Degradación de fenol por medio de bacterias aisladas de
agua de mar de Cartagena
Valeria Albán Domínguez
Proyecto de Grado Ingeniería Ambiental, Asesora: Johana Husserl, Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de los Andes, Bogotá-‐Colombia, Junio de 2014.
Resumen
En este estudio se evaluó la capacidad de bacterias aisladas de las aguas de la bahía de Cartagena para degradar fenol. Para ello se utilizó cuatro cepas de dicho ambiente y se determinó la degradación de fenol de las bacterias durante 3 días en frascos de agitación con medio de soporte plásticos utilizando fenol como única fuente de carbono a una concentración inicial de 30 ppm. Los resultados indicaron que la cepa Paenibacillus lactis
(Cepa 7B) fue la que mejor degrado fenol. Los parámetros cinéticos de dicha cepa fueron identificados por medio del modelo de Monod, haciendo ensayos a concentraciones iniciales de fenol de 0,5,10,20 y 30 ppm y determinando la concentración inicial de biomasa (7 mg/L) . Los parámetros cinéticos calculados fueron la tasa máxima de utilización del sustrato k= 0,084 mg fenol/mg biomasa; y el coeficiente medio de saturación Ks= 48,02 mg fenol/L.
Palabras clave: Bahía de Cartagena, degradación de fenol, Paenibacillus lactis, modelo de Monod.
Abstract
In this study was estimated the ability of isolated bacterium from waters of The Cartagena Bay to degrade phenol. For the four strains used of said environment was established the phenol degradation of bacteria during 3 days in shake flasks with plastic support ambience using phenol as the sole carbon source at an initial concentration of 30 ppm. The results revealed that the strain Paenibacillus lactis (strain 7B) showed the best phenol degradation. The kinetic parameters of this strain were identified by Monod model, making tests of initial phenol concentrations of 0,5,10,20 and 30 ppm and determining the initial biomass concentration (7 mg / L). The kinetic parameters calculated were at the maximum substrate utilization rate k = 0.084 mg phenol / mg biomass; and the half saturation coefficient Ks = 48.02 mg phenol/ L.
Key words: The Cartagena Bay, phenol degradation, Paenibacillus lactis, Monod´s model
Introducción
La contaminación producto de la actividad industrial es un tema de gran importancia en la actualidad debido a las implicaciones que esta contaminación trae al medio ambiente y a la salud pública (Brooks & Michael, 2012). Por ello, a medida que incrementa el desarrollo industrial, se busca implementar tecnologías y sistemas de remediación que traten los diferentes contaminantes que son perjudiciales para las personas y los ecosistemas. Los vertimientos de aguas en industrias y empresas son uno de las principales vectores de contaminación, ya que la mayoría de estos llegan a fuentes de agua naturales que en muchos casos representan un recurso esencial para diferentes ecosistemas y poblaciones (Smith,
Lingas, & Rahman).
El fenol es un compuesto orgánico peligroso, que se puede detectar en fuentes de agua naturales sin contaminación a concentraciones menores de 1 ppb (ATSDR), concentración inferior al contenido perjudicial para la salud. El fenol es caracterizado por ser reactivo, tóxico, inflamable y corrosivo (Environmental Health and Safety , 2003). Este elemento puede ser absorbido por todas las rutas de exposición y puede causar efectos sistemáticos, o letales dependiendo la ruta, la concentración y la frecuencia de exposición del contaminante (Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial,2003). Por estas razones la agencia de protección ambiental de los Estados Unidos (USEPA) y la Comunidad Económica Europea lo considera como un contaminante prioritario; en Colombia se encuentra descrito en la lista de residuos peligrosos en el Anexo A de la resolución 4741 del 2005 y se planea regular a concentraciones menores de 0.2 ppm (Ministerio de Ambiente y Desarrollo
Sostenible, 2012).
Comúnmente la contaminación por fenol está dada por las actividades de industrias manufactureras de resina, plástico, fibras, adhesivos, hierro, acero, aluminio, caucho y efluentes de manufactura sintética de combustible; también es encontrado en productos comerciales como medicamentos, lociones, desinfectantes y otros (Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial,2003). Generalmente, en las aguas residuales petroleras se excede la concentración de fenol que se quiere regular por la norma Colombiana. En estudios se ha encontrado que la concentración de fenol en esta agua puede variar entre 1 y 20 mg/L y que dichas concentraciones dependen de las características del crudo, de la tecnología utilizadas para la refinación y de la calidad de producto que quiera obtenerse (Díaz y otros, 2005; Puentes, 2008)
La remoción de fenol puede darse por procesos físico químicos como la adsorción, la oxidación química y la incineración, entre otros. Dichos procesos tienen asociados costos elevados y la generación de subproductos indeseables. La degradación biológica siempre será una buena alternativa para la remoción de productos orgánicos, ya que reduce considerablemente los costos y además existe la posibilidad de completar la mineralización
(Mahammedilyas & Thangavelu, 2010). A pesar de esto, la toxicidad de este contaminante
puede inhibir los microorganismos presentes en el agua, evitando con ello la degradación de este y otros contaminantes. Afortunadamente, varios microorganismos son capaces de degradar estos compuestos como hongos y bacterias. Algunas de dichas especies de
bacterias son: Pseudomonas sp, Arthrobacter sp y Bacillus sp, con las que se han realizado múltiples estudios (Mahammedilyas & Thangavelu, 2010).
