α-AMILASA SALIVA
Determinaciσn enzimαtica de la α-AMILASA en la saliva.
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REF
DKO075USO PREVISTO
El kit α-Amilasa Saliva es un ensayo cinético colorimétrico para la determinación cuantitativa de amilasa en la saliva.
1. SIGNIFICADO CLÍNICO
La amilasa es el nombre que se da a las enzimas que hidrolizan el almidón. Están clasificadas como sacaridasas, enzimas que hidrolizan los polisacáridos.
Aunque existen distintas amilasas, indicadas mediante distintas letras griegas, todas actúan en enlaces α-1,4-glucosídicos.
Las α-amilasas son metaloenzimas, completamente incapaces de funcionar en ausencia de calcio.
La α-amilasa hidroliza los carbohidratos de cadena larga, en maltotriosa y maltosa desde la amilosa, o maltosa, glucosa y “dextrina límite” desde la amilopectina.
En los animales, es la principal enzima digestiva. Aunque se encuentra en muchos tejidos, la amilasa está presente principalmente en el jugo pancreático y en la saliva, cada uno de los cuales presenta una isoforma distinta.
La amilasa salival hidroliza el almidón en maltosa y dextrina. Esta isoforma se denomina ptialina. La ptialina actúa sobre las moléculas grandes e insolubles de almidón, transformándolas en almidones solubles (amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina) que posteriormente se dividen en almidones más pequeños y en maltosa. La ptialina actúa sobre los enlaces α(1,4) glucosídicos lineales, pero la hidrólisis completa requiere una enzima para hidrolizar enlaces ramificados. La amilasa salival se inactiva en el estómago por el ácido gástrico.
La α-amilasa pancreática hidroliza de forma aleatoria los enlaces α(1-4) glucosídicos de la amilosa liberando dextrina, maltosa o moléculas de glucosa.
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La amilasa humana cataliza la hidrólisis de 2-cloro-4 nitrofenil-α-maltotriosido (CNP-G3) en polímeros de glucosa y p-nitrofenil-oligosacáridos de cadena corta con formación de 2-cloro-4-nitrofenol (CNP).
El aumento de absorbancia se evalúa fotométricamente a 405 nm y es proporcional a la actividad de la amilasa presente en la muestra.
3. REACTIVOS, MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN
3.1. Reactivos y materiales suministrados en el kit
1. Reactivo A (1 frasco) 32 mL
CNP-G3 2 mmol/l, tampón de Good 100 mmol/l, estabilizantes y conservantes REF DCE042-0
2. Solución Tampón de ensayo 5x (1 frasco) 50 mL
Tampón Hepes 200 mM pH 7,4; BSA 0,5 g/l
REF DCE049/7549-1
3. Microplaca REF DMZ001-0
3.2. Reactivos necesarios no suministrados en el kit
Agua destilada.
3.3. Material e instrumentación auxiliares
Dispensadores automáticos. Lector de microplacas (405 nm)
Nota
Conservar todos los reactivos a 2÷8 °C, protegidos de la luz.
4. PRECAUCIONES
• Tras la apertura, los componentes del kit deben conservarse a 2÷8 ºC protegidos de la luz y no deben usarse después de la fecha de caducidad. • Este kit solo debe usarse para diagnóstico in vitro.
• Evitar el contacto con reactivos que podrían ser tóxicos si se ingieren. No utilizar la pipeta con la boca.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación del tampón de ensayo
Diluir el frasco completo de tampón de ensayo conc. 5x en 200 mL de agua destilada o desionizada. LOT
Mantener a 2÷8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del frasco
5.2. Preparación de la muestra
Para la obtención de la muestra se recomienda usar tubos de vidrio de centrífuga y una cánula de plástico.
Hacer fluir la saliva a través de la cánula hasta el tubo de vidrio, congelarla y descongelarla para favorecer la precipitación de las mucinas. Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 3000 rpm.
No usar tubos de plástico o dispositivos disponibles en el mercado, ya que podrían alterar el resultado analítico.
Diluir el líquido sobrenadante 10 µl a 1 mL con tampón de ensayo diluido (reactivo 2). Mezclar con cuidado dejando al menos 5 minutos en el agitador giratorio.
Si la dosificación no se realiza el mismo día de la extracción, conservar la muestra a -20 °C.
5.3. PROCEDIMIENTO
Esperar hasta que todos los reactivos se encuentren a temperatura ambiente (22÷28 °C).
