PATENTES Y MARCAS ESPA ˜NA
N´umero de publicaci´on:
2 163 085
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51Int. Cl.7:
A61K 35/78
A61P 5/32
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
T3
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86 N´umero de solicitud europea: 97121030.7 k
86 Fecha de presentaci´on: 29.11.1997 k
87 N´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 847 755 k
87 Fecha de publicaci´on de la solicitud: 17.06.1998
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54 T´ıtulo: Utilizaci´on de un extracto de Cimicifuga racemosa.
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30 Prioridad: 14.12.1996 DE 196 52 183 k
73 Titular/es:
SCHAPER & BR¨UMMER GMBH & CO. KG Bahnhofstrasse 35
D-38259 Salzgitter, DE
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45 Fecha de la publicaci´on de la menci´on BOPI:
16.01.2002
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72 Inventor/es: Nesselhut, Thomas;
Bodinet, Cornelia; Schneider, Peter y Freundenstein, Johannes
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45 Fecha de la publicaci´on del folleto de patente:
16.01.2002
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74 Agente: Javier S´anchez, Elena
Aviso:
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas).ES
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DESCRIPCION
Utilizaci´on de un extracto de Cimicifuga race-mosa.
La invenci´on se refiere a la utilizaci´on de un extracto de Cimicifuga racemosa para fabricar un medicamento para tratar tumores relaciona-dos con los estr´ogenos.
Los extractos de la cepa de vela plateada race-mosa (cimicifugae racerace-mosae rhizoma) presentan efectos similares a los estr´ogenos. En los extrac-tos se han encontrado componentes que se unen espec´ıficamente a receptores de estr´ogenos y que pueden reducir el nivel de gonadotropina en ra-tas ovarectomizadas. Por lo tanto, se ha acre-ditado la administraci´on de estos extractos para el tratamiento de afecciones climat´ericas y de la dismenorrea.
Para pacientes de riesgo de carcinoma de mama, no se permite la utilizaci´on de medica-mentos que contienen estr´ogenos para la regu-laci´on de afecciones climat´ericas, ya que la propa-gaci´on de tumores relacionados con los estr´ogenos se ve reforzada naturalmente mediante la apor-taci´on de estr´ogenos. Puesto que el mecanismo del funcionamiento de las sustancias similares a los estr´ogenos no est´a claro a´un, por precauci´on se relaciona la administraci´on de estas sustancias con un riesgo relativo a tumores relacionados con los estr´ogenos, como contraindicaci´on.
Ciertamente ya se ha comunicado (Nesselhut y otros en TW Ginecolog´ıa (1993), p´aginas 249 a 250) que los fitof´armacos raponticina y extracto de cimicifuga en bajas concentraciones refuerzan la proliferaci´on de c´elulas de carcinoma in vitro y posiblemente en elevadas concentraciones, por el contrario, la impiden.
Una verificaci´on de estos resultados no ha sido publicada, de manera que persiste la prohibici´on de la administraci´on de fitof´armacos con un efecto similar al de los estr´ogenos para pacientes de riesgo en cuanto a los tumores relacionados con los estr´ogenos.
Es conocida la terapia para los tumores rela-cionados con los estr´ogenos basada en una sus-tancia activa antiestr´ogena. Las sustancias acti-vas m´as usuales de este tipo son actualmente los tamoxifenos (Z) - 2 - [4 - (1,2 - difenil - 1 - bute-nil)fenoxi] - N, N - dimetiletilamina).
Para los pacientes que han sido tratados con un antiestr´ogeno de este tipo, no se realiz´o, por las razones antes mencionadas, una regulaci´on de las afecciones climat´ericas mediante estr´ogenos o sustancias similares a los estr´ogenos.
La obstaculizaci´on de la proliferaci´on de c´ elu-las tumorales mamarias es funci´on de la concen-traci´on de tamoxifenos. No obstante, la elevaci´on de la concentraci´on hasta una gama en la que la proliferaci´on de las c´elulas tumorales se impide con seguridad, no es posible, ya que el tamoxifeno se vuelve t´oxico a estas concentraciones.
La presente invenci´on parte por lo tanto de la problem´atica de posibilitar una tumorterapia tambi´en a bajas concentraciones de antiestr´ oge-nos.
