Degradación de fenol por medio de bacterias aisladas de agua de mar de Cartagena

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Degradación  de  fenol  por  medio  de  bacterias  aisladas  de  

agua  de  mar  de  Cartagena  

 

Valeria  Albán  Domínguez  

 

Proyecto  de  Grado  Ingeniería  Ambiental,  Asesora:  Johana  Husserl,  Departamento  de  Ingeniería   Civil  y  Ambiental,  Universidad  de  los  Andes,  Bogotá-­‐Colombia,  Junio  de  2014.    

Resumen  

 

En   este   estudio   se   evaluó   la   capacidad   de   bacterias   aisladas     de   las   aguas   de   la   bahía   de   Cartagena   para   degradar   fenol.   Para   ello   se   utilizó   cuatro   cepas   de   dicho   ambiente   y   se   determinó  la  degradación  de  fenol  de  las  bacterias  durante  3  días  en  frascos  de  agitación  con   medio   de   soporte   plásticos   utilizando   fenol   como   única   fuente   de   carbono   a   una   concentración   inicial   de   30   ppm.   Los   resultados   indicaron   que   la   cepa  Paenibacillus   lactis  

(Cepa   7B)   fue   la   que   mejor   degrado   fenol.   Los   parámetros   cinéticos   de   dicha   cepa   fueron   identificados  por  medio  del  modelo  de  Monod,  haciendo  ensayos  a  concentraciones  iniciales   de  fenol  de  0,5,10,20  y  30  ppm  y  determinando  la  concentración  inicial  de  biomasa  (7  mg/L)  .     Los   parámetros   cinéticos   calculados   fueron   la   tasa   máxima   de   utilización   del   sustrato   k=     0,084  mg  fenol/mg  biomasa;  y  el  coeficiente  medio  de  saturación  Ks=  48,02  mg  fenol/L.    

Palabras  clave:  Bahía  de  Cartagena,  degradación  de  fenol,  Paenibacillus  lactis,  modelo  de  Monod.  

 

Abstract  

 

In  this  study  was  estimated  the  ability  of  isolated  bacterium  from  waters  of  The  Cartagena   Bay   to   degrade   phenol.   For   the   four   strains   used   of   said   environment   was   established   the   phenol  degradation  of  bacteria  during  3  days  in  shake  flasks  with  plastic  support  ambience   using   phenol   as   the   sole   carbon   source   at   an   initial   concentration   of   30   ppm.   The   results   revealed  that  the  strain  Paenibacillus  lactis  (strain  7B)  showed  the  best  phenol  degradation.   The  kinetic  parameters  of  this  strain  were  identified  by  Monod  model,  making  tests  of  initial   phenol   concentrations   of   0,5,10,20   and   30   ppm   and   determining   the   initial   biomass   concentration  (7  mg  /  L).  The  kinetic  parameters  calculated  were  at  the  maximum  substrate   utilization  rate  k  =  0.084  mg  phenol  /  mg  biomass;  and  the  half  saturation  coefficient  Ks  =   48.02  mg  phenol/  L.    

 

Key  words:  The  Cartagena  Bay,  phenol  degradation,  Paenibacillus  lactis,  Monod´s  model    

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Introducción  

 

La  contaminación  producto  de  la  actividad  industrial  es  un  tema  de  gran  importancia  en  la   actualidad  debido  a  las  implicaciones  que  esta  contaminación  trae  al  medio  ambiente  y  a  la   salud   pública  (Brooks & Michael, 2012).   Por   ello,   a   medida   que   incrementa   el   desarrollo   industrial,   se   busca     implementar   tecnologías   y   sistemas   de   remediación   que   traten   los   diferentes   contaminantes   que   son   perjudiciales   para   las   personas   y   los   ecosistemas.   Los   vertimientos   de   aguas   en   industrias   y   empresas   son   uno   de   las   principales   vectores   de   contaminación,  ya  que  la  mayoría  de  estos  llegan  a  fuentes  de  agua  naturales  que  en  muchos   casos   representan   un   recurso   esencial   para   diferentes   ecosistemas   y   poblaciones  (Smith,

Lingas, & Rahman).      