En caso de que se deba dispensar manualmente un número elevado de muestras, se recomienda cargar un máximo de cuatro tiras a la vez.
Preparar los pocillos de la microplaca para cada muestra que se vaya a analizar. Volver a colocar las tiras que no se utilicen en la bolsa.
Muestra Blanco
Muestra diluida 10 μL
---Agua destilada --- 10 μL
Reactivo A 300 μL 300 μL
Incubar a 37°C durante 3 min inmediatamente después de la dispensación de los reactivos.
Al final de la incubación, colocar la microplaca en el lector a temperatura ambiente (22-28°C) y leer la variación de absorbancia (ΔA) a 405 nm dos veces, la primera vez tras 1 minuto y la segunda tras 5 minutos del final de la incubación, restando a cada lectura la absorbancia del blanco.
6. CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe analizar las muestras a niveles de los rangos bajo, medio y alto de α-amilasa para supervisar el rendimiento del análisis. Estas muestras deben tratarse como desconocidas y los valores deben determinarse en cada ensayo realizado. Se deben mantener los gráficos de control de calidad para seguir el rendimiento de los reactivos suministrados. Se deben emplear métodos estadísticos adecuados para determinar las tendencias. El laboratorio debe establecer los límites de aceptabilidad del rendimiento del análisis. Una
desviación significativa del rendimiento establecido puede indicar un cambio inadvertido en las condiciones experimentales o la degradación de los reactivos del kit. Se deben usar reactivos frescos para determinar la causa de las variaciones.
7. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 7.1. Rendimiento del análisis
Es importante que el tiempo de reacción de cada pocillo sea el mismo para obtener resultados reproducibles. Los lectores de microplacas miden las DO verticalmente. No tocar el fondo de los pocillos.
8. RESULTADOS
Calcular ΔA/Min.= [(A5 min –A1 min) / 4]
Cαlculo: α-amilasa (U/mL): ∆A/min x TV x DF MMA x SV x LP Donde:
ΔA/Min = diferencia de absorbancia por minuto TV = volumen total del ensayo (0,310 mL) DF = factor de dilución
MMA = coeficiente de absorción (absorbancia) milimolar del 2-cloro-p-nitrofenol (12,9)
SV = volumen de la muestra (0,010 mL)
LP = recorrido óptico en centímetros = 0,95 (específico para la microplaca recibida con el kit) ΔA/min x 0,310 x 100 = ΔA/min X 253 = U/mL(*)
12,9 x 0,010 x 0,95
(*)
= actividad de α-amilasa en la muestra Nota:
la microplaca suministrada con el kit no está tratada químicamente y su uso está previsto como recipiente de reacción. De forma alternativa, la reacción podría realizarse en un recipiente distinto (por ejemplo, en cubetas para espectrofotometría) y, por lo tanto, es importante determinar el recorrido óptico (LP) justo o la distancia recorrida por la radiación luminosa a través de la muestra; en general, para las cubetas estándar es de 1 cm.
9. VALORES DE REFERENCIA
Adultos (normales) 80,0 U/mL Rango absoluto: 4 – 400 U/mL
10. PARÁMETROS CARACTERÍSTICOS 10.1. Precisión
10.1.1. Intraensayo
La variabilidad dentro del mismo kit se ha determinado replicando (16x) la determinación de dos muestras de saliva distintas. La variabilidad intraensayo es de < 1,5 %.
10.1.2. Interensayo
La variabilidad entre distintos kits se ha determinado replicando la determinación de tres muestras de saliva distintas con dos kits pertenecientes a lotes distintos. La variabilidad interensayo es de < 1,5 %.
10.2. Sensibilidad
La concentración mínima de α-amilasa medible es 2,5 U/mL con un límite de confianza del 95%.
10.3. Correlación
El kit α-Amilasa (Diametra) se ha comparado con un kit similar disponible en el mercado.
La curva de regresión es: y = 1,19 x + 2,55
r = 0,998 (r2 = 0,996)
11. DISPOSICIONES PARA LA ELIMINACIÓN
Los reactivos deben eliminarse de acuerdo con las leyes locales.
BIBLIOGRAFÍA
- Tietz NW. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. Philadelphia: WB Saunders Company: 46-49 (1995) - (IFCC) “Approved Recommendation on IFCC Methods
for the measurement of catalytic concentration of Enzymes” _Part 9
- Clin Chem Lab Med 36(3): 185 –203 (1998)
Ed 04/2010 DCM075-2
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 – 20090 SEGRATE (MI) Tel. 0039-02-2139184 – 02-26921595 – Fax 0039–02–2133354.
