Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli in childrentreated at an inter-zonal pediatric hospital in the city of La Plata

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www.elsevier.es/ram

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G

E

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I

N

A

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E

MICROBIOLOGÍA

ORIGINAL

Detección

y

caracterización

de

Escherichia

coli

productor

de

toxina

Shiga

en

ni˜

nos

atendidos

en

un

hospital

pediátrico

interzonal

de

la

ciudad

de

La

Plata

Sebastián

Oderiz

a_,_∗

_,

_Gerardo

_A.

_Leotta

b

_y

_Lucía

_Galli

b

a_Sala_de_{Microbiología,}_Hospital_Interzonal_de_Agudos_{Especializado}_en_Pediatría_Superiora_Sor_María_Ludovica,_La_Plata,_Buenos

Aires,Argentina

b_Instituto_de_Genética_Veterinaria_Ing._Fernando_N._Dulout_(IGEVET)_{(UNLP-CONICET,}_La_Plata),_Facultad_de_Ciencias_{Veterinarias,}

LaPlata,BuenosAires,Argentina

Recibidoel28demarzode2017;aceptadoel3deagostode2017

PALABRASCLAVE EscherichiacoliO157; Diarrea;

SUH;

Caracterización molecular

Resumen EscherichiacoliproductordetoxinaShiga(STEC)esunpatógenotransmitido por alimentos quepuede causardiarreaacuosa,diarrea sanguinolenta(DS)y síndromeurémico hemolítico(SUH).Elobjetivodeesteestudiofuedeterminarlascaracterísticasfenotípicasy genotípicasdecepasSTECaisladasdeniñosconDSySUHatendidosenunhospitalpediátricode laciudaddeLaPlataenelperíodo2006-2012yestablecerlarelaciónclonaldelos aislamien-tosO157:H7medianteelectroforesisdecampopulsado.Elporcentajedemuestraspositivas fuede4,9y39,2%enlospacientesquepresentaronDSySUH, respectivamente.Seaislaron 77cepasSTECde10serotiposdistintos,conel100%derecuperacióndecolonias.Elserotipo másfrecuentefueO157:H7(71,4%),seguidoporO145:NM(15,6%).El98,2%delosaislamientos O157:H7correspondióalbiotipoCyfuesensiblealosantibióticosensayados.Todosesos ais-lamientospresentaronelgenotipostx2,eae,fliCH7,ehxA,iha,efa, toxB,lpfA1-3ylpfA2-2. Alestudiar larelaciónclonaldelascepasO157:H7,seidentificaronuntotalde42patrones conalmenosun88%desimilitudyseestablecieron6clústeresqueagruparoncepascon perfi-lesidénticos.LosaislamientoseaenegativospertenecieronalosserotiposO59:H19,O102:H6, O174:NMyO174:H21.LascepasO59:H19yO174:H21fueronpositivasparaelgen aggR.Este estudiomuestraqueenlaciudaddeLaPlatayalrededorescirculanSTECdediferentes seroti-posygenotipos.ApesardeladiversidadgenéticaobservadaentrelosaislamientosO157:H7, algunosfueronindistinguiblesporlastécnicasdesubtipificaciónutilizadas.

∗_Autor_para_{correspondencia.}

Correoelectrónico:sebastianoderiz@yahoo.com.ar(S.Oderiz).

https://doi.org/10.1016/j.ram.2017.08.008

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Cómocitar este artículo:Oderiz S, etal. Detección y caracterización deEscherichia coli productor de toxina Shiga en ni˜nos atendidos en un hospital pediátrico interzonal de la ciudad de La Plata. Rev Argent Microbiol. 2018. https://doi.org/10.1016/j.ram.2017.08.008

ARTICLE IN PRESS

+Model

RAM-247; No.ofPages10

2 S.Oderizetal.

KEYWORDS

EscherichiacoliO157; Diarrhea;

HUS; Molecular characterization

DetectionandcharacterizationofShigatoxin-producingEscherichiacoliinchildren treatedataninter-zonalpediatrichospitalinthecityofLaPlata

Abstract Shigatoxin-producingEscherichiacoli(STEC)isafoodbornepathogenthatcancause waterydiarrhea,bloodydiarrhea(BD),andhemolyticuremicsyndrome(HUS).Theobjective ofthisstudywastodeterminethephenotypicandgenotypicprofilesofSTECstrainsisolated fromchildrenwith BDandHUStreatedatapediatrichospitalinthecityofLaPlata inthe period2006-2012,andtoestablishtheclonalrelationshipofO157:H7isolatesbypulsedfield electrophoresis.Thepercentageofpositivesampleswas4.9%and39.2%inpatientswithBDand HUS,respectively.Seventy-sevenSTECstrainsfrom10differentserotypeswereisolated,with 100%colonyrecovery,O157:H7beingthemostfrequent(71.4%)serotype,followedbyO145:NM (15.6%).Anaverageof98.2%ofO157:H7isolatesbelongedtobiotypeCandweresensitiveto alltheantibioticstested.Allofthem(100%)carriedgenotypestx2,eae,fliCH7,ehxA,iha,efa,

toxB,lpfA1-3andlpfA2-2.WhentheclonalrelationshipoftheO157:H7strainswasstudied,a totalof42patternswithatleast88%similaritywereidentiﬁed,and6clusterswithidentical proﬁleswereestablished.Theeae-negativeisolatesbelongedtoserotypesO59:H19,O102:H6, O174:NMandO174:H21.ThestrainsO59:H19andO174:H21werepositiveforthe aggRgene. ThisstudyshowsthatSTECofdifferentserotypesandgenotypescirculateinthecityofLaPlata andsurroundings.DespitethegeneticdiversityobservedbetweentheO157:H7isolates,some wereindistinguishablebythesubtypingtechniquesused.

