Métodos analíticos para la determinación de antioxidantes en muestras biológicas

(1)

FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

TRABAJO FIN DE GRADO

TÍTULO: Métodos Analíticos para la

Determinación de Antioxidantes en Muestras

Biológicas

Autor: Huet Breña, Cristina

Tutor: María Antonia Martín Carmona

Convocatoria: Febrero 2017

Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(2)

2

RESUMEN

Introducción y Antecedentes: la formación de radicales libres en los organismos vivos es un proceso natural tan deseable como la fagocitosis o la formación de colágeno, ya que contribuye a mantener la homeostasis. El equilibrio entre a) los radicales y especies reactivas en general, y b) los antioxidantes, debe mantenerse para evitar que produzcan más radicales, y con ello, se desajuste dicho equilibrio conduciendo a padecer diversas patologías como: diabetes, cáncer, hipertensión, ateroesclerosis… Objetivos: revisión y descripción de los métodos más relevantes que existen actualmente para determinar la capacidad antioxidante “in vitro” e “in vivo” frente al estrés oxidativo. Metodología: se realizó una revisión bibliográfica a través de de diferentes bases de datos como Google

Académico, Science Direct, SciELO. Resultados y Discusión: la capacidad

antioxidante se puede medir de diversas formas, dos sobresalen: la capacidad total de una muestra como ORAC, FRAP, TEAC, TRAC; o la capacidad antioxidante especifica de diferentes sustancias, ya sea con actividad enzimática: SOD, CAT, GP, GR; o bien

no enzimáticas: glutatión y vitaminas C y E. Conclusiones: en la actualidad se siguen

buscando o mejorando métodos para determinar la capacidad antioxidante de muestras biológicas. No hay que olvidar que el la mejor forma de disminuir el riesgo de desarrollar una de estas patologías es llevar una estilo de vida saludable.

Palabras claves: radicales libres, capacidad antioxidante, especies reactivas de oxígeno, ORAC, FRAP, TEAC,TRAC, SOD, CAT, GP, GR.

(3)

3 INDICE INTRODUCCION Y ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Métodos para medir la capacidad antioxidante total

ORAC, TRAP, TEAC, FRAP

Métodos para medir la capacidad antioxidante especifica

Enzimáticos: SOD, GPx, GR, CAT

No enzimáticos Glutatión, vitamina C, vitamina E

CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(4)

4

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Los antioxidantes son compuestos capaces de proteger los sistemas biológicos contra las reacciones y/o procesos que puedan producir un efecto potencialmente dañino, como es el caso de las especies reactivas de oxigeno (EROS o ROS) o de

nitrógeno (ERN o NOS). (Karadag et al., 2009), debido a que estas especies son

inestables y muestran un elevada reactividad que en muchos casos se manifiesta como simple reacción química que determina una secuencia de reacciones manifestadas como una agresión y posteriormente una patología.

La producción de especies reactivas de oxigeno y otros radicales libres son un proceso natural del metabolismo celular; sin embargo, la exposición a contaminante, medioambiente, estilo de vida, y situaciones patológicas, pueden generar un exceso o

acumulación de los mismos. (Sánchez Valle et al., 2013)

En el desarrollo normal del las células del organismo se producen diferentes reacciones metabólicas para crecer y desarrollarse. En dichos procesos se generan de forma espontánea diferentes productos entre los cuales podemos encontrar radicales libres que posteriormente serán eliminados por los antioxidantes. Los radicales libres se pueden forman mayoritariamente en la mitocondria (cadenas transportadoras de electrones), peroxisomas, células del sistema inmunitario (como los macrófagos, leucocitos, neutrófilos, para defender al organismo frente a los patógenos externos), por la acción de diferentes enzimas que participan en las cadenas redox, como: el citocromo

P450, xantina oxidasa, NADPH oxidasa… (Rodríguez Perón et al., 2001)

La dieta, estilo de vida, exposición a las radiaciones, contaminantes atmosféricos, metales, pesticidas, tóxicos, humo de tabaco y algunos medicamentos están asociadas a un fenómeno conocido como “estrés oxidativo”, es decir, un aumento en las especies oxidantes (principalmente Especies Reactivas del Oxígeno, EROs) y/o una disminución/afectación en los mecanismos de detoxificación de ellas. El incremento de las EROs promueve la aparición y desarrollo de enfermedades como cáncer, diabetes, aterosclerosis, desórdenes neurodegenerativos y envejecimiento. (Londoño Londoño, 2012)

Entre las especies reactivas, las cuales pueden estar en forma radicalaria o no ,

podemos encontrar: a) las EROs ( , , , , , (singlete), , HOBr,

HOCl, , ROOH) o b) las ERNs (las especies reactivas de nitrógeno , , ,

(5)

