BIOTECNOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS

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BIOTECNOLOGIA DE LOS

MICROORGANISMOS

Enzimas fúngicas involucradas en la

degradación de los polimeros vegetales

Dra. Isabel E. Cinto

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Polímeros vegetales

Reserva

Almidón

Celulosa

Polisacáridos

Hemicelulosa

Pectina

Polímero fenólico

Lignina (en pared 2ª)

Estructurales

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Distribución de los polímeros en

la pared celular

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•Los hongos, por su capacidad hidrolítica y por su distribución, son los

organismos lignocelulolíticos por excelencia

•Secretan enzimas extracelulares que actúan sinérgicamente en la degradación de los materiales lignocelulósicos

•Presentan nutrición absortiva: sólo son capaces de incorporar moléculas pequeñas que utilizarán como fuente de materia y energía.

¿Por qué los hongos?

•Al ser incapaces de utilizar polímeros, el paso inicial para su nutrición a partir de estos, es la secreción al medio de enzimas extracelulares que puedan degradarlas a moléculas pequeñas

•El hecho de que posean crecimiento filamentoso hace que sean los organismos mejor adaptados al aprovechamiento del sustrato, porque además de degradarlo pueden penetrar en él.

•Las formas levaduriformes no son tipicamente degradadoras de polímeron, prefiriendo hábitats donde abundan los azúcares solubles.

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Características de las enzimas que

degradan polisacáridos

- Extracelulares

- Sistemas enzimáticos: endoenzimas

exoenzimas

enzimas que actúan sobre oligómeros

- Sinergismo

- Regulación de la síntesis: inducción (polímero)

represión (glucosa)

- Enzimas glicosiladas

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Almidón

Es la principal sustancia de reserva en vegetales. Se almacena en forma de gránulos (amiloplastos) Está compuesto por dos polímeros de alto PM: amilosa y amilopectina

Amilosa: polímero lineal de glucosa

α-1,4. Tiene forma helicoidal, las cadena se unen por ptes de Hidrógeno y precipita expontaneamente

Amilopectina: es un polímero de glucosa

α-1,4 con ramificaciones α-1,6 cada 16-17 residuos.

Estos dos polímeros pueden ser separados por ej: con el agregado de butanol. La milosa forma un compuesto insoluble cristalino mientras que la amilopectina permanece en suspensión.

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-

α-amilasa: endoenzima, actúa al azar sobre uniones α-1,4 del

polímero, produciendo oligosacáridos lineales y ramificados de

longitud variada. La acción de la α-amilasa produce una pérdidad de la

viscosidad del sustrato y una rápida reducción de color con yodo.

-

β-amilasa: exoenzima que por hidrólisis a partir del extremo no

reductor del polímero produce una inversión dando como producto

β-maltosa y β-glucosa. Se creía que era particular de plantas y algunas

Principales enzimas fúngicas amilolíticas:

maltosa y β-glucosa. Se creía que era particular de plantas y algunas

bacterias, pero ha sido identificada también en hongos

-

Glucoamilasa (amiloglucoamilasa): Enzima tipica de hongos, muy

poco frecuente en bacterias. Es una exoenzima que actúa a partir del

extremo no reductor, ataca uniones α-1,4 preferentemente y α-1,6 con

menor afinidad. Degrada preferentemente polisacáridos de alto peso

molecular dando como producto glucosa

-

α-glucosidasa: exoenzima, actúa sobre la maltosa y oligosacáridos

desde el extremo no reductor. Es capaz de actuar en uniones α-1,4 y

también α-1,6.

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Degradación de almidón por varias hidrolasas. Los círculos negos representan a glucosas con extremo reductor

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Aplicaciones de amilasas

(Aspergillus oryzae)

-

Fabricación de detergentes (para disolver almidones).

- Industria alimenticia:

- jarabes de glucosa (aumentar glucosa en el medio)

- panadería (para sacarificar harinas y favorecer el

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La primera enzima producida industrialmente fue la amilasa fúngica

takadiastasa, empleada en USA como agente farmacéutico (para los

desórdenes intestinales)en1894.