Introducción

Lasenfermedadesdiarreicasagudasconstituyenunodelos problemasdesaludpúblicamásseriosenlospaísesenvías dedesarrollo,conaltastasasdemorbimortalidad,ysonla segundacausademortalidadenmenoresde5a˜nos37_.

Losagentesenteropatógenosresponsablesdelasdiarreas agudasson múltiplesypueden ser deorigenviral, bacte-rianooparasitario; sonfrecuentes las asociacionesde 2o másdeellos.Losvirus,principalmentelosdelgénero

Rota-virus,causandel70al80%delasdiarreasinfecciosasylas

bacteriasocasionanel10-20%deloscasos.Entrelosagentes bacterianoshabitualesseencuentranCampylobacterspp.,

Shigellaspp., Salmonella notyphi, Clostridiumdifﬁcile y

Escherichiacolidiarreigénicos,ytambiénotros40_.

E. coli productor de toxina Shiga (STEC) es un pató-genozoonótico principalmentetransmitido por alimentos. Puede causar una variedad de manifestaciones clínicas, desde infecciones asintomáticas o diarrea leve a mode-radahasta enfermedadgrave, comocolitis hemorrágica y síndromeurémicohemolítico(SUH)35_._Las_cepas_STEC

per-tenecen a un amplio rango de serotipos2_, _aunque _E. _coli

O157:H7eselserotipomásfrecuentementeasociadoa gran-desbrotesycasosesporádicosdecolitishemorrágicaySUH entodo elmundo. Sinembargo, otrosserogruposdeSTEC tambiénhansidoreconocidosporsupotencialpatogénico, yaquesonaisladosfrecuentementedecasosdeenfermedad humana24_.

El principalfactor de virulencia delas cepas STECson las denominadas toxinas Shiga, codiﬁcadas por los genes

stx38_._La_adhesina_intimina,_codiﬁcada_por_el_gen_eae_,_está

involucradaenlaadherenciaíntimadelas bacteriasa los enterocitos33_._Sin_embargo,_las_cepas_STEC_que_carecen_de

este gentambién puedenocasionar enfermedadenel ser

humano.Sibiennosehaestablecidoaúnquécombinación demarcadoresdeﬁnenqueunacepaSTECresultepatógena, lapresenciadelosgenesstx/eaeseasociaconunriesgode enfermedadmásgrave14_.

EnArgentina, elSUHposentérico esendémicoy repre-senta la principal causa de insuficiencia renal aguda e hipertensiónarterialenlactantesyniñosylasegundacausa de insuficiencia renal crónicay detrasplante renal25_._Las

cepas STECfueron identiﬁcadascomo el principal agente etiológico;sinembargo,nosonrutinariamente diagnostica-dasentodosloslaboratoriosdemicrobiología34_.

Elobjetivodelpresentetrabajofuedeterminarmediante unanálisisretrospectivolafrecuenciadeaparicióndeSTEC en muestras fecales de ni˜nos con diagnóstico clínico de diarreaagudasanguinolentaySUHatendidosenelHospital EspecializadoenPediatríaSorMaríaLudovicadelaciudad deLaPlata.Asimismo,sebuscódeterminarelperﬁl fenotí-picoygenotípicodelascepasSTECrecuperadasyestablecer larelaciónclonaldelascepasdeE.coliO157:H7mediante electroforesisengeldecampopulsado(PFGE).

Materiales

y

métodos

Muestrasestudiadas

Desdeel 1demarzode2006hasta el30dediciembre de 2012 se estudiaron 1.051 muestras de materia fecal (MF) obtenidas porevacuación espontánea (una por paciente). Estas comprendieron107 muestras depacientescon diag-nóstico de SUH y 944 muestras de pacientes con diarrea aguda,deloscuales 731(77,4%) presentarondiarrea san-guinolenta(DS)y213(22,6%)diarreanosanguinolenta,por observaciónmicroscópicaalmomentodelarecolección.