5 QUINONAS

SOD

, , , , , ONOO, , ONOOH, ROONO,

).(Sánchez Valle et al., 2013)

NADPH NADP+

Esquema de formación de radicales libres en el organismo y la forma que tiene este de deshacerse de ellas (Castillo Sánchez, 2010; Pérez Gastell et al., 2000; Sánchez Valle et al., 2013)

No obstante lo expresado anteriormente, los radicales libres del oxígeno tienen una función fisiológica en el organismo importantísima como la de participar en la fagocitosis, favorecen la síntesis de colágeno, y la síntesis de prostaglandinas, activan enzimas de la membrana celular, disminuyen la síntesis de catecolaminas por las glándulas suprarrenales, modifican la biomembrana y favorecen la quimiotáxis. (Venereo Gutiérrez, 2002) Origen de especies oxidantes: _{Mieloperoxidasa} Daño ADN Proteínas Lípidos Quelantes Catalasa (CAT) GSH-Peroxidasa (GPx) RH GSH- Peroxidasa (GPx) Vit.. E GSH- Reductasa (GR) Superóxido dismutasa Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(6)

6

Antioxidantes

Los antioxidantes, moléculas

capaces de captar el electrón

desapareado del orbital externo de los radicales libres y de esta forma desactivarlos, disminuyen el estrés oxidativo y actúan sobre el mismo inhibiéndolo, para evitar la oxidación de las proteínas, los lípidos y el ADN. Las alteraciones en estas biomoléculas como

consecuencia del estrés oxidativo

producirán el desarrollo de patologías siendo las más relevantes diabetes,

enfermedades cardiovasculares,

enfermedades neurodegenerativas como el Párkinson y Alzhéimer, o incluso

cáncer, como se indica en la Figura 1. (Barbosa, 2008; Sánchez Valle et al., 2013)

La clasificación de los antioxidantes según el mecanismo de acción realizada por de Guterridge y Mitchell distingue:

a) Primarios, previene la formación de RL (radicales libres)

b) Secundarios, inactivan los RL (radicales libres) ya formados

c) Terciarios, reparan el daño oxidativo principalmente el ocasionado al ADN.

(Moragón, 2007)

Los antioxidantes de prevención impiden la formación de los radicales libres

mediante la descomposición del o la quelación de los metales (que participan de

las cadenas redox por sus características oxido/reductoras). Algunos de estos antioxidantes son enzimas como las catalasas, glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa, transferrina o ceruloplasmina. Los eliminadores/secuestrantes de radicales libres (scavenger) inhiben el inicio de la cadena redox y rompen la su propagación.

Entre estos podemos encontrar las vitaminas A, C y E, la coenzima Q10, y los

flavonóides y polifenoles. Y por último los de reparación o “síntesis de novo” reparan

Figura 1: Inhibición del estrés oxidativo, los cuales están relacionas con el desarrollo de diversas patologías, por parte de los antioxidantes. Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(7)

7

los daños y la reconstrucción de la membrana como es el caso de los enzimas de reparación del ADN, proteasas y transferrasas. (Polo de Santos, 2016)

Los radicales libres al igual que los antioxidantes se pueden encontrar en el citosol, núcleo, cadena respiratoria mitocondrial, sistema retículo-endotelial (RE), lisosoma, peroxisoma, cadenas de transporte a nivel microsomal, cloroplastos.

(8)

8

Tabla 1: Clasificación de principales antioxidantes (Amazán, 2013; Mayor, 2010; Moragón, 2007; Olivares, et al., 2010; Prior et al., 1999; Venereo, 2002):

ACCION INTRACELULAR MENBRANA EXTRACELULAR INDEFINIDO/ TODOS

ORIGEN Antioxidante/ localización Acción Antioxidante/ localización Acción Antioxidante / localización Acción Antioxidante / localización Acción EXOGENO