Fue el alemán Otto Röhm quien, en 1913 lanzó el primer detergente enzimático de la historia, Burnus, basado en un extracto de páncreas de cerdo que contenía tripsina, una enzima del aparato digestivo.

En la década de los 60, el 80% de todos los detergentes de lavandería

Amilasas: aceleran la degradación de los residuos

de almidón de alimentos como papa, chocolate, etc. Las amilasas no son componentes esenciales de los detergentes porque tienen una acción limitada

sobre los carbohidratos. En adición, los

carbohidratos son solubles en agua y tienden a ser fácilmente removidos con la mayoría de los detergentes y agua.

En la década de los 60, el 80% de todos los detergentes de lavandería contenía ya enzimas

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-LAS ENZIMAS EN LA

PANIFICACIÓN-El uso de las enzimas en la panificación se remonta al año 1850, a medida

que se va conociendo las cualidades de la harina de malta para mantener la miga del pan más húmeda, las características organolépticas del pan mejora, al mismo tiempo de aporte de una gran mejora en el aspecto final (color de la corteza) del pan.

La alfa-amilasa de la malta de la cebada aumentaba la fermentación con la La alfa-amilasa de la malta de la cebada aumentaba la fermentación con la generación de azúcares fermentables (maltosa) a partir del almidón.

Un siglo después se descubre que los hongos y bacterias son fuentes de

enzimas alimenticias.

La amilasa fúngica se empieza a utilizar remplazando a la harina de malta ya que en ella no era controlable su actividad y porque la harina no siempre tiene el mismo contenido enzimático, ya que esto depende de la humedad del trigo.

Amiloglucosidasa. También denominada Glucoamilasa se obtiene también

de un hongo, el Aspergillus rhizopus, y actúa sobre las dextrinas produciendo glucosa, lo que se traduce en una aceleración de la fermentación.

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Amilasa de origen fúngico. Es la más utilizada en la fabricación del pan, como alternativa a la harina de malta. Ello es debido al hecho, entre otros, de que la α-amilasa fúngica tiene una mayor tolerancia a la sobredosificación que la de origen cereal, lo que se basa en su desactivación durante la primera fase de la cocción (60-65º C), por lo que no existe el riesgo de que se produzca exceso de dextrinas, lo cual produciría migas pegajosas.

La actividad de las alfa-amilasas de origen fúngico comerciales se mide en dos unidades:

unidades:

– FAU (Unidad Fungal Amilasa), que es la cantidad que dextrinizará una solución estándar de almidón a una velocidad de 1 g/hora a 400 C.

– SKB que mide la capacidad de la enzima para degradar una solución de almidón puro, a un pH de 4,6, durante 60 minutos a 300 C.

La relación entre las FAU y las SKB, es que 1.000 FAU/g aproximadamente equivalen a 10.000 SKB/g.

Las amilasas de origen fúngico utilizadas en la panadería tienen una actividad variada que va desde baja actividad 2.500 SKB/g hasta alta actividad 50.000 SKB/g.

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Materiales lignocelulósicos

Células vegetales con crecimiento secundario Maderas

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Materiales estructurales en las paredes

vegetales

Polímeros estructurales: Celulosa 40-45% Lignina 15-35% Hemicelulosas 20-40 %

Las microfibrillas de celolosa se hayan embebida en una matriz amorfa de lignina y hemicelulosa.

Los tejidos inmaduros

pueden contener un %

importante de otro

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Sustancias Pécticas

•Son heteropolisacáridos ácidos de alto PM.

•Forman parte de las paredes celulares primarias y la laminilla media.

