Universidad de Sonora
Unidad Regional Norte INVESTIGACIÓN
Potencialidad y Retos del Uso de Nematodos Entomopatógenos para el Control Biológico de
Plagas. I: Control biológico mediante una asociación simbiótica NEP-Bacteria
Fimbres Cubillas Gerardo2,3,Flores-Lara Yolanda1*
1 Departamento de Ciencias Químico Biológicas y Agropecuarias. Universidad de Sonora. Unidad Norte Caborca. Caborca, Sonora, México. 2 Programas de Enseñanza Oficial de la Universidad de Almería, España.
3 Asesor técnico agrícola independiente. Resumen
Los nematodos entomopatógenos (NEPs) han sido usados como agentes de control biológico en el suelo, en aplicaciones foliares y también para el control de plagas de almacén. Cada especie de NEP tiene una asociación natural específica con una sola especie de Xenorhabdus o Photorhabdus (aunque la bacteria puede estar asociada con más de una especie de nematodos). El nematodo provee a la bacteria de protección contra el medio ambiente y contra la respuesta inmunológica del hospedero. El nematodo es un medio de transporte para la bacteria del cadáver del insecto al hemoceloma de un nuevo hospedero, mientras que la bacteria provee de nutrientes al nematodo. Esta es la primera de una serie revisiones que comenzará con información fundamental (morfología, clasificación, ciclo de vida y su asociación simbiótica) sobre los NEPS y terminará con la discusión de aspectos más prácticos relacionados con la aplicación de NEP en el campo. Esta revisión se hace con el fin de sumarizar la gran cantidad de información ya publicada y servir como una fuente de referencia en español a todos aquellos que comienzan a tener interés en el campo de los nematodos entomopatógenos.
Palabras clave: Nematodos entomopatógenos, Control biológico, EPNs, NEPs, Steinernematidae, Heterorhabditidae.
The Potential and Challenges of the Use of Entomopathogenic nematodes (EPNs/NEPs) as biological control agents. I: Biological control by an EPN-Bacteria simbiotic association
Abstract
Entomopathogenic nematodes (NEPs) have been used mainly as biological agents to control soil pests, however their use has been reported in foliar applications and in the control of storage pests. Each NEP species has a specific natural association with only one Xenorhabdus or Photorhabdus species (but bacteria can be associated with more than one nematode species). In this symbiotic association, the nematode gives bacteria protection against the environment and host immunological responses. The NEP is also a vehicle for the bacteria to move from the insect hemocoel to a new host. In return, the bacteria provides nutrients for the nematode. This review is the first of a series of three manuscripts in which we will present information related to basic aspects such as NEP’s morphology, biological cycle, etc. Subsequently more applied information will be revealed regarding ecology, field applications, application equipment. The purpose of this review is to improve communication and knowledge and be a source of information in Spanish, especially for newcomers into the field of entomopathogenic nematodes.
Keywords: Entomopathogenic nematodes, Biological control, EPNs, Steinernematidae, Heterorhabditidae.
*Autor para envío de correspondencia: Universidad de Sonora. Campus Caborca. Av. Universidad e Irigoyen, s/n. C.P. 83621. Caborca, Sonora, México. E-mail: yflores@caborca.uson.mx
© 2016 Editorial UNISON — URN. Derechos reservados.
INVURNUS, Vol. 11 No. 1 (2016): 27-36 Introducción
Los nematodos son organismos en forma de gusanos redondos, no segmentados que tienen diferentes “estilos de vida”, incluyendo los de vida-libre, los predadores y los parásitos (Fig. 1). La biodiversidad de estos organismos animales es extensa, existen cerca de 40 familias asociadas con insectos, sin embargo los nematodos entomopatógenicos (NEPs) pertenecen exclusivamente a dos familias: la Steinernematidae y la Heterorhabditidae.
Gotthold Steiner (1886-1961), nació en Suiza, pero emigró a los EE.UU., dónde trabajó con Nathan Cobb (padre de la nematología en los EE.UU.). En 1929 describió Neoaplectana glaseri Steiner, la primera especie usada en el control biológico de larvas de escarabajos. Aunque Steiner originalmente posicionó erróneamente sus especies en el género Aplectana, pronto el brasileño Travassos revisó la clasificación y creó un nuevo género Steineria, el cual fue renombrado rápidamente como Steirnernema spp.
Lauro Pereira Travassos (1890-1970), fue primeramente helmintólogo, y publicó extensamente en el área de la sistemática y taxonomía. Otros dos pioneros en este campo son Iván Nikolaevich Filipjev (1889-1940) y Prosper Louis Bovien quién nació en 1894 en Dinamarca. Nikolaevich fue responsable de la creación de la familia Steinernematidae, así como de la descripción de Neoaplectana feltia (conocida actualmente como Steinernema feltiae). Prosper L. Bovien, primariamente zoólogo describió las especies Neoaplectana affinis y N. bibionis en 1937, y fue el primero en asociar a los NEPs con las bacterias que ahora conocemos como Xenorhabdus y Photorhabdus. En este primer artículo se pretende presentar información basica sobre los nematodos entomopatógenos con referencia a su morfología, clasificación, ciclo de vida y su asociación simbiótica bacteria/NEP. Esto establecerá una base de conocimiento para el entendimiento de conceptos más aplicados que se desarrollarán en los siguientes dos manuscritos relacionados con el uso y aplicación de los NEPs en el campo como controladores biológicos de plagas. Esta revisión también pretende sumarizar la gran cantidad de información ya publicada y servir como una fuente de referencia en español para todos aquellos que comienzan a tener interés en el campo de los nematodos entomopatógenos.