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Paralaseleccióndeloscasosseestipularonlas siguien-tescondiciones:personapreviamentesanamenorde14años condiagnósticopresuntivodeDSocaso clínicamente con-firmado de SUH posentérico, con no más de 14 días de evoluciónalmomentodelatomademuestra.Loscriterios deexclusiónfueronlossiguientes:a)niñoscon diarreade másde14díasdeevolución;b)antecedentesdeenfermedad intestinal inflamatoria crónica; c) inmunocomprometidos; d) pacientes con infección nosocomial; e) SUH familiar, recurrente,secundario,noinfecciosooasociadocon

infec-ción por Streptococcuspneumoniae. Lademora promedio

enlatomademuestras paraeldiagnósticomicrobiológico enaquellospacientesquedesarrollaronSUHfuede7días (intervalo:1-15días)desdeelcomienzodelossíntomas. Cultivomicrobiológicoprimarioyaislamiento deSTEC

LasmuestrasdeMFfueronprocesadasportécnicas micro-biológicas estandarizadas antesde las 2h de recogidas o conservadasenmediodetransporteCary-Blairy refrigera-dasa 4◦C hastasuprocesamiento22_._A _partir_de_las _zonas

de crecimiento conﬂuente,se realizó la detección de los genesstx1,stx2yrfbO157porPCRmúltiple30.Decada

mues-trapositivaseanalizaron10coloniastípicasdeE.coli,hasta lograr identiﬁcarla colonia stxpositiva. Las cepasfueron conservadasa−70◦Cparasuposteriorcaracterización. Caracterizaciónfenotípicadelosaislamientos deSTEC

Los aislamientos fueron identificados por pruebas bioquí-micasconvencionalesyutilizandoelsistemaautomatizado Vitek-2 Compact (bioMérieux, Mercy l´ıEtoile, Francia). La identificación de los antígenos somáticos y flagelares fue realizada por aglutinación con antisueros específi-cos provistos por el Instituto Nacional de Producción deBiológicos-ANLISDr.CarlosG.Malbrán.Losaislamientos deE.coliO157:H7fueron clasificadosen4biotipos,según la capacidad de fermentar los azúcaresrafinosa, dulcitol yramnosa29_._La_producción _de_Stx_se_determinó _mediante

ELISA (PremierTM _EHEC, _Meridian _Diagnostics, _Cincinnati,

Ohio, EE. UU.) y la de enterohemolisina (EHEC-HlyA) fue determinadaenplacasdeagarsangreovina3_.

La sensibilidad antimicrobiana se determinó según el

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI )10_.

Se ensayaron los siguientes antimicrobianos: ampicilina (10mg), amoxicilina/ácido clavulánico (20/10mg), cefa-lotina (30mg), cefoxitina (30mg), ceftazidima (30mg), cefotaxima (10mg), piperacilina/tazobactama, imipenem (10mg), meropenem (10mg), gentamicina (10mg), amica-cina(30mg),ácidonalidíxico(30mg),ciproﬂoxacina(5mg), trimetoprima-sulfametoxazol (1,25/23,75mg), nitrofuran-toína(300mg),fosfomicina(200mg),tetraciclina(30mg)y colistina(10mg).

Caracterizacióngenotípicadelosaislamientos deSTEC

Todoslosaislamientosde STECfueron analizadosporPCR paraladeteccióndelosgeneseae,ﬂiCH7,ehxA,saa,iha,

efa/lifA, toxB, lpfA1,lpfA2, cdt-V, subABy astA19,20_. _Los

genes aggR y aaiC fueron detectadosporPCR entiempo real16_.

Subtipiﬁcaciónmoleculardelosaislamientos deSTEC

Elanálisisdelossubtiposdestx1serealizóporPCR,según

metodologíapreviamentepublicada44_._La_{identiﬁcación}_de

lossubtiposdestx2fuerealizadaporPCR-RFLP49yporPCR

múltiple, según metodologíapreviamente publicada44_. _La

técnicadePFGE sedesarrollóutilizando elprotocolo Pul-seNet de 24-48h para E. coli7 _O157:H7. _El _ADN _de _cada

cepa contenido en bloques de agarosa fue digerido con 30U dela enzima derestricción XbaI (ThermoScientiﬁc) a37◦Cdurante3h.Losperﬁlesmolecularesobtenidospor

XbaI-PFGE fueron documentados utilizando el sistema de adquisicióndeimágenesMaestroGenslider® _imager

(Maes-trogen Inc., Nevada, EE. UU.). Las imágenes en formato TIFF fueron analizadas con el software BioNumerics ver-sión6.6 (Applied Maths,Sint-Martens-Latem, Bélgica). La relaciónentre los perﬁlesfue estimada mediante la pro-porcióndebandascompartidasaplicandoelcoeﬁcientede similitud de Dice y generando dendrogramas basados en el método unweighted pair group method with arithme-ticmean(UPGMA).Lascepasfueronagrupadasenclústeres cuandomostraronidénticopatrónXbaI-PFGE(100%de simi-litud).

Resultados

Seencontraron77(7,33%)muestraspositivasparaalmenos unodelossiguientesgenes:stx1,stx2yrfbO157.Apartirde

esasmuestrasfueronaisladas77cepasSTEC.Serecuperaron 35cepasdelospacientescondiagnósticodeDS(4,8%)y42 delospacientesconSUH(39,2%).

Entrelospacientesinfectados,elgrupoetarioconmayor proporción de casos fue el de niños menores de 5 años (75,3%);la edadpromediodentrodeesegrupode afecta-dosfuede23,5meses.Elgrupode5a9añosrepresentóel 16,9%,mientrasqueel2,6%fuerondelgrupode10a14años. El5,2%restantefueron casosnotificadossinespecificarla edad.Paratodoslosgrupos,elserotipoO157:H7fueelde mayorprevalencia.