•En los árboles la laminilla media de los elementos xilemáticos jóvenes está constituída mayoritariamente por pectina, pero al envejecer se torna altamente lignificada

•Son sustancias solubles en agua con alto poder gelificante

Pectina: cadena principal de ácido galacturónico,con uniones α-1,4,

parcialmente esterificado con metanol y acetato, azúcares neutros en cortas cadenas laterales

Ácido péctico: polímero de ácido galacturónico

Protopectina: es la sustancia péctica madre, insoluble en agua, presente en las

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Enzimas pectinolíticas

Protopectinasas: Solubilizan lo protopectina para formar pectina

Tipo A: reaccionan con el ácido poligalacturónico en el interior de la molécula

Tipo B: actúan sobre uniones de la protopectina con otros componentes de la pared

Pectin-esterasas: catalizan la desesterificación de la pectina

pectina ác. péctico + metilo

Enzimas despolimerizantes (pectinasas):

Actúan sobre uniones α-1,4

Preferencia por sustrato: pectina (polimetilgalacturonasas) pectato (poligalacturonasas)

Modo de acción: al azar (endoP)

a partir del extremo no reductor (exoP) Mecanismo de clivaje: hidrólisis (hidrolasas)

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Degradación de pectina

tipo A: sobre el polímero

tipo B: liberan desde otros componentes

metilo

Hidrolasas (α-1,4) Endo (azar)

Exo (ext. no red.) Liasas (α-1,4)

Endo (azar)

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Aplicaciones de pectinasas

fúngicas

Fabricación de jugos

-

Manzana:

Manzana:

- Prensado y separación del jugo. 15 min a 2 hs dependiendo de madurez, cantidad, tipo de fruta y temperatura (pueden ser combinadas con celulasas y xilanasas).

- Clarificación: Depende del pH, tiempo de contacto y

temperatura (5-50ºC y 2-16 hs). (Puede ser combinada con amilasas).

- Fabricación de sidra: En clarificación previa (mejora fermentación).

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-

Pera:

Similar a manzana.

-

Uva:

- Prensado, separación y clarificación del jugo.

- Vinos: Reducción de turbidez y nivel de gelificantes en el distintos estados de producción:

a) Obtención del jugo (aumenta volumen y reduce tiempo de prensado).

tiempo de prensado).

b) Tratamiento del jugo antes de fermentación

(reduce partículas suspendidas y microorganismos no deseados).

c) Tratamiento del fermentado (mejora filtración y clarifica).

-

Fresas, frambuesas y moras:

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-

Naranja:

Altos niveles de pectinas

Posee pectinas parcialmente metiladas (grandes

cantidades de pectin esterasa).

Con Ca se forman pectatos insolubles.

Con Ca se forman pectatos insolubles.

Puede ser usada en dos pasos:

- Antes de terminar la etapa de extracción de la pulpa

(reduce viscosidad).

- o sobre el jugo resultante de la prensada (mejora

extracción de azúcares y sólidos suspendidos).

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-

Limón:

Cáscara y pulpa se minimizan (3-5 mm) y se mezclan con

agua (1:1), 95ºC para destruir pectín esterasas y se

enfría a 50ºC. Esta mezcla es rica en pectina, polisacáridos,

glucoproteínas, ceras y aceites. Se trata con pectinasas.

- Recuperación de aceites: Se usan complejos de pectinasas

- Recuperación de aceites: Se usan complejos de pectinasas

y proteasas para facilitar separación y la calidad de los aceites.

- Alimento para animales: Residuos de obtención de jugo

es mezclado con cal (pH 8) para activar pectin esterasas,

se seca a 8-10%.

-

Otras frutas:

Banana, mango, papaya, damasco,

ananá, guayaba.

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pectinasas pectinasas

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-

Maceración de tejidos vegetales:

Se obtiene suspensión de células intactas (pulpa).

Usada en jugos con pulpa y dulces, alimentos para bebés,

puré instantáneo, budines y yogures.

Antes se deben desactivar pectinasas endógenas.

Evita degradación de almidón celular.

Evita degradación de almidón celular.

Se usa sobre zanahoria.

-

Licuefacción y sacarificación de biomasa:

Se la usa junto con otras enzimas para sacarificar residuos

agroindustriales previo a fermentación.

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-

Aislamiento de protopastos:

Se usa en mejoramiento vegetal, investigación sobre tejidos

no lignificados.