Los NEPs como controladores biológicos
El éxito del control biológico basado en el uso de los NEPs puede depender de que estos posean ciertas características benéficas, como la virulencia, el potencial reproductivo y la tolerancia al medio ambiente. Dichas características pueden variar significativamente incluso entre cepas de la misma especie. Los NEPs pueden ser aplicados enestadío de juvenil infectivo en conjunción con otros pesticidas biológicos y/o químicos, fertilizantes, mejoradores del suelo y frecuentemente es más económico mezclarlos con estos insumos para su aplicación. Los NEPs han sido usados principalmente como agentes de control biológico en el suelo pero existen reportes sobre aplicaciones foliares de NEPs con Steinernema feltiae que han sido exitosas para controlar el gusano minador Liriomyza huidobrensis en lechuga de invernadero (Cuthbertson y col. 2003).
Figura 1. Los nematodos son organismos en forma de gusanos redondos.
Se han utilizado diferentes nombres para denominar a los nematodos asociados con insectos. Por un tiempo se usó el término entomofílico que literalmente significa “amante de los insectos”, el cual pareció inapropiado ya que el nematodo parasita y mata al insecto. Después surgió el término entomógeno usado en micología que significa “crecer sobre insectos” y entoparasítico que describe nematodos parasíticos. El término entomopatógeno el cual es actualmente utilizado se refiere a nematodos que causan la muerte del insecto por la liberación de una bacteria simbiótica al hemoceloma del mismo (causando una toxemia/bacteremia) más que por efecto directo del nematodo.
La mayoría de los primeros reportes con respecto a los NEPs, se concentraron más en nematodos grandes y largos medidos en centímetros y no en milímetros. No fue hasta el siglo XX que los nematodos a los que nos referimos actualmente como steinernematidos fueron descubiertos por G. Steiner (1923) al describir Aplectana kraussei Steiner.
Flores Lara y col., Potencialidad y Retos del Uso de Nematodos Entomopatógenos para el Control Biológico de Plagas Los NEPs también han sido usados como agentes de
control biológico de plagas en productos de almacén ya que ofrecen varias ventajas como tener baja toxicidad para vertebrados, están exentos de registro en los EE.UU. por la EPA (US Environmental Protection Agency), existen muchas especies comercialmente disponibles, pueden ser aplicados con equipo convencional, pueden tolerar mezclarse con muchos pesticidas, muchas especies tienen un amplio rango de hospederos, y tienen la capacidad de ir en búsqueda de su hospedero (Ramos-Rodríguez y col. 2006).
En contraste a los NEPs, los pesticidas químicos no se pueden desplazar por el agua en el suelo y tienden a decaer en unos días. Los NEP son móviles y persistentes, ellos se reciclan dentro del insecto hospedero, manteniendo así su efecto a largo plazo. El uso de los NEP es seguro para los usuarios y el medio ambiente. Tienen muy pocos efectos secundarios en poblaciones de insectos no objetivo, ni la bacteria ni el nematodo causa efectos secundarios en mamíferos o plantas y en casi todos los países, están exentos de requisitos para ser registrados (Ralf-Udo, 2001; Selcuk y col. 2001). Los NEPs son aplicados al suelo en forma del tercer estadío juvenil llamado también infectivo juvenil (IJ). A diferencia de la mayoría de agentes biocontroladores que requieren varios días o semanas para matar a sus huéspedes, los NEPs al trabajar en conjunto con las bacterias simbióticas (Xenorhabdus spp. o Photorhabdus spp.) causan la muerte del huésped en 1 ó 2 días (García-Peña, 2009; Fernández y col. 1997 ; Ralf-Udo, 2001; Smits, 1997).
Los nematodosentomopatógenos son agentes controladores efectivos de una gran variedad de plagas de importancia económica incluyendo las larvas de varias especies de gorgojos (Coleóptera: Curculionidae) como es el caso de Otiorhynchus sulcatus en arándanos y Diaprepes abbreviatus en cítricos. También se reporta un control exitoso de fungus nat (díptero) Bradysia spp. en invernadero y en moscas de los hongos Lycoriella spp. en setas (Shapiro-Ilan y col. 2003). En Cuba, se tienen registros del uso combinado de Heterorhabditis bacteriophora (cepa HC1) y el hongo Verticillium lecanii, para el control integrado de la chinche harinosa del cultivo del café. La combinación de ambos agentes biológicos dieron por resultado la disminución de los niveles de infestación de la chinche harinosa y mayores rendimientos en las fincas donde se aplicó esta estrategia. Los productores de guayaba en Brasil también se han beneficiado con el uso de los NEPs ya que controlan una importante plaga subterránea, el gorgojo de la guayaba Conotrachelus psidii (Dolinski y col. 2012).