 

El   fenol   es   un   compuesto   orgánico   peligroso,   que   se   puede   detectar   en   fuentes   de   agua   naturales  sin  contaminación  a  concentraciones  menores  de  1  ppb  (ATSDR),  concentración   inferior   al   contenido   perjudicial   para   la   salud.   El   fenol   es   caracterizado   por   ser   reactivo,   tóxico,  inflamable  y  corrosivo (Environmental Health and Safety , 2003).  Este  elemento  puede   ser   absorbido   por     todas   las   rutas   de   exposición   y   puede   causar   efectos   sistemáticos,   o   letales  dependiendo  la  ruta,  la  concentración  y  la  frecuencia  de  exposición  del  contaminante   (Ministerio   de   Ambiente,   Vivienda   y   Desarrollo   Territorial,2003).   Por   estas   razones   la   agencia  de  protección  ambiental  de  los  Estados  Unidos  (USEPA)  y  la  Comunidad  Económica   Europea  lo  considera  como  un  contaminante  prioritario;  en  Colombia  se  encuentra  descrito   en  la  lista  de  residuos  peligrosos  en  el  Anexo  A  de  la  resolución  4741  del  2005  y  se  planea   regular   a   concentraciones   menores   de   0.2   ppm   (Ministerio de Ambiente y Desarrollo

Sostenible, 2012).  

 

Comúnmente   la   contaminación   por   fenol   está   dada   por   las   actividades   de   industrias   manufactureras   de   resina,   plástico,   fibras,   adhesivos,   hierro,   acero,   aluminio,   caucho   y   efluentes   de   manufactura   sintética   de   combustible;   también   es   encontrado   en   productos   comerciales  como  medicamentos,  lociones,  desinfectantes  y  otros  (Ministerio  de  Ambiente,   Vivienda  y  Desarrollo  Territorial,2003).  Generalmente,  en  las  aguas  residuales  petroleras  se   excede  la  concentración  de  fenol  que  se  quiere  regular  por  la  norma  Colombiana.  En  estudios   se  ha  encontrado  que  la  concentración  de  fenol  en  esta  agua  puede  variar  entre  1  y  20  mg/L   y   que   dichas   concentraciones   dependen   de     las   características   del   crudo,   de   la   tecnología   utilizadas  para  la  refinación  y  de  la  calidad  de  producto  que  quiera  obtenerse    (Díaz  y  otros,   2005;  Puentes,  2008)  

 

La   remoción   de   fenol   puede   darse   por   procesos   físico   químicos   como   la   adsorción,   la   oxidación   química   y   la   incineración,   entre   otros.   Dichos   procesos   tienen   asociados   costos   elevados   y   la   generación   de   subproductos   indeseables.   La   degradación   biológica   siempre   será   una   buena   alternativa   para   la   remoción   de   productos   orgánicos,   ya   que   reduce   considerablemente  los  costos  y  además  existe  la  posibilidad  de  completar  la  mineralización

(Mahammedilyas & Thangavelu, 2010).   A   pesar   de   esto,   la   toxicidad   de   este   contaminante    

puede  inhibir  los  microorganismos  presentes  en  el  agua,  evitando  con  ello  la  degradación  de   este   y   otros   contaminantes.   Afortunadamente,   varios   microorganismos   son   capaces   de   degradar   estos   compuestos   como   hongos   y   bacterias.   Algunas   de   dichas   especies   de  

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bacterias   son:  Pseudomonas   sp,   Arthrobacter   sp  y  Bacillus   sp,  con   las   que   se   han   realizado   múltiples  estudios  (Mahammedilyas & Thangavelu, 2010).    