Para ello, en el marco de la invenci´on se utiliza en combinaci´on con la sustancia activa antiestr´ o-gena un extracto de Cimicifuga racemosa.
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Sorprendentemente se ha observado que el ex-tracto de Cimicifuga racemosa no s´olo no refuerza la proliferaci´on de c´elulas tumorales relacionadas con los estr´ogenos, sino que en combinaci´on con una sustancia activa antiestr´ogena refuerza cla-ramente su efecto de impedir la proliferaci´on, de manera que se logra tambi´en un completo impedi-mento de la proliferaci´on sin tener que llegar a la gama del l´ımite de la toxicidad para la sustancia activa antiestr´ogena.
La potenciaci´on de la acci´on de una sustancia activa antiestr´ogena se ha investigado con pre-cisi´on en base a la sustancia activa est´andar tamo-xifeno. Otros experimentos indican que tambi´en la acci´on antiestr´ogena de la genisteina se ve re-forzada mediante un extracto de Cimicifuga race-mosa. Las diluciones preferentes del extracto, se encuentran en la zona entre 10−3y 10−5, ya que las diluciones hasta 10−2en vitro aportan efectos t´oxicos. Dosificaciones preferentes, se encuentran entre uno 5 mg y 500 mg de droga por d´ıa.
La acci´on correspondiente a la invenci´on del extracto de cimicifuga sobre la proliferaci´on de c´elulas de carcinoma relacionadas con los estr´ o-genos, en particular de c´elulas de carcinoma de mama, se ha realizado in vitro con un sistema de prueba de c´elulas MCF-7.
La l´ınea de c´elulas MCF-7 es un modelo es-tablecido in vitro para tumores relacionados con los estr´ogenos, que poseen tanto receptores de estr´ogenos como tambi´en actividad aromat´asica. La l´ınea humana de c´ancer de pecho se dedujo de una efusi´on de pleura en un tumor de pecho con met´astasis y tienen cantidades significativas de receptores 17-β (Schwarte, A. (1994)) espectro activo de flavonoide seleccionado sobre la l´ınea humana de c´ancer de pecho MCF-7: Un estudio in vitro. Witten-Herdecke, Universidad, Sector Medicina, Dis, 1994).
La influencia del extracto de cimicifuga sobre la proliferaci´on de las c´elulas MCF-7 se determin´o en base a la inclusi´on de timidina marcada radiac-tivamente.
Material y M´etodos Sustancias de prueba
El estradiol 17β (sigma) y el tamoxifencitrato (sigma) se disolvieron a 1-M en DMSO (dime-tilsulf´oxido) y se siguieron diluyendo correspon-dientemente en una l´ınea 1: 10 de diluci´on en un medio de cultivo de c´elulas. El extracto de cimi-cifuga se diluy´o en una l´ınea 1: 10 de diluci´on directamente con medio de cultivo de c´elulas. Fabricaci´on del extracto de Cimicifuga racemosa
Tras comprobar la identidad, pureza y conte-nido, se maceraron 30 Kg del medicamento tri-turado Cimicifuga racemosa rhizoma durante 10 d´ıas con 50 l de isopropilalcohol de 40 % (V/V). El extracto se purg´o y la droga se prens´o. Las fracciones reunidas se rellenaron con isopropilal-cohol al 40 % (V/V) hasta un volumen final de 35 l.
Ensayo de proliferaci´on MCF-7
Las c´elulas de MCF-7 se obtuvieron del ATCC (HTB 22) y se cultivaron en Eagle’s MEM (Ea-gle’s Minimal-Essential-Medium) con amino´ aci-dos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 10 µg/ml de insulina y 10 % de FKS (suero infantil fetal).
Antes de su utilizaci´on en la prueba las celdas MCF-7 se mantuvieron al menos un tiempo breve en Eagle’s MEM sin rojo de fenol con amino´acidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 10 µg/ml de insulina y 5 % de FKS (suero infantil fetal). Para obtener en la prueba condiciones de crecimiento libres de estr´ogenos, se elimin´o para compensar la prueba la insulina del medio de cul-tivo de c´elulas y se sustituy´o el FKS por 5 % de “Characoal stripped” FKS (CSF).