Muchos artículos científicos han mostrado que la biodegradación solo es posible para concentraciones que no superen 1000 ppm debido al efecto inhibidor que tiene el fenol sobre los microorganismos (Kumar, Kumar, & Kumar, 2004). En los ensayos realizados por los hermanos Kumar se encuentra que la degradación por Pseudomonas putidas en frascos de agitación para concentraciones de 1000 ppm se alcanza en 162 horas. Otros estudios demuestran como la inmovilización de células por medio de un bioreactor de membrana pueden incrementar la tasa de crecimiento de las células y la tasa de degradación de este contaminante, reduciendo la inhibición del fenol a concentraciones mayores de 1000 ppm
(Loh, Chung, & Ang, 2000). La mayoría de estudios se han realizado con concentraciones
mayores a 100 ppm (Dey & Mukherjee, 2010), concentraciones que exceden significativamente las producidas por la industria petrolera (Díaz y otros, 2005; Puentes, 2008).
En este ensayo se pretende comparar la capacidad de degradación de fenol de cepas aisladas de la Bahía de Cartagena bajo concentraciones que pueden encontrarse en las aguas producidas en la industria petrolera, con el fin de proveer una alternativa de tratamiento para alcanzar el cumplimiento de la norma de vertimientos que se está por llevarse a cabo en el país.
Modelo cinético
Para determinar los parámetros cinéticos se asume que el crecimiento bacteriano, usando un sustrato inhibitorio (fenol), se comporta como se establece en el modelo de crecimiento cinético de Haldane, propio para sustratos inhibitorios (Kumar y otros, 2004), y que dicho crecimiento debe ser proporcional a la utilización del sustrato. Sin embargo, la constante de inhibición en diferentes estudios es mucho más grande que las concentraciones utilizadas en los ensayos de este proyecto que son menores a 30 ppm (Ver Tabla 1), por lo tanto puede asumirse que para las concentraciones utilizadas, el comportamiento cinético de las bacterias se asemeja más al modelo de Monod que al modelo inhibitorio descrito por Haldane.
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𝑏𝑋
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Se asume que debido al poco tiempo de retención de los microorganismos, la tasa de decaimiento es
despreciable. También se asume que las
concentraciones utilizadas en los ensayos son tan bajas comparadas con las de otros estudios (Tabla1) que no se presenta inhibición y el comportamiento de la cinética se acerca más al modelo de Monod.
Nomenclatura:
X Concentración biomasa (mg/L) S Concentración fenol (mg/L)
𝑣! Velocidad de degradación (mg L-‐1 h-‐1) 𝑏 Tasa específica de deacaimiento bacteriano (h-‐1)
k Tasa máxima de utilización del sustrato (mgS/mgX)
𝐾! Concentración de sustrato que alcanza la mitad de la velocidad máxima (mgS/L)
𝐾! Constante de inhibición (mg/L)
𝑣
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Con ello obtenemos la linealización de Monod, por medio de la cual, se puede determinar k y 𝐾! a partir de las concentraciones iniciales de fenol y el cambio de la concentración de fenol en el tiempo, conociendo la concentración inicial de biomasa.
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Tabla 1. Resumen estudios de biodegradación de fenol. Está tabla ilustra los valores de Ki para diferentes estudios de biodegradación de fenol, para cada estudio se describe la cepa, el sistema y el rango de concentraciones utilizadas. En esta tabla se puede observar que el valor de Ki supera las 100 ppm para cualquiera de los estudios citados, concentración mayor a las trabajadas en este ensayo (30 ppm).