 

Muchos   artículos   científicos   han   mostrado   que   la   biodegradación   solo   es   posible   para   concentraciones   que   no   superen   1000   ppm   debido   al   efecto   inhibidor   que   tiene   el   fenol   sobre  los  microorganismos (Kumar, Kumar, & Kumar, 2004).    En  los  ensayos  realizados  por   los  hermanos  Kumar  se  encuentra  que  la  degradación  por  Pseudomonas  putidas  en  frascos   de   agitación   para   concentraciones   de   1000   ppm   se   alcanza     en   162   horas.     Otros   estudios   demuestran   como   la   inmovilización   de   células   por   medio   de   un   bioreactor   de   membrana   pueden   incrementar   la   tasa   de   crecimiento   de   las   células   y   la   tasa   de   degradación   de   este   contaminante,   reduciendo   la   inhibición   del   fenol   a   concentraciones   mayores   de   1000   ppm  

(Loh, Chung, & Ang, 2000).     La   mayoría   de   estudios   se   han   realizado   con   concentraciones  

mayores   a   100   ppm   (Dey & Mukherjee, 2010),   concentraciones   que   exceden   significativamente   las   producidas   por   la   industria   petrolera   (Díaz   y   otros,   2005;   Puentes,   2008).  

 

En  este  ensayo  se  pretende  comparar  la  capacidad  de  degradación  de  fenol  de  cepas  aisladas   de   la   Bahía   de   Cartagena   bajo   concentraciones   que   pueden   encontrarse   en   las   aguas   producidas   en   la   industria   petrolera,   con   el   fin   de   proveer   una   alternativa   de   tratamiento   para  alcanzar  el  cumplimiento  de  la  norma  de  vertimientos  que  se  está  por  llevarse  a  cabo   en  el  país.  

 

Modelo  cinético

   

 Para  determinar  los  parámetros  cinéticos  se  asume    que  el  crecimiento  bacteriano,  usando   un  sustrato  inhibitorio  (fenol),  se  comporta  como  se  establece  en  el  modelo  de  crecimiento   cinético  de  Haldane,  propio  para  sustratos  inhibitorios  (Kumar  y  otros,  2004),  y  que  dicho   crecimiento  debe  ser  proporcional  a  la  utilización  del  sustrato.  Sin  embargo,  la  constante  de   inhibición  en  diferentes  estudios  es  mucho  más  grande  que  las  concentraciones  utilizadas  en   los  ensayos  de  este  proyecto  que  son  menores  a  30  ppm  (Ver  Tabla  1),  por  lo  tanto  puede   asumirse   que   para   las   concentraciones   utilizadas,   el   comportamiento   cinético   de   las   bacterias   se   asemeja   más   al   modelo   de   Monod   que   al   modelo   inhibitorio   descrito   por   Haldane.  

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Se  asume  que  debido  al  poco  tiempo  de  retención  de   los   microorganismos,   la   tasa   de   decaimiento   es  

despreciable.   También   se   asume   que   las  

concentraciones   utilizadas   en   los   ensayos   son   tan   bajas  comparadas  con  las  de  otros  estudios  (Tabla1)   que  no  se  presenta  inhibición  y  el  comportamiento  de   la  cinética  se  acerca  más  al  modelo  de  Monod.  

 

Nomenclatura:  

X       Concentración  biomasa  (mg/L)   S   Concentración  fenol  (mg/L)    

𝑣!     Velocidad  de  degradación  (mg  L-­‐1  h-­‐1)   𝑏   Tasa  específica  de  deacaimiento  bacteriano   (h-­‐1)  

k   Tasa  máxima  de  utilización  del  sustrato   (mgS/mgX)  

𝐾!   Concentración  de  sustrato  que  alcanza  la   mitad  de  la  velocidad  máxima  (mgS/L)  

𝐾!                    Constante  de  inhibición  (mg/L)    

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Con  ello  obtenemos  la  linealización  de  Monod,  por  medio  de  la  cual,  se  puede  determinar  k  y   𝐾!  a  partir  de  las  concentraciones  iniciales  de  fenol  y  el  cambio  de  la  concentración  de  fenol   en  el  tiempo,  conociendo  la  concentración  inicial  de  biomasa.  

 

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Tabla  1.  Resumen  estudios  de  biodegradación  de  fenol.  Está  tabla  ilustra  los  valores  de  Ki  para  diferentes  estudios  de   biodegradación  de  fenol,  para  cada  estudio  se  describe  la  cepa,  el  sistema  y  el  rango  de  concentraciones  utilizadas.  En  esta   tabla  se  puede  observar  que  el  valor  de  Ki  supera  las  100  ppm  para  cualquiera  de  los  estudios  citados,  concentración  mayor   a  las  trabajadas  en  este  ensayo  (30  ppm).  

