UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA

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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

IZTAPALAPA

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Nombre: Karina Contreras Gómez

Matrícula: 201331236 Teléfono: (595) 9

53 33 52 Licenciatura: Biología

Experimental División: Ciencias

Biológicas y de Salud Unidad: Iztapalapa

Trimestre lectivo: 06

Título del Proyecto de Investigación:

"Collection, Distribution, Phenotyping, and Genotyping Directed towards Utilisation of Existing

Wheat Genetic Stocks to Enhance Tolerance/Resistance of Wheat Cultivars to Abiotic and Biotic

Stresses with Emphasis on Drought"

Título del trabajo de Servicio Social:

"Colaboración en la elaboración de dendogramas"

Asesores:

Dr. Masahiro Kishii

Cruzas Amplias

Programa de Recursos Genéticos

Cimmyt, Int.

M. en C. Fernando Díaz de León Sanchéz

Profesor titular "C" T.C. Laboratorio de Bioquímica, Biología Molecular y Fisiología

Vegetal S-253

Depto. Ciencias de la Salud. D.C.B.S. UAM-I

Lugar de realización:

Laboratorio de Cruzas Amplias, Laboratorio de Biotecnología, Programa de Recursos Genéticos,

Cimmyt, Int

Denominación

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Colaboración en la elaboración de dendogramas para el mejoramiento del trigo

Programa: Recursos Genéticos

Lugar de Realización: Lab. de Cruzas Amplias, Lab. de Biotecnología, Cimmyt, Int. Periodo de Realización: 27 de Enero del 2006 - 27 de Julio del 2006 Asesores:

· Dr. Masahiro Kishii, Cruzas Amplias, Programa de Recursos Genéticos Cimmyt, Int.

· M. en C. Fernando Díaz de León Sanchz, Profesor Titular C. TC, Departamento de Ciencias de la Salud, CBS, UAM-Iztapalapa

Introducción

La resistencia genética del trigo a factores abióticos como son: la sequía, el calor y la salinidad son de gran relevancia para la producción de trigo. Los pronósticos referentes a la disponibilidad de agua para la agricultura son desalentadores, siendo cada vez menores para este siglo en las áreas de mayor producción de trigo en países como Estados Unidos, China y Australia (Naciones Unidas, 2003). Este último país ha sido afectado en los últimos 10 años por 2 sequías, y debido a ello hubo una reducción del 50% de su producción de trigo, según los estudios del Banco Mundial de Trigo.

El trigo harinero (2n=6X=42) con los genomas: A, B, y D evolucionó hace 10.000 años aproximadamente y surgió de la hibridación natural entre el trigo tetraploide (2n=4X=28, AABB) y el antepasado del genomaD; Aegilops tauschi (2n=2X=14, DD) (Kilian B., et al. 2006). Este último se distribuye en Turquía Oriental, Irán, Afganistán, los países de Asia Central, de la antigua Unión Soviética, Pakistán y China Occidental. Crece en diferentes climas, inclusive en regiones secas con precipitación anual de 100 mm aproximadamente (Malik R et al, 2003) Dadas sus características es una especie con potencial para transferir sus características de resistencia a la sequía a especies de trigo a través de hibridaciones inducidas.

Los recursos genéticos de Ae. tauschi pueden ser utilizados para producir trigos sintéticos, es decir trigos artificiales obtenidos de la hibridación inducida entre trigos tetraploidesyAe. tauschii. El Centro Internacional de Mejoramiento del Maíz y Trigo (CIMMYT) en México ha producido trigos sintéticos desde 1980 y cuenta con cerca de 1.100 accesiones. Casi el 50% de los cultivos de trigo de escasa irrigación en CIMMYT han sido derivados de trigo sintético.

Se han identificado cerca de 60 accesiones sintéticas de trigo excelentes para la sequía, para el calor, o para salinidad. Sin embargo, la relación genética entre esas líneas no ha sido descifrada. Es importante saber si estas líneas poseen genes diferentes que las coloque en un nivel mas alto de resistencia a diversos tipos de estrés. Recientemente fueron desarrollados los marcadores SSR (secuencia sencilla repetida) de trigo y puede disponerse de gran parte de ellos. Los marcadores SSRs son una buena herramienta para analizar la diversidad genética dentro de una especie

Objetivo General

El objetivo de este estudio es realizar un análisis que permita establecer la relación filogenética entre trigos sintéticos así como sus ancestros Ae. tauschii por medio del uso de marcadores SSR (simple sequence repetitive) para definir posibles relaciones de resistencia en trigos sintéticos y para definir cuales son las mejores opciones de cruzas para el mejoramiento del trigo.

