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INGENIERÍA METABÓLICA DE ESCHERICHIA COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE GLICEROL
MARIA DEL PILAR BASTO ALUJA ROSSMARY JAY-PANG MONCADA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA D.C
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INGENIERÍA METABÓLICA DE ESCHERICHIA COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE GLICEROL
MARIA DEL PILAR BASTO ALUJA ROSSMARY JAY-PANG MONCADA
Para optar por el titulo de Ingeniera Química
ASESOR
ANDRES GONZÁLEZ BARRIOS Ph. D Ingeniero Químico
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA D.C
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AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a nuestras familias que nos apoyaron a lo largo de la carrera. Agradecemos a las personas cuyo aporte incalculable nos permitió llegar a la culminación de este proyecto. A nuestro asesor Andrés González por su apoyo, dedicación y paciencia. Y por contribuir en nuestro desarrollo profesional. También a Sonia Rojas, Luz Dary Rugeles y Oscar Fonseca por su apoyo y colaboración en la parte experimental.
4 TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN... 8 2. OBJETIVOS ... 10 2.1 OBJETIVO GENERAL ... 10 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 10 3. MARCO TEÓRICO ... 11 3.1 BIOCOMBUSTIBLES ... 11
3.1.1 Categorías de los Biocombustibles ... 11
3.1.2 Impacto de los Biocombustibles (10) ... 12
3.1.3 Retos Actuales para los Biocombustibles ... 13
3.1.4 Biodiesel ... 13
3.2 SOBREOFERTA DE GLICEROL ... 14
3.3 PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES A PARTIR DE MICROORGANISMOS ... 14
3.3.1 Producción de etanol a partir de microorganismos ... 15
3.3.2 Estrategias de transformación de glicerol ... 16
3.3.3 Metabolismo del Glicerol ... 16
3.3.4 Bioconversión del glicerol a etanol ... 17
4. MATERIALES Y MÉTODOS ... 20
4.1 SELECCIÓN DE GENES ... 20
4.2 CULTIVO DE LAS CEPAS MODIFICADAS ... 21
4.3 PROPAGACIÓN Y FERMENTACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS ... 22
4.3.1 Propagación del microorganismo ... 22
4.3.2 Fermentaciones ... 23
4.4 SEGUIMIENTO DEL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS... 24
4.5 CUANTIFICACIÓN DEL ETANOL PRODUCIDO ... 25
4.6 DETERMINACIÓN DEL CONSUMO DEL INDUCTOR ... 27
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS ... 28
5.1 SELECCIÓN DE GENES ... 28
5.2 CURVAS DE CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS ... 30
5.2.1 Curvas de crecimiento de E.coli W3110/pCA24N lpd+ ... 30
5.2.2 Curvas de crecimiento de E. coli W3110/pCA24N gapA+ ... 31
5.2.3 Curvas de crecimiento de E. coli W3110 ... 31
5.3 CUANTIFICACIÓN DEL ETANOL PRODUCIDO ... 33
5.3.1 Calibración del NIRS ... 33
5.3.2 Ecuaciones de calibración ... 35
5.3.3 Toma de lectura a las muestras desconocidas ... 36
5.3.4 Comparación de los resultados con el modelo in silico ... 39
6. CONCLUSIONES ... 41
7. RECOMENDACIONES ... 42
BIBLIOGRAFIA ... 43
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Reacción de transesterificación de un triglicérido con etanol para producir biodiesel……….13 Figura 2. Modelo de la fermentación de glicerol dependiente de la formación de 1,3-propanediol……….17 Figura 3. Rutas fermentativas principales en la fermentación anaeróbica de
glicerol en E. coli………..19
Figura 4. Crecimiento celular de la cepa E. coli W3110/pCA24N lpd+ para tres concentraciones de glicerol 10, 15, 20 (g/L)………30 Figura 5. Crecimiento celular de la cepa E. coli W3110/pCA24N gapA+ para tres concentraciones de glicerol 10, 15, 20 (g/L)………31 Figura 6. Crecimiento celular de la cepa E. coli W3110 para tres concentraciones de glicerol 10, 15, 20 (g/L)………32 Figura 7. Velocidad de crecimiento para las cepas E.coli W3110/pCA24NgapA+, E.coli W3110/pCA24N lpd+, E.coli W3110……….33 Figura 8. Espectros de las soluciones de etanol utilizadas en la calibración del equipo de espectroscopia de infrarrojo cercano……….34 Figura 9. Grafico típico de resultados de una regresión lineal para la calibración del espectofotómetro de infrarrojo cercano……….35 Figura 10. Relación entre la concentración de etanol medido y calculada para las ecuaciones de calibración descritas en la Tabla 7………...36 Figura 11. Producción de etanol para las cepas E.coli W3110, E.coli W3110/pCA24N lpd+, E.coli W3110/pCA24N gapA+………..37 Figura 12. Comparación de resultados con otros trabajos de producción de etanol a partir de glicerol en E.coli………39 Figura 13. Comparación de los resultados experimentales vs resultados del modelo in silico para la cepa E.coli W3110/pCA24N lpd+……….40 Figura 14. Comparación de los resultados experimentales vs resultados del modelo in silico para la cepa E.coli W3110/pCA24N lpd+……….40
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INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición del medio LIU sólido……….22 Tabla 2. Composición del medio LIU modificado………23 Tabla 3. Diluciones de etanol en balones aforados de 10 mL a partir de una mezcla concentrada de 10 g/L para la calibración del NIR………...27 Tabla 4. Lista de genes principales involucrados en la degradación de glicerol a etanol………..28 Tabla 5. Resultados del análisis del metabolismo de E.coli utilizando la herramienta “ChangeRxnBounds” de Cobratoolbox®………29 Tabla 6. Velocidad de crecimiento de cada cepa a diferentes concentraciones de glicerol………..32 Tabla 7. Ecuaciones de calibración del NIR………35 Tabla 8. Resumen de resultados de producción de etanol a partir de microorganismos………..38
7 RESUMEN
Dada la abundancia en la oferta de glicerol causada por su generación como subproducto en las plantas de biodiesel, es preciso encontrar medios para aprovechar esta coyuntura y transformar el glicerol en productos de alto valor agregado, contribuyendo a la sostenibilidad de las plantas de producción de biodiesel. En este trabajo se utilizaron herramientas de Ingeniería Metabólica para sobre expresar los genes gapA –responsable de la transformación de D-gliceraldehído-3-fosfato a 1,3-difosfatoglicerato- y lpd –parte del complejo de enzimas responsables de la transformación de piruvato a acetil-CoA- y se estudió el efecto de dicho proceso en la producción de etanol, a partir de glicerol. Se encontró que a tres niveles de glicerol (10, 15 y 20 g/L) las dos cepas modificadas aumentaron la producción de etanol, siendo más significativo este aumento a 20 g/L, donde la cepa que sobre expresa el gen gapA aumentó 14 veces la producción de etanol, mientras que la que sobre expresa el gen lpd lo hizo 12 veces. El crecimiento de los microorganismos tuvo un comportamiento satisfactorio, lo cual indica que su metabolismo no tuvo efectos negativos aparentes debidos a la carga metabólica.