Autor   Cepa   Sistema   Concentración  Rango  de  

(mg/L)   Ki  (mg/L)  

Pawlowsky  &  Howell   (1973)  

Cultivo  Mixto  I  

Discontinuo  

0-­‐900   173,0   Cultivo  Mixto  II  

(organismos  

filamentosos)   0-­‐1000   934,5  

Hill  &  Robinson  (1975)   Pseudomonas  putida     Discontinuo  y  continuo   0-­‐700   470,0  

Yang  &  Humpret  (1975)   Pseudomonas  putida     Continuo   0-­‐500   106,0  

Chi  &  Howell  (1976)   Pseudomonas  putida     Continuo   0-­‐900   380,0   Hutchinson  &  Robinson  

(1990)   Pseudomonas  putida     Discontinuo   0-­‐200   903,0   Kotturi  y  otros  (1991)   Pseudomonas  putida     Discontinuo   0-­‐200   377,0  

Livingston  and  Chase  

(1989)   sp.,  Pseudomonas  sp.)  Mixto  (Acineo  bacter   Discontinuo   0-­‐500   370,0  

Okaygun  y  otros  (1992)   Pseudomonas  sp.   Discontinuo   0-­‐170   170,0   Klebsiella  sp.   0-­‐230   454,8   Kumara  y  Paruchuri  

(1997)   Mixta   Discontinuo   60-­‐500   145,0   Tanyolac  y  Beyenal  

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Materiales  y  metodología  

 

Organismos   y   medio.   Las   cepas   utilizadas   fueron   aisladas   de   la   bahía   de   Cartagena   y   alimentadas  con  fenol  como  única  fuente  de  carbono  durante  meses  a  una  concentración  de   30  ppm.  En  un  comienzo  las  cepas    aisladas  fueron  catalogadas  como  la  cepa  2,  3,  7A  y  7B.   Posteriormente,  Las  cepa  7A  fue  identificada  como  Microbacteriumparaoxydans  y  la  7B  como  

Paenibacillus  lactis.  Las  cepas  2  y  3  aún  no  han  sido  identificadas.      

Para  alimentar  los  microorganismos  se  utilizó  medio  de  fenol,  un  medio  con  las  condiciones   de   salinidad   apropiadas   para   simular   la   características   de   los   vertimientos   de   la   industria   petrolera  y  garantizar  el  crecimiento  de  los  microorganismos  .  El  medio  se  compone  en    g/L   por  los  siguientes  nutrientes:  11.986  de  NaCl,  4.002  de  Na2SO4,  0.666  de  KCl,  0.097  de  KBr,   0.020  de  NHCO3,  0.027  de  H3BO3,  5.416  de  MgCl2,  0.059  de  K2HPO4,  0.060  NH4Cl,  0.003  de   FeSO4,  0.002  de  CaCL2.    Adicionalmente  por  cada  100mL  de  medio  se  añade  1mL  de  solución   de   trazas   que   tiene   como   componentes   en   g/L   los   siguientes   compuestos:   0.1   de   NaMoO4*6H2O,   0.1   de     CaSO4*5H2O,   0.1   H3BO3,   0.1  ZnSO4*7H2O.   A   la   solución   final   se   le  

añade  la  cantidad  necesaria  de  fenol  para  obtener  una  concentración  de  30  ppm.      

La   primera   fase   consiste   en   sembrar   los   microorganismos   en   agar   Luria-­‐Bertani     LB   para   estimular  su  crecimiento,  con  el  fin  de  apreciar  adecuadamente  las  colonias  y  de  esta  manera   corroborar   su   pureza.   Luego   se   realizan   las   siembras   en   el   medio   de   fenol   previamente   descrito.   los   pases   se   realizaron   en   la   cámara   de   flujo   (Labcanco   purifer   class   II)   con   los   materiales   y   reactivos   previamente   esterilizados   por   medio   del   Tuttnaur   autoclave-­‐   steam   sterilizer  y  de  un  filtro  para  solución  de  fenol  de  0.2  µm.    Luego  de  sembrar  las  cepas  en  las   cajas  Petri  con  medio  se  procedió  a    instalar  los  cultivos  en  la  Imperial  III  Incubator  (Labline)   a  una  temperatura  de  30ºC    para  garantizar  su  crecimiento.    