200 µl de una suspensi´on celular ajustada a 5 x 104c/ml se pipetaron por cavidad en placas de
microt´ıtulo 96◦(Nunc) y se incubaron durante 24 horas a 37◦ C y 5 % de CO2 en la incubadora. A continuaci´on se retiraron con cuidado los residuos y se pipetaron 150 µl de medio de cultivo celular fresco por cavidad.
Las sustancias de prueba se disolvieron, se di-luyeron en medio de cultivo celular y se pipetaron en 4 paralelos a 50 µl/cavidad. Como controles, se incub´o conjuntamente en cada caso medio de cultivo celular, as´ı como las correspondientes di-luciones del disolvente.
Tras 2-3 d´ıas de incubaci´on a 37◦ C y 5 % de CO2, se pulsaron las c´elulas con 25 µl/copa (6−3H) - timidina (Amersham, actividad espec´ı-fica 2 Ci/mMol) durante 8 horas. A continua-ci´on se recolectaron seg´un m´etodos est´andar (Cell Harvester Inotech) sobre filtro de fibra de vidrio y se contaron en un contador de escintilaci´on l´ı-quido (Wallac). Los resultados se expresaron en cpm = “counts per minute”.
Fabricaci´on del “Charcoal-Stripped” FKS (CSF) 1 tableta de “Dextran coated charcoal tablets” (Steranti Separe x R ) se disolvi´o en 10 ml FKS.
A continuaci´on se inactiv´o el suero 2 x 45 min en ba˜no de agua a 56◦ C y se centrifug´o despu´es a 3000 rpm durante 10 minutos. Se retir´o el residuo y se filtr´o mediante un filtro con tama˜no de poros de 0,2 µm.
Ensayo de toxicidad
Para determinar la toxicidad de las distintas sustancias de prueba, se realiz´o un ensayo de fluo-rescencia con c´elulas de suspensi´on Hela.
Las c´elulas Hela se ajustaron a una densidad de c´elulas de 2,5 x 105 c/ml de medio (Eagle’s
MEM + 5 % de FKS) y se pipetaron 100 µl de la suspensi´on en placas de microt´ıtulo 96◦ (Nunc). Tras 24 horas de incubaci´on a 37◦ C y 5 % CO2, se practic´o una serie de diluciones 1: 2 de las sus-tancias de prueba en medio y de cada diluci´on se pipetaron 100 µl por cavidad en 4 paralelas. Los preparados se incubaron durante 48 horas a 37◦ C y 5 % de CO2. A continuaci´on se centrifugaron las placas de microt´ıtulo a 800 rpm y se extra-jeron cuidadosamente los residuos. Se pipetaron 200 µl de una soluci´on de 0,1 mg/ml de 4-Metilo-beliferilheptanoato en PBS por cavidad. Tras 60 minutos se determinaron las unidades de fluores-cencia por cavidad en un fluor´ımetro de placas de microt´ıtulo (fluoroskan II).
Resultados
Al comienzo de los ensayos, se comprob´o pri-meramente el sistema de prueba en cuanto a sen-sibilidad. Como control positivo, se prob´o estra-diol 17-β en dosificaciones de 10−7,10−8 y 10−9 molar. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
En cada una de las tres dosificaciones proba-das, el estradiol 17-β indujo un aumento de la pro-liferaci´on de c´elulas MCF-7 en un 80 - 100 % en comparaci´on con el control no tratado, tal como se ve en la figura 1.
En paralelo, se realiz´o en cada preparado de prueba un control del disolvente. El DMSO no provoc´o en la concentraci´on m´axima empleada en la prueba aumento o inhibici´on significativa al-guna en comparaci´on con el control no tratado.
En otro preparado se comprob´o la influencia del antiestr´ogeno no esteroidal tamoxifeno sobre el sistema de prueba.
El tamoxifeno provoc´o en las dosificaciones 10−4 y 10−5 molar una inhibici´on del 100 % y 77 % respectivamente de la proliferaci´on, y en do-sificaciones de 10−6, por el contrario, un aumento de las tasas de incorporaci´on en un 52 % en com-paraci´on con el control sin tratar.
