INTEGRANTES INTEGRANTES
Burgos Tuñoque Stefany
Burgos Tuñoque Stefany
Diez Vazquez Sindy
Diez Vazquez Sindy
Farro Barbarán Rocio
Farro Barbarán Rocio
Gutierrez Armijos Leydi
Gutierrez Armijos Leydi
Lopez Ramirez Kelly
Lopez Ramirez Kelly
Practica 4: Método directo de
Practica 4: Método directo de
determinación de microorganismos
determinación de microorganismos
aerobios mesófilos viables
aerobios mesófilos viables
I.
Introducción
En diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el número de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante métodos de medida de la masa total celular, que generalmente es directamente proporcional al número de células, (métodos de determinación del peso, de la actividad del cultivo o métodos turbidimétricos) o por la determinación del número de células.
Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número “total” de
microorganismos:
1. Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables (entre las que se encuentran el método de la placa vertida, el de superficie y el de goteo).
2. Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables.
3. Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora.
4. Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para lasno viables.
El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número decélulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c) en un alimento.
Los recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores:
Método de muestreo utilizado
Distribución de los microorganismos en la muestra
Naturaleza de la micro flora del alimento
Naturaleza del alimento
Antecedentes del alimento
Adecuación nutricional del medio de cultivo
Temperatura y medio de incubación
pH,
aw, potencial de óxido
–
reducción del medio Tipo de diluyente utilizado
Número relativo de microorganismos en la muestra
Practica
Método directo de determinación de microorganismos
aerobios mesófilos viables
Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no puedenconsiderarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación.
El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de -34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos a) Los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura cuya temperatura:
psicrótofos
b) Los que crecen entre 20
–
30º C, con una temperatura óptima de crecimiento está entre 30–
40º C:mesófilos
c) Los que crecen por encima de los 45º C:
termófilos
En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presenciade flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar:
Excesiva contaminación de la materia prima
Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración
La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos
La inmediata alteración del producto
El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.
II.
Objetivos
Conocer los métodos para determinar el número de microorganismos viables Realizar un recuento de bacterias mesófilas viables en los alimentos como
unindicador microbiano de la calidad del alimento.
III.
Materiales
Muestra biológica: Leche de soja
Medio de cultivo: Agar PlateCount: A. recuento en placa Placas Petri
Diluyente: agua peptonada al 0.1% Pipetas
IV.
Procedimiento
a. Para la dilución (en agua peptonada al 0,1%)
Se deben hacer 6 diluciones, pero para efectos de la práctica solo se realizaran 3
(10-1, 10-2 y 10-3) de las que se tomara 1ml para las placas de siembra en profundidad, 0.1ml para siembra en superficie y 0.02ml para la siembra por
goteo
Para la dilución se emplean 10 o 100ml de muestra más 90 o 900ml de diluyente
respectivamente; para efectos de la práctica las dilución se hicieron con 27ml de diluyente y 3ml de muestra
b. Método de siembra en profundidad
Prepararla muestra de alimento, si este es líquido hay que homogenizar, si es
sólido hay que licuar o triturar la muestra debe estar en un frasco estéril
se realizan 3 diluciones (2 placas petri por dilución), en cada placa colocar 1ml
de la dilución, luego agregar medio de cultivo (agar PlateCound de 10-15ml)
Luego mezclamos, la mezcla se realiza haciendo rotar la placa (5 veces sentido
horario, 5 veces de abajo arriba, 5 veces anti horario y 5 veces derecha e izquierda).
Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 30ºC por 24- 48
horas (dejamos una placa control).
Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h.
Para el recuento de las colonias(a las 24 y 48 horas) se debe elegir placas que
c. Método de superficie
se utiliza una placa para cada dilución (son 3 diluciones), se controla en estufa
antes de servir el medio
Servir 0.1 ml de cada dilución en la superficie de la placa y luego se la expandir
usando la espátula de Drigalsky.
Incubar a 30 ºC x 24 y 48 horas. Conteo y aumentar una cifra
d. Método por goteo
Se utiliza una placa por dilución, delimitada en 2 partes.
colocar gotas de la dilución correspondiente en cada lado de la placa (0.02 ml de
gota).
Resultados contar entre 30
–
300 colonias. Si una dilución 10-2 = 68 colonias los multiplicamos por 102 y por 50 y el
resultado lo igualamos a UFC/ml
Luego llevar a incubar
V.
Fundamento teórico
SiembraSembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
Que se efectúen asépticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.
VI.