El nematodo Neoaplectana carpocapsae (actualmente conocido como Steinernema carpocapsae) clase DD-136 fue
reportado patogénico a larvas y pre pupas del defoliador de los bosques Oxydia trychiata bajo condiciones simuladas de campo. Aún y cuando es necesario llevar experimentos a nivel de campo para corroborar estos resultados obtenidos, se cree que la humedad del suelo de plantaciones de pino tiene la humedad requerida para la supervivencia de los NEPs, la cual es una condición critica que ha limitado el uso de S. carpocapsae en muchos cultivos (Bustillo, A.E., 1976). También se han obtenido resultados prometedores en el campo para el control de Cosmopolites sordidus en cultivos de banano; Diaprepes abbreviatus y Phyllophaga spp. en caña de azúcar y Popillia japonica en campos de golf (García-Peña, 2009). Los NEPs también se han utilizado con éxito para controlar a la plaga de grillo topo en Florida y se siguen utilizando en huertas de naranjo, tanto en Florida como en California para controlar el gorgojo de la raíz de los cítricos entre otras plagas (Dillman y col. 2012).
Aunque el rango de hospederos de los nematodos entomopatógenos incluye más de 200 especies de insectos, los NEPs que han sido comercializados solo cubren una pequeña fracción de estas 200 especies. Pero aún así existe un gran interés en aislar estos nematodos de diferentes regiones del mundo para que puedan ser usados como agentes de control biológico para plagas de dichas regiones. Tales nematodos estarían mejor adaptados climáticamente al igual que la plaga y se evitaría la introducción de NEPs exóticos en la región. Por esta razón muestreos en muchas partes del mundo se han llevado a cabo para levantar un inventario de los NEPs presentes, los cuales por estar ya bien adaptados, serían más adecuados para un control biológico inundativo (Didem y col. 2006). Los NEPs pueden ser agentes de control biológico efectivos de plagas del suelo cuando son altamente patogénicos con Dosis letales 50 (DL50) tan bajas como 3 a 30 IJ, siempre y cuando se asocie especie y cepa apropiada de nematodo con el insecto objetivo de control Curran J., 1993).
Morfología
Los nematodos se conocen vulgarmente con el nombre de “gusanos redondos” por la forma de su cuerpo en un corte transversal. Su cuerpo es alargado, cilíndrico y no segmentado (Fig. 1). La cavidad de su cuerpo es un pseudohemoceloma y su cuerpo está cubierto de una cutícula, la cuál puede o no exhibir variaciones. Tienen un sistema excretor rudimentario (Fig. 2) y no poseen sistema circulatorio o respiratorio, pero su sistema nervioso, reproductor y digestivo están bien desarrollados. El ano y gonoporo en el macho (Fig. 5) se unen para formar la cloaca. La mayoría son de vida libre en medios ambientes acuáticos y terrestres mientras que otros parasitan plantas y animales. Las principales diferencias entre los nematodos fitoparásitos
INVURNUS, Vol. 11 No. 1 (2016): 27-36
Figura 2. Nematodo mostrando poro excretor (A) y campos laterales (B).
y los nematodos entomopatógenos es la ausencia del estilete y la asociación de los NEPs con una bacteria simbiótica. Su esófago está dividido en el corpus, istmo y bulbo basal. Los machos pueden tener o no bursa (Fig. 5), el poro excretor (Fig.2) puede estar localizado anterior o posteriormente al anillo nervioso.
Los infectivos juveniles (Fig. 1) de la mayoría de las especies miden entre 500 y 800 micrómetros (Smits, 1997) y están asociados a una bacteria simbiótica especie-especifica. Estas bacterias se encuentran en una estructura llamada receptáculo bacterial (originalmente llamado vesícula intestinal o bacterial por Bird y Akhurst, en 1983). Este receptáculo está localizado entre el esófago y la porción anterior del intestino y es el resultado de la modificación de las dos células anteriores de la porción ventricular del intestino (Fig. 3 A-B). Existe evidencia que sugiere que el desarrollo de la vesícula en los infectivos juveniles no depende de la presencia de los simbiontes ya que se ha observado la presencia de esta estructura en infectivos juveniles axénicos. En estudios realizados en S. carpocapsae se observó que la morfología del receptáculo bacterial esta influenciado por los niveles de colonización, edad y estado nutricional del nematodo. (Flores-Lara y col. 2007). Kyu Kim y col. (2012) observó variación en el tamaño del receptáculo bacterial, en un estudio de 25 especies de Steinernema spp. donde S. monticolum miembro de la clase II presentó el receptáculo más grande (promedio 46 x 17 μm), mientras que S. rarum (sin afiliación a un clado)
Figura 3. A. Receptáculo bacterial de 3 especies de Steirnernema B. Intestino C. Estructura intravesicular (IVS) presentó el receptáculo más pequeño (8 x 5 μm). Martens y Goodrich-Blair, reportaron en el 2005, la presencia de una subestructura subcelular llamada estructura intravesicular (IVS) en S. carpocapse (Fig. 3C). El IVS aparentemente juega un papel importante en la iniciación de la colonización por la bacteria simbiótica.
Familia Steinernematidae: son parásitos obligados de insectos. Los infectivos juveniles de tercer estadío trasportan la bacteria simbiótica Xenorhabdus spp. en el receptáculo intestinal. El poro excretor (Fig. 2) está localizado anteriormente al anillo nervioso. Las hembras son grandes, con longitud del cuerpo variable, cutícula lisa o anulada, sin campos laterales, poro excretor visible, cabeza redonda o trunca. El sistema reproductivo es didélfico, amfidélfico, reflejado. Los machos son más chicos que las hembras, bursa ausente, con papilas genitales de 21-23 (Fig. 5). El infectivo juvenil presenta un estoma hundido, con o sin cutícula del segundo estadio juvenil, los campos laterales pueden tener de 4-9 hendiduras o campos laterales (Fig. 2, 4) y la cola es conoide o filiforme (Fig. 6).