El efecto antiproliferativo del tamoxifeno se mostr´o tambi´en cuando el tamoxifeno se aplic´o junto con una dosis constante de estradiol. El au-mento de la proliferaci´on inducida por estr´ogenos pudo inhibirse mediante tamoxifeno, en funci´on de la dosis.
Los resultados de estos ensayos previos deja-ron claro que el sistema de prueba MCF-7 es ade-cuado para demostrar los efectos tanto estr´ogenos como tambi´en antiestr´ogenos de sustancias de prueba.
Para controlar estos efectos, se realizaron a la vez en las siguientes series de ensayos, junto a controles del medio y controles del disolvente (controles negativos) tambi´en un control positivo en cada caso de la acci´on estr´ogena, compuesta por estradiol 17 β en una dosificaci´on de 10−7 ´o 10−8 molar y un control positivo de la acci´on an-tiestr´ogena, compuesta por tamoxifeno en una do-sificaci´on de 10−5 molar.
Antes de introducir el extracto de cimicifuga en el sistema MCF-7, se comprob´o primeramente su toxicidad en un ensayo de toxicidad con c´elulas Hela.
Hasta una diluci´on de 10−2, el extracto mostr´o en esta l´ınea de c´elulas efectos t´oxicos. A partir de una diluci´on de 10−3, no se observ´o diferencia alguna entre el control del medio y el preparado de prueba (figura 2). Para poder excluir efec-tos citot´oxicos no espec´ıficos, se emple´o en con-secuencia esta diluci´on como dosis m´axima para las series de prueba sobre c´elulas MCF-7.
La figura 3 explica comparativamente la pro-liferaci´on para el sistema de control, para una so-luci´on de tamoxifeno 10−5 molar y una soluci´on de estradiol 10−8molar, as´ı cuando para una com-binaci´on de tamoxifeno y estradiol, para verificar tambi´en la inhibici´on producida por el tamoxifeno de proliferaciones inducidas por estr´ogenos.
La figura 3 muestra adem´as la inhibici´on de la proliferaci´on para combinaciones de tamoxifeno 10−5 molar con extracto de Cimicifuga racemosa en diferentes diluciones 1:10 entre 10−3 y 10−8. Se comprueba que en las diluciones de 10−3 a 10−5 se refuerza claramente la acci´on inhibidora de la proliferaci´on del tamoxifeno, suprimi´endose la proliferaci´on por completo de la diluci´on a 10−3 y suprimi´endose casi totalmente en la diluci´on a 10−4. En diluciones a 10−6 y mayores, no se
am-plifica el efecto inhibidor de la proliferaci´on del tamoxifeno.
Mediante la combinaci´on de tamoxifeno con el extracto de cimicifuga en una diluci´on a 10−3 a 10−4, puede lograrse por lo tanto un impedimento 5
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casi completo de la proliferaci´on de las c´elulas tu-morales, sin tener que aplicar para ello concentra-ciones de tamoxifeno m´as elevadas, por ejemplo 10−4 molar, que muestran ya efectos t´oxicos.
REIVINDICACIONES
1. Utilizaci´on de un extracto de Cimicifuga ra-cemosa para fabricar un medicamento para tratar tumores relacionados con los estr´ogenos en com-binaci´on con un medicamento que contiene una sustancia activa antiestr´ogena.
2. Utilizaci´on de un extracto de Cimicifuga racemosa en combinaci´on con una sustancia ac-tiva antiestr´ogena para fabricar un medicamento
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
para el tratamiento de tumores relacionados con los estr´ogenos.
3. Utilizaci´on de un extracto seg´un la reivin-dicaci´on 1 ´o 2, en combinaci´on con tamoxifeno.
4. Utilizaci´on de un extracto seg´un la reivin-dicaci´on 1 ´o 2 en combinaci´on con genisteina.
5. Utilizaci´on de un extracto de Cimicifuga racemosa seg´un una de las reivindicaciones 1 a 4 en una dosificaci´on entre unos 5 mg y unos 500 mg de droga por d´ıa.
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Euro-peas (CPE) y a la Disposici´on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´on del Convenio de Patente Europea, las patentes euro-peas que designen a Espa˜na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´an ning´un efecto en Espa˜na en la medida en que confieran protecci´on a produc-tos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.
Esta informaci´on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.