RESULTADOS
A.
Recuento estándar en placa
Elegir las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.
Contar utilizando un contador de colonias.
Contar las colonias de cada placa teniendo en cuenta la dilución. Si la 1° dilución tiene más de 300 colonias se desecha.
Tomar la media aritmética de las dos placas de cada dilución.
Si hay dos diluciones entre el rango Se cuenta por separado l as colonias.
Luego dividimos la dilución más alta entre las más baja.
Si el resultado es mayor que 2 se coge las UFC de la última dilución.
Si el resultado es menor que 2 se coge las UFC de la mayor dilución.
B. Recuento Estimado
Si todas las diluciones tienen más de 300 colonias se realiza un estimado (una aproximación) dividiendo en cuadrantes la placa, escogiendo 2 o más de ellos, se saca el promedio, y finalmente se multiplica por el número total de cuadrantes divididos.
Finalmente para hallar el número de aerobios mesofilos viables, se aplica la fórmula:
Solo se informan las 2 primeras cifras Ej.: 1200 = 12 x 102.
El resultado se expresa como
UFC/ml. o gr.
Recuento Método de Profundidad
1 LECTURA 24 HORAS
2 LECTURA 48 HORAS
10
- 926 685 640 80010
-1 464 96010
- 204 213 448 51710
-110
-2Recuento = N° de Colonias / Dilución x inoculo
Utilizamos elRecuento estándar , por lo tanto escogemos las diluciones con lectura de
24h por tener menos de 300 colonias.
10-2/10-3 = 213/193 =
1.10
* Por lo tanto : 213 x 102 x 1 =
1. Recuento Método de Superficie
1 LECTURA 24 HORAS
2 LECTURA 48 HORAS
10
-1300
896
10
-2180
384
10
-364
264
Utilizando elRecuento estándar , escogemos las diluciones con lectura de
24h
por tener menos de 300 colonias.10-2/10-3 = 180/64 =
2.81
o Por lo tanto : 64x 103 x 10 =
2. Recuento Método de Goteo
10
-2 224 57510
- 198 193 384 35210
- 188 32010
-110
-210
-322 x 10
3ufc/
64 x 10 ufc/ mL10
-210
-3 Utilizando un Recuento estándar , escogemos las diluciones con lectura de menos de 300 colonias. Podemos utilizar cualquiera de las diluciones obtenidas. 10-2/10-3 = 8/2 =
2.00
* Por lo tanto : 4 x 103 x 50 =
Según laNORMA
TÉCNICA
PERUANANTP
202.0012003
.
determina como límite máximo permisible para estos productos el valor de 105 UFC/ml. De los valores obtenidos en los 3 métodos aplicados en la práctica, solo el método por goteo sobrepasa los valores permisibles, pero los otros 2 métodos utilizados se encuentran dentro de los valores permisibles, por lo tanto se puede decir que la muestra tiene una regular calidad microbiológica. Para descartar se puede repetir la práctica, para una mayor seguridad. A lo anterior se debe agregar que los valores fueron calculados por aproximación ya que no se trabajó con más diluciones.
Al término de la práctica se ha podido determinar que el alimento empleado, en nuestro caso LECHE DE SOYA, es regular calidad debido al cierto crecimiento excesivo de colonias que presento en el método por goteo.
VII.
CONCLUSIONES
Se logró determinar el número de bacterias aerobias mesófilas viables a través de los 3 métodos trabajados en práctica.
Se pudo determinar el número de microorganismo presentes en la muestra de mayonesa casera
1 LECTURA 24 HORAS
2 LECTURA 48 HORAS
10
-28
10
10
-34
6
VIII.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar análisis
microbiológicos en alimentos?
Además del Agua Peptona Tamponada (BPW), que es útil en diluir muestras de alimentos permitiendo mantener sus características sin alterar la muestra; es muy común el uso de diluyente Agua de Triptona (Trytone Water: TW) y la solución Ringer¼, cuyas composiciones son las siguientes:
Agua Triptona Solución Ringer ¼ Agua Peptona Tamponada Triptona 10 g Cloruro sódico 2.250 g Peptona de
carne
10 g
Cloruro de sodio
5 g Cloruro cálcico 0.120 g Cloruro sódico 5 g
Agua destilada 1000 ml Bicarbonato sódico 0.050 g Fosfato sódico 3.5 g Cloruro potásico 0.105 Fosfato potásico 1.5 g
Agua destilada 1000 ml Agua destilada 1000 ml
Solución Ringer ¼:
Es una solución electrolítica balanceada en la que parte del sodio de la solución salina isotónica es sustituida por calcio y potasio. Es un medio isotónico más equilibrado que la simple solución salina de cloruro sódico y su composición permite su esterilización al autoclave sin que se formen precipitados. Se utiliza
rutinariamente, en los estudios sobre bacterias, a una disolución ¼ para obtener suspensiones celulares o para hacer un banco de soluciones. Al proporcionar una presión osmótica similar a la que tiene en su interior la célula bacteriana, permite
mantener las bacterias durante un cierto tiempo sin que éstas se destruyan.