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Metodología:

Germinación. Se germinaron las siguientes 60 líneas de semillas de trigo en cajas petri para monitorear su desarrollo:

Sintético 22 Sintético 445 Ae. squarrosa 255

Sintético 30 Sintético 446 Ae. squarrosa 320

Sintético 36 Sintético 456 Ae. squarrosa 358

Sintético 60 Sintético 595 Ae. squarrosa 369

Sintético 231 Duro 1 Ae. squarrosa 418

Sintético 277 Duro 2 Ae. squarrosa 428

Sintético 341 Duro 12 Ae. squarrosa 458

Sintético 349 Duro 13 Ae. squarrosa 526

Sintético 351 Duro 14 Ae. squarrosa 536

Sintético 365 Duro 18 Ae. squarrosa 1025

Sintético 377 Duro 22 Ae. squarrosa 1027

Sintético 409 Duro 23 Ae. squarrosa 1030

Sintético 410 Duro 26 Leymus racemosus

Sintético 421 Duro 27 Chinese spring ph ph

Sintético 422 Duro 28 Leymus racemosus

Sintético 426 Duro 44 Thynopirum bessaracum

Sintético 428 Duro 51 OPATA ITM 133

Sintético 436 Ae. squarrosa 163 OPATA ITM 132

Sintético 442 Ae. squarrosa 205

Sintético 444 Ae. squarrosa 210

Sintético 445 Ae. squarrosa 213

Sintético 446 Ae. squarrosa 220

Sintético 456 Ae. squarrosa 224

Una vez germinadas las semillas, las plántulas se mantuvieron en invernadero sembradas en tierra.

Liofilización. Cuando la parte aérea de las plantas alcanzó un tamaño aproximado de 30 cm. se procedió a hacer la colecta. Se tomaron muestras de 10 a 15 cm de hojas sanas, éstas se colocaron en bolsas de plástico y se mantuvieron a -80° C hasta su procesamiento.

Las muestras congeladas se liofilizaron durante 4 días a -60° C.

Trituración. Se molieron las muestras liofilizadas y se colocaron en tubos previamente etiquetados y se mantuvieron a -20° C hasta la extracción de DNA.

Extracción de DNA. Se pesaron 700 mg de cada tejido vegetal liofilizado y se colocaron en tubos de polipropropileno de 15 ml. Se adicionaron 9 ml de Buffer de extracción CTAB a 65° C, se mezcló en el vortex y se mantuvo en agitación constante durante 1.5 horas a 65° C. Se dejó enfriar a temperatura ambiente. Posteriormente se colocaron 4ml de (24:1) cloroformo-octanol a cada tubo y se mezcló 10 minutos. Las muestras se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 minutos, se recuperó el sobrenadante en otro tubo de 15m1 y se adicionaron 4ml de (24:1) cloroformo-octanol, se mezcló vigorosamente por 10 min., se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos. Se colocaron 7ml del sobrenadante en otro tubo de 15m1 y se adicionaron 30µl de RNAsa (10mglml), se mezcló e incubó 30 min a 37° C, se adicionaron 4ml de isopropanol frío, se mezcló vigorosamente por inversión y se colocó a -80° C durante 30 min. El DNA precipitado se recuperó con un gancho.

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El DNA se colocó en un tubo de 5ml que contenía solución de lavado 1 y se mantuvo así durante 20 minutos después que se agitó. Se eliminó la solución de lavado 1 y se colocaron 2 ml de solución de lavado 2, se agito y posteriormente se recuperó nuevamente el DNA y se colocó en un tubo de 1.5 ml que contenía 1ml de TE. Se mantuvo en agitación toda la noche a temperatura ambiente y luego se guardó a -4° C.