 

Método   Analítico:   4   amino   antipirina.   La   medición   de   las   concentraciones   de   fenol   se   determinaron  por  medio  del  método  colorimétrico  4  amino  antipirina.    Este  método  se  basa   en   la   reacción   de   los   compuestos   fenólicos   con   la   4   amino   antipirina   en   presencia   de   ferrocianuro  de  potasio  a  pH  de  10  para  formar  una  solución  estable  de  color  marrón  rojizo,   cuya  intensidad  determina  las  concentraciones  de  fenol  (NPDES, 1978).  

 

Para  la  utilización  del  método  es  necesario  realizar  la  curva  de  calibración,  que  relaciona  la   absorbancia   obtenida   en   el   espectrofotómetro   con   una   concentración   de   fenol   conocida.   Para  la  curva,  se  prepara  1mL  de  concentraciones  conocidas  de  fenol  que  varían  de  1  a  30   ppm.   Se   toma   1   mL   de   cada   montaje   y   de   las   concentraciones   conocidas   de   fenol   para   realizar  el  análisis  de  las  diferentes  muestras  en  tubos  ependor,  se  centrifuga    las  muestras   contenidas   en   los   tubos   a   13000   rpm   durante   1   minuto   a   una   temperatura   de   4ºC   en   él   Sorvall  Legend  17R  Centrifuge.    El  sobre  donante  obtenido  del  proceso  anterior  se  diluye  en   9  mL  de  agua  destilada  en  tubos  de  vidrio.  Se  adiciona  a  todos  los  tubos  0.5  mL  de    hidróxido   de   amonio   0.5N,   luego   0.25   mL   de   4-­‐aminoantipirina  al  2%   y   0.25   mL   de   ferrocianuro   de  

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potasio  al  8%.  Se  mezclaron  las  soluciones  con  el  Mixer  Maxi  mix  II  y  se  esperó  15  minutos   para  que  se  atenuara  el  color.    Se    procede  a  medir    la  absorbancia  a  una  longitud  de    onda   correspondiente  a  510nm  en  el  espectrofotómetro  Termo  Genesys  205-­‐K17,  y  se  determina   la  concentración  de  fenol  en  cada  muestra  relacionando  la  concentración  con  la  absorbancia   obtenida  por  medio  de  la  curva  de  calibración.  

 

Comparación  de  la  capacidad  de  remover  fenol.  Luego  de  que  las  bacterias  hayan  crecido  en  el   medio  con  fenol,  se  procede  a  realizar  los  montajes  para  comparar  la  degradabilidad  de  fenol   en  las  cepas.  Estos  consisten  en  sembrar  en  medio  de  fenol  las  cepas  de  estudio  e  incubarlas   durante  3  días  (72  horas).  Los  montajes  se  realizaron  en  tubos  falcón  con  medio  de  soporte   plástico  y  con  15  mL  de  medio  de  fenol  a  una  concentración  de  30  ppm,  se  incubaron  en  el   Lab-­‐line  Max  4000  a  una  temperatura  de  30.5ºC  y  a  una  velocidad  de  150  rpm.  Se  realizó  un   control   abiótico,   un   montaje   para   cada   uno   de   los   inóculos   descritos   anteriormente   y   un   duplicado  para  cada  uno  de  ellos.  Al  tercer  día  se  tomó  una  muestra  de  1mL  de  cada  ensayo  y   se  determinó  la  capacidad  de  degradación  de  fenol  por  el  método  4  amino  antipirina,  con  el   fin  de  escoger  la  cepa  que  mejor  degrada  fenol.    

