APLICACIONES DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR II

Texto completo

(1)

A

PLICACIONES

DE

B

IOQUÍMICA

Y

B

IOLOGÍA

M

OLECULAR

II

“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(es) de

carbohidratos en maíz”

Giovanna Paulina Aguilera Alvarado Tutor: Dra. Sobeida Sánchez Nieto Departamento de Bioquímica Facultad de Química

(2)
(3)

C

LONACIÓN

MOLECULAR

.

La clonación molecular se refiere a los procesos mediante los cuales moléculas de DNA recombinante son

producidos y transferido a un organismo hospedero en el cual serán replicadas.

https://www.neb.com/~/media/NebUs/Files/Brochures/Cloning_Tech_Guide.pdf http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi Embrión de maíz

Se necesitaba un molde…

24h

RNA

Transcripción reversa

cDNA

TRIzol

5’UTR

ORF

3’UTR

Mucha similitud

Diseño de primers

¡PCR!

Adenilación

y ligación Miles copias del cDNA de las HXKs de maíz Transformación

y secuenciación

HXKs

aisladas

(4)

T

ECNOLOGÍA

G

ATEWAY

®

.

Esta tecnología usa el sistema de recombinación del fago lamba para facilitar la transferencia de secuencias de DNA heterólogo (flanqueado por los sitios att) entre diferentes vectores. Se basa en dos reacciones de recombinación.

Reacción BP

BP clonasa® KanR KanR

Reacción LR

gen gen Vector donador Clona de entrada gen Clona de entrada KanR AmpR Vector destino Clona de expresión gen AmpR KanR Subproducto LR clonasa® https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/cloning/gateway-cloning/gateway-technology.html

(5)

C

ARACTERIZACIÓN

CINÉTICA

(6)

INDUCCIÓN: Liberación de la represión de los genes.

P

RODUCCIÓN

DE

PROTEÍNA

RECOMBINANTE

.

BL21 (DE3) Codon Plus RIL (pET-DEST42 Gateway: V5, 6X His).

Inducción con IPTG RNA pol E. coli

lacI lacI RNA pol T7 RNA pol T7 lacI lacI RNA pol T7 Gen de interés Inducción con IPTG

pEXP42

Genoma de E. coli BL21 (DE3)

ptRNAR

ptRNAI

ptRNAL

Probar diferentes condiciones:

o

Temperatura

o

Tiempo de inducción

o

[IPTG]

o

Cepa

o

Tag

(7)

P

RODUCCIÓN

DE

PROTEÍNA

RECOMBINANTE

.

Resina Proteína-6His

ZmHXK

75 kDa 50 kDa

4

5

6

7

8

X No se produjo ZmHXK9.

X ZmHXK4, ZmHXK5 y ZmHXK6 insolubles, sin actividad de HXK.

AtHXK1 AtHXK2 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9 MEM* Citosol

¿Qué tienen en común?

*Membrana Externa Mitocondrial Balasubramanian et al., Plant Physiol (2007); Cheng et al., Biol Plantarum (2011); Cho et al., Plant Physiol (2009)

(8)

Templado en pGEM

®

-T Easy

ZmHXK5 ZmHXK5Δ30

 Se produjo ZmHXK9Δ1-30

 ZmHXK4Δ1-30, ZmHXK5Δ1-30, ZmHXK6Δ1-30 y ZmHXK9Δ1-30 solubles, con actividad de HXK.

75 kDa 50 kDa

4Δ30 5Δ30 6Δ30

7

8

9Δ30

ZmHXK

V

ARIANTES

SIN

N-

TERMINAL

.

Diseño de primer 5’

Eliminemos la región hidrofóbica, la PCR es nuestra amiga…

ZmHXK5 ZmHXK5 sin la región hidrofóbica

(9)

M

EDICIÓN

DE

LA

ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA

.

Existen diversas maneras de medir la actividad de una enzima: cuantificando la desaparición del sustrato, la

aparición del producto o mediante un ensayo acoplado.

y = 0.1435x + 0.2075 R² = 0.9998 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 A bs 3 4 0nm Tiempo (min)

Curva temporal de actividad de HXK

(10)