Agua Triptona:
Su base nutritiva permite el desarrollo de diversas especies bacterianas. La triptona presenta alto contenido en triptófano, el cual es el sustrato utilizado por los microorganismos para la producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Agua Peptonada Tamponada:
Es un medio utilizado como diluyente y para el pre-enriquecimiento de microorganismos a partir de diferentes muestras. Es ampliamente utilizado en los protocolos de control higiénico de alimentos para la búsqueda de Salmonella spp. El Agua Peptonada Bufferada mantiene un pH alto durante el período de pre-enriquecimiento y anula los efectos del daño celular que pueden ocurrir a pH ácido. Esto es particularmente importante en las muestras de vegetales que
tienen una baja capacidad reguladora. También puede ser utilizado para evaluar alimentos de aves de corral. En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y los fosfatos forman un sistema buffer que regulan el pH del
medio.
También se podría utilizar
Solución Salina Fisiológica (SSF)
como diluyente, que como su nombre lo dice sirve para mantener viables las muestras de contenidos fisiológicos tales como secreciones. Además sirve para diluir muestras fisiológicas. Sólo contiene 0.9 g de Cloruro sódico y 1000 ml de Agua Destilada.2. ¿En una preparación de dilución como se prepara 10
0?
Una dilución 100 es muy utilizada para nombrar la primera dilución preparada a partir de una muestra líquida de la cual se obtendrán diluciones decimales sucesivas, no se considera una dilución 10-1 debido a que en esta dilución busca diluir una muestra sólida para su homogenización.
3. Ventajas y desventajas de cada técnica de siembra.
Recuento en Placa por M étodo de Siembr a en Pr ofun didad:
Ventajas:
- Es el mejor método para el desarrollo de microaerófilos.
- Hay un mayor aprovechamiento de nutrientes.
- Mayor cantidad de la muestra.
- Menor error.
- Facilita el aislamiento de algunas especies características como
Clostridium.
Desventajas:
- La temperatura del agar puede afectar a algunos microorganismos sensibles al calor.
- Hay dificultades al subcultivar colonias.
- Si no se emplea el medio translucido la visualización de colonias se ve afectada.
Recuento en Pl aca por M étodo de Siembra en Superf icie:
Ventajas:
- Permite un fácil estudio de las diferentes colonias tanto en su morfología como en su recuento.
- Hay facilidad para realizar el subcultivo de colonias.
- No es necesario que el medio sea claro o traslucido.
Desventajas:
- Debido al pequeño volumen de muestra utilizada el alimento suspendido puede interferir como nutriente o ejerciendo efecto inhibitorio sobre los microorganismos.
Recuento en Pl aca por M étodo de Siembra en Goteo:
Ventajas:
- Es fácil de realizar el estudio morfológico y la caracterización de los diversos tipos de colonias.
- Se comprueba fácilmente con exactitud del sistema de dilución.
- Los microorganismos son inactivos por el calor.
- No es necesario que el medio sea traslucido.
Desventajas:
- Debido al pequeño volumen de muestra utilizada el alimento suspendido puede interferir como nutriente o ejerciendo efecto inhibitorio sobre los microorganismos.
- Solo da buenos resultados en muestras demasiado contaminadas
IX.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
Adams M. R. y M. O. Moss
; 1995; “Microbiología de los Alimentos”; Editorial
Acribia; Zaragoza; España; Pág. 388–
391.
Doyle B.; 1997; “Microbiología de los Alimentos”; Editorial Acribia; Zaragoza;
España.
FRAZIER W.C, WESTHOFF D.C. “MICROBIOLOGÍA DE LOS
ALIMENTOS”. 4ta Edit. Acr
ibia, S.A. Zaragoza, España.1993.
Harrigan B. W.; 1995; “Métodos de Laboratorio en Microbiología de los
Alimentos y Productos Lácteos”; 3
raedición; Editorial Acribia; Zaragoza, España.