no enzimáticos Ascórbico) Vit. C (Ac. (hidrosoluble) LISOSOMA -Neutraliza el oxígeno singlete -Captura radicales libres hidroxilo -Captura -Regenera la forma oxidada de la vit. E Vit. E (α-tocoferol) (liposoluble) NUCELO RETICULO ENDOTELIAL LISOSOMA Comp. fenolicos solubles en lípidos, loc en menb. -Neutraliza el oxígeno singlete -Captura radicales libres hidroxilo -Captura -Neutraliza peróxidos - Principal antioxidante que bloquea la etapa de propagación de la peroxidación lipidica de AGPI, membrana lipidica Vit. E (α-tocoferol) (Liposoluble) NUCELO RETICULO ENDOTELIAL LISOSOMA Comp fenolicos solubles en lípidos, loc en menb. -Neutraliza el oxígeno singlete -Captura radicales libres hidroxilo -Captura -Neutraliza peróxidos - Principal antioxidante que bloquea la etapa de propagación de la peroxidación lipidica de AGPI, menbran lipidica Flavonóides (polifenoles) -Quelan metales. B-carotenos ( pro- vit A) (liposoluble) NUCLEO RE LISOSOMA - Neutraliza el oxígeno singlete - Protege al DNA, detiene el deterioro de tejidos. Vit. C (Ac. Ascórbico) (hidrosuluble) LISOSOMA -Neutraliza el oxígeno singlete -Captura radicales libres hidroxilo -Captura -Regenera la forma oxidada de la vit. E Licopeno (liposoluble) ENDÓGENOS

enzimáticos dismutasa (SOD) Superóxido CITOSOL MITCONDRIA -Cofactor: Cu, Mn -Elimina el anion peroxido Glutatión peroxidasa (GPx) CITOSOL LISOSOSOMAS -Cofactor: Se -Previene la reducción del peróxido de hidrógeno para formar el radical hidroxilo Catalasa (CAT) -Cofactor: Fe

(9)

9 PEROXISOMA -Previene la reducción del peróxido de hidrógeno para formar el radical hidroxilo ENDOGENOS

No Enzimáticos Glutatión (GSH) CITOSOL MITOCANDRIA -Barreras fisiológicas que enfrenta el oxígeno a su paso desde el aire hasta las células -Captura radicales libres hidroxilo -Captura Ác. Tioctico -Transportadores de metales (transferrina y ceruloplasmina) Coenzima Q Indefinido

/ambos Peroxidasa Ubiquinol-10 Ácido úrico no enzmaitico peroxidación Producción de lipidica Proteínas que

ligan metales

Lactoferrinas No enz

-Quelante del ion Fe3+

Sistemas

proteolíticos Transferrinas No enzimatico tranportador del -Quelante y ion Fe3+ Ceruloplasmina No enzimático -Quelante y transportador del ion Cu3+ Albúminas no enzimatico Haptoglobinas Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(10)

10

OBJETIVOS

Los objetivos de este trabajo de fin de grado se centran en describir cuales son los métodos analíticos mas usados para la cuantificación y determinación de la capacidad antioxidante total de diferentes antioxidantes en las muestras biológicas, entre las que se encuentran muestras de saliva, sangre, suero, plasma, orina. Por lo tanto, servirá para cuantificar la capacidad del organismo para responder ante los diferentes daños, ya sean externos (como medicamos, tóxicos entre otros) o internos (procesos metabólicos o de defensa), los cuales pueden llegar a generar diferentes patologías en el organismo.

No se tendrá en cuenta aquellas pruebas que determinan la capacidad antioxidante en muestras que solo sirvan para cuantificar esta capacidad antioxidante en muestras de suelo, agua, aire, plantas, alimentos, bebidas, etc.

El segundo objetivo será cuantificar la capacidad antioxidante especifica de otros antioxidantes que podemos encontrar en los seres vivos, ya sea enzimas como SOD (superóxido dismutasa), GPx (Glutation peroxidasa), GR (Glutation reductasa), CAT (catalasa) u otros no enzimáticos como glutatión y las vitamina C y E.

METODOLOGÍA

Para llevar a cabo este estudio, una revisión bibliografía, se llevo a cabo una búsqueda a través de diferentes bases de datos como Google Académico, Science Direct, SciELO.

La búsqueda se especificó palabras claves, ya fueren en ingles o español, de “capacidad antioxidante”, “sangre”, “plasma”, “orina”, “actividad antioxidante”, o directamente indicando el método o la enzima o antioxidante a estudiar como “ ORAC”, “FRAD”, “TRAP”, “ TEAC”, “SOD”, “ CAT”, “GP” entre otros.

Para evitar posibles errores y obtener resultados de mediciones de la capacidad o actividad antioxidantes que no correspondieran al análisis de animales, se especificó la exclusión de términos como cualquier tipo de planta, alimento, bebida, etc.