Se hidroliza en un sólo paso (método simultáneo) junto con

celulasas o en dos pasos (método secuencial). En este caso

se aplican en el primero.

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-

Industria textil:

En el tratamiento de las fibras de

algodón, se deben extraer las pectinas

de la pared de las células primarias del

algodón. Las enzimas pectinasas (que

degradan esta sustancia) son utilizadas

degradan esta sustancia) son utilizadas

en el lavado alcalino del algodón.

Numerosos

estudios

realizados

muestran que un tratamiento usando

solamente pectinasa, seguido por un

enjuagado en agua caliente, es capaz

de hacer que la fibra de algodón se

vuelva

hidrófila

y

absorbente,

facilitando su posterior utilización.

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Hemicelulosa

Heteropolisacárido, uniones β-1,4 y ramificaciones de 1-2

azúcares, puede estar acetilado

Se nombran según el/los azúcares predominantes.

Aparecen en las paredes celulares en forma amorfa, asociadas a las microfibrillas de celulosa por uniones hidrógeno y mediante uniones covalente a la lignina

Se nombran según el/los azúcares predominantes.

El más abundante:

Xilano: xilosa, β- 1,4

Arabinoxilano

Glucuronoxilano

Glucuroronoarabinoxilano

Las hemicelulosas son a menudo los primeros componentes de la pared celular que son atacados por hongos causantes de pudrición debido a la extensión de sus cadenas, solubilidad y localización expuesta alrededor de las microfibrillas de celulosa

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•Son enzimas hodrolíticas

•Patrón de ataque análogo al de degradación de celulosa por celulasas. Sin embargo, las exoenzimas están ausentes, reflejando probablemente el bajo grado de polimerización de la hemicelulosa.

•La hidrólisis de estas moléculas complejas requier la interacción de numerosas enzimas que corten la cadena principal y también las laterales. Las distintas enzimas actúan sinérgicamente en la degradación del sustrato.

Enzimas xilanolíticas

Endoxilanasa: actúa sobre la cadena de xilano al azar, disminuyendo el Endoxilanasa: actúa sobre la cadena de xilano al azar, disminuyendo el

grado de polimerización con liberación de: xilooligosacáridos, xilobiosa, xilosa

β-xilosidasa: actúa luego de la endoxilanasa. Actúa sobre xilanooligosacáridos (a partir de los extremos no reductores) o sobre xilobiosa, dando como producto xilosa.

Se producen tempranamente en los procesos de pudrición y están relacionadas con la degradación de la lignina. Degradarían las hemicelulosas que se encuentran “pegadas” al lumen y se introducirían en la pared 2aria abriendo canales como para permitir el acceso de las enzimas degradadoras de lignina de mayor peso molecular

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Aplicaciones de xilanasas

fúngicas

Aspergillus niger, Trichoderma sp. y Humicola insolens.

-

Alimentos para animales:

Junto con otras enzimas.

Reducen viscosidad degradando arabinoxilanos (interfieren en la

movilidad y absorción otros componentes en los animales).

-

Manufactura de pan, alimentos y bebidas:

- Se las combina con pectinasas y celulasas en la fabricación de

jugos.

- Junto con endoglucanasas forma parte de la hidrólisis de

arabinoxilanos y almidón en la separación del gluten del almidón

en la harina de trigo.

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- Vino: Se introdujo en levaduras el gen xlnA de Aspergillus

nidulans. Mejora aroma

- Cerveza: Hidrólisis de arabinoxilanos de cebada para reducir

viscosidad.

Industria farmacéutica:

Industria farmacéutica:

Uso limitado en industria farmacéutica. Suplementos dietarios

o tratamientos en baja digestibilidad.

Aplicaciones químicas:

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Industria textil:

Xilanasas libres de celulasas son usadas para obtener fibras

intactas.

Evita oxidación de la lignina.

Industria del papel:

Es la principal aplicación industrial.

Es la principal aplicación industrial.