 

Determinación   de   parámetros   cinéticos.  Luego   de   determinar   la   cepa   más   eficiente   para   degradar  fenol,  Paenibacillus  lactis,  se  procede  a  determinar  los  parámetros  cinéticos  de  está.   Para   la   determinación   de   los   parámetros   cinéticos   se   realizó   tres   ensayos.   Cada   ensayo   consistía  en  frascos  de  agitación  con  medio  de  soporte  que  contenían  15  mL  de  medio  fenol  a   concentraciones  de  0,  5  10,  20  y  30  ppm  (para  cada  montaje  se  hizo  un  duplicado).  Dos  de   los  ensayos  fueron  inoculados  por  una  colonia  de  la  cepa  a  analizar1,    y  el  ensayo  restante  no   fue  inoculado  y  se  utilizó  como  control  abiótico.    

 

Determinación  concentración  inicial  de  biomasa.  Para   la   determinación   de   la   concentración   de  biomasa  se  pesaron  colonias  en  la  balanza  Duzico  (Ohaus).  Para  ello  se  utilizó  palillos  de   madera  con  los  que  se  cogió  una  colonia  sembrada  en  medio  LB.  En  el  plato  de  la  balanza  se   colocó  el  palillo  sobre  un  clínex  y  se  calculó  la  diferencia  de  peso  entre  el  palillo  con  y  sin  la   colonia  

Resultados  

 

Para  cada  análisis  de  lectura  de  la  concentración  de  fenol  (4-­‐aminoantipirina)  se  realizó  una   curva  de  calibración,  en  la  que  se  aseguro  que  el  coeficiente  de  regresión    fuera  mayor  a  0.95,   con   el   fin   de   reducir   la   incertidumbre   al   calcular   concentraciones   a   partir   de   las   absorbancias   leídas   en   el   espectrofotómetro.   A   continuación   se   enseña   la   curva   de   calibración   realizada   para   determinar   la   concentración   remanente   de   fenol   en   los   ensayos   realizados  para  comparar  la  capacidad  de  degradación  de  cada  cepa  (Grafica    2).    

 

                                                                                                               

1  No  se  logró  inocular    los  montajes  con  el  mismo  contenido  de  biomasa  debido  a  la  dificultad  de  la  

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Grafica    1.  Curva  de  calibración.  Esta  curva  se  modifico  con  el  fin  de  obtener  un  coeficiente  de  correlación  lineal  

de  0,99.  Los  puntos  azules  corresponden  a  los  que  fueron  omitidos  al  realizar  la  regresión.    

Luego  de  analizar  y  manejarlos  datos    obtenidos  se  concluye  que  la  cepa  Paenibacillus  lactis  

es   la   única   cepa   que   muestra   una   degradación   estadísticamente   relevante   de   fenol,   alcanzando   un   porcentaje   de   aproximadamente   65%   en   72   horas.   De   estos   resultados   también  se  puede  determinar  que  la  degradación  biológica  no  es  la  única  fuente  de  remoción   de  fenol,  sino  que  también  otros  mecanismos  como  la  adsorción  demuestran  un  decaimiento   de  la  concentración  de  fenol  en  el  tiempo,  esto  es  evidente  ya  que  en  el  control  abiótico  se   reduce  la  concentración  inicial  de  fenol  que  corresponde  a  30  ppm  (Ver  Gráfica  2).  

 

   

Grafica    2.Concentración  remanente  de  fenol.    En  está  gráfica  se  muestra  la  concentración  de  fenol  pasadas  las  

72  horas  de  realizados  los  montajes.  La  concentración  inicial  de  fenol  fue  de  30  ppm  para  todos  los  montajes.  

Debido  a  la  sobresaliente  degradación  de  la  cepa  Paenibacillus  lactis  comparada  con   las   otras   cepas,  se   eligió   está   para   realizar   el   análisis   cinético   y   determinar   la   tasa   máxima   de   utilización   del   sustrato   k   y   la   concentración   de   sustrato   que   alcanza   la   mitad  de  la  velocidad  máxima  Ks.  Los  resultados  de  los  ensayos  muestran  que  hay  una  

y  =  0,0103x   R²  =  0,99149  

-­‐0,1   0   0,1   0,2   0,3   0,4  

0   5   10   15   20   25   30   35  

A

b

so

rb

an

ci

a  

 

Concentración  (ppm)  

Microbacteriu mparaoxydans

Paenibacillus   lactis

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gran   variabilidad   en   los   resultados   obtenidos,   a   pesar   que   las   concentraciones   iniciales  y  las  condiciones  de  los  montajes  son  las  mismas  (Grafica    3).    