La media de edad del grupo de pacientes con DS fue 45,3 meses (intervalo: 7-152 meses) y la del grupo con SUHfue29,1meses(intervalo:6-142meses).El62%delos pacientesconSUHteníanmenosde2añosylamayor inci-denciaseobservóenlosniñosdeunaño.Encambio,el63% delospacientesconDSeranmayoresde2años;lamayor incidenciaseobservóenelgrupode5a9años.

Caracterizaciónfenotípicadelosaislamientos Seserotipiﬁcaron76cepasSTEC(98,7%).Deellas,55(71,4%) fueronO157:H7biotipoC,solounacepapertenecióal bio-tipoDy22cepas(28,6%)fueronnoO157.Dentrodelgrupo noO157, el serotipo O145:NM fue el demayor prevalen-cia, seguido por O121:H19.La frecuenciade serotiposde lascepassegúneldiagnósticosedetallaenlatabla1.

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ARTICLE IN PRESS

+Model

4 S.Oderizetal.

Tabla1 Frecuenciadeserotipossegúndiagnóstico

Serotipo Diagnósticoclínico Totaln(%)

Diarreasanguinolenta Síndromeurémicohemolítico

n(%)decepas n(%)decepas O157:H7 25(69,4) 30(73,2) 55(71,4) O145:NM 6(16,7) 6(14,6) 12(15,6) O121:H19 - 3(7,3) 3(3,9) O26:H11 1 - 1(1,3) O59:H19 1 - 1(1,3) O102:H6 1 - 1(1,3) O103:NM 1 - 1(1,3) O174:NM - 1 1(1,3) O174:H21 - 1 1(1,3) Ont:NM - 1 1(1,3) Total 35(45) 42(55) 77(100)

Ont:antígenoOnotipable;NM:nomóvil.

La producción de toxina Shiga determinada mediante ELISA se demostró en 76 de las 77 cepas estudiadas. La únicaexcepción fuela cepaO102:H6,asociada a uncaso dediarrealeve.Laactividadhemolítica,compatibleconla presenciadeEHEC-Hly,fuedetectadaen73cepas(94,8%). Elfenotipoa-hemolíticonofuedetectadoenningunadelas cepasestudiadas.Fueronsensiblesatodoslosantibióticos ensayados74cepas(96%).Tresaislamientosfueron resisten-tesaunsoloantibiótico:O157:H7(AMPr_),_O145:NM_(TETr₎_y Ont:NM(TMSr_).

Caracterizacióngenotípicadelosaislamientos Los perﬁles genotípicos de las cepas aisladas de pacien-tesconDSfueron lossiguientes:stx2/rfbO157 (68,6%),stx2 (25,8%), stx1/stx2 (2,8%) y stx1/stx2/rfbO157 (2,8%). Los de las cepas aisladas de pacientes con SUH fueron el stx2/rfbO157(71,5%)yelstx2(28,5%).

Fueroneaepositivas73cepas(95%).Lascepaseae nega-tivas pertenecieron a los serotipos O59:H19, O102:H6, O174:NMyO174:H21.Enestas4cepasseensayóla presen-ciadelosgenesaggRyaaiC,lascepasO59:H19yO174:H21 fueronaggRpositivas.

TodoslosaislamientosO157:H7fueronpositivosparalos genesrfbO157,ﬂiCH7iha,efa1ytoxB.Entrelosaislamientos noO157,sedetectóelgendelaadhesinaihaen18deellos (81,8%),elefa1en17(77,2%)yeltoxBen16(72,7%).Solo lacepaO59:H19fuenegativa paralos3genes simultánea-mente.

Utilizando la clasiﬁcación experimental de las distin-tasvariantes delosgeneslpfA1 ylpfA248_,_todas_las_cepas

O157:H7portaronlasvarianteslpfA1-3ylpfA2-2.Lascepas O145:NMportaronlasvarianteslpfA1-5ylpfA2-3.Entrelos aislamientos distintos a O157:H7 y O145:NM, lpfA2-1 fue lavariante másprevalente (100%), 5de esos aislamientos fueron,además,positivosalpfA1-2.Nosepudoestablecer ningunaasociaciónentrelapresenciadealgunavarianteen particulardelpfA yla gravedaddelaenfermedad(SUHo DS).Sinembargo,seobservóquelosaislamientosO157:H7 yO145:NMmantuvieronlamismacombinacióndevariantes

lpfA,independientementedelaenfermedadasociada.

Nosedetectólapresenciadelosgenessaa,subAB,cdt-V

ni astA en ninguna de las cepas estudiadas. La caracte-rización genotípica de los aislamientos se muestra en la tabla2.

Subtipiﬁcaciónmoleculardelosaislamientos Alestudiarelgenotipodestxdelas 55cepasO157:H7,se halló que 42 de ellas (76,4%) fueron stx2a/stx2c(vh-a), este

fueel subtipopredominante, independientementede que setrataradecepasaisladasdepacientesconDSoconSUH. En las cepas noO157, el subtipo más frecuentefue stx2a

(77%)(tabla3).