PCR con distintos marcadores. Se preparó 1.5 mL de mezcla para PCR que contenía ddH2O, buffer taq IX, MgCI2 2mM, mezcla de dNTPs 50µM, primer 1 0.2 µM, primer 2 0.2µM, primer3 0.2µM, primer 4 0.2µM, primer 5 0.2µM, primer 6 0.2µM, primer 7 0.2µM, primer 9 0.2µM,

primer 10 0.2µM, primer 11 0.2µM, primer 12, primer 13 0.2µM, primer 14 0.2µM y 0.5 U. de enzima taq polimerasa.

EN 66 tubos se colocaron 25 µL de la mezcla y a cada uno de los diferentes tubos se les agregó 0.5 ng de DNA proveniente de cada una de las líneas de semillas, se mezclaron y centrifugaron, posteriormente se adicionaron 25 pL de aceite mineral ultra puro y se colocó en es termociclador con el siguiente programa de amplificación:

1 ciclo: 94° C por 1 minuto

25 ciclos: 94° C por 1 minuto, 55° C por 2 minutos, 728 C por 2 minutos. 1

ciclo: 72° C por 1 minuto.

Fingerprinting de DNA. Las muestras se corrieron en un gel de Bis-acrilamida (AA) 40 % en un secuenciador ABI prism y los resultados se analizaron en el programa PowerMarker (versión 3.25)

Actividades Realizadas:

· Colaboración en la germinación de las semillas, · Liofilización de las muestras,

· Trituración de las muestras, · Extracción del DNA, · PCR y fingerprinting Objetivos y metas alcanzadas

Se realizó el análisis que permitió establecer la relación filogenética entre trigos sintéticos por medio de la utilización de marcadores SSR (simple sequence repetitive).

Resultados y Conclusiones

Las 60 líneas de trigo sintético resistentes a sequía, salinidad, calor se analizaron con 14 marcadores de SSR específicos del genoma D. 46 de estas líneas fueron accesiones de Ae. tauschii de las cuales proviene la resistencia de los trigos sintéticos, de esta manera se esperaba obtener información geográfica ligada a los rasgos de resistencia. De las accesiones analizadas de Ae. Tauschii, 17 provienen de Irán, 6 líneas provienen de Afganistán, 2 de China, 1 de Uzbekistán y Pakistán y las 18 restantes tienen un origen desconocido.

En total se lograron amplificar 134 bandas, las cuales se localizaron entre 2 y 19 alelos por cada marcador individual.

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El dendograma del trigo sintético fue hecho con el software PowerMarker (ver 3.25). Fl árbol formó tres grupos: dos de ellos contienen principalmente de accesiones originarias de Irán y el otro contiene accesiones originarias de Afganistán y China.

Hay evidencias claras respecto a lo que se origina en Irán y lo que se origina en otras regiones. Se encontraron dos marcadores que producen bandas que permite hacer una distinción entre el origen Iraní y no Iraní. Las accesiones de Irán poseen una mayor diversidad que las no Iraníes.

Dado que la resistencia de los trigos sintéticos no se concentró en un grupo, en este estudio los rasgos de la resistencia no pueden predecirse por datos de ADN ni por datos geográficos.

Recomendaciones

No hay recomendaciones

Bibliografía:

· United Nations. Water for People, Water for Life: The United Nations World Water

Development Report (Hardcover), 2003. Editorial Unesco Publishing y Berghahn Books. i' Edición. París. 576 pp

· ESTUDIOSdel Banco Mundial de Trigo. Proyecto SICA.

http://www.sica.gov.ec/cadenas/trigo/docs/trígo200l/mercado%20mundíal/ínforme99.html · Kílían B., ózkan, Deusch O, Effgen S, Brandolíni E., Kohl J, Martín W and Salamíní F.

Independent Wheat B and G Genome Origins in Outcrossing Aegilops Progenitor Haplotypes, Mol Bíol Evol. 2006 24 (1):217-227

· Malík R., Smíth C., Brown-Guedíra G., Harvey T., and Bíkram S., Assessment of Aegilops tauschii for Resistance to Biotypes of Wheat Curl Mite (Acari: Eriophyidae). Journal of Economic Entomology 2003 96 (4):421-428

· Hoisington, D., Khairallah, M. and González de León, D. Laboratory protocols: CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory. 2001 Third Edition. México, D.F., 72 pp.

Firma de Asesores:

Dr. Masahiro Kishii Dr. Fernando Díaz de León Sánchez

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