Manufact: Via Giustozzi 35/35a – Z.I Paciana – 06034 FOLIGNO (PG) ITALY. Tel. 0039-0762–24864
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Mod. PIS
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Spiegazione dei simboli Explanation of symbols Explication des symboles Significado de los símbolos Verwendete Symbole Explicaçao dos simbolos
DE ES FR GB IT PT In vitro Diagnostikum
Producto sanitario para diagnóstico in vitro Dispositif medical de diagnostic in vitro In vitro Diagnostic Medical Device Dispositivo medico-diagnostico in vitro Dispositivos medicos de diagnostico in vitro DE ES FR GB IT PT Hergestellt von Fabricante Fabriqué par Manufacturer Produttore Produzido por REF DE ES FR GB IT PT Bestellnummer Número de catálogo Réferéncès du catalogue Catalogue number Numero di Catalogo Número do catálogo yyyy-mm DE ES FR GB IT PT Herstellungs datum Fecha de fabricación Date de fabrication Date of manufacture Data di produzione Data de produção yyyy-mm-dd DE ES FR GB IT PT Verwendbar bis
Estable hasta (usar antes del último día del mes) Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué) Use by (last day of the month)
Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese) Utilizar (antes ultimo dia do mês)
DE ES FR GB IT PT Biogefährdung Riesgo biológico Risque biologique Biological risk Rischio biologico Risco biológico DE ES FR GB IT PT Gebrauchsanweisung beachten Consultar las instrucciones de uso Consulter le mode d’emploi Consult instructions for use Consultare le istruzioni per l’uso Consultar instruções para uso DE ES FR GB IT PT Chargenbezeichnung Código del lote Numero de lot Batch code Codice del lotto Codigo do lote Σ = xx DE ES FR GB IT PT Ausreichend für “n” Tests
Contenido suficiente para ”n” ensayos Contenu suffisant pour “n” tests Contains sufficient for “n” tests Contenuto sufficiente per “n” saggi Contém o suficiente para “n” testes DE ES FR GB IT PT Inhalt
Contenido del kit Contenu du coffret Contents of kit Contenuto del kit Conteúdo do kit Max Min DE ES FR GB IT PT Temperaturbereich Límites de temperatura
Limites de température de conservation Temperature limitation
Limiti di temperatura
Temperaturas limites de conservação
Cont. IT GB FR PT ES DE
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Mod. PIS
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SUGERENCIAS PARA LA SOLUCIÓN DE PROBLEMAS/TROUBLESHOOTING
ERROR / POSIBLES CAUSAS / SUGERENCIAS
No se produce ninguna reacción colorimétrica del ensayo
- no se ha dispensado el reactivo A
- contaminación del reactivo A
- errores en la ejecución del ensayo (p. ej., dispensación accidental de los reactivos procedentes de
frascos equivocados, etc.)
Reacción escasa (DO demasiado bajas)
- reactivo A no idóneo (p. ej., no procedente del kit original)
- tiempo de incubación demasiado corto, temperatura de incubación demasiado baja
Reacción demasiado intensa (DO demasiado altas)
- reactivo A no idóneo (p. ej., no procedente del kit original)
- tiempo de incubación demasiado largo, temperatura de incubación demasiado alta
Valores inexplicablemente fuera de escala
- contaminación de pipetas, puntas o contenedores, CV% intraensayo elevado
- los reactivos y/o tiras no se encontraban a temperatura ambiente antes del uso
- condiciones de incubación no constantes (tiempo o temperatura)
- dilatación de los tiempos de dispensación
- variación en función de los operadores
ERROR POSSIBLE CAUSES / SUGGESTIONS
No colorimetric reaction
- no Reagent A pipetted
- contamination of Reagent A
- errors in performing the assay procedure (e.g. accidental pipetting of reagents from the wrong
vial, etc.)
Too low reaction (too low ODs)
- incorrect Reagent A (e.g. not from original kit)
- incubation time too short, incubation temperature too low
Too high reaction (too high ODs)
- incorrect Reagent A (e.g. not from original kit)
- incubation time too long, incubation temperature too high
Unexplainable outliers
- contamination of pipettes, tips or containers, CV% too high within-run
- reagents and/or strips not pre-warmed to room temperature prior to use
-