Familia Heterorhabditidae: son parásitos obligados de insectos, los IJs transportan la bacteria simbiótica Photorhabdus spp. El poro excretor se localiza posteriormente del anillo nervioso. Las hembras hermafroditas (adultos de primera generación) presentan una cabeza trunca, 6 labios cónicos bien desarrollados, estoma ancho, poro excretor usualmente posterior al final del esófago, ovotestis amfidélfico reflejado. Las hembras amfimícticas (adulto de segunda generación) son más chicas que las hembras
Flores Lara y col., Potencialidad y Retos del Uso de Nematodos Entomopatógenos para el Control Biológico de Plagas hermafroditas, presentan papila labial prominente, sistema
reproductivo amfidélfico. Los machos presentan un testículo reflejado, cabeza de la espícula corta, presentan bursa con 9 pares de papilas genitales. El infectivo juvenil normalmente mantiene la cutícula del segundo estadío juvenil (ya que el estado pre-infectivo no muda, especialmente si no hay suficientes nutrientes) de manera que el IJ presenta una doble cutícula, la cual lo protege de factores ambientales adversos y aumenta su virulencia, la cabeza presenta diente dorsal prominente, la cutícula es estriada (Nguyen y col. 1996); De-Jun y col. 2001). El diente dorsal (Fig.7) les ayuda a penetrar al interior del insecto hospedero por las membranas inter segméntales (Stuart y col. 1994).
Clasificación
Los NEPs más utilizados en control biológico pertenecen a la clase Secernentea, orden Rhabditida, familias Heterorhabditidae y Steinernematidae, siendo los géneros Heterorhabditis spp. y Steinernema spp. los más estudiados. Existen algunas claves taxonómicas basadas únicamente en características morfométricas de machos y juveniles infectivos como longitud del cuerpo, distancia de la cabeza al anillo nervioso, distancia de la cabeza al poro excretor, gobernaculo, etc. Las identificaciones basadas exclusivamente en infectivos juveniles pueden ser no muy precisas, ya que existen muy pocas características morfológicas diferenciales entre especies. Asimismo los rangos morfométricos de muchas especies se traslapan. Deben usarse las características de hembras y machos
para lograr una identificación precisa para la mayoría de las especies. La morfometría tanto de Steinernema spp. y Heterorhabditis spp. varían dependiendo del tiempo de colecta (tiempo transcurrido después de la aparición del primer juvenil infectivo) y de la forma de cría (in vivo o in vitro). Si el juvenil infectivo emerge después, son más cortos que los IJ que emergieron primero, lo que sugiere que la diferencia en tamaño está correlacionada con la disminución en el abastecimiento de alimento por el insecto cadáver (Barbercheck y col. 2003). También debe tomarse en cuenta la presencia de ciertas estructuras las cuales solo se pueden observar a nivel de microscopia electrónica de barrido (como las papilas genitales Fig. 5A) para las identificaciones a nivel de familias, género y especie. El uso de la combinación de los métodos taxonómicos con características morfológicas, bioquímicas y de biología molecular, ha modificado el sistema de clasificación primario. De acuerdo a Poinar (1979, 1983) el sistema de clasificación hasta 1998, Steinernematidae estaba dividido en 2 géneros Steinernema y Neoaplectana con un total de 21 especies. Heterorhabditidae tiene un género (Heterorhabditis) y 9 especies. Conforme se encontraban nuevas especies Akhurst en 1995 consideró que todavía existían algunos problemas en la taxonomía de los NEPs. Por ejemplo actualmente las nuevas especies se describieron basados en las características morfológicas y con una nula o mínima atención puesta sobre la bacteria simbionte. También existen diferencias entre el análisis morfológico y el análisis de biología molecular (De-Jun y col. 2001). Figura 4. Campos laterales mostrando 8 campos laterales (A) y 2 campos laterales (B) respectivamente.
INVURNUS, Vol. 11 No. 1 (2016): 27-36
Ciclo de vida
Típicamente una vez que el nematodo localiza al hospedero, lo penetra a través de las aberturas naturales como la boca, ano y/o espiráculos y en algunos casos a través de la cutícula. Una vez que esta en el hemoceloma del insecto regurgita o defeca la bacteria simbiótica especie-específica en la hemolinfa del insecto. La bacteria prolifera en el cuerpo del insecto y alcanza altas densidades, en este punto produce diversos compuestos antimicrobiales que suprimen el crecimiento de microorganismos antagónicos creando así un ambiente favorable para la reproducción y desarrollo del nematodo. La bacteria también auxilia en la muerte del insecto y en proveer nutrientes al nematodo. El insecto infectado muere en las siguientes 48-72 horas y el nematodo se alimenta de la bacteria simbiótica y de los tejidos del insecto (Koppenhofer y col. 2006). Conforme la infección progresa el tejido del hospedero es consumido por los nematodos y sus simbiontes. El infectivo juvenil (3er estadío), muda y pasa al 4to estadío juvenil y después se desarrolla en un adulto de primera generación (hembra o macho en el caso de Steinernema spp. o en un hermafrodita adulto en el caso de Heterorhabditis spp). Se producen de 1 a 3 generaciones en el cadáver del insecto y cuando el alimento escasea, o el espacio es limitante la bacteria simbiótica se reasocia al infectivo juvenil y este emerge del cadáver para buscar un nuevo hospedero en el suelo y repetir el ciclo. El numero de IJ producidos por insecto varía con la especie del nematodo y del hospedero (Herbert y col. 2007).