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1. INTRODUCCIÓN
Debido al interés por la producción de fuentes de energía alternativas a los combustibles fósiles, se ha presentado un auge alrededor de la creación e instalación de industrias encaminadas hacia tal fin. Esto conlleva inevitablemente a la producción de desechos. Pese a esto se debe buscar una solución para darles valor agregado a estos y eliminar el impacto negativo que puedan generar al no ser utilizados apropiadamente. En el caso del biodiesel, se genera 1 mol de glicerol por cada mol de biodiesel producido, esto significa que por cada 100 lb de biodiesel, se producen 10 lbs de glicerol (1). Para el año 2008, la capacidad instalada de producción en Colombia para producir biodiesel era de 721000 toneladas/año (2) .Esto significa que en la actualidad hay una oferta de glicerol de 72100 toneladas/año, provenientes de las industrias de biodiesel y que es considerado un desecho industrial debido a la falta de desarrollo de esta industria. Por esta razón es necesario encontrar alternativas viables para la transformación de este recurso en un producto con un alto valor agregado. Por medio de este proyecto se pretende explotar esta situación y utilizar las herramientas de la Ingeniería Metabólica para producir etanol a partir de glicerol, sobre-expresando dos genes involucrados en la ruta metabólica de degradación de glicerol, con el fin de aumentar el flux de etanol. De esta manera, se están buscando alternativas de utilización del glicerol para producir un compuesto considerado de alto valor agregado por sus propiedades como combustible y en auge comercial debido a su potencial como sustituto de la gasolina para automóviles. La selección de los genes se realizó con el estudio del modelo in silico de E. coli con la herramienta CobraToolbox®, desarrollada en MatLab, como primera aproximación al problema real y que sirvió como base importante para la parte experimental. Se estudió el efecto de la concentración de glicerol en la producción de etanol, utilizando tres concentraciones diferentes: 10, 15 y 20 g/L.
La utilización de microorganismos para la producción de bienes en general, y de combustibles en particular, ha sido aplicada ampliamente en investigación, y de manera reducida en la industria. Para la producción de etanol, se han hecho numerosos estudios durante las dos últimas décadas, de los cuales han surgido como limitaciones principales el bajo rendimiento a etanol, la producción de subproductos y la incapacidad de fermentar sustratos diferentes a la glucosa. Los mejores resultados han surgido con la ingeniería de bacterias como Escherichia coli (E. coli), Klebsiella oxytoca y Zymomonas mobilis, con los cuales, se ha logrado una producción máxima de etanol de 0,92 (g L-1 h-1), 0,96 (gL-1h-1) y 0,61(gL-1h-1), respectivamente, y con la utilización de xilosa y mezclas de azúcares como fuentes de carbono (3). En cuanto a la utilización
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de fuentes económicas de sustrato, como residuos lignocelulósicos o industriales, también se han logrado avances en la producción de etanol, mediante el estudio de las condiciones experimentales y pretratamientos, como lo hace Krishna, quien estudió la capacidad de Saccharomyces cerevisiae para producir etanol a partir de la celulosa proveniente de las hojas de A. leptopus, una enredadera no utilizada con fines productivos, obteniendo la síntesis de 3,02% (w/v) de etanol (4). Por medio de la ingeniería metabólica de bacterias como E. coli se ha logrado un aumento significativo en la producción de etanol, logrando la generación de concentraciones finales de etanol de 2.05 g/L en la cepa E. coli B SZ420 (5).
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
Evaluar la producción de etanol a partir de glicerol por la sobreexpresión de dos genes a diferentes concentraciones de glicerol.
2.2 Objetivos Específicos
Determinar los genes que se sobreexpresen en Escherichia coli para la producción de etanol.
Cuantificar la producción de biomasa para evaluar el crecimiento de Escherichia coli mediante la determinación de la densidad óptica en el tiempo.
Cuantificar la producción de etanol usando espectroscopía de infrarrojo cercano.
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3. MARCO TEÓRICO
3.1 Biocombustibles
El término biocombustible se refiere a los combustibles líquidos, sólidos o gaseosos producidos predominantemente de biomasa (6). Su estudio y producción abarca razones de tipo económico, social, ambiental y de seguridad energética. Las reservas conocidas de petróleo, reportadas por Oil & Gas Journal (7) para enero de 2008 son estimadas en 1332 billones de barriles, de lo cual el 56% está localizado en el Medio Oriente. El agotamiento de este recurso no renovable y el incremento de su costo son temas de preocupación mundial y la búsqueda de fuentes alternativas de energía es primordial. La emisión de gases de efecto invernadero asociado a la combustión de derivados del petróleo es otra razón para la disminución de su uso.
El déficit en la disponibilidad de energía puede ser eventualmente superado con desarrollos en fusión nuclear, celdas de combustible, tecnología solar, entre otros, pero la sustitución de gasolina y diesel en los motores de combustión interna de los vehículos actuales tiene como vía directa la mezcla o reemplazo total con biocombustibles (8).
Para ser una alternativa viable, un biocombustible debe proveer una ganancia neta de energía, tener beneficios ambientales, ser económicamente competitivo y ser producible en largas cantidades sin reducir la disponibilidad de alimento (9). En la actualidad la producción de biocombustibles como sustitutos totales de los combustibles tradicionales no se considera viable dado que la cosecha de biomasa aún es sostenida con subsidios y exenciones que han permitido su surgimiento. El tema de la seguridad alimenticia aún continúa en debate y es necesario evaluar la capacidad de producción de biocombustibles sin poner en riesgo este factor.
3.1.1 Categorías de los Biocombustibles
La materia prima para la producción de biocombustibles es la biomasa, que puede ser con ningún tratamiento o desechos. Los biocombustibles pueden ser clasificados como sólidos líquidos o gaseosos (10).
Biocombustibles Sólidos: Son los más comunes y antiguos utilizados en la historia humana. Comprende los residuos de industrias del plástico y del papel, briquetas producidas de biomasa sin tratamiento previo por procesos termo-mecánicos, pellets producidos compactando biomasa finamente picada (residuos forestales y de la agricultura), madera y residuos industriales. El valor energético de estas fuentes oscila entre 9200-20000 KJ/Kg.
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Biocombustibles Gaseosos: Son los menos usados. Son producidos a través del proceso de gasificación de biomasa, entendido como su degradación térmica (pirolisis) o microbiana (digestión). El producto de la gasificación es una mezcla que contiene metano (CH4), hidrógeno (H2), monóxido de carbono (CO) y dióxido de carbono (CO2). Su composición depende del tipo de biomasa y la tecnología usada. Como materia prima para la gasificación se utiliza madera, residuos de agricultura, deshechos y estiércol. Se utiliza como combustible industrial, y como materia prima para la producción de amoniaco y en la industria química. El valor energético del biogás varía entre 10000-20000 KJ/Kg.
Biocombustibles Líquidos: Constituidos principalmente por biodiesel y bioetanol. El biodiesel es definido como ésteres monoalquílicos de largas cadenas de ácidos grasos derivados de fuentes renovables, como aceites vegetales, grasas animales, entre otros, que reaccionan con un alcohol como metanol. La reacción requiere un catalizador, usualmente una base fuerte. Puede ser usado en motores de ignición por compresión en máquinas actuales o con modificaciones, mezclado con diesel o como combustible total. Su valor energético está entre 40500-37300 KJ/Kg. El bioetanol es producido por la destilación de un líquido proveniente de la fermentación de biomasa con contenido de azúcares (caña de azúcar, remolacha, sorgo, melaza, maíz) o lignocelulosa (tallos de plantas, raíces y hojas). Su valor energético y pureza depende de la materia prima.
3.1.2 Impacto de los Biocombustibles (10)
La disminución de emisiones de CO2 y otros gases es el impacto positivo más citado por los investigadores. Esto se debe a que los organismos constituyentes de la biomasa masa absorben durante su vida cantidades de CO2 iguales a las que son emitidas cuando la biomasa es quemada. Esto presume que la biomasa es 100% renovada. En algunos casos, los biocombustibles pueden contribuir positivamente al desarrollo regional y la sostenibilidad de las regiones. Por otro lado, el problema más serio derivado de la producción de biocombustibles es el aumento de los precios de los alimentos, dado por la disminución del cultivo de alimentos que se da al reemplazar el uso de tierras cultivables destinadas a la agricultura de alimentos por biomasa. Esto también está influenciado por el subsidio para biocombustibles que causa una migración de los cultivadores hacia cultivos de biomasa. El estudio del verdadero impacto ambiental de los biocombustibles muestra en algunos casos que éstos pueden llegar a contribuir al aumento de las emisiones de gases de efecto invernadero incluso más que los combustibles fósiles. El uso de organismos genéticamente modificados puede resultar en la extensión de estos organismos en hábitats naturales.