Al analizar los productos de restricción obtenidos tras digerir el genoma de 51 cepas de E. coli O157:H7 con la enzima de restricción XbaI, se encontró que se genera-ron42patronesdebandasdiferentes,conalmenosun88% de similitud entreellos.Cuatro cepas quedaronexcluidas delanálisisporquesuADNsedegradórepetidasveces.Los patrones presentaron entre16 y22 bandas, con tama˜nos aproximados de 40 a 600 kpb.El porcentaje de similitud entrelascepasserepresentóenundendrogramade homolo-gíautilizandoelalgoritmoUPGMA(ﬁg.1).Delos42patrones de bandasobtenidos, 36 resultaronser únicos y15 cepas fueronagrupadasen6clústeres:clústerI(SML72,73y74), clústerII(SML8,9,y10),clústerIII(SML39,40y77),clúster IV(SML22y26),clústerV(SML6y19)yclústerVI(SML32y 43).

Las 3cepas agrupadas en el clúster I se aislaron de 3pacientes con DS que no requirieron internación. Estos3pacientesvivíanenlaciudaddeLaPlata,enunradio de500myelcomienzodelossíntomasdiﬁrióen32días. Aunquenofueposibleestablecerlafuentedeinfecciónen ningunodeloscasos,mediantelainformación epidemioló-gicadisponibleseidentiﬁcócomolaúnicavariableencomún elconsumodecremasheladascompradasenelmismolocal comercial.

Lascepas agrupadasen elclúster II fueron aisladas de 3casosdeSUHocurridosenenerode2007,enunperíodode 15díasyen2ciudadesdistintas,LaPlatayOlavarría, distan-tes330kmentresí.Sinembargo,losdatosepidemiológicos

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este artículo: Oderiz S, et al. Detección y caracterización de Escherichia coli productor de toxina Shiga atendidos en un hospital pediátrico interzonal de la ciudad de La Plata. Re v Argent Microbiol. 2018.

AR

TICLE IN PRESS

of P ages 10 caracterización de STEC en La Plata 5

Tabla2 CaracterizaciónmoleculardelosaislamientosSTECrecuperadosdepacientesconDSySUHatendidosenelHospitaldeNi˜nosdeLaPlata(n=77) Serotipo Enfermedad

asociada

N.de cepas

Númerodecepaspositivas

stx1 stx2 ehxA eae iha efa1 toxB lpfA1-1lpfA1-2lpfA1-3lpfA1-4lpfA1-5lpfA2-1lpfA2-2lpfA2-3saa subABcdt-V ast1

O157:H7 SUH 30 0 30 30 30 30 30 30 0 0 30 0 0 0 30 0 0 0 0 0 O157:H7 DS 25 1 25 25 25 25 25 25 0 0 25 0 0 0 25 0 0 0 0 0 O145:NM SUH 6 0 6 5 6 6 6 5 0 0 0 0 6 0 0 6 0 0 0 0 O145:NM DS 6 0 6 6 6 6 6 6 0 0 0 0 6 0 0 6 0 0 0 0 O121:H19 SUH 3 0 3 3 3 0 3 2 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 O26:H11 DS 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 O59:H19 DS 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 O102:H6 DS 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 O103:NM DS 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 O174:NM SUH 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 O174:H21 SUH 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Ont:NM SUH 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Total (%) 77(100) 2 (2,6) 77 (100) 73 (95) 73 (95) 73 (95) 72 (94) 71 (92) 0 5 (6,5) 55 (71,4) 0 12 (15,6) 10 (13) 55 (71,4) 12 (15,6) 0 0 0 0

NM:nomóvil;Ont:antígenosomáticonotipable;ehxA:hemolisinadeEHEC;eae:intimina;iha:adhesinahomólogaaIrgA;efa:factorparalaadherenciadeE.colienterohemorrágico;

toxB:proteínaplasmídicaqueparticipaenlaadherenciadeSTEC;lpfA:subunidadmayordelaﬁmbriapolarlarga;saa:adhesinaautoaglutinantedeSTEC;subAB:subtilasa;cdt-V:toxina citoletal;ast1:enterotoxinatermoestabledeE.colienteroagregativa.

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+Model

6 S.Oderizetal.

Tabla3 Genotipostxdelascepasaisladasenelperíodo deestudio(n=77)

Serotipo Diagnóstico clínico

n(%)decepas Genotipostx O157:H7 SUH 20(26) stx2a/stx2c(vh-a)

SUH 8(10,4) stx2a SUH 2(2,6) stx2c(vh-a) DS 22(28,6) stx2a/stx2c(vh-a) DS 1 stx2a DS 1 stx2c(vh-a) DS 1 stx1a/stx2a/stx2c(vh-a) O145:NM SUH 6(7,8) stx2a O145:NM DS 6(7,8) stx2a O121:H19 SUH 3(3,9) stx2a O26:H11 DS 1 stx1a/stx2a/stx2c(vh-a) O59:H19 DS 1 stx2a O102:H6 DS 1 stx2b O103:NM DS 1 stx2a/stx2c(vh-a) O174:NM SUH 1 stx2a O174:H21 SUH 1 stx2d

Ont:NM SUH 1 stx2a/stx2c(vh-a)

fueroninsuﬁcientesparaestablecerunnexoentreloscasos. LascepasdelclústerIVposeíanidénticogenotipostxy fue-ronrecuperadasde pacientesque desarrollaron SUH,uno condomicilioenBrandsenyelotroenAzul,perolosdatos epidemiológicos disponibles no permitieron establecer un nexoentreellos.