Figura 5. Macho de la Familia Steinernematidae, sin bursa y papilas genitales (A). Espículas (B).
Hasta hoy se han reconocido 8 familias de nematodos parásitos de insectos, las cuales son: Allantonematidae, Diplogasteridae, Mermithidae, Phaenopsitylenchidae, Sphaerularidae, Tetradonematidae, Heterorhabditidae y Steinernematidae. Los géneros Steinernema spp. y Heterorhabditis spp. son los más utilizados para controlar insectos plaga (García-Peña, 2009; Fernández y col. 1997); Ralf-Udo E. 2001; Smits, 1997).
Familia Steinernematidae
Son parásitos obligados de insectos, el infectivo juvenil está asociado a la bacteria simbiótica Xenorhabdus (= Achromobacter). La reproducción involucra machos y hembras. Algunos individuos de esta familia se usan en el control biológico por su alta virulencia y amplia gama de hospederos.
Familia Heterorhabditidae
Son parásitos obligados de insectos. El infectivo juvenil (IJ) lleva en su intestino una bacteria simbiótica llamada Photorhabdus. Existen hembras hermafroditas (solo en la primera generación) y amfimícticas (reproducción sexual). Heterorhabditis bacteriophora es la especie tipo de esta familia. Existen 8 especies descritas y actualmente se continúa descubriendo nuevas especies (Alatorre-Rosas, 2007; Koppenhofer y col. 1995).
Figura 6. La cola del infectivo juvenil (IJ) es conoide o filiforme.
Flores Lara y col., Potencialidad y Retos del Uso de Nematodos Entomopatógenos para el Control Biológico de Plagas El IJ es el único estadío en el ciclo del NEP donde el
nematodo está libre en el suelo y no se alimenta. En un medio ambiente húmedo mediante el uso de una película de agua los NPSs pueden moverse verticalmente y horizontalmente y buscar su hospedero para penetrarlo. Los infectivos juveniles pueden esperar a su hospedero en el mismo sitio (como cuando se pone una emboscada), también pueden salir a buscarlo activamente (“los buscadores”) o bien presentar una modalidad intermedia entre las dos primeras. Los IJ que esperan a su presa se encuentran cerca de la superficie del suelo y generalmente atacan a insectos móviles. Estos nematodos levantan su cuerpo del substrato (“nictación”) y saltan hacia las señales volátiles asociadas al hospedero cuando este pasa cerca de ellos. Los buscadores generalmente los encontramos a mayores profundidades del suelo y atacan más efectivamente a los hospederos sedentarios ya que se mueven hacia las señales asociadas con el hospedero. La selección natural probablemente favorece los IJs que son capaces de evaluar la condición del hospedero potencial antes de la invasión, ya que los infectivos juveniles que se encuentran con hospederos sanos deben superar el sistema inmunológico y los mecanismos de defensa del insecto para establecer una infección. Cuando se encuentran con un hospedero que ya está infectado, la edad de la infección puede ser un factor que puede afectar la pertinencia del hospedero, ya que un infectivo juvenil que llega al hospedero recién iniciada la infección, dispone de más recursos mientras que el que invadió una vez muerto el hospedero cuenta con recursos muy limitados. Otros factores que pueden afectar la pertinencia
Figura. 8. Ciclo de vida de los nematodos Entomopatógenos
Figura 7. Diente dorsal (A) de los infectivos juveniles del genero Heterorhabditis spp. (ayuda a penetrar al interior del insecto hospedero por las membranas inter segméntales).
del hospedero incluyen compuestos vegetales consumidos por el hospedero y la competencia heteroespecífica (Fig. 8) (Kunkel y col. 2006; Smits, 1997).
Las especies de Steirnernema se presentan más comúnmente en el suelo y tienen una mayor persistencia después de su aplicación. A diferencia de estos Heterorhabditis tiene menor persistencia pero mayor movilidad y es más activo en la búsqueda de su hospedero. El color del cuerpo del hospedero ya infectado es indicativo de los pigmentos producidos por el monocultivo de la bacteria mutualista que está creciendo dentro del cadáver (Nastaran y col. 2012). Los Steinernematidos provocan cadáveres color ocre, amarillo-café, o negro sin luminiscencia en la obscuridad. Por otro lado los heterorhabditidos producen cadáveres color rojo, rojo ladrillo, morado-anaranjado con luminiscencia en la obscuridad (Kaya y Stock 1997).
Género Steinernema
Los nematodos entran al insecto como tercer estadío larvario o infectivo juvenil, se alimentan y pasan al cuarto estadío y luego se transforman en adultos hembras y machos de la primera generación. Estos adultos copulan y las hembras ovipositan sus huevecillos, los cuales eclosionan y pasan de nuevo por los 4 estadíos larvarios para convertirse en adultos de la segunda generación. Como se mencionó anteriormente normalmente ocurren de 2 a 3 generaciones y esto depende de la cantidad de alimento que proporciona el hospedero. Cuando se acaba el alimento del cadáver del insecto, el segundo estadío juvenil deja de alimentarse e incorpora una cantidad de bacterias en su esófago, luego muda a un pre-estadío infectivo manteniendo la cutícula del segundo estadio juvenil, quedando una doble cutícula la cual actúa como un armazón protector. Este juvenil infectivo sale del cadáver del hospedero en busca de un
INVURNUS, Vol. 11 No. 1 (2016): 27-36 nuevo insecto hospedero y puede sobrevivir en el suelo por
varios meses.