Por último, no hay que olvidar que aunque la obtención de resultados sea muy amplia, a veces no se obtiene un acceso total y libre a todos esos posibles artículos que obtenemos en un principio por lo que la revisión bibliográfica no llega a ser tan exacta y detallada. Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(11)

11

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Existen dos mecanismos por los cuales los antioxidantes pueden actuar son mediante transferencia de átomos de hidrogeno o mediante la transferencia de electrones. La transferencia de átomos de hidrogeno o HAT se representa por la siguiente reacción donde X* es el radical y AH el antioxidante; el radical A* es mal estable que el inicial. (Pérez Jiménez, 2007)

En el caso de de la reacciones de transferencia de electrones el antioxidante transfiere un electrón para reducir el compuesto, incluyendo metales, carbonilos y radicales siguiendo la siguiente reacción (Pérez Jiménez, 2007):

Métodos para medir la capacidad antioxidante total en muestras biológicas A) Secuestradores de radicales

A.1) Secuestradores radicales peroxilo

- Ensayo de transferencia de átomos de hidrogeno

ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity o Capacidad de absorción de radicales de oxigeno)

Esta técnica determina la capacidad antioxidante mediante un método fluorimétrico. En primer lugar mediante la descomposición térmica de un azoderivado AAPH (2,2 '-azo-bis (2-amidino-propano) dihidrocloruro) se generara un radical peroxilo. Este intentara oxidar un sensor/marcador oxidable y fluorescente (una proteína como la ficoeritrina o un sensor fluorescente como la fluoresceína) y por el contrario el antioxidante intentara evitar esta oxidación. A medida que el radical oxide el sensor fluorescente este irá perdiendo poco a poco su fluorescencia (dicha

fluorescencia se registrara con un fluorimetro). (Karadag et al., 2009; Niki, 2010)

(12)

12

Para calcular la capacidad antioxidante se tendrá en cuenta el rendimiento neto de en AUC (área bajo la curva) en un periodo de tiempo, es decir, el AUC en presencia

de un antioxidante menos el AUC en ausencia del antioxidante. (Karadag et al., 2009;

Niki, 2010). Por lo tanto, combina porcentaje de inhibición y la duración de tiempo de inhibición de la acción de radicales libres por los antioxidantes en una única cantidad.

(Cao et al., 1998). Con la finalidad de poder comparar los resultados obtenidos, para

distintas muestras y matrices se emplea un patrón interno que es un análogo de vitamina E y se expresara en equivalentes de Trolox (análogo de la vitamina E), un antioxidante

estándar generalmente utilizado como valor de referencia. (Shahidi et al., 2015)

El método ORAC tiene una alta especificidad y responde a diversos antioxidantes en muestras biológicas de plasma y suero. Entre los antioxidantes que se puede cuantificar encontramos algunos proteicos como la albumina y otros no proteicos como vitaminas, acido úrico y bilirrubina, otros compuestos puros que también puede determinar son la melatonina, dopamina o flavonoides. Sin embargo, uno de los inconvenientes frente a otros métodos es que el ensayo ORAC requiere ~ 60 min más de

la FRAP o ensayo Randox-TEAC para cuantificar los resultados. (Cao et al., 1998;

Karadag et al., 2009)

En la Figura 2 se muestra como debido la acción de los antioxidantes la fluorescencia se mantendrá en el tiempo ya que evita que el radical peroxilo reacción con la fluoresceina y más adelante ya si irá perdiendo al florescencia. (Pacheco, 2001)

Esta ralentización de la perdida de florescencia se representa gráficamente en la Figura 3, en la que se observa como a medida que aumenta la concentración de antioxidante el descenso de las líneas (% fluorescencia) se va desplazando a la derecha, ya que tarda más tiempo en reaccionar. (Peter J., 2012)

(13)

13

TRAP (Total radical trapping power o poder de captación de radicales totales)

Al igual que el método ORAC se utiliza un azo-iniciador como es el caso de AAPH o ABAP para generar los radicales peroxilos, pero en vez de medir la perdida de fluorescencia se mide el oxigeno consumido durante la reacción.

A medida que se incorpore la muestra con antioxidantes se irá controlando el oxigeno consumido por el mismo. El periodo en el que la oxidación se inhibe por el antioxidante se compara con una muestra con el Trolox un antioxidante de referencia. Los resultados se expresan en equivalentes de Trolox (mmol de peroxilo capturado por molécula de Trolox/L plasma).esta prueba se puede realizar en plasma, suero o sangre.