Las cepas agrupadas en el clúster VI poseían idéntico genotipo stx y fueron aisladas en La Plata de un caso dediarreaconsangreydeotrocasoconSUH,con5a˜nosde diferenciaentreellos.Lascepasagrupadasenlosclústeres IIIyVfuerondiferenciadasporelgenotipodestx.

Discusión

Mediantetécnicasmicrobiológicasestándarytamizajepor PCRseinvestigólapresenciadeSTECenMFdeniñoscon diagnósticopresuntivodeDSySUHatendidosenel Hospi-taldeNiñosSorMaríaLudovica»de laciudaddeLaPlata desdeelaño2006.Unanálisisretrospectivodepacientescon diarreaaguda basadoenlosresultados obtenidosdurante 6 años mostró la presencia de STEC enel 4,8% de aque-llosquepresentabanDSyfuenegativoeltamizajeentodos lospacientes con diarrea. Estosresultados nodifieren de losobtenidosenotrosestudiosrealizadosennuestropaís,a pesardelaslimitacionesenlavigilancia,ydelosobservados enelrestodelmundo.

Enpaísespocodesarrollados,larecuperacióndeSTECes menordel2%enni˜nospeque˜noscongastroenteritis9,12_y_en

losEE.UU.latasadedeteccióndeSTECvadel0al4,1%de lasmuestrasenviadasaloslaboratorios23_.

En Argentina, Rivero et al.43 _detectaron _la _presencia

deSTECenel10,1%(44/437)delasmuestrasanalizadasde ni˜noscondiarreaaguda;enel27,3%deellosladiarreaera nosanguinolenta, adiferencia deloquesucedió en nues-troestudio.En2012,López etal.32 _efectuaron_un_estudio

prospectivode2.435ni˜nos(edades:0,5-15a˜nos)condiarrea acuosaosanguinolenta,ydetectaronlapresenciadeSTEC

enel4,1%delospacientesquepresentarondiarreaacuosa demenosde5díasdeevolución,DSdemenosde36hde duración,oambas.Sinembargo,laincidenciadeinfección porSTECfuesigniﬁcativamentemayorenpacientesconDS. AlestudiaralospacientesquedesarrollaronSUH posen-térico,pudimosevidenciarlapresenciadeSTECenel39,2% delacohorteanalizada.Estosresultadossonsimilaresalos reportadosporotrosautoresennuestropaís41,43_y_en_Chile39_,

peroinferioresalosobtenidosenFrancia15_y_en_un_estudio

que abarcó Austria y Alemania21_. _Estas _diferencias _en_las

tasasdedetecciónorecuperacióndeSTECpuedendepender dediversosfactores,entrelosqueseencuentraneltiempo transcurridoentreeliniciodelossíntomasylarecolección dela muestra,la metodologíautilizada parala detección oelaislamientodelosmicroorganismos,elusodeterapia antimicrobianaantesdeldiagnósticocerteroyotros.

Apartirdeunestudioprospectivo,Tarretal.46

informa-ronlarecuperaciónde E.coliO157:H7enel 91,4%delas muestras de pacientes que desarrollaron SUHposentérico cuandoaquellaseranobtenidasentrelos3y6díasdesde eliniciodeladiarrea,perolarecuperaciónbajabaal33% sisedemorabanmásde7díasenrecolectarlas.Esdecir,al momentoquesemanifestabaelSUH,el67%delospacientes noteníanO157:H7enlaMF.

OtrofactorimportanteparaasociarelSUHconla infec-ciónporSTECeslametodologíautilizadaparaladetección del microorganismo. Labúsqueda decitotoxinas libres en MF,elusodeanticuerposantitoxinaShigaoanti-LPSO157en suero,lautilizacióndeseparacióninmunomagnéticacomo técnicadeinmunoconcentracióndeSTECylaampliﬁcación porPCRcomotécnicadetamizajepermitenaumentar sus-tancialmentelaevidenciadeinfecciónporSTEC21,41_._En_el

presente trabajo, la combinación de procedimientos bac-teriológicos y la ampliﬁcación por PCR múltiple aplicada permitieronmejorareldiagnósticodeSTECennuestro hos-pital.

En un análisis retrospectivo realizado en nuestro laboratorio22_se_estudiaron_7.075_pacientes_con_diarrea.

Uti-lizando agar MacConkey sorbitol para la recuperación de STECysinefectuartamizajeporPCR,soloserecuperaron 5 aislamientosdeE. coliO157:H7a lolargo de3 a˜nosde estudio.