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3.1.3 Retos Actuales para los Biocombustibles
Dado el incremento en la demanda de biocombustibles, es necesario investigar nuevas y más eficientes alternativas para su producción. Por ejemplo, la producción de biocombustibles de fuentes no alimenticias como la conversión de lignocelulosa a etanol y el uso de algas oleo-acumuladoras en la producción de biodiesel están siendo investigados. Aún así, la viabilidad económica en la producción de biocombustibles aún está en juego. La implementación de biorefinerías se ha propuesto como una alternativa para incrementar la viabilidad económica de la industria de los biocombustibles. Un modelo económico de éstas consiste en la transformación de deshechos y subproductos generados. Las corrientes ricas en glicerol tienen el potencial de ser usadas en este contexto. La transformación del glicerol en productos de valor agregado es un camino para incrementar la viabilidad económica de la industria de los biocombustibles.
3.1.4 Biodiesel
Biodiesel y Etanol son los combustibles líquidos para transporte que pueden reemplazar la gasolina y el diesel (6). En la actualidad el biodiesel se produce principalmente de soya, colza (rapeseed) y aceite de palma. Su valor energético es alto, variando entre 39-41MJ/Kg. Los metil-ésteres de biodiesel mejoran las propiedades de lubricación del diesel. La producción de biodiesel incluye la etapa de transesterificación seguida por etapas de separación y evaporación (10). La reacción básica de producción de biodiesel es:
Figura 1 Reacción de Transesterificación de un triglicérido con etanol para producir biodiesel (11).
Actualmente la Unión Europea es el principal productor de biodiesel, con el 82% del biodiesel producido en el mundo en 2003. La producción estimada en 2005 fue de 3,2 millones de toneladas y la capacidad de producción en 2006 fue estimada en 6069 millones de toneladas. En 2005, Estados Unidos era el segundo productor mundial con 250000 toneladas (11).
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Por cada 100lbs de biodiesel producido por la transesterificación de aceites vegetales o grasas animales, se generan 10lbs de glicerol (1). Para el año 2008, la capacidad instalada de producción en Colombia para producir biodiesel era de 721000 toneladas/año (2). Esto significa que en la actualidad hay una oferta de glicerol de 72100 toneladas/año provenientes de la industria del biodiesel y que es considerado desecho industrial debido a la falta de desarrollo de esta industria.
3.2 Sobreoferta de Glicerol
El Glicerol (1, 2, 3-propanetriol) es el principal subproducto que se obtiene durante la transesterificación de aceites vegetales o grasas animales. El superávit en su producción dado el incremento en la producción de biodiesel ha resultado en una disminución dramática de su precio, que ha pasado de $1,1/lb a 25¢/lb (12), constituyéndolo como una corriente de desecho, con un costo de disposición final asociado a esta categorización. El desarrollo de procesos para convertir el glicerol en productos de alto valor agregado es entonces una necesidad urgente y una oportunidad para el desarrollo de biorefinerías que aumenten la viabilidad económica de esta industria (13).
El glicerol es abundante en la naturaleza, dado que es un componente estructural de muchos lípidos. También es uno de los principales solutos compatibles, siendo ampliamente producido en respuesta a la disminución de la actividad extracelular del agua durante la osmo-regulación en levaduras (14). Por su repetida ocurrencia en la naturaleza, varios organismos tienen la capacidad de transformar naturalmente el glicerol como fuente de carbono y energía (11).
El glicerol es materia prima en múltiples industrias, tales como cosméticos, pintura, automotriz, alimentos, tabaco, farmacéutica, pulpa y papel, cuero y textil. También se utiliza para la producción de varios químicos (14). Se están evaluando nuevas aplicaciones, en las industrias del poliglicerol y el poliuretano, el campo de los estabilizadores de madera y la producción de pequeñas moléculas. El glicerol se considera actualmente como materia prima de nuevas industrias de fermentación.
3.3 Producción de biocombustibles a partir de microorganismos
Los biocombustibles son producto de la refinación de diversos tipos de materias primas entre las que se encuentra aceites vegetales, grasas animales, azucares, almidones, maíz y materiales de lignocelulosas entre otros. Las tecnologías utilizadas para darles valor agregado a este tipo de materias
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primas es muy amplia y sus principales productos son bio-etanol, biodiesel e hidrogeno (15).
Las rutas metabólicas que permiten la síntesis de la biomasa en biocombustibles se dividen en dos, las rutas de alimentación las cuales toman las fuentes de carbono y las convierten en productos intermediarios, y las rutas de los productos que convierten los intermediarios en los productos deseados, que en este caso son los biocombustibles, se debe lograr que estas rutas sean lo más eficientes, teniendo la menor cantidad de sub-productos (16). Entre los proceso de producción con mayor desarrollo se encuentra actualmente la producción de etanol que predomina el mercado, su materia prima son los derivados de la sacarosa y los derivados del maíz, el microorganismo utilizado en este proceso es Saccharomyces cerevisiae, y la producción se puede realizar en sistemas continuos o por lotes, cuyos tiempos de fermentación son de 6 a 10 h, obteniendo la producción 57 billones de litros por año (16).
El biodiesel es otro biocombustible que se puede obtener a partir de microalgas, bacilos y hongos. Entre las microalgas productoras de biodiesel se encuentran Botryococcus braunii, Chlorella sp, Nitzschia sp, entre otras, el proceso consiste en cultivar las algas en fotobioreactores, después se extraen ácidos grasos y por medio de un proceso de transesterificación se obtiene biodiesel (17).
3.3.1 Producción de etanol a partir de microorganismos
Para realizar la síntesis de etanol por vía microbiana convencionalmente se utilizan levaduras, sin embargo se puede llevar a cabo su producción a partir de bacterias. Las materias primas para la producción de etanol a partir de microorganismos son diversas, entre ellas se encuentra el maíz y los residuos celulósicos.
La carencia de microorganismos industriales que sean capaces de convertir la biomasa en etanol ha sido un motivo para impulsar el desarrollo de la investigación en este campo en las dos últimas décadas, ya que se ha encontrado que la biomasa lignocelulósica contiene los carbohidratos complejos que hacen necesario utilizar los microorganismos capaces de fermentar los azúcares no fermentables por medio de las levaduras. El más significativo de estos es xilosa, para el cual se ha tenido gran éxito su conversión a etanol utilizando bacterias gram-negativas entre las que se encuentran: Escherichia coli, Klebsiella oxytoca y Zymonas mobilis. Las bacterias como E. coli y K. oxytoca pueden naturalmente usar una amplia gama de azúcares como fuente de carbono, y por medio de la ingeniería metabólica se han usado la selección de genes para la obtención de etanol
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como producto del metabolismo de estas bacterias. Z. mobilis tiene una alta productividad de etanol, pero solo tiene la capacidad de fermentar glucosa y fructosa (18).
Otro microorganismo productor de etanol que se ha utilizado para tal fin a nivel investigativo e industrial es Saccharomyces cerevisiae, utilizado en fermentaciones por lotes para convertir azúcares en etanol, que es utilizado para la producción de bebidas alcohólica y combustibles (19)
3.3.2 Estrategias de transformación de glicerol
Se han propuesto aproximaciones químicas y biológicas para la transformación de glicerol en productos de mayor valor agregado. La catálisis química presenta desventajas como la baja selectividad en los productos, uso de altas presiones y/o temperaturas, problemas con materia prima con altos niveles de contaminación, entre otros. La conversión biológica del glicerol ha podido superar estas desventajas, con la capacidad de sintetizar una gran variedad de productos con distintas funcionalidades (13). Además, el alto grado de reducción de los átomos de carbono presentes en el glicerol, le da a éste una ventaja adicional sobre azúcares como glucosa y xilosa en la fermentación microbiana, produciendo rendimientos mayores (13). La fermentación anaeróbica es preferida ante la fermentación aeróbica por la baja inversión de capital requerida y costos operacionales bajos.
3.3.3 Metabolismo del Glicerol
Microorganismos como Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes y Lactobacillus reuteri han sido identificados por su capacidad de crecer anaeróbicamente en glicerol, utilizándolo como fuente de carbono y energía ( (11) y todos los citados en él).