Género Heterorhabditis
El ciclo biológico de este género es similar al de Steinernema spp., pero en la primera generación los adultos son solo hembras son hermafroditas. La segunda generación se da por reproducción sexual, es decir hay hembras y machos. La bacteria simbiótica asociada a este género es Photorhabdus sp. (Adams y col. 2002; Stuart y col. 1994; Smits, 1997). Los NEPs pasan de nuevo al primer, segundo, tercer y cuarto estadío juvenil y finalmente se convierten en adultos. Como ya se mencionó antes, el tercer estadío juvenil es la forma infectiva y puede vivir fuera del cuerpo del hospedero (llamado también dauer juvenil) (Ralf-Udo E. 2001; Cabello, 2006; De-Jun y col. 2001).
Los IJ entran al hemocele del insecto a través de aberturas naturales como boca, ano y espiráculos y en el caso de Heterorhabditis spp. también puede entrar a través de la cutícula. Una vez dentro del insecto los NEPs regurgitan su bacteria simbionte ( a diferencia del genero Steinernema spp. que defeca la bacteria). La bacteria simbionte es responsable de la muerte del insecto, el nematodo se alimenta del insecto y de las bacterias. Las bacterias producen antibióticos en contra de invasores secundarios. Los nematodos completan su desarrollo y pasan de dos a tres generaciones dentro del insecto hospedero. Cuando el alimento obtenido del huésped es limitante, los IJ abandonan el cadáver en busca de nuevos hospederos (De-Jun y col. 2001; Stuart y col. 2005; Smits, 1997). A temperatura ambiente, el ciclo de vida de la mayoría de los steinernematidos dura entre siete a diez días, mientras que en el caso de los heterorhabditidos tiene una duración de 12 a 15 días (Kaya y col. 1993) (Fig. 8).
Simbiosis NEP-Bacteria
La relación nematodo/bacteria fue aludida por primera vez por Bovien y Dutky en 1937, pero no fue ampliamente apreciada. En 1959 Dutky aclaró ciertas características de la asociación incluyendo la existencia de antibióticos producidos por la bacteria. Esta asociación fue nuevamente estudiada pero con más detalle por Poinar y Thomas (entre 1965 y 1967) y fueron incluidas en el género Achromobacter el cual se convirtió en Xenorhabdus (1979) por Thomas y Piner (Kaya y col. 1993). Los NEPs del género Steinernema y Heterorhabditis se asocian simbióticamente con bacterias patogénicas de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus respectivamente, los cuales pertenecen a la familia Enterobacteriaceae (Shapiro-Ilan y col. 2012).
El término entomopatógenos (EP) apareció en la literatura de nematología al referirse a las bacterias simbióticas de Steinernema y Heterorhabditis. Las bacterias son consideradas EP cuando su dosis letal 50 (LD50) es menor de 10,000 células introducidas en el hemocele. Algunos EP asociados a estos dos géneros tienen una LD50 menor de 10 células introducidas, pero esto varía de acuerdo al tipo de hospedero, además se sabe que estas bacterias no infectan los insectos sin la ayuda de su nematodo simbiótico (Dillman y col. 2012).
De las relaciones existentes en la naturaleza entre insectos y nematodos, la patogénica es característica de una alta especialización. Estudios taxonómicos confirman que cada especie de NEP tiene una asociación natural específica con una sola especie de Xenorhabdus o Photorhabdus (aunque la bacteria puede estar asociada con más de una especie de nematodos). La especificidad de esta asociación opera a 2 niveles: la suplementación de nutrientes esenciales para el nematodo por la bacteria y la retención de la bacteria dentro del intestino del IJ (Kaya y col. 1993).
El nematodo provee a la bacteria de protección contra el medio ambiente externo y también le da protección contra la respuesta inmunológica del hospedero. Igualmente el nematodo es un medio de transporte para la bacteria del cadáver del insecto al hemoceloma de un nuevo hospedero. La contribución de la bacteria en esta asociación es la de proveer de nutrientes al nematodo. Un nematodo axénico no puede reproducirse en un insecto axénico, es decir se necesita de la presencia de actividad bacteriana para producir condiciones nutricionales adecuadas. Las bacterias simbióticas pueden reproducirse por ejemplo en Galleria mellonella infectada con otra bacteria diferente a Xenorhabdus, pero no se reproducen en forma tan prolifera como cuando Xenorhabdus domina la flora del cadáver (Akhurst y col. 1990).