 

   

Grafica    3.  Sustrato  final  de  los  ensayos  para  calcular  parámetros  cinéticos.  En  esta  gráfica  se  observa  la   concentración  remanente  de  fenol  para  cada  concentración  inicial  de  fenol  conocida.  Para  ambos  ensayos  se  

realizaron  montajes  con  0,  5,  10,  20  y  30  ppm  inoculados  con  una  colonia  de  Paenibacillus  lactis.    

La   velocidad   de   degradación   presenta   un   comportamiento   lineal   respecto   a   la   concentración   inicial   de   fenol   a   las   concentraciones   trabajadas   en   este   estudio   (menores  a  30  ppm),  lo  que  indica  que  a  mayor  sustrato  inicial  será  menor  el  tiempo   de  degradación  del  fenol,  esto  es  consistente  con  el  supuesto  de  que  se  está  trabajando   muy   por   debajo   de   la   concentración   de   inhibición   de   fenol   y   por   tanto   el   comportamiento   inhibitorio   del   fenol   es   despreciable.   Este   comportamiento   puede   observarse  en  la  Grafica  4.  En  dicha  gráfica  está  incluida  la  velocidad  de  remoción  del   control  abiótico  que  es  independiente  de  la  degradación  de  las  bacterias,  y  es  pequeña   comparada  con  la  remoción  total2.  Esto  indica  que  la  mayor  parte  de  la  remoción  de   fenol  se  debe  a  la  degradación  por  parte  de  la  cepa  Paenibacillus  lactis.  

 

                                                                                                               

2  Para  el  control  abiótico  se  realizo  la  lectura  de  fenol  al  inicio  y  a  los  tres  días  de  transcurrido  el  

montaje,  con  el  fin  de  eliminar  el  error  correspondiente  a  la  degradación  de  la  solución  de  fenol  a  través   del  tiempo.  En  la  gráfica  4  se  puede  observar  que  para  las  cantidades  de  la  solución  agregadas  

(0,5,10,20  y  30)  la  concentración  resultante  de  fenol  fue  significativamente  menor,  lo  cual  indica  que  es   importante  tener  este  factor  en  cuenta.  

0   2   4   6   8   10   12   14  

0   5   10   20   30  

Con

cen

trac

ión

 reman

en

te  de  fen

ol  

lu

ego

 d

e  

7

2

 h

or

as  

(p

p

m

)  

Montaje  (Concentraión  inicial    de  fenol  en   ppm)  

(9)

 

Grafica    4.  Relación  entre  velocidad  de  degradación  y  la  concentración  inicial  de  fenol.    En  esta  gráfica  se   muestra  la  velocidad  de  degradación  de  fenol    

 

Los  datos  tienen  una  tendencia  a  comportarse  como  el  modelo  de  Monod  (Ver  gráfica   5),  sin  embargo  el  coeficiente  de  correlación  para  el  modelo  de  Monod  se  encuentra   alejado   de   1,   lo   que   no   es   aconsejable.   Como   el   ensayo   1   se   acerca   mas   al   comportamiento  de  Monod  (R=0,95)  ,  se  calcularon  los  parámetros  cinéticos  con  estos   valores.  La  concentración  de  biomasa  inicial  para  un  volumen  de  0.015  L  (volumen  de   medio  contenido  en  cada  montaje)    y  un  peso  promedio  por  colonia    de  0,105    mg  es   de  7mg/L  (Ver  Tabla2).  Con  ello  se  obtiene  la  tasa  máxima  de  utilización  del  sustrato   k=    0,084  mg  fenol/mg  biomasa;  y  la  concentración  de  sustrato  que  alcanza  la  mitad   de  la  velocidad  máxima  Ks  48,02  mg  fenol/L.  