Madera pulpa preblanqueada final

Kraft NaOH + NaS2 O2 ClO2 O3 NaOH, O2, H2O2 ClO2

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Xilanasas reducen 30% de ClO2 y 15-20% de organoclorados en efluentes.

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Celulosa

Polímero lineal de monómeros de glucosa unidos por enlaces β-1,4

Las microfibrillas estan

conformadas por zonas cristalinas dónde las moléculas de celulosa se

hallan ordenadas y regiones

hallan ordenadas y regiones

paracristalinas dónde se

deorganizan

Tipos de celulosa:

Nativa o cristalina: alto grado de cristalinidad u ordenamiento y de polimerización, insoluble (avicel, papel de filtro)

Celulosa modificada: menor grado de cristalinidad y de polimerización, soluble (celulosa amorfa, CMC)

Sólo ciertos hongos y bacterias son capaces de degradar completamente la

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-

endoglucanasas (endoenxima):

Cortan al azar sobre el polímero liberando mayormente oligosacáridos.

Generan extremos reductores.

Actúan sobre zonas amorfas de la fibrilla.

Disminuyen el grado de polimerización

Sustratos sobre los que actúan: carboximetilcelulosa (CMC), celulosa

amorfa, celooligosacáridos

Enzimas celulolíticas

amorfa, celooligosacáridos

-

celobiohidrolasas o exoglucanasas (exoenzima):

Actúan a partir de extremos no reductores.

Liberan celobiosa

Actúan sobre la celulosa cristalina

-

β- glucosidasas:

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Inductores:

Celulosa

Celobiosa

Soforosa (T.reesei)

Lactosa

Inducción / Represión

Represores:

Glucosa

Otros azúcares

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Aplicaciones de celulasas

fúngicas

En 1985 se introdujo al mercado un tipo revolucionario de

enzima celulasa para detergentes, Cellulasa, producida por el

hongo Humicola insolens para remoción de suciedad, y

restaurador de suavidad y color de fibras de algodón. Las

celulasas aceleran la degradación de pequeñas fibras que

Detergentes:

endurecen la ropa y opacan los colores sin afectar las fibras

principales de la ropa, mejorando así la suavidad y los colores

de la misma.

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Las fibras están compuestas básicamente de celulosa la cual, al ser un material no biodegradable, constituye un problema para el posterior tratamiento de efluentes.

Se utilizan celulasas para degradar las fibras de la superficie (fibras sueltas y microfibrillas) haciendo a los tejidos más lisos y blandos.

También son usadas para producir la apariencia “stonewashed” en los jeans.

Industria textil:

También son usadas para producir la apariencia “stonewashed” en los jeans. Tradicionalmente esta apariencia en los tejidos Denim (nombre de la tela con que se realizan los jeans) es otorgada por un proceso que utiliza piedra-pómez para desgastar el color localmente por roce. Este proceso presenta muchas desventajas ya que causan el desgaste rápido y rotura de las máquinas utilizadas, provocan gran abrasión empeorando la calidad de la tela y causan problemas ambientales ya que se generan efluentes no biodegradables.

La ventaja en la utilización de celulasas en el proceso de desgaste del jean en relación al proceso convencional, es que no causa gran degradación de la fibra como la piedra-pómez y el desgaste es más uniforme.

Las celulasas son utilizadas juntamente con las piedras o sustituyéndolas totalmente.

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El procedimiento general para su aplicación consiste en: • introducción de los artículos de celulosa en la máquina

• ajuste de las condiciones del baño de tratamiento con pH entre 5,5 y 8,0 y temperaturas de 50 a 60ºC

• adición de la enzima y control de las condiciones de reacción (tiempo, temperatura, pH y agitación mecánica)

• interrupción de la actuación de la enzima: agregando carbonato de sodio y/o aumentando la temperatura hasta 80ºC durante 10 minutos

Al culminar este proceso, se suele realizar un tratamiento de limpieza con un agente blanqueante para resaltar los contrastes y eliminar la reposición de microfibras teñidas de color azul que enmascaran el efecto logrado.