El genero Xenorhabdus spp. es una bacteria móvil, gram negativa, tiene forma de varilla, es anaeróbica facultativa y pertenece a la familia Enterobacteriaceae al igual que Photorhabdus luminescens. Esta ultima previamente llamada Xenorhabdus luminescens, es bioluminiscente, produce toxinas como la TcA (complejo de proteínas insecticida de alto peso molecular). Es tóxica para los insectos vía oral. presenta doble fenotipo o dimorfismo (fase primaria y fase secundaria). Las 2 fases tienen diferentes características para colonizar. La fase primaria fue aislada del cuerpo de infectivos juveniles y frecuentemente cambia a secundaria por la inestabilidad en cultivos fuera del insecto. La fase primaria y secundaria difieren en la morfología de la colonia, excreción de pigmentos, absorción de azul de bromofenol, rojo de metilo, glutinosidad, etc., pero no hay diferencia en las toxinas. La bacteria tipo primario es bioluminiscente, produce proteasas extracelulares, lipasa extracelular,
Flores Lara y col., Potencialidad y Retos del Uso de Nematodos Entomopatógenos para el Control Biológico de Plagas antibióticos, cristales de proteínas intracelulares, absorbe
ciertos colorantes. A diferencia del tipo secundario, que no produce estas substancias (por lo que el medio debe ser inoculado con la bacteria simbiótica en fase primaria para la reproducción masiva), la fase primaria soporta muy bien la propagación in vitro de los nematodos.
La familia Heterorhabditidae tiene una mayor dependencia a la bacteria simbiótica. No se puede cultivar in-vitro y no puede matar al insecto sin la presencia de la bacteria simbiótica, mientras que Steinernematidae se puede cultivar in-vitro, pero su habilidad reproductiva y patogénica disminuye. Los NEP pueden digerir y usar la bacteria simbiótica, pero los IJ no la digieren, su relación mutualística es cercana y es una simbiosis obligada (De-Jun y col. 2001). Un NEP efectivo debe evadir o dañar el mecanismo de defensa del insecto. Después de ser infectado, la hemolinfa del hospedero inicia varios mecanismos de defensa. Inicialmente las células del hospedero resisten la etapa inicial de la bacteria simbionte por un periodo de 3 a 12 horas. Pasadas las 24 horas comienza a reproducirse en los principales órganos del insecto y a causar daño.
La bacteria simbiótica no puede causar la muerte del hospedero por vía oral, ya que actúa sobre la hemolinfa. Existen diferencias en virulencia de la bacteria simbiótica ya que las diferentes especies de hospederos tienen diferentes reacciones. Las bacterias simbióticas pueden producir endotoxinas y exotoxinas durante su periodo de crecimiento. Las endotoxinas son polisacáridos de la pared celular, que pueden estimular la degradación de la hemolinfa del hospedero. La exotoxina es una exoenzima celular, cuya toxicidad hacia el insecto no ha sido verificada (De-Jun y col. 2001; Smits, 1997).
Referencias Bibliográficas
Adams, B.J. and Nguyen, K.B. 2002. Taxonomy and systematics. In: Entomopathogenic Nematology. R. Gaugler (Ed.) p. 373 CABI Publishing. Wallingford Oxon, U.K.
Akhurst R.J. and Boemare N.E. 1990. Biology and Taxonomy of Xenorhabdus in Entomopathogenic nematodes in Biological Control. R. Gaugler and H.K. Kaya (eds.) CRC Press. Florida USA 365 pp.
Alatorre-Rosas, R. 2007. Nematodos parásitos de insectos en Microbiología Agrícola. R. Ferrera-Cerrato y A. Alarcón (eds.) Editorial Trillas, S. A. de C. V., México, D.F. 416-421
Barbercheck M.E., Wang J. and Brownie C. 2003. Adaptation of the entomopathogenic nematode, Steirnernema carpocapsae to insect food plant. Biological control 27:81-84.
Bustillo, A.E., 1976. Patogenicidad del Nematodo Neoplectana
carpocapsae en Larvas, Prepupas y Pupas de Oxydia
trychiata. Revista Colombiana de Entomología 2(4):
139-144.
Cabello, T. 2006. Nematodos entomopatógenos en Tema 6 en Entomopatógenos y sus características. www.ual.es/ personal/tcabello/Temarios/CBTema06Web.pdf Fecha de consulta 30 de agosto 2015.
Curran J. 1993. Post application biology of entomopathogenic Nematodes in soil in Nematodes and the Biological Control of Insect Pests. R. Bedding. R. Akhurst and H. Kaya (eds.) CSIRO Melbourne Australia 178 pp.
Cuthbertson A.G.S., Head J., Walters K.F.A., Gregory S.A. 2003. The efficacy of the entomopathogenic nematode,
Steinernema feltiae, against the immature stages of Bemisia tabaco. Journal of Invertebrate Pathology 83:267–269.
De-Jun H., Zhen-Huan G., Qian Z. and Hua L. 2001. Advance of Entomopathogenic Nematodes. Journal of Forestry Research, 12(4): 257-262.
Didem S.G., Keskin N. and Hazir S. 2006. Ecological characterization of Steinernema anatoliense (Rhabditida: Steinernematidae) Journal of Invertebrate Pathology 92:39–44.
Dillman, A.R., Chaston, J.M., Adams, B.J., Ciche, T.A., Goodrich-Blair, H., Stock, S.P., Sternberg, P.W. 2012. An Entomopathogenic Nematode by Any Other Name. PLoS Pathogens 8(3): 1-4.
Dillman, A.R. and Sternberg, P.W. 2012. Entomopathogenic Nematodes. Current Biology 22(11): 430-431.
Dolinski C., Choo H.Y., Duncan L.W. 2012. Grower Acceptance of Entomopathogenic Nematode: Case Studies on three Continents. Journal of Nematology 44 (2): 226-235.