En Klebsiella, Citrobacter, Clostridium y Enterobacter el glicerol es metabolizado por reducción y por oxidación. En el camino oxidativo, la enzima glicerol dehidrogenasa (NAD+ dependiente) cataliza la conversión de glicerol a dihidroxiacetona y la enzima glicolítica dihidroxiacetona kinasa fosforila este producto, que es entonces destinado a la glicólisis. El camino reductivo es catalizado por la coenzima glicerol dehidratasa (B12-dependiente) y las diol dehidratasas relacionadas, convirtiendo el glicerol en 3-hidroxipropionaldehído, y por medio de la enzima 1,3 propanediol dehidrogenasa (dependiente de NADH+H+) se reduce el 3-hidroxipropionaldehído a 1,3-propanediol (1,3-PDO) y NAD+ regenerado. El producto 1,3-PDO no puede ser obtenido por ninguna
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otra conversión anaeróbica, dada su especificidad por la fermentación del glicerol ( (11) y todos los citados en él).
Figura 2 Modelo de la fermentación del glicerol dependiente de la formación de 1,3-propanediol. (11).
La optimización de la conversión a 1,3-propanediol ha sido el foco de investigación principal en la mayoría de trabajos de este tipo (13). Se ha estudiado el mejoramiento de cepas por inactivación del gen de la aldehído-dehidrogenasa y la sobreexpresión de genes del dha regulon, que codifican las enzimas de la ruta a 1,3-PDO. También se ha estudiado la microencapsulación de las cepas de producción, la electrodiálisis del sustrato crudo, aditiva al medio, inhibidoras de crecimiento y manipulación de parámetros de cultivo. También se ha explorado la utilización de organismos que no metabolizan naturalmente el glicerol, importando rutas de organismos que fermentan naturalmente el glicerol, resultando en una síntesis eficiente de 1,2-PDO ( (13) y todos los citados en él).
3.3.4 Bioconversión del glicerol a etanol
Son pocos los estudios que se han realizado para la conversión de glicerol a etanol. Nakas reporta la realización de un estudio para la obtención de solventes a partir de algas, y describe una bacteria tentativamente clasificada como un miembro del género Bacillus que produce etanol (concentración final de 7.0-9.6g/L) de una mezcla de algas enriquecida con glicerol (20). Por otra parte, se identificó una cepa (DR3) de Klebsiella planticola presente en el estómago del venado rojo con la capacidad para producir formato y etanol a
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niveles equimolares de 32 mmol/L y 30 mmol/L, respectivamente (21). No se encontró la ruta metabólica de este proceso. Ito reporta la evaluación de la producción de H2 y etanol a partir de los deshechos de glicerol de la producción de biodiesel por medio de Enterobacter aerogenes HU-101. Con la dilución de las corrientes de deshechos y la adición de extracto de levadura y triptona al medio se acelera la producción de H2 y etanol, y la presencia de sales en los deshechos disminuye la producción de éstos, pues en glicerol puro la producción es mayor, de 80 mmol/L/h de y 0,8 mol/mol de glicerol de H2 y etanol respectivamente (22).
Dharmadi et al (2006) reportan que el microorganismo E. coli fermenta glicerol dependiendo del pH, siendo el proceso ligado a la disponibilidad de CO2, que es producido bajo condiciones ácidas por la oxidación del formato por la enzima formato hidrogeno liasa. El glicerol (10 g/L) fue consumido casi completamente obteniendo como productos etanol (86%) y ácido succínico (7%). (Citado por (11)).
El trabajo realizado por Yazdani y Gonzalez muestra el metabolismo fermentativo de glicerol en E. coli para la producción de etanol y co-productos. Se reportan rendimientos y productividades superiores a las reportadas para la conversión de glicerol a etanol y H2 o etanol y formato por otros organismos pero equivalentes a las alcanzadas en la producción de etanol a partir de azúcares usando E. coli. Se presentan las rutas y mecanismos responsables del proceso metabólico, en el que se obtiene etanol, succinato, acetato y formato como los productos principales, como se muestra en la Figura 3 (1).
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Figura 3 Rutas fermentativas principales en la fermentación anaeróbica de glicerol en E. coli. Las modificaciones genéticas propuestas por Yazdani & Gonzalez (2008) son ilustradas por las líneas punteadas o doble barra. (1)
En este trabajo se crearon dos cepas para la co-producción de etanol-H2 (SY03) y etanol-formato (SY04). Se inhibió la expresión de los genes que expresan las enzimas fumarato reductasa (ΔfrdA) y fosfato acetiltransferasa (Δpta) y se sobreexpresó la glicerol dehidrogenasa (gldA) y la dihidroxiacetona kinasa (dhaKLM).
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Selección de genes
Para escoger los genes que se utilizaron en el procedimiento in vivo, se utilizó un modelo in silico para predecir el comportamiento celular de Escherichia coli. Esto se realizó por medio de un paquete de herramientas de CobraToolbox® del software MatLab (23). Con esta herramienta se carga un modelo a escala del microorganismo, que contiene las reacciones bioquímicas involucradas en el metabolismo, y permiten establecer cómo se comporta el mismo. Es así como esta herramienta permite la predicción del comportamiento óptimo en estado estacionario y dinámico del crecimiento, permite eliminar genes y realizar análisis de robustez, entre otras funciones (23).
Para determinar de manera sistemática los genes representativos del proceso de interés, se realizó un estudio de la ruta metabólica de degradación del glicerol por vía fermentativa, disponible en la página www.ecocyc.org, donde se encuentra una base de datos completa con el genoma y las rutas metabólicas de la bacteria. Se parte de la búsqueda de las reacciones involucradas. La descripción de las reacciones incluye los genes que regulan a las enzimas catalizadoras, su localización en el genoma y sus productos. De esta manera se preseleccionan los genes que se consideran de mayor importancia en la producción de etanol a partir de glicerol.
Se procede a sobreexpresar los genes por medio de las funciones del software anteriormente mencionado. Primero se identifica la reacción controlada por el gen, luego con la función “ChangeRxnBounds” se aumentan los límites de la reacción. Estos límites se aumentaron un 50% sobre el valor original, lo cual representa biológicamente aumentar la más alta velocidad de reacción posible (23). Posteriormente se optimiza el modelo para verificar los resultados del cambio, y evaluar si hubo un cambio favorable en el flux de salida de etanol.
El modelo se optimiza por medio de un Análisis de Balance de Flux (FBA, por sus siglas en inglés). Con este método se simula el crecimiento de la célula dándole los nutrientes necesarios y la composición de biomasa definiendo esta última como la función objetivo, representando el máximo crecimiento posible de la célula. FBA se basa en una optimización lineal la cual representa la formación típica de la biomasa. Después de llevar a cabo este procedimiento se verifican los resultados de formación de etanol. Este procedimiento se llevó a cabo para varias reacciones.
El Análisis de Balance de Flux se basa en un modelo de un microorganismo representado por las reacciones de su metabolismo. A partir de esta red de reacciones metabólicas se construye una matriz estequiométrica en la cual las
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filas representan los metabolitos y las columnas es el numero de reacciones, también se encuentra el vector de flux metabólicos y se pretende solucionar esta matriz, este sistema se representa por medio de un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias tal como se muestra en la Ecuación 1
Donde S es la matriz estequiometria y es el vector de velocidades de reacción, para llevar a cabo la solución del sistema se tiene un espacio infinito de soluciones, el cual consideramos en estado estacionario, y además se aplican las restricciones del modelo la cual es:
Esto permite formularlo como un problema de optimización donde se desea maximizar el crecimiento de la biomasa. Cuando se soluciona este problema es posible determinar las velocidades de reacción, sabiendo como aumentar un flux de interés. En nuestro case se desea aumentar el flux de etanol que excreta el microorganismo (23).