(Fernández Pachón et al., 2006; Ugartondo, 2009; Vasconcelos et al., 2007)

Con este método podemos obtener resultados de antioxidantes como ascorbato, alfa- tocoferol, acudo úrico en incluso antioxidantes con grupos tiol. Se considera un método simple, fiable y permite un manejo rápido de las muestras. Hay que tener en cuenta que existen posibles errores debido a la acción sinérgica entre algunos antioxidantes como es el caso de ascórbico y los derivados tiol que pueden hacer que se produzca un pérdida de capacidad antioxidante que si se midieran por separado. (Ghiselli et al., 1995)

A.2) Secuestradores de radicales estables

-Ensayo de transferencia de electrones

TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity o capacidad antioxidante de equivalentes al Trolox)

El ensayo TEAC es una técnica espectrofotométrica que se basa en la inhibición por parte de los antioxidantes de la absorbancia del catión radical de ABTS (2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), un cromóforo azul-verde y estable que tiene

un espectro de absorción de longitud de onda larga característico. (Prior et al., 1999;

Shahidi et al., 2015) Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(14)

14

En primer lugar se generan cationes radicales de ABTS; a partir de peróxido de

hidrogeno H2O2 u otros oxidantes fuertes como

persulfato potásico en presencia de

metamioglobina generan un radical intermedio ferrilmioglobina que luego reacciona con ABTS para formar el catión radical ABTS.

A continuación los antioxidantes pueden neutralizar estos cationes radicales mediante la transferencia de electrones u átomos de hidrogeno (ET y HAT). Esto hace que el catión radical (cromóforo) vaya perdiendo coloración y por lo tanto la disminución de la absorción espectrofotométrica. El porcentaje de inhibición de la formación catión radical ABTS por la muestra antioxidante añadido en un punto de tiempo fijo se cuantifica como el resultado. Los cuales se expresan en equivalentes de Trolox( mmol de Trolox/L de muestra problema). Este método es aplicable para el

estudio de antioxidantes liposolubles e hidrosolubles. (Cao et al., 1998; Shahidi et al.,

2015)

El tiempo de inhibición se fija en 3 min en el ensayo de Randox-TEAC, habitualmente se emplean 6 min como fue utilizado en el procedimiento original ensayo TEAC. Los kits comerciales para el ensayo TEAC eran caros; el coste de reactivos por muestra en el ensayo Randox-TEAC era ~ 9 veces mayor que en el ensayo ORAC. Sin embargo, el ensayo ORAC requiere un detector de fluorescencia y toma 70 min para completar.

Este método es útil con respecto a las actividades antioxidantes de fitoquímicos

(flavonóides) en muestras de suero, saliva u orina. (Cao et al., 1998)

FRAP ((Ferric ion Reducing Antioxidant Power o Capacidad antioxidante para Reducir el ion Férrico )

El ensayo FRAP también se trata de un método espectrofotométrico que mide la reducción de un complejo formado por un cromógeno, normalmente de TPTZ (2, 4,

Formación del radical ABTS mediante el persulfato de potasio. (Santa Cruz Cifuentes, 2011) Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

(15)

15

tripiridil-s-triazina), y hierro férrico ( ) incoloro a un complejo ferroso de un

intenso color azul verdoso en presencia de antioxidantes en un medio acido. Es muy simple y barato, pueden reducir diferentes antioxidantes no enzimáticos como es el caso de vitamina C (ácido ascórbico) y otros como acido úrico, entre otros; pero no mide los antioxidantes que contienen grupos SH, tal como el glutatión, acido lipóico y algunos

aminoácidos, ya que estos no reducen de forma efectiva el a . Se utiliza en

muestras de saliva, suero, plasma, orina o fluidos biológicos. (Cao et al., 1998;

Fernández Pachón et al., 2006; Mora H., 2009)

Figura 5: Reacción del complejo cromóforo de hierro tras actuar el antioxidante sobre este (pasando de a ). (Pérez Jiménez, 2007)

La actividad antioxidante se determina como aumento de la absorbancia de

forma lineal y los resultados se expresan como mg equivalentes de _{o micromolar}

de _{. (Antolovich}_{et al.,}_{2002; Suarez, 2008)}

B) Métodos para medir la capacidad antioxidante especifica en muestras biológicas B.1) Sistemas enzimáticos

Determinación de la actividad superoxido dismutasa (SOD) eritrocitaria

Uno de los métodos utilizados para la determinación de de la actividad enzimática de la SOD. Es un método espectrofotométrico que mide la actividad de la enzima por el grado de inhibición de la siguiente reacción. A partir de la xantina y xantina oxidasa (XO) se forman radicales superóxido, los cuales reaccionan con

compuesto para formar un complejo coloreado. (Blanco Hernández et al., 2004;

Jimenez, V., 2013)

Se determina espectrofotométricamente la inhibición de la formación de dicho cromógeno debido a la eliminación del superóxido por acción de SOD, de esta manera

(16)

16

se obtendrá el porcentaje de inhibición del enzima. Los resultados se expresan en

Unidades/mg de proteína por minuto.(SotoCastruita et al., 2015; Jimenez, V., 2013)

Glutatión peroxidasa GPX eritrocitaria

En este caso también se mide la disminución de absorción en un espectrofotómetro por un método indirecto. El glutatión peroxidado GPx cataliza la oxidación del glutatión GSH por el hidróxido de cumeno a glutatión oxidado GSSG. Y este será convertido otra vez a glutatión reducido por la enzima glutatión reductasa GR

con la ayuda de NADPH que se transformará a NADP+. (Blanco Hernández et al.,

2004)

Enzima GPx.:

Enzima GR:

La tasa de formación de GSH es monitoreada mediante la disminución de la absorbancia por el consumo de NADPH. La diferencia de consumo de de NADPH entre el blanco y la muestra determinara la activada enzimática, la cual será proporcional a la disminución de la absorbancia debido a la desaparición de NADPH.