Substrate

Glucose Fructose Mannose ATP

ZmHXK4Δ30 Km (µM) 195.70 ± 31.96 19324.15 ± 3914.89 138.85 ± 22.42 134.90 ± 25.74 Vmax 5.65 ± 0.12 kcat ZmHXK5Δ30 Km (µM) 136.65 ± 20.01 30216.8. ± 5708.76 119.55 ± 33.30 135.60 ± 11.46 Vmax 4.55 ± 0.34 kcat ZmHXK6Δ30 Km (µM) 65.86 ± 15.19 4291.84 ± 1410.04 48.85 ± 1.06 198.85 ± 12.80 Vmax 3.60 ± 0.14 kcat ZmHXK9Δ30 Km (µM) ND ND ND ND Vmax ND kcat ND ZmHXK7 Km (µM) 108.10 ± 17.96 2701.85 ± 590.93 123.79 ± 11.61 28.74 ± 0.30 Vmax 27.19 ± 0.77 kcat ZmHXK8 Km (µM) 4687 ± 299.53 ND 10396.50 ± 54.31 147.20 ± 62.08 Vmax 17.38 ± 0.24 kcat

(11)

O

BTENCIÓN

DE

PARÁMETROS

CINÉTICOS

.

Inhibitor ADP NAG G6P IC50 (mM) ZmHXK4Δ30 0.71 ± 0.15 52.14 ± 16.42 47.49 ± 2.89 ZmHXK5Δ30 0.69 ± 0.15 46.80 ± 1.82 47.46 ± 1.44 ZmHXK6Δ30 0.72 ± 0.14 25.15 ± 2.25 53.54 ± 2.48 ZmHXK9Δ30 ND ND ND ZmHXK7 6.47 ± 1.14 15.01 ± 3.24 NS ZmHXK8 3.12 ± 1.14 37.54 ± 1.63 NS ND: Non detected NS: Non significance

Sin actividad.

¿Plegamiento incorrecto?

¿Sistema heterólogo

inadecuado?

(12)

C

ARACTERIZACIÓN

CINÉTICA

(13)

E

NSAYO

DE

COMPLEMENTACIÓN

EN

S. cerevisiae

.

La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado, investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos.

Eason, PNAS (2004); https://es.wikipedia.org/wiki/Gen%C3%A9tica_inversa

¿Cómo se obtiene una mutante de

S. cerevisiae

?

Deleción

Ronda 1 PCR Homología con el gen de interés Homología con el gen de interés Primer de homología Primer de homología Templado 2 Ronda 2 PCR Cassette de deleción La levadura perdió un gen pero adquirió otro, en este caso uno que le permite crecer en presencia de Kan Confirmación por PCR Primer UPTAG Homología con el gen de interés Templado Resistencia

o prototrofía Primer DNTAG Homología

con el gen de interés

Inserción del cassete por recombinación homóloga

(14)

E

NSAYO

DE

COMPLEMENTACIÓN

EN

S. cerevisiae

.

JT 20088:

hxk1::HIS3 hxk2::LEU2 glk1::LEU2

, fondo genético W303-1a: No es capaz de crecer en presencia de

Glu ni en ausencia de uracilo.

pDRf1-GW: Alto número de copias, prototrofía a uracilo, gen de interés bajo un promotor constitutivo.

Transformación de la mutante con las diferentes HXKs de maíz: Método LiAc/SS DNA/ PEG.

JT 20088 Crece en

YPGal

Crecimiento hasta la fase

mid-log SSDNA LiAC

PEG DNA de interés Vórtex 42°C 40 min Siembra en medio selectivo 29°C, 2-3 días

SGal-URA

Gietz, Yeast Protocols (2014); http://2011.igem.org/Team:WashU/Notebook/Transformation

Crecimiento en presencia de diferentes hexosas.

(15)

E

NSAYO

DE

COMPLEMENTACIÓN

EN

S. cerevisiae

.

¿El extremo

N-terminal estará

afectando la

actividad

in vivo

?

(16)

Todas las versiones

truncas crecieron

mejor que las

versiones completas,

incluso

ZmHXK9Δ30.

(17)

C

ARACTERIZACIÓN

CINÉTICA

.

• ZmHXK4Δ30, ZmHXK5Δ30 and ZmHXK6Δ30: They have a smaller Km value for Man

followed by the Glc Km value, but the lower V

max

found is displayed with Man.

• The enzyme with the smallest Km for Glc was ZmHXK6Δ30. In addition, ZmHXK7 showed the

smallest Km for ATP and Fru, as opposed to ZmHXK8, whose Km for Fru was not possible to

estimate.

• The 30 amino acids at N-terminal not only make the proteins insoluble in

E. coli

, but also

modify their activity.

• ZmHXK9 has a minimal enzymatic activity sufficient to allow yeast growth in a medium

supplemented with Glc or Fru as carbon source. Therefore, ZmHXK4-9 must be considered as true

HXKs, even if ZmHXK9 shows a marginal enzymatic activity whose physiological relevance

remains uncertain.

(18)

R

ECORDANDO

EL

OPERON

LAC

lacI

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