Como segunda herramienta de análisis se utilizó la función “rxnRemoveList”, con la cual se analizó la producción de etanol al eliminar la reacción que contiene el gen de interés, verificando el valor del flux de etanol a la salida. Luego se aplicó la función “deleteModelGenes”, con lo cual se analizó el -metabolismo al eliminar el gen de interés, y verificar que tuviera un rol importante en el valor el flux de etanol de salida. Por medio de estas herramientas se pretende simular la eliminación de la reacción, de este modo el modelo in silico permite verificar qué importancia tiene la reacción en el metabolismo de E.coli. Al eliminar el gen se asegura que al realizar el experimento el gen tenga importancia en la producción de etanol, ya que es el gen y no la reacción lo que se pretende experimentar.
4.2 Cultivo de las cepas modificadas
Una vez seleccionados los genes de interés, se procede a ubicar los clones individuales que tienen codificada la sobreexpresión del gen, contenidos en la librería ASKA (24) disponible en el laboratorio de biotecnología de la Universidad de los Andes. Con asa incandescente se toma una pequeña muestra del clon ubicado en la posición de interés y se siembra en medio sólido rico en nutrientes, con la composición como se lista en la Tabla 1. Se deja incubando durante 24 horas a 37ºC. Al día siguiente se verifica el crecimiento de colonias individuales del microorganismo.
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Tabla 1 Composición medio LIU sólido
Compuesto Concentración (g/L) Agar 15 Glucosa 8 Extracto de levadura 8 (NH4)2SO4 1 CaCl2 0,41 MnSO4 0,3 MgSO4 4 KH2PO4 3 K2HPO4 3 Cloranfenicol 50 g/L 1 μg/mL
Se procede a tomar una colonia de la caja de Petri y se inocula en 50mL de medio líquido para promover el crecimiento óptimo de la bacteria, cuya composición es similar a la usada en el medio sólido descrito en la Tabla 1, pero sin la presencia de agar. Esto se realiza en un erlenmeyer de 250 mL debidamente cerrado, el cual se ubica en un shaker incubador orbital MRC® con agitación de 250 rpm y temperatura de 37ºC durante 24 horas. Pasado el tiempo y con la verificación del crecimiento de la bacteria, se procede a tomar 250 μL del cultivo y se agregan a tubos de criopreservación previamente esterilizados y con 250 µL de glicerol para criopreservar el microorganismo en glicerol al 50% v/v, a una temperatura de -80ºC. Estas muestras pasan a ser parte del cepario del laboratorio y son utilizados en los experimentos posteriores como fuente de obtención del microorganismo.
4.3 Propagación y fermentación de los microorganismos
Para llevar a cabo una experimentación efectiva se realiza un proceso de propagación previo a las fermentaciones para asegurar que las bacterias hayan multiplicado su número considerablemente.
4.3.1 Propagación del microorganismo
Se preparan 20 mL de medio sólido con la composición descrita en la Tabla 1. Al día siguiente de preparado el medio, se siembra la cepa de interés previamente criopreservada. Se sella la caja de Petri con papel parafinado para evitar la contaminación de la siembra, y se deja en una incubadora a 37ºC por 24 horas. Pasado este tiempo y verificando la presencia de colonias, se toma una de ellas y se inoculan 50 mL de medio líquido con la composición descrita en la Tabla 1, pero sin la adición de agar, en un erlenmeyer debidamente cerrado. Se deja en un shaker a 250 rpm y 37ºC durante 24 horas. Pasado este tiempo, se toma lectura de densidad óptica para verificar el crecimiento del
23
microorganismo. Si esta tiene un valor entre 0.5 y 0.8, se considera que el cultivo está listo para utilizar en los experimentos posteriores.
4.3.2 Fermentaciones
Para realizar las fermentaciones con glicerol como sustrato, se prepara medio líquido con la composición descrita en la Tabla 2. En este medio, la fuente de carbono es el glicerol, y se han eliminado las sales de potasio (KH2PO4 y K2HPO4) que pueden inhibir el consumo de glicerol en E. coli (25). La adición de lactosa se debe a la necesidad de adicionar un inductor para promover la sobreexpresión de los genes modificados.
Tabla 2 Composición medio LIU modificado
Compuesto Concentración (g/L) Glicerol 10, 15 y 20 Extracto de levadura 8 (NH4)2SO4 1 CaCl2 0,41 MnSO4 0,3 MgSO4 4 Lactosa 2 Cloranfenicol 50 g/L 1 μL/mL
La concentración de glicerol se varió en 3 niveles (10, 15 y 20 g/L) para evaluar el nivel de mejor consumo. Se toman tubos falcon de 13 mL previamente esterilizados y se adicionan 10.8 mL del medio LIU modificado. Luego se agrega 1.2 mL del inóculo que se preparó tal como se describe en la sección 4.3.1., de tal manera que se tenga un 10% de inóculo y 90% de medio de propagación, y se sellan con papel parafinado. Se preparan 2 o 3 tubos con cada concentración de glicerol para tener suficiente muestra para medir densidad óptica y seguir el crecimiento, y se deja un tubo completamente cerrado durante toda la fermentación. Estos tubos se dejan durante 4 días que dura el desarrollo del crecimiento de E. coli W3110 hasta terminar la fase estacionaria. Pasado este tiempo se toman los tubos y se centrifugan a 4000 rpm durante 15 minutos para separar las células. El sobrenadante es almacenado a -80ºC para el análisis posterior de los productos de la fermentación.
24
4.4 Seguimiento del crecimiento de los microorganismos
Un método rápido de cuantificar concentración de células es por medio de la absorción de la luz que se suspende en las células presentes en el medio, la intensidad de luz transmitida es medida por medio de la densidad óptica de manera rápida. Este método permite estimar la densidad de células en ausencia de sólidos o de la luz que absorben los componentes. La luz que se transmite en la muestra cambia en función de la densidad celular. (26)
El crecimiento es el resultado de la replicación y el cambio del tamaño de las células, la velocidad de crecimiento es directamente relativa a la concentración de las células, y la reproducción de las células. A partir de esta técnica se puede obtener la velocidad de crecimiento del microorganismo por medio de la siguiente ecuación (26):
Donde X es la concentración de células (g/l) y t es el tiempo en (h), es la velocidad de crecimiento, a partir de la lectura de la densidad óptica se puede obtener las fases de crecimiento del microorganismo que están representadas por la fase de latencia que ocurre inmediatamente después de la inoculación y es un periodo de adaptación de al nuevo ambiente, en este el microorganismo reorganiza sus constituyentes moleculares cuando se transfiere a un nuevo medio (26).
La fase de crecimiento exponencial en esta fase las células se ajustan al nuevo medio y después de este periodo de adaptación pueden multiplicarse rápidamente, y las células y la densidad celular aumentan exponencialmente con el tiempo. En esta etapa los componentes de las células crecen en la misma velocidad. Esta aproximación permanece constante durante la fase de crecimiento. Es posible entonces aplicar la Ecuación 3.
Después continua la fase de desaceleración, en esta fase el crecimiento decrece ya que las fuentes de carbono se agotan, resultando desfavorable para el crecimiento del microorganismo.
La fase estacionaria empieza cuando la velocidad de crecimiento del microorganismo es cero, durante esta fase el microorganismo aun tiene activo su metabolismo y genera metabolitos secundaros, comúnmente en esta fase se obtienen antibióticos y algunas hormonas (26). Finalmente se llega a la fase de declinación o muerte, esto ocurre cuando el medio se encuentra agotado y o hay subproductos tóxicos que se acumulan, ocasionando la muerte del microorganismo (26).
25
Para conocer el comportamiento de las cepas en cada fermentación, se llevó a cabo un seguimiento del crecimiento de los microorganismos por medio de la lectura de la densidad óptica de las muestras en el espectrofotómetro Genesys 10 UV Termoelectron Corporation. En el momento de realizar los tubos, se toma una muestra de 250 µL y se mezclan con 500 μL de agua destilada para medir la densidad óptica con una dilución de 1:3, que asegura una lectura dentro del rango lineal del equipo. Esto se determinó luego de ensayar con distintas diluciones. De esta manera se obtiene la lectura en el tiempo = 0. Se siguen tomando lecturas 2 veces al día durante los 4 días que duran las fermentaciones. Se toma como blanco agua destilada para asegurar la estabilidad del blanco. Este procedimiento se realizó con el fin de facilitar la observación del crecimiento.