Estas enzimas no sólo se utilizan en el proceso de stone-wash de telas para jeans, sino que también se utilizan en telas destinadas a la confección de blusas y faldas, porque el proceso enzimático les otorga una textura aterciopelada similar a la seda natural.

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El concepto de la utilización de celulosa como materia prima de azúcares que puedan ser bio-convertidos a combustibles mediante el empleo de microorganismos, ha retomado gran importancia en los últimos años debido a los altos precios del petróleo y a las inconveniencias de los cultivos mencionados

La hidrólisis de la celulosa con celulasas de origen fúngico se lleva a cabo en un rango de 50 a 55 °C y alrededor de pH 5. Comercialmente se encuentra disponible una mezcla de celulasas conocida como AccelleraseTM (de Genencor®) producida por una cepa recombinante de

Trichoderma reesei. Sin embargo, otras enzimas necesitan ser estudiadas para el desarrollo de nuevas formulaciones comerciales.

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Manufactura de pan,

alimentos y bebidas:

- Se las combina con

pectinasas, xilanasas y

celulasas en la fabricación de jugos.

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LIPASAS

Lípidos: triglicéridos, esteroles, P-lípidos

lipasa (ester hidrolasa)

triglicérido glicerol-P ácidos grasos

Las lipasas forman parte de una de las familias de enzimas más utilizadas en la industria por su gran versatilidad. Estas enzimas hidrolizan triglicéridos en condiciones acuosas pero también pueden participar en reacciones de esterificación y transesterificación en presencia de solventes orgánicos, por lo que es muy importante tener en cuenta su estabilidad en estas condiciones.

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Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea relativamente lenta e inefectiva. Además, las condiciones dentro de una lavadora de ropa son

Detergentes:

Aplicaciones de lipasas fúngicas

inefectiva. Además, las condiciones dentro de una lavadora de ropa son hostiles para una enzima y la mayoría de las lipasas no son suficientemente estables en esas condiciones. Por lo tanto, se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa Humicola , que se logró producir en Aspergillus oryzae y que se conoce como "Lipolasa".

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PROTEASAS

1. según el modo de acción:

endopeptidasas

exopeptidasas aminopeptidasas

carboxipeptidasas

2. según del sitio catalítico: los aminoácidos, o unión con

metales

metales

serin-proteasas

aspartil-proteasas

cistein-proteasas

metalo-proteasas

3. según el pH de actividad:

proteasas ácidas

proteasas neutras

proteasas alcalinas

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En la industria alimenticia:

quesería (renina)

reducción de amargor de hidrolizados proteicos

Aplicaciones de proteasas

Detergentes:

aceleran la degradación de proteínas y producen pequeños péptidos o aminoácidos individuales los cuales pueden ser fácilmente aminoácidos individuales los cuales pueden ser fácilmente solubilizados y removidos de los tejidos. Representan cerca del 60% del mercado de enzimas mundial y se usan a altos pH y temperaturas superiores a 60o C. Las proteasas son el tipo más importante de enzimas en detergentes enzimáticos para uso médico porque existe un alto contenido de proteínas en los fluidos corporales (sangre, tejidos y mucosas) los cuales no pueden removerse con detergentes convencionales y agua. Las enzimas usadas son producidas principalmente por Bacillus licheniformis o B. Amyloliquefaciens y Aspergillus flavus mediante fermentación. Existe un considerable interés en el desarrollo de mejores proteasas para polvos de lavado a través de ingeniería de proteínas, para evitar su oxidación.

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Enzimas intracelulares

Nucleasas – de P.citrinum para degradar ARN

Glucosa-oxidasa – oxida glucosa con incorporacon de O

2

y liberación

de H

2

O

2

de Aspergillus y P.chrysogenum

- eliminar O de jugos de fruta

Otras enzimas fúngicas de interés

- eliminar O

2

de jugos de fruta

- kits para detectar glucosa

Alcohol dehidrogenasa

de S. cerevisiae para determinar alcohol

Fitasa – de A. ficuum expresada en A. niger

Ácido fítico inositol + 6 PO

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