(Ceballos et al., 1999; Floriano Sanchez, 2009)

Glutatión reductasa GR

Este análisis se realiza utilizando una técnica espectrofotométrica. Dicho enzima necesita la acción del NADPH para producirse, esta transformación del NADPH en NADP es la que se detecta espectrofotométricamente para cuantificar la actividad del

enzima. (Vasconcelos et al., 2007)

Determinación de la actividad catalasa (CAT)

Una de las técnicas para determinar la actividad enzimática de la CAT es una técnica espectrofotométrica. El método de Aebi se fundamenta en la descomposición de

H2O2 catalizada por la enzima catalasa. Para cuantificar la actividad del enzima se

cuantifica la disminución de absorbancia debido a la disminución de H2O2 con respecto

a una muestra con blanco. (Cárdenas, 2007)

(17)

17

B.2) Sistemas no enzimáticos

Glutatión

La concentración total de glutatión (GSH + GSSG) se puede medir usando diferentes métodos uno de los más utilizados es por cromatografía liquida de alta eficacia (HPLC). Que más tarde después de la separación serán detectados por absorbancia en el UV, detección por fluorescencia, detección electroquímica, y

espectrometría de masas. (Vulcano et al., 2013)

Vitamina C o Ascórbico.

El método estándar más utilizado para la separación y el análisis de la vitamina C es la cromatografía liquida de alta eficacia (HPLC). Sin embargo, este método

requiere equipos altamente especializados y un alto nivel de habilidad técnica. (Choy et

al., 2000)

Además, la detección de la vitamina C en el plasma o suero requiere precaución, ya que es un compuesto fácilmente oxidable. Debido a su facilidad de oxidación a neutral (fisiológica) o pH alcalino, se recomienda la acidificación plasma,

preferiblemente después de su separación por centrifugación. (Vasconcelos et al., 2007)

Vitamina E o Tocoferol

La medición de la vitamina E en suero, plasma, plaquetas y eritrocitos se realiza por una técnica cromatografía HPLC-RPC (cromatografía liquida de fase reversa). Los compuestos de la muestra se desplazaran dependiendo de la polaridad, los cuales se detectaran posteriormente mediante espectrofotometría y se cuantificaran tras la

comparación de los picos con una muestra estándar. (Sánchez et al., 2008)

CONCLUSIÓN

La formación de radicales libres en los seres vivos aunque pueden puedan verse favorecidas su formación por agentes exógenos, como el consumo de alimentos con alto contenido graso ( hamburguesas y aderezadas), alimentos procesados (embutidos), fritos o asados o con conservantes, o el exceso de alcohol, elementos químicos (medicamentos, pinturas, humo del tabaco, herbicidas, metales pesados o radiaciones

ionizantes(Olivares et al., 2010); O endógenas mediante reacción metabólicas

(18)

18

necesarias para la vida, el organismo tiende a equilibrar esta balanza para evitar este estrés oxidativo mediante la acción de los antioxidantes.

Como hemos visto en este estudio existen varios métodos para determinar cómo los organismos vivos pueden actuar frente a estas sustancias y como medir su capacidad antioxidante mediante los métodos más relevantes. Esto no quiere decir, que en la actualidad existan otros métodos, incluso varios métodos para determinar, por ejemplo, la misma enzima.

A medida que la investigación aumente se siguen buscando nuevos métodos o mejorando los ya existentes más específicos, selectivos y fiables, evitando así los posibles errores de medición que aun podemos encontrar, para así poder cuantificar de manera más exacta cual es la capacidad antioxidante real.

El hecho de poder obtener resultados mas específicos, selectivos y fiables, nos ayudaran en un futuro a determinar qué factores pueden aumentar esta capacidad antioxidante para así incorporarlos a nuestros estilo de vida ( alimentos como frutas y verduras) y como consecuencia, los diversos procesos patológicos como envejecimiento, aterosclerosis, cáncer, cataratas, insuficiencia renal, diabetes, hipertensión, cirrosis o neurodegenerativas como Alzhéimer o Párkinson (Guerra, 2001); se podrían ver disminuidos en nuestra sociedad.