4.5 Cuantificación del etanol producido
Para lograr una cuantificación efectiva de la cantidad de etanol producida en cada uno de los cultivos, se hizo uso del equipo FOSS NIR System 6500, que trabaja con base en la técnica analítica de la espectroscopía de infrarrojo cercano. Esta es una técnica no destructiva ampliamente usada en la industria agrícola, farmacéutica, alimenticia, textil, cosmética y de producción de polímeros, dada la facilidad y rapidez de su aplicación (27). Esta técnica ha sido utilizada para monitorear la concentración de sustratos y productos en bioprocesos, dado que tiene la posibilidad de analizar varios compuestos simultáneamente en muestras tanto líquidas como sólidas. Para utilizarlo en el proceso de interés, extraer la información importante del espectro y desarrollar modelos de calibración basados en la correlación entre los datos arrojados por el NIR y los datos conocidos en el laboratorio, se aplica una regresión lineal múltiple con la cual se obtienen los parámetros de las ecuaciones de calibración (28).
La región de espectroscopía de infrarrojo cercana se encuentra entre una longitud de onda de 700-2500 nm, y el origen de la absorción son los sobretonos y bandas de combinación de vibraciones moleculares fundamentales. Para que una molécula absorba la radiación electromagnética tiene que darse dos condiciones. La primera condición es la radiación que debe tener la energía precisa para satisfacer los requerimientos energéticos del material. Debe producirse un acoplamiento entre la radiación y la materia. La radiación en el infrarrojo tiene la energía necesaria para provocar transiciones vibracionales en las moléculas, y la primera condición para la absorción se satisface si una determinada frecuencia de radiación infrarroja corresponde exactamente a una frecuencia fundamental de vibración de una determinada
26
molécula. En la práctica cuando dos átomos se aproximan, la repulsión coulombica entre los dos núcleos provoca un incremento más rápido de la energía potencial del que predice la aproximación armónica y cuando la distancia interatómica se aproxima a la distancia en la que tiene lugar a la disociación, el nivel de la energía potencial se estabiliza. Así podemos decir que las moléculas reales se acercan mas al comportamiento de un oscilador anarmonico. Las moléculas tienen un comportamiento armónico solo cuando la energía potencial es baja, es decir, en torno a la posición de equilibrio (29). Para obtener una buena concordancia entre la teoría y la experimentación se añaden términos de corrección a la aproximación armónica que se denominan correcciones de anarmonicidad. Una consecuencia que se deduce del modelo del oscilador no armonico es que no es posible observar la banda fundamenta ( sino que también puede ser observadas bandas correspondientes a la transición, las cuales son denominadas sobretonos y corresponden a parte de las bandas observadas en el NIR (30).
Las ventajas que presenta la espectroscopia NIR es que es una técnica que no es destructiva ni invasiva, el análisis presenta un bajo coste, la ausencia de reactivos y otro tipo de materiales para la preparación de muestras hacen que el costo de la técnica sea mínimo. La técnica permite la determinación de varios analitos de la muestra sin tener que seguir un procedimiento analítico diferente para cada uno de ellos. También la técnica presenta inconvenientes como la preparación de la calibración de las muestras es compleja ya que necesita que los intervalos de concentración sean estrechos para una mejor aproximación, también las muestras a analizar con esta técnica no pueden presenta una variabilidad física o química ya que la sensibilidad de la técnica es alta. Es difícil cuantificar elementos minoritarios. (30)
De esta manera, inicialmente se pensaba calibrar el equipo para determinar la concentración de etanol y de glicerol, pero en el proceso surgió la dificultad de que los picos de mayor importancia en el espectro de ambas sustancias se encontraban en las mismas longitudes de onda, por lo tanto se decidió estudiar únicamente la concentración de etanol. Para esto, se realizaron fermentaciones idénticas a las descritas en la sección 4.3.2, con la diferencia de que se llevaron a cabo en erlenmeyers de 250 mL, para tener un volumen suficiente de cultivo para hacer las muestras para calibrar el equipo. Estas fermentaciones fueron centrifugadas durante 30 minutos a 4000 rpm y 25°C. El sobrenadante fue sometido a un proceso de evaporación durante 60 minutos a 45°C, para eliminar todo el etanol que posiblemente fue producido. El producto de este proceso, llamado medio blanco, se utilizó para crear un conjunto de soluciones de etanol en este mismo blanco, que se usaron para la calibración del NIR. Se partió de una solución concentrada de 10 g/L de etanol en el medio blanco. Para prepararla, se tomó un balón aforado de 50 mL, se le agregó 0,5 g de etanol y se aforó con el medio blanco. Luego se tomaron 25 balones aforados
27
de 10 mL y se les agregó esta solución concentrada en las cantidades descritas en la Tabla 3, y se procedió a aforar los balones con el medio blanco. Tabla 3 Diluciones de etanol en balones aforados de 10 mL a partir de una mezcla concentrada de 10 g/L para la calibración del NIR
Concentración Final del balón
(g/L)
Volumen de Concentrado
(mL)
Concentración Final del balón
(g/L) Volumen de Concentrado (mL) 0 0 1,3 1,3 0,1 0,1 1,4 1,4 0,2 0,2 1,5 1,5 0,3 0,3 1,6 1,6 0,4 0,4 1,7 1,7 0,5 0,5 1,8 1,8 0,6 0,6 1,9 1,9 0,7 0,7 2,0 2,0 0,8 0,8 2,1 2,1 0,9 0,9 2,2 2,2 1,0 1,0 2,3 2,3 1,1 1,1 2,4 2,4 1,2 1,2 2,5 2,5
Estas muestras fueron sometidas a estudio en el equipo de infrarrojo cercano (NIR) y con una manipulación matemática realizada por el equipo se obtuvieron las ecuaciones de calibración para el etanol en solución del medio. Este proceso se llevó a cabo repetidas veces hasta obtener un conjunto de 150 muestras, de las cuales 75 fueron usadas para la creación de la ecuación de calibración, y la otra mitad se usó para validar dicha ecuación o modificarla según el análisis de los resultados.
4.6 Determinación del consumo del inductor
En el proceso de fermentación se utilizo la lactosa como inductor. Para comprobar que el microorganismo utilice la lactosa con este fin, se efectúa el método de acido 3,5-dinitrosalicílico DNS para cuantificar que la concentración de lactosa (azúcar reductor) permanezca constante. Por medio del proceso estandarizado Di-Nitro-Salicílico basado en la colorimetría. Se realiza una curva de calibración por medio de la cual los datos de absorbencia permiten obtener los datos cuantitativos. La técnica consiste en preparar muestras con concentraciones conocidas de lactosa, a las cuales se agrega de solución DNS y de muestra, se mezclan y se llevan a baño maría por 5 minutos, se agrega 5 ml de agua y se procede a leer en el espectrofotómetro Genesys 10 UV Tremoelectron Corporation a una longitud de onda de 600nm, ya que se presenta una relación directamente proporcional entre la absorbancia y la concentración de las muestras se obtiene una curva de calibración que permite evaluar las muestras desconocidas que se tomaron al inicio y final de las fermentaciones.
28
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS
5.1 Selección de genes
Para seleccionar los genes que se sobre-expresaron en el procedimiento experimental se estudió la ruta de degradación de glicerol en E.coli mostrada en la Figura 3. A partir de este estudio se seleccionaron las reacciones que tenían una mayor importancia en la producción de etanol, las cuales se presentan en la Tabla 4. Teniendo presente este conjunto de reacciones se configuró el modelo in silico que se simula en Cobra Toolbox® de MatLab, el cual debe simular las condiciones a las que se lleva el experimento, es decir la fuente de carbono se cambia por glicerol y se presenta un restricción de oxígeno que simule las condiciones anaeróbicas del experimento.