 

y  =  0,0148x   R²  =  0,97892  

y  =  0,0137x   R²  =  0,9729  

y  =  0,0035x   R²  =  0,89951  

0   0,05   0,1   0,15   0,2   0,25   0,3   0,35   0,4   0,45   0,5  

0   5   10   15   20   25   30   35  

velo

ci

dad  de  r

emo

ci

ón  (h-­‐1

)  

Concentración  inicial  de  fenol  (ppm)  

Ensayo  1   Ensayo  2  

Control  Abiótico   Lineal  (Ensayo  1)  

(10)

 

Grafica    5.  Linealización  modelo  de  Monod.  En  la  siguiente  gráfica  se  presenta  la  regresión  entre  el  inverso  de  la   velocidad  de  degradación  y  del  inverso  de  la  concentración  inicial  de  sustrato  (0,5,10,20,30  ppm)  con  el  fin  de  

comprobar  si  el  comportamiento  de  los  ensayos  se  ajustan  al  modelo  de  Monod.    

 

 

Tabla  2.  Datos  obtenidos  de  pesar  la  colonia  Paenibacillus  lactis  de  una  siembra  en  LB.  El  peso  de  la  clonia  se    

 

Peso  Colonia  (g)   Peso  Colonia  (mg)  

Muestra  1   0,000225   0,225   Muestra  2   7,5E-­‐05   0,075   Muestra  3   0,00013   0,13   Muestra  4   2,5E-­‐05   0,025   Muestra  5   7E-­‐05   0,07   Peso  Promedio  de  la  colonia   0,105   Desviación  Estándar   0,076730046    

Conclusiones  

 

La   bacteria  Paenibacillus   lactis   evidenció   una   degradación   significativa   de   fenol   a   concentraciones  inferiores  a  30  ppm.  Se  determina  que  la  remoción  de  fenol  no  solo  se   da  por  la  actividad  enzimática  de  las  bacterias,  sino  que  también  la  adsorción  del  fenol   a  las  paredes  de  los  tubos  falcon  y  al  medio  de  soporte  es  una  fuente  que  debe  tenerse   en   cuenta.   Ambos   tipos   de   remoción   son   cuantificables   y   deben   realizarse   ensayos   para  determinar  la  capacidad  máxima  de  adsorción  del  medio  de  soporte  con  el  fin  de   determinar  la  capacidad  de  degradación  real  de  la  cepa.  

   

y  =  81,58x  +  1,6988   R²  =  0,95179   y  =  114,58x  +  1,6485  

R²  =  0,81685  

0   5   10   15   20   25   30  

0   0,05   0,1   0,15   0,2   0,25  

1

/v

d

 (

h

or

as)

 

1/So  (mg/L)-­‐1  

(11)

Puede  haber  alteraciones  en  la  solución  de  fenol  a  medida  que  pasa  el  tiempo,  y  esto   puede   afectar   los   resultados.   Es   recomendable   tener   precaución   en   este   tema,   y   realizar   el   análisis   de   lectura   de   la   concentración   de   fenol   al   inicio   y   al   final   del   montaje,   con   el   fin   de   reducir   la   incertidumbre   y   obtener   mejor   calidad   en   los   resultados.   También   es   necesario   conservar   la   solución   de   fenol   refrigerada   y   en   condiciones  de  oscuridad  para  evitar  la  pérdida  del  material  por  la  degradación  de  luz   o  la  volatilización.  

 

Aunque  los  datos    presentan  un  comportamiento  similar  al  establecido  en  el  modelo   de     Monod,   se   recomienda   repetir   los   ensayos   con   un   rango   de   concentraciones   iniciales  más  amplio  para  disminuir  la  incertidumbre  y  lograr  entender  más  a  fondo  el   comportamiento  cinético  de  la  cepa  Paenibacillus  lactis.  Puede  ser  necesario  el  estudio   e   implementación   de   otro   modelo   cinético   que   pueda   ajustarse   mejor   al   comportamiento  de  la  cepa.    

 

En  este  estudio  se  logró  determinar  el  coeficiente  medio  de  saturació  Ks  y  la  tasa  de   utilización   del   sustrato.   Es   necesario   realizar   la   cinética   bacteriana   para   lograr   calcular  otros  parámetros  cinéticos  como  la  velocidad  máxima  y  la  tasa  de  producción   de   lodos,   y   así   utilizar   dicha   cepa   y   optimizar   su   degradación   para   su   futura   implementación  en  la  industria.  

   

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