Cuandoseanalizólaedad delospacientesconSUH,la mediadelgrupofuede29,1meses(intervalo:6-142meses), el62%eramenorde2añosylamayorincidenciaseobservó enlosniñosdeunaño.Estoshallazgossonunreflejodela situación observada ennuestro país1_. _En_cambio, _la_edad

promedio del grupo de pacientes con DS fue 45,3 meses (intervalo:7-152meses).

Diversosautoreshanreportadoquelospacientes meno-resexpuestosaSTECpresentanmásriesgodeevolucionar a enfermedad grave4_. _Este _fenómeno _podría _responder _a

un problema de competencia bacteriana y de inmunidad cruzada, yaque losni˜nos mayores olos queproceden de ambientesconcondicionessanitariasdeﬁcientesamenudo presentan ----o han presentado---- otras infecciones intesti-nalescausadaspormicroorganismosquepodríanimpediro limitareldesarrollodeSTEC.

Las cepas STEC caracterizadas pertenecieron a varios serotipos (tabla 1), la mayoría asociados con enfermedad graveenloshumanos.E.coliO157:H7fueelprincipalagente etiológicodeSUHposentérico(73,2%)yelserotipoSTECfue

(7)

PFGE-Xbal PF GE-Xbal N.º cepa SML20 SML21 SML13 SML51 SML44 SML23 SML55 SML5 SML7 SML33 SML70 SML12 SML30 SML72 SML73 SML74 SML22 SML26 SML27 SML60 SML14 SML28 SML61 SML19 SML6 SML47 SML57 SML48 SML58 SML46 SML29 SML10 SML8 SML9 SML42 SML24 SML69 SML25 SML39 SML40 SML77 SML34 SML37 SML35 SML71 SML32 SML43 SML2 SML41 SML52 SML53 La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata La Plata Florencio Varela Granbourg S/D S/D Berisso Trenque Lauquen Bolivar Lomas de Zamora Almirante Brown Olavarria Berazategui Berazategui S/D S/D S/D Berisso Berisso Gral. Lamadrid Brandsen Brandsen Azul Azul Florencio Varela Bavio Tandil Tandil S/D Quilmes Ensenada Localidad Clúster l Clúster lV Clúster V Clúster ll Clúster lll Clúster Vl

Figura1 Dedrogramadelarelacióngenéticaentre51cepasE.coliO157:H7estudiadasporXbal-PFGE,connúmerodecepay localidad.

elprevalenteentrelospacientesconDSestudiados(69,4%). Este serotipo esresponsable de másdel 70% delos casos de SUHposentérico enArgentina34 _y _es _el _principal

sero-tipoaislado enChile,Japón, Canadá,EE. UU. ypaísesde la UE11,36,39_. _Con _respecto _a _STEC _no _O157, _los _serotipos

implicadosvaríansegúnelpaís,aunqueciertosserogrupos, comoO26,O103,O111yO145,sonlosdescriptosconmayor frecuencia12,21,27_. _En _el _presente _estudio, _se _recuperaron

cepasSTECnoO157enel28,5%deloscasosyelserotipomás frecuentefueO145:NM,aligualqueenelrestodenuestro país34_.

AlestudiarlaexpresiónfenotípicadelastoxinasShiga, sepudocomprobarlaproducción deestasen76delas77 cepasestudiadas.LaúnicaexcepciónfuelacepaO102:H6 portadoradelgenstx2b,elcualcodiﬁcaunatoxinaqueno

(8)

ARTICLE IN PRESS

+Model

8 S.Oderizetal.

El presente estudio reﬂeja una elevada sensibilidad a los antimicrobianos en las cepas STEC de origen humano circulantesennuestraregión.Apesardelusoinadecuado de antibióticos en casos de diarrea que se observa en Argentina43_----a_lo_que_se_suma_el_uso_de_diversos_{antibióticos}

comopromotoresdecrecimientoenganadooenmedicina veterinaria45_----,_la_presión_de_selección_que_estos_ejercen_no

severeﬂejadaenlapérdidadesensibilidadalos antimicro-bianosdelascepasSTECdeorigenhumano50_._En_contraste,

losaislamientoseuropeosdeSTECmuestrangradosvariables deresistencia,ylaproporcióndeaislamientos multirresis-tentes(aquellosqueresistena3omásantimicrobianos)es cercanaal20%36_.

Lavigilanciamoleculardeestospatógenoshumanos per-mitiócaracterizarlas cepascirculantesenlaregióndeLa Platayalrededores. Todas las cepasO157:H7 yel 82%de lasnoO157portaronel geneae. Estegen sedetectamás frecuentementeencepasaisladas depacientescon enfer-medad grave como SUH o DS que en aquellos pacientes conenfermedadmenosgraveo encontrolessanos4,26_. _Sin

embargo,lapresenciadeeaenoesesencialparala patogé-nesis.