Aunque no hay que olvidar que el hecho de obtener unos resultados elevados de antioxidantes no nos indica necesariamente un resultado positivo, al igual que uno disminuido no nos indica un resultado bajo no nos indica un resultado negativo. Siempre hay que tener en cuenta el equilibrio entre los radicales libres y los antioxidantes.

BIBLIOGRAFIA

AMAZÁN, Daniel. Estudio de eficacia de una fuente de vitamina E natural (D-α-tocoferol) en

ganado porcino. 2013. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid.

ANTOLOVICH, Michael, Prenzler, P. D., Patsalides, E., McDonald, S., & Robards, K. Methods for testing antioxidant activity. Analyst, 2002, vol. 127, no 1, p. 183-198.

BARBOSA, K. B. F., Bressan, J., Zulet, M. A., & Martínez, J. A. Influencia de la dieta sobre marcadores plasmáticos de estrés oxidativo en humanos.En Anales del Sistema Sanitario de Navarra.

Gobierno de Navarra. Departamento de Salud, 2008. p. 259-280.

BLANCO HERNÁNDEZ, Ricardo, Ruíz-Ramos, M., Sánchez-Rodríguez, M. A., & Mendoza-Núñez, V. M. Lipoperóxidos, actividad antioxidante y factores pro-oxidantes en adultos mayores con diabetes mellitus tipo 2. Bioquimia, 2004, vol. 29, no 4, p. 118-125.

(19)

19 CAO, Guohua; Prior, R. L. Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clinical chemistry, 1998, vol. 44, no 6, p. 1309-1315.

CÁRDENAS FERNÁNDEZ, Anthony Max. Oxidación de proteínas y lípidos en cerebro de cobayos durante la exposición a las grandes alturas (4540 m). Tesis Doctoral, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2007.

CASTILLO SÁNCHEZ, Julián. Estrés oxidativo, antioxidantes y salud. Fundacion de estudios, médicos de Molina de Segura, 2010

CEBALLOS, Alejandro, Wittwer, F. G., Contreras, P. A., Quiroz, E., & Böhmwald, H.

Actividad de glutatión peroxidasa en bovinos lecheros a pastoreo correlacionada con la concentración sanguínea y plasmática de selenio. Pesq agropec bras, 1999, vol. 34, p. 2331-2338.

CHOY, Camus Kar Man; Benzie, I. F. F., & Cho, P. Ascorbic acid concentration and total antioxidant activity of human tear fluid measured using the FRASC assay. Investigative ophthalmology & visual science, 2000, vol. 41, no 11, p. 3293-3298.

FERNANDEZ PACHON, María Soledad, VILLAFIO, D., TRONCOSO, A. M., & García-Parrilla, M. Revisión de los métodos de evaluación de la actividad antioxidante in vitro del vino y valoración de sus efectos in vivo. Archivos latinoamericanos de nutrición, 2006, vol. 56, no 2, p. 110-122. FLORIANO SANCHEZ, E. S. A. U. Caracterización del estrés oxidativo y efectos del acido nordihidroguayaretico en un modelo de ratas expuestas a ozono. Tesis Doctoral. Instituto Politécnico Nacional (IPN), 2009.

GHISELLI, Andrea, Serafini, M., Maiani, G., Azzini, E., & Ferro-Luzzi, A. A fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability. Free Radical Biology and Medicine, 1995, vol. 18, no 1, p. 29-36.

GUERRA, JI Elejalde. Estrés oxidativo, enfermedades y tratamientos antioxidantes. En Anales de Medicina Interna, 2001. p. 326-335.

JIMENEZ, V. Evaluation of the oxidative stress modulation in Drosophila melanogaster strains deficient in endogenous antioxidants and with chronic exposure to casiopeina Cas II-gly and gamma

radiation. Tesis. Universidad Autonoma del Estado de Mexico, 2013.

KARADAG, Ayse, Ozcelik, B., & Saner, S. Review of methods to determine antioxidant capacities. Food analytical methods, 2009, vol. 2, no 1, p. 41-60.

LONDOÑO LONDOÑO, Julián. Antioxidantes: importancia biológica y métodos para medir su actividad. En Desarrollo y Transversalidad serie Lasallista Investigación y Ciencia. Corporación Universitaria Lasallista, 2012.

MAYOR OXILIA, Rosa. Oxidative stress and antioxidant defense system. Revista del Instituto de Medicina Tropical, 2010, vol. 5, no 2, p. 23-29.