Tabla 4. Lista de genes principales involucrados en la degradación del glicerol a etanol
Genes Reacción Nombre de la
reacción Productos y Reactivos
Glpk GLYK glicerol kinasa
glyDH GLYCDx glicerol
deshidrogenasa aceEf PDH piruvato deshidrogenasa lpdA PDH piruvato deshidrogenasa pflB, tdcE PFL
gapA GAPD glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
adhE ACALDi
acetaldehído deshidrogenasa
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Se realiza un análisis de balance de flux que permite conocer los metabolitos que se presentan en el microorganismo cuando no hay una sobre-expresión de los genes. Después se sobre-expresan las reacciones mostradas en la Tabla 4, nuevamente se realiza un análisis de flux metabólicos y se observa si hay un incremento significativo en la producción de etanol. Estos resultados se listan en la Tabla 5, donde se presentan los resultados de las reacciones que presentan un incremento en la producción de etanol. Como segunda herramienta de análisis se utilizó la función “rxnRemoveList”, con la cual se analizó la producción de etanol al eliminar la reacción que contiene el gen de interés, verificando el valor del flux de etanol a la salida. Luego se aplicó la función “deleteModelGenes”, con lo cual se analizó el metabolismo al eliminar el gen de interés, y verificar que tuviera un rol importante en el valor el flux de etanol de salida. Por medio de estas herramientas se pretende simular la eliminación de la reacción, de este modo el modelo in silico permite verificar qué importancia tiene la reacción en el metabolismo de E.coli. Al eliminar el gen se asegura que al realizar el experimento el gen tenga importancia en la producción de etanol, ya que es el gen y no la reacción lo que se pretende experimentar. Las 4 filas finales de la Tabla 5 muestran reacciones que mejoraron el flux de etanol. De ellas, se descartaron los genes de la reacción dihidroxiacetona fosfotransferasa denominada DHAPT por ser un complejo de 3 genes, y la de la reacción piruvato formato liasa denominada PFL por ser la reacción codificada por las enzimas de la formato piruvato liasa, lo cual puede indicar que con la sobreexpresión de estos genes se aumente la producción de formato preferiblemente, y no la de etanol. Quedan entonces las reacciones Glicerol -3-Fosfato y Piruvato Deshidrogenasa respectivamente denominadas GAPD y PDH, que fueron las escogidas como las más representativas, siendo los genes gapA y lpd los que se procederán a sobre-expresar en el estudio experimental.
Tabla 5 Resultados del análisis del metabolismo de E. coli utilizando la herramienta “ChangeRxnBounds” de CobraToolbox®.
Reacción Producción inicial
Etanol Producción final Etanol GLYK 18,36 18,36 G3PD2 18,36 18,36 DHAPT 18,36 19,44 PDH 18,36 18,90 GAPD 18,36 19,49 PFL 18,36 22,52
30
5.2 Curvas de crecimiento de los microorganismos
5.2.1 Curvas de crecimiento de E.coli W3110/pCA24N lpd+
Se tomó lectura de la densidad óptica de todos los cultivos que se realizaron para la culminación de este proyecto. A continuación se reportan las curvas de crecimiento para la cepa E. coli W3110/pCA24N lpd+ fermentada con las tres concentraciones de glicerol manejadas.
En la Figura 4 se reportan los resultados de la lectura de la densidad óptica del cultivo de la cepa que sobreexpresa el gen lpd. En este caso se observó una diferencia notable en el nivel de crecimiento durante la fase estacionaria comparando los tres experimentos, lo que significa que la concentración del glicerol como fuente de carbono afecta el crecimiento de esta cepa, aunque la tendencia no es clara. La fase de crecimiento tiene una forma lineal, mostrando una cinética de crecimiento de orden cero. Para caracterizar el crecimiento de las cepas, se obtuvo la velocidad de crecimiento mostrada en la Tabla 6, que se obtiene por un ajuste de datos en la fase de crecimiento lineal y es un indicador de la capacidad de adaptación de los microorganismos al medio, donde la fuente de carbono es el glicerol.
Figura 4 Crecimiento celular de la cepa E.coli W3110/pCA24N lpd+ para una concentración
31
5.2.2 Curvas de crecimiento de E. coli W3110/pCA24N gapA+
Se tomó lectura de la densidad óptica de todos los cultivos que se realizaron para la culminación de este proyecto. A continuación se reportan las curvas de crecimiento para la cepa E. coli W3110/pCA24N gapA+ fermentada con las tres concentraciones de glicerol manejadas.
Figura 5 Crecimiento celular de la cepa E. coli W3110/pCA24N gapA+ para tres concentraciones de glicerol: 10g/L
( ), 15g/L ( ) y 20g/L ( ).
En la Figura 5 se observa que las curvas de crecimiento para las tres concentraciones de glicerol son muy similares, por lo cual, como primera aproximación es posible inferir que el nivel de glicerol no afecta de manera significativa el crecimiento de la cepa estudiada. La fase de latencia es muy corta y no es significativa para el estudio de la cinética del microorganismo. A partir de las 5 horas de crecimiento se observa un crecimiento lineal constante hasta el final de las fermentaciones, lo cual que la cinética de crecimiento del microorganismo es de orden cero.
5.2.3 Curvas de crecimiento de E. coli W3110
De igual forma, para la cepa salvaje se tomó lectura de la densidad óptica durante los 4 días de fermentación anaeróbica. En este caso se observa que para el menor nivel de concentración de glicerol el crecimiento fue menor que para los otros dos niveles, que tuvieron un crecimiento similar. Las gráficas no muestran una tendencia a la disminución de la densidad óptica como se esperaría si el crecimiento llegara a una fase de declinación, por lo cual es
32
posible sugerir que el crecimiento de estos microorganismos requiere más tiempo para completar su ciclo de crecimiento.
Figura 6 Crecimiento celular de la cepa E. coli W3110 para tres concentraciones de glicerol: 10g/L ( ), 15g/L ( ) y 20g/L ( ).
Para hallar la velocidad de crecimiento para las cepas sobreexpresadas y la cepa silvestre se tomó la fase de crecimiento lineal y se halló el comportamiento que hay entre la densidad óptica y el tiempo para cada cepa, este se presenta en la Tabla 6. A partir de las cinco horas de crecimiento se observa un crecimiento lineal constante hasta las treinta horas que empieza la fase estacionaria, lo cual indica que la cinética de crecimiento del microorganismo es de orden cero. Con base en este análisis se calcularon los valores de la Tabla 6.
Tabla 6 Velocidad de crecimiento de cada cepa a diferentes concentraciones de glicerol
Cepa Glicerol [g/L] µ (h-1)
E.coli W3110/pCA24N lpd+
10 15 20
E.coli W3110/pCA24N gapA+
10 15 20 E. coli W3110 10 15 20
En la Tabla 6 se observa que cada gen presenta una velocidad de crecimiento distinta, lo cual refleja la adaptación de cada cepa al medio de fermentación que contiene glicerol como sustrato. La cepa salvaje presenta una velocidad menor pues no tiene ninguna modificación que permita un mejor metabolismo para la degradación de glicerol. Como se observa en la Figura 7, la cepa que
33
tiene una adaptación más rápida a las condiciones del medio es la que sobre-expresa el gen lpd, esto se ve reflejado en un aumento en la densidad del número de células que está representado por la velocidad de crecimiento. Mientras que la cepa que sobre-expresa el gen gapA y la cepa silvestre presentan una velocidad de crecimiento menor. La cepa que sobre-expresa el gen lpd tiene una mayor capacidad de metabolizar las fuentes de carbono presentes en el medio de fermentación.