Fernández, E., Arteaga, E. y Pérez M., 1997. Utilización de los nematodos entomopatógenos en el control de plagas agrícolas. Laboratorio de nematología INISAV, la Habana Cuba. 1-8 Dir. www.aguascalientes.gob.mx/codagea/ produce/NEMA-ENT.htm Fecha de consulta 30 agosto 2015.
Flores-Lara Y., Renneckar D., Forst S., Goodrich-Blair H., Stock S.P. 2007. Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacteria vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae)) Journal of Invertebrate Pathology 95(2): 110-118.
García-Peña, J.M., 2009. Nematodos Entomopatógenos y Hongos del suelo con Potencial Antagónico a Nematodos Entomopatógenos Asociados a Cítricas. Tesis de Maestría. Universidad de Puerto Rico. Recinto de Mayagüez, Puerto Rico.
Herbert E.E. and Goodrich-Blair H. 2007. Friend and foe: two faces of Xenorhabdus nematophila Nature 5:634-646.
INVURNUS, Vol. 11 No. 1 (2016): 27-36 Hunt J.D. 2007. Early beginnings: of dragons and serpents in
Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts Vol 5. K.B. Nguyen and D.J. Hunt (eds.) Brill Academic Publishers. The Neatherlands .
Kaya K.H., Bedding R.A. and Akhurst R. J. 1993. An overview of Insect-Parasitic and entomopathogenic Nematodes in Nematodes and the Biological Control of Insect Pests R. Bedding. R. Akhurst and H. Kaya (eds.) CSIRO Melbourne Australia.
Kaya H.K. and Stock S.P. 1997. Techniques in insect nematology in Manual of techniques in insect pathology. L.A. Lacey (ed.) Academic Press. San Diego, USA. Koppenhofer A.M., Kaya H.K. and Taormino S.P. 1995.
Infectivity of Entomopathogenic Nematodes Rhabditida: Steinernematidae. Journal of Invertebrate Pathology. 65: 193-199.
Koppenhofer M.A. and Fuzy E.M. 2006. Effect of soil type on infectivity and persistance of the entomopathogenic nematodes Steinernema scarabai, Steinernema glaseri, Heterorhabditis zealandica and Heterorhabditis bacteriophora Journal of invertebrate Pathology 92:11-22.
Kunkel B.A., Shapiro-ILan D.I., Campbell J.F. and Lewis E.F. 2006. Effect of Steinernema glaseri-infected host exudates on movement of cospecific infective juveniles. Journal of Invertebrate Pathology 93:42-49.
Kyu Kim S., Flores-Lara Y. and Stock P. 2012. Morphology and ultraestructure of the bacterial recptacle in Steinernema nematodes (Nematoda: Steinernematidae). Journal of invertebrate Pathology 110: 366-374.
Martens E.C. and Goodrich-Blair H. 2005. The Stenernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus Nematophila associates during colonization initiation. Cellular Microbiology 7(12): 1723-1735.
Nastaran T., Arthurs S.P. and Giblin-Davis R.M. 2012. Entomopathogenic Nematodes (Nematoda: Rhabditida: families Steinernematidae and heterorhabditidae). IFAS Extension EENY-530 University of Florida Entomology and Nematology Department. Gainesville Florida.
Nguyen, K.B. and Smart, Jr. G.C., 1996. Identification of Entomopathogenic Nematodes in the Steinernematidae and Heterorhabditidae (Nemata: Rhabditida). Journal of Nematology 28 (3): 286- 300.
Ralf-Udo E. 2001. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiological Biotechnology 56:623-633.
Ramos-Rodríguez O., Campbell J.F., Ramaswamy S.B. 2006. Pathogenicity of three species of entomopathogenic nematodes to some major stored-product insect pests Journal of Stored Products Research 42:241–252. Rivera-Orduño B. 2005. Determinación de la presencia de
nematodos entomopatógenos y la factibilidad de su uso para el manejo de la chicharra cantadora en el cultivo del esparrago Asparagus oficinalis en la Región de Caborca. Tesis de Maestría. Universidad de Sonora, México. Selc uk H., Stock S.P, Kaya H.K, Koppenhöfer A.M., Keskin
N. 2001. Developmental temperature effects on five geographic isolates of the entomopathogenic nematode Steinernema feltiae (Nematoda: Steinernematidae) Journal of Invertebrate Pathology 77: 243–250.
Shapiro-Ilan D.I., Richou H. and Dolinski C. 2012. Entomopathogenic nematode production and application technology. Journal of Nematology 44(2): 206-217.
Shapiro-Ilan D.I., Stuart R. and McCoy C.W. 2003. Comparison of beneficial traits among strains of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, for control of Curculio caryae (Coleoptera: Curculionidae) Biological Control 28:129–136.
Smits, P.H., 1997. Insect Pathogens: their suitability as biopesticides in Microbial Insecticides: Novelty or Necessity. Presented BCPC Symposium Proceedings Number. UK 68: 26-28.
Stuart R.J., Barbercheck M.E., Grewal P.S., Taylor R.A.J., Hoy C.W. 2005. Population biology of entomopathogenic nematodes: Concepts, issues, and models. Biological Control 38:80-102.
Stuart R.J. and Gaugler R. 1994. Patchiness in Populations of Entomopathogenic Nematodes. Journal of invertebrate pathology 64:39- 45.