MORA H, Ángela C. Caracterización del estrés oxidativo en ratas Wistar diabéticas por estreptozotocina.Vitae, 2009, vol. 16, no 3, p. 311-319.

MORAGÓN, Ángela Casado. Termalismo y actividad física. Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), 2007.

NIKI, Etsuo. Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo. Free Radical Biology and Medicine, 2010, vol. 49, no 4, p. 503-515.

OLIVARES, Luis Delgado, Cabrera, G. B., & Martínez, M. T. S. Importancia de los antioxidantes dietarios en la disminución del estrés oxidativo. Investigación y Ciencia, 2010, vol. 18, no 50, p. 10-15.

PACHECO, Elio Mujica. Biomarcadores de estrés oxidativo y capacidad antioxidante plasmática en la insuficiencia venosa. Tesis Doctoral. Universidad Autónoma de Madrid, 2011.

(20)

20 PÉREZ GASTELL, Pedro Luis, de Alejo, P., & Luis, J. Métodos para medir el daño oxidativo.

Revista Cubana de Medicina Militar, 2000, vol. 29, no 3, p. 192-198.

PETER J. Brescia. Determinación del potencial antioxidante usando un análisis de capacidad de

absorbencia Radical oxígeno (ORAC) con Synergy™ H4. Biotek, 2012.

PÉREZ JIMÉNEZ, Jara. Metodología para la evaluacion de ingredientes funcionales antioxidantes efectos de fibra antioxidante de uva en status antioxidante y parametros de riesgo

cardiovascular en humanos. Tesis Doctoral. Universidad Autónoma de Madrid, 2007.

PRIOR, Ronald L.; Cao, G. In vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical methods 1. Free Radical Biology and Medicine, 1999, vol. 27, no 11, p. 1173-1181.

PRIOR, Ronald L.; Cao, G. In vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical methods 1. Bio-Assays for Oxidative Stress Status, 2001, Pages 39-47

POLO DE SANTOS, Mª. Estudio de la actividad antioxidante de las aguas mineromedicinales.

Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid, 2016.

RODRÍGUEZ PERÓN, José Miguel; Menéndez López, J. R., & Trujillo López, Y. Radicales libres en la biomedicina y estrés oxidativo. Revista cubana de medicina militar, 2001, vol. 30, no 1, p. 15-20.

SÁNCHEZ M., Maribel C.; Rodríguez A., R. A.; Martín D., V, Sepúlveda P., L.E.; Sutil N, R.; Contreras Freddy; Mary Lare; Eukaris Maurera. Estrés y vitaminas antioxidantes en pacientes diabéticos Tipo 2. Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica, 2008, vol. 27, no 1, p. 59-65.

SÁNCHEZ VALLE, Vicente; Méndez-Sánchez, N. Estrés oxidativo, antioxidantes y enfermedad. Revista de Investigacion Medica Sur Mexico, 2013, vol. 20, no 3, p. 161-168.

SANTA CRUZ CIFUENTES, Liliana Andrea. Análisis químico de antocianinas en frutos silvestres colombianos. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de Colombia, 2011.

SHAHIDI, Fereidoon, Zhong, Y. Measurement of antioxidant activity. Journal of functional foods, 2015, vol. 18, p. 757-781.

SOTO CASTRUITA, Alejandro. Daño a la integridad del ADN y la membrana del

espermatozoide de conejo Nueva Zelanda blanco causados por sobrepeso. Tesis. Universidad Autonoma

Metropolitana, 2015.

SUAREZ PALOS, Del Rosario, G. M. Evaluacion de la actividad antioxidante de la chaya (cnidoscolus chayamansa) en un modelo experimental de diabetes en ratas wistar. Tesis Doctoral. Instituto Politecnico Nacional, 2008.

UGARTONDO, V. Caracterización de derivados polifenólicos obtenidos de fuentes naturales. Citotoxicidad y capacidad antioxidante frente a estrés oxidativo en modelos celulares. Universitat de Barcelona. Facultad de farmacia, 2009.

VASCONCELOS, Sandra Mary Lima, Goulart, M. O. F., Moura, J. B. D. F., Manfredini, V., Benfato, M. D. S., & Kubota, L. T. Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo em sangue humano: principais métodos analíticos para sua determinação.

Química Nova, São Paulo. Vol. 30, n. 5, p. 1323-1338, 2007.

VENEREO GUTIÉRREZ, Justo R. Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes. Revista Cubana de medicina militar, 2002, vol. 31, no 2, p. 126-133.

VULCANO, Laura Andrea Denzoin, Soraci, A. L., & Tapia, M. O. Homeostasis del glutatión.

Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, 2013, vol. 47, no 3, p. 529-539.