ElbroteocurridoenEuropaenmayo/juliode2011, aso-ciadoalnuevopatotipodeEAECproductordetoxinaStx2ay alserotipoO104:H4,provocó3.141casosdediarrea/colitis hemorrágica, 881 casos de SUH y50 muertes5_. _Luego _de

ocurridoese brote,el comitécientíﬁco parapeligros bio-lógicosdelaUE14_propuso_ensayar_la_presencia_de_los_genes

aggR (regulador transcripcional) y aaiC (proteína secre-tada),ambosmarcadoresgenéticoscaracterísticosdeEAEC, entodaslascepasSTECeaenegativas.Siguiendoesa reco-mendación,todaslascepaseaenegativasanalizadaseneste trabajofueronevaluadasparaestosgenes.Elhallazgoenlas cepasSML49serotipoO59:H19 ySML67serotipoO174:H21 desecuencias relacionadascon EAEC (presenciade aggR) encepasproductorasdetoxinaShigaesunhechopoco fre-cuenteennuestro país6_. _{Probablemente}_estas_cepas _STEC

adquirieronportransferenciahorizontalelplásmidode viru-lenciadecepasEAEC,yaqueelgen aaiC(codiﬁcadoenel cromosoma)estáausenteenambas.Sibienesinteresante este hallazgo, se desconoce el impacto de este probable híbridoenlasaludpúblicayserequierenestudios adiciona-lessobreestascepas.

Enestudiospreviossehamostradoquelavirulenciade lascepasSTECparaloshumanosestárelacionadaconeltipo detoxinaShigaproducidaporlabacteria18_._En_este_estudio

sedetectólapresenciadestx2enel100%delascepas

estu-diadasysolo2cepasportabanconjuntamentestx1ystx2.Al

estudiarlossubtiposdestx,lapresenciasimultáneadestx2a

ystx2c(vh-a)sedetectóenel76%delosaislamientosO157:H7.

Estoshallazgossonsimilares alosreportadospreviamente enArgentina,dondemásdel90%delascepasO157:H7 pre-sentanestacombinación13,31_._Este_genotipo_fue_asociado_con

enfermedadgraveenloshumanosysedemostró queestá presentemás frecuentemente enpacientes conDS ySUH queotrossubtipos18_.

LavirulenciadelascepasSTECpuedenoestar relacio-nadaexclusivamentecon laproduccióndetoxinasShiga e intimina, sino también con la presencia de otras adhesi-nasytoxinas.Lafrecuenciadeaparicióndelas adhesinas putativas estudiadas no diﬁere de la reportada por otros autores8,19,20,47_. _A _pesar _de _no _estar _relacionadas _con _el

potencialpatogénico delascepas28_,_las _adhesinas_podrían

serunimportantefactordecolonizaciónespecie-especíﬁco. En este punto cabe resaltar que la combinación

lpfA1-5/lpfA2-3 hallada en las cepas O145:NM se describe por

primera vezenel presentetrabajo, yesdistintade otras cepas O145 descriptas con anterioridad48_. _Asimismo, _no

debemos excluir la posibilidad de complicaciones de la enfermedadatribuiblesaestosfactores.Esdedestacarque ninguna de las cepas STECcaracterizadas en el presente estudio presentósecuencias asociadas a las toxinas subti-lasa, Cdt-VyEast-1.Sinembargo,surelevancia clínicano debeignorarse,debidoaldemostradopotencialpatogénico delascepasconestosfactoresdevirulencia.

LascepasdeE.coliO157:H7presentaronunaltogrado de diversidad genética, tal como se describe en trabajos previosrealizados enArgentina42_._Además, _en_el _presente

trabajo se identificaron cepas con idéntico patrón XbaI -PFGErecuperadas endistintaslocalidadesyendiferentes años,loqueimplicaríaqueestánampliamentediseminadas ypersistenatravésdelosaños.

La aplicación de técnicas de epidemiología molecular contribuyeamejorarlavigilanciadeSTECypermiteintegrar losresultadosdelaboratorioconlosdatosepidemiológicos, perosuimplementaciónentiemporealyelaccesoabases dedatosnacionalesyregionalesesfundamentalpara identi-ficarenformatempranalaprobableocurrenciadeunbrote ynotificarlaalas autoridades,quedebenocuparsedelas accionesdecontrol.Estoquedódemostradoalidentificarun probablebroteporcepasdelclústerIvariosañosdespués dehaberocurrido.

Lagravedaddelascomplicacionesquesuelenacompa˜nar alas infeccionesasociadas conSTECponeenevidencia la necesidaddereforzarlavigilanciaactivaenloslaboratorios demicrobiologíaclínicaennuestropaís,implementar pro-tocolospara ladetecciónde STECymejorar lacapacidad diagnósticayanalíticadeaquellos.Además,nuestros resul-tadosponendemaniﬁestolaimportanciadecompletar la caracterizaciónfenotípicaygenotípicadelosaislamientos entiemporeal,yaqueestosdatospermitendeterminarel tipodecepasqueestáncirculandoennuestropaís.

Conﬂicto

de

intereses

Losautoresdeclarannotenerningúnconﬂictodeintereses.

Agradecimientos

LosautoresagradecenalaBqca.SilvinaGiugnoporsu cola-boraciónenlarecolección,recepciónyconservacióndelas muestras. AlaDra.NoraL.Padolaporsucolaboraciónen la serotipiﬁcación delas cepas STEC no-O157y a la Dra. AlejandraLonderoporsucolaboraciónenelanálisisdelos patrones XbaI-PFGE.

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