5.3 Cuantificación del etanol producido
5.3.1 Calibración del NIRS
Se procedió a tomar los espectros de las soluciones descritas en la metodología para hallar las longitudes de onda a las cuales es mayor la correlación entre el cambio en las concentraciones de etanol y la absorbancia. En el programa de manejo del equipo Vision se almacenan los espectros, mostrados en la Figura 8 para las soluciones de concentración de etanol conocida en el rango de 0 a 2 g/L, y se ingresa al sistema el valor de concentración de etanol evaluado en el laboratorio, es decir el correspondiente a cada dilución. 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 10 15 20 Ve lo ci da d m áxi m a de c re ci m ie nt o (h -1)
Concentración inicial de glicerol (g/L)
Figura 7 Velocidad de crecimiento para la cepa E.coli W3110/pCA24N gapA+( ),
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Figura 8 Espectros de las soluciones de etanol utilizadas en la calibración del equipo de espectroscopía de infrarrojo cercano
Una vez almacenados todos los espectros se ingresa en el modo de Análisis Cuantitativo para realizar un proceso de tres pasos del cual se obtiene la ecuación de calibración. Primero, se realiza una selección de muestras por el cálculo de la distancia de Mahalanobis en el espacio del componente principal, con lo cual se detecta la presencia de valores atípicos y se apartan del conjunto de muestras usadas para la calibración, y se guarda el conjunto de muestras apropiadas para la regresión. Como segundo paso se realiza la regresión. Para esto, se selecciona el conjunto de muestras y el constituyente a estudiar, en este caso, el etanol. Se selecciona el método de regresión y los parámetros con los cuales se va a llevar a cabo, como el rango de longitudes de onda y el intervalo de medición. El método de regresión usado fue la regresión lineal múltiple. En este paso el programa revisa el espectro de las muestras de 1125 a 2500 nm y como resultado se obtiene un gráfico como el mostrado en la Figura 9, donde se relaciona la sensibilidad y la correlación obtenida. Automáticamente el programa elige la longitud de onda a la cual se obtuvo la mejor correlación con la menor sensibilidad, y se obtiene la ecuación de calibración.
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Figura 9 Gráfico típico de resultados de una regresión lineal para la calibración del espectrofotómetro de infrarrojo cercano.
Se reportan también las constantes obtenidas para la ecuación, indicadores estadísticos, las diferentes gráficas de residuales de las muestras y de datos calculados Vs datos del laboratorio. El último paso consiste en predecir un conjunto de muestras de concentración de etanol conocida, con la ecuación obtenida en el paso anterior para probar la validez de la misma. Se toma un conjunto de muestras diferentes a las utilizadas en la calibración y se selecciona la opción de Predecir, del modo Análisis Cuantitativo. De esta manera se evalúan las muestras de acuerdo a la ecuación. El programa sugiere cambios a la ecuación que pueden realizarse si se considera necesario.
5.3.2 Ecuaciones de calibración
Llevando a cabo el proceso anterior y con base en el mejor ajuste a los datos se obtuvo una ecuación para cada una de las cepas. Para la cepa E. coli W3110/pCA24N gapA+ se realizó la regresión con las muestras hasta la concentración de 1,5 g/L de etanol, y para la cepa E. coli W3110/pCA24N lpd+ se realizó la regresión con las soluciones de 0 a 2,5 g/L. En la Tabla 7 se resumen los parámetros obtenidos para las ecuaciones.
Tabla 7 Ecuaciones de calibración del NIR. EEP: Error Estándar de Predicción.
Parámetro Valor Lpd gapA Longitud de onda 1698nm 1678nm Intercepto -0,1407 0,1952 Pendiente 1513,98 -1388,57 Correlación 0,9676 0,9414 EEP 0,1769 0,1522
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En la Figura 10 se observa la relación que se obtuvo entre los datos calculados con la ecuación y los valores conocidos o de laboratorio. La relación obtenida es satisfactoria, por lo cual se evaluaron las muestras desconocidas con estas ecuaciones.
Figura 10 Relación entre la concentración de etanol medida y calculada para las ecuaciones de calibración descritas en la Tabla 7: La gráfica A corresponde a la ecuación del gen gapA y la B corresponde a la del gen lpd.
5.3.3 Toma de lectura a las muestras desconocidas
Con la ecuación de calibración determinada y validada, se procedió a descongelar las muestras de las fermentaciones para tomarles muestra en el espectrofotómetro de infrarrojo cercano NIRS. A cada muestra se le tomó el espectro 5 veces para tener un dato confiable en el reporte expuesto a continuación. Para cada nivel de glicerol se tenían de 4 a 5 muestras, de tal manera que el valor reportado de producción de etanol es un promedio de más de 20 datos.
Al realizar una sobreexpresión de genes en E. coli se ha obtenido un incremento en la producción de etanol. Para esto se compararon las cepas de los genes sobre-expresados contra la cepa silvestre, en la Figura 11 se muestra un incremento en la producción de etanol. La producción de etanol en las cepas modificadas aumentó con respecto a la cepa silvestre, se observa que al aumentar la concentración de glicerol hay un incremento en la producción de etanol, esto ocurre solo en las cepas que tiene sobre-expresados los genes, para la cepa silvestre no se presenta una relación clara entre la producción de etanol teniendo como fuente de carbón el glicerol.
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Comparando los resultados obtenidos al aumentar la producción de etanol en otros microorganismos de otros estudios, se obtienen los datos mostrados en la Tabla 8. De manera resumida se observa que la producción de etanol obtenida en este estudio es comparable con estudios realizados en otras investigaciones, y los resultados abren la posibilidad de continuar el estudio con los microorganismos modificados. Como se observa las cepas que sobre expresan los genes gapA y lpd, tiene un aumento en la producción de etanol a medida que aumenta la concentración inicial de glicerol. Esto sugiere la posibilidad de estudiar la realización de este tipo de fermentación con una concentración inicial de glicerol mayor, ya que no se encontró un efecto negativo en el crecimiento de los microorganismos. Comparando la sobre-expresión de los genes gapA y lpd con los resultados de los estudios publicados (1) y (31) se concluye que es viable la sobre-expresión de estos genes para continuar el estudio de la producción de etanol.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 10 15 20 Pr o d u cc ió n d e e tan o l ( g/ L)
Concentración inicial de glicerol (g/L)
Figura 11 Producción de etanol para la cepa salvaje ( ),
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Tabla 8 Resumen de resultados de producción de etanol a partir de microorganismos
Algunos de estos resultados son graficados en la Figura 12, donde se observa la tendencia que tiene la cepas que sobre-expresan los genes lpd y gapA a medida que aumenta la concentración inicial de glicerol se ve un aumento en la producción de etanol, mientras que las cepas que sobre-expresan los genes adhE y pflb no se puede asegurar que exista una relación entre la concentración inicial de glicerol y la producción de etanol. Si se compara con los resultados obtenidos por Ramón González y sus colaboradores (25), es evidente la diferencia en la obtención de etanol. Es necesario precisar que las condiciones experimentales de los otros estudios eran más estrictas y controladas, además que los cambios genéticos en los microorganismos eran más complejas, dado que incluían la deleción de los genes de las rutas metabólicas de subproductos y la sobreexpresión de más de un gen.
Cepa Concentración inicial de glicerol (g/L) Producción de Etanol (g/L) Rendimiento de Glicerol (g EtOH/g Gly) Fuente E.coli W3110/pCA24N lpd+ 10 15 0.47 0.59 0.0095 Este estudio 0.031 20 0.029 E.coli W3110/pCA24N gapA+ 10 15 20 0.12 0.31 0.012 Este estudio 0.020 0.69 0.034 E.coli W3110 10 15 20 0.22 0.015 Este estudio 0.0023 E.coli W3110/pCA24N adhE+ 10 0.15 0.015 Margarita Diaz 2009, (Articulo no publicado) 15 ND --- 20 0.63 0.0315 E.coli W3110/pCA24N pflb+ 10 0.25 0.025 Camilo Urrego 2009,(Articulo no publicado) 15 0.30 0.02 20 0.31 0.015 S. cerevisiae/WildType Fuente de carbono alternativa 0.48 (31) S.cervisiae/ Fuente de carbono alternativa 0.52
E.coli/SY03 10 0.12 0.012 (Yazdani &
Gonzalez, 2008) E.coli/SY04(pZSKLMgldA) 20 0.42 0.021
