y cols., 2010). En la figura 26 se muestra la densidad de espinas dendríticas de neuronas piramidales de la ABL en donde no se encontraron cambios entre las ratas púber tratadas con ANF comparadas con el CTL; en las demás edades no se observan cambios significativos. Interesantemente se puede observar una disminución de la densidad de espinas dendríticas en la edad DP 62 comparada con la DP 38 en las ratas tratadas con ANF.

E d a d N ú m e r o d e e s p in a s /1 0m DP 38 DP 50 DP 62 0 2 4 6 8 1 0 1 2 C T L A N F * A B L D e n s id a d d e e s p in a s d e n d r ític a s

Figura 26. Densidad de espinas dendríticas de la ABL. Se muestra número de espinas por 10 µm

comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media del valor total del número de espinas por 10 µm ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni, *P < 0.05).

(42)

35

8.4.2 Longitud dendrítica total.

No existen reportes acerca del efecto de la ANF sobre la morfología neuronal de la ABL. En la figura 27 se observa la LDT de la ABL a edades DP 38, 50 y 62 sin cambios significativos entre los grupos tratados con ANF comparados con los CTL. A B L lo n g i t u d d e n d r ít ic a E d a d L o n g it u d (m ) DP 38 DP 50 DP 62 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 C T L A N F

Figura 27. Longitud dendrítica total de la ABL. Se muestra la LDT (µm) de neuronas piramidales de

la ABL comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media de la LDT ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni).

(43)

36

8.4.3. DP 38.

8.4.3.1. Arborización.

La figura 28 muestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la ABL en la edad DP 38, en donde no se encontraron cambios significativos.

A r b o r iz a c ió n D P 3 8 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m )

Figura 28. Gráfica de arborización dendrítica de la ABL a edad DP 38. Los valores indican la media del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías).

8.3.3.2. Número de orden

La figura 29 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas piramidales de la ABL en la edad DP 38, en donde no se encontraron cambios significativos.

N ú m e r o d e o r d e n D P 3 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m )

Figura 29. Gráfica de número de orden de la ABL a edad DP 38. Los valores indican la media del

(44)

37

8.4.4. DP 50.

8.4.4.1. Arborización.

La figura 30 muestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la ABL en la edad DP 50, en donde no se encontraron cambios significativos.

A r b o r iz a c ió n D P 5 0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 C T L A N F D is ta n c ia a l s o m a L o n g it u d (m )

Figura 30. Gráfica de arborización dendrítica de la ABL a edad DP 50. Los valores indican la media del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías).

8.4.4.2. Número de orden

La figura 31 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas piramidales de la ABL en la edad DP 50, en donde se observa una disminución en la longitud del 4° orden dendrítico de las ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL (ANOVA dos vías, **P < 0.01).

N ú m e r o d e o r d e n D P 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m ) **

Figura 31. Gráfica de número de orden de la ABL a edad DP 50. Los valores indican la media del

(45)

38

8.4.5. DP 62.

8.4.5.1. Arborización.

La figura 32 muestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la ABL en la edad DP 62, en donde no se encontraron cambios significativos.

A r b o r iz a c ió n D P 6 2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 C T L A N F D is t a n c ia a l s o m a L o n g it u d (m )

Figura 32. Gráfica de arborización dendrítica de la ABL a edad DP 62. Los valores indican la media del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías).

8.4.5.2. Número de orden.

La figura 33 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas piramidales de la ABL en la edad DP 50, en donde no se encontraron cambios significativos.

A r b o r iz a c io n D P 6 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m )

Figura 33. Gráfica de número de orden de la ABL a edad DP 62. Los valores indican la media del

(46)

39

8.5. Hipocampo dorsal región CA1. 8.5.1. Densidad de espinas dendríticas.

Se ha reportado un aumento en la densidad de espinas dendríticas en el HD CA1 en ratas tratadas con ANF (3 mg/kg) posterior a una administración crónica (Robinson y Kolb, 2004). En la figura 34 se muestra la densidad de espinas dendríticas de neuronas piramidales del HD CA1 a edades DP 38, 50 y 62 sin observarse cambios entre los grupos tratados con ANF comparados con los CTL.

H D C A 1 D e n s i d a d d e e s p in a s d e n d r í t ic a s E d a d N ú m e r o d e e s p in a s /1 0m DP 38 DP 50 DP 62 0 2 4 6 8 1 0 1 2 C T L A N F

Figura 34. Densidad de espinas dendríticas de la HD CA1. Se muestra número de espinas por 10

µm comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media del valor total del número de espinas por 10 µm ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni).

(47)

40

8.5.2 Longitud dendrítica total.

Se ha reportado un aumento en la LDT en neuronas piramidales del HD CA1 posterior a un tratamiento crónico con ANF (3-8 mg/kg) (Robinson y Kolb, 2004). En la figura 35 se muestra la LDT de ratas tratadas con ANF comparadas con los CTL a edades DP 38, 50 y 62 en donde no se encontraron cambios.

H D C A 1 L o n g it u d d e n d r ít ic a t o t a l E d a d L o n g it u d (m ) DP 38 DP 50 DP 62 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 C T L A N F

Figura 35. Longitud dendrítica total de la HD CA1. Se muestra la LDT (µm) de neuronas

piramidales de la HD CA1 comparando el grupo tratado con ANF y el CTL a edades DP 38, 50 y 62. Los valores indican la media de la LDT ±EEM (ANOVA dos vías; post-hoc Bonferroni).

(48)

41

8.5.3. DP 38.

8.5.3.1. Arborización.

La figura 36 muestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la HD CA1 en la edad DP 38, en donde no se encontraron cambios significativos.

A r b o r iz a c ió n D P 3 8 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 C T L A N F N ú m e r o d e o r d e n L o n g it u d (m )

Figura 36. Gráfica de arborización dendrítica de la HD CA1 a edad DP 38. Los valores indican la

media del promedio de la longitud (µm) ±EEM (ANOVA dos vías).

8.5.3.2. Número de orden.

La figura 37 muestra la longitud del orden dendrítico de las neuronas piramidales del HD CA 1 en la edad DP 38, en donde se observan cambios significativos en la longitud del 4° orden dendrítico en las ratas tratadas con ANF comparadas con el CTL (ANOVA dos vías, *P < 0.05).

N ú m e r o d e o r d e n D P 3 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 C T L A N F E d a d L o n g it u d (m ) *

Figura 37. Gráfica de número de orden de la HD CA1 a edad DP 38. Los valores indican la media

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