Autor Cepa Sistema Concentración Rango de
(mg/L) Ki (mg/L)
Pawlowsky & Howell (1973)
Cultivo Mixto I
Discontinuo
0-‐900 173,0 Cultivo Mixto II
(organismos
filamentosos) 0-‐1000 934,5
Hill & Robinson (1975) Pseudomonas putida Discontinuo y continuo 0-‐700 470,0
Yang & Humpret (1975) Pseudomonas putida Continuo 0-‐500 106,0
Chi & Howell (1976) Pseudomonas putida Continuo 0-‐900 380,0 Hutchinson & Robinson
(1990) Pseudomonas putida Discontinuo 0-‐200 903,0 Kotturi y otros (1991) Pseudomonas putida Discontinuo 0-‐200 377,0
Livingston and Chase
(1989) sp., Pseudomonas sp.) Mixto (Acineo bacter Discontinuo 0-‐500 370,0
Okaygun y otros (1992) Pseudomonas sp. Discontinuo 0-‐170 170,0 Klebsiella sp. 0-‐230 454,8 Kumara y Paruchuri
(1997) Mixta Discontinuo 60-‐500 145,0 Tanyolac y Beyenal
Materiales y metodología
Organismos y medio. Las cepas utilizadas fueron aisladas de la bahía de Cartagena y alimentadas con fenol como única fuente de carbono durante meses a una concentración de 30 ppm. En un comienzo las cepas aisladas fueron catalogadas como la cepa 2, 3, 7A y 7B. Posteriormente, Las cepa 7A fue identificada como Microbacteriumparaoxydans y la 7B como
Paenibacillus lactis. Las cepas 2 y 3 aún no han sido identificadas.
Para alimentar los microorganismos se utilizó medio de fenol, un medio con las condiciones de salinidad apropiadas para simular la características de los vertimientos de la industria petrolera y garantizar el crecimiento de los microorganismos . El medio se compone en g/L por los siguientes nutrientes: 11.986 de NaCl, 4.002 de Na2SO4, 0.666 de KCl, 0.097 de KBr, 0.020 de NHCO3, 0.027 de H3BO3, 5.416 de MgCl2, 0.059 de K2HPO4, 0.060 NH4Cl, 0.003 de FeSO4, 0.002 de CaCL2. Adicionalmente por cada 100mL de medio se añade 1mL de solución de trazas que tiene como componentes en g/L los siguientes compuestos: 0.1 de NaMoO4*6H2O, 0.1 de CaSO4*5H2O, 0.1 H3BO3, 0.1 ZnSO4*7H2O. A la solución final se le
añade la cantidad necesaria de fenol para obtener una concentración de 30 ppm.
La primera fase consiste en sembrar los microorganismos en agar Luria-‐Bertani LB para estimular su crecimiento, con el fin de apreciar adecuadamente las colonias y de esta manera corroborar su pureza. Luego se realizan las siembras en el medio de fenol previamente descrito. los pases se realizaron en la cámara de flujo (Labcanco purifer class II) con los materiales y reactivos previamente esterilizados por medio del Tuttnaur autoclave-‐ steam sterilizer y de un filtro para solución de fenol de 0.2 µm. Luego de sembrar las cepas en las cajas Petri con medio se procedió a instalar los cultivos en la Imperial III Incubator (Labline) a una temperatura de 30ºC para garantizar su crecimiento.
Método Analítico: 4 amino antipirina. La medición de las concentraciones de fenol se determinaron por medio del método colorimétrico 4 amino antipirina. Este método se basa en la reacción de los compuestos fenólicos con la 4 amino antipirina en presencia de ferrocianuro de potasio a pH de 10 para formar una solución estable de color marrón rojizo, cuya intensidad determina las concentraciones de fenol (NPDES, 1978).
Para la utilización del método es necesario realizar la curva de calibración, que relaciona la absorbancia obtenida en el espectrofotómetro con una concentración de fenol conocida. Para la curva, se prepara 1mL de concentraciones conocidas de fenol que varían de 1 a 30 ppm. Se toma 1 mL de cada montaje y de las concentraciones conocidas de fenol para realizar el análisis de las diferentes muestras en tubos ependor, se centrifuga las muestras contenidas en los tubos a 13000 rpm durante 1 minuto a una temperatura de 4ºC en él Sorvall Legend 17R Centrifuge. El sobre donante obtenido del proceso anterior se diluye en 9 mL de agua destilada en tubos de vidrio. Se adiciona a todos los tubos 0.5 mL de hidróxido de amonio 0.5N, luego 0.25 mL de 4-‐aminoantipirina al 2% y 0.25 mL de ferrocianuro de
potasio al 8%. Se mezclaron las soluciones con el Mixer Maxi mix II y se esperó 15 minutos para que se atenuara el color. Se procede a medir la absorbancia a una longitud de onda correspondiente a 510nm en el espectrofotómetro Termo Genesys 205-‐K17, y se determina la concentración de fenol en cada muestra relacionando la concentración con la absorbancia obtenida por medio de la curva de calibración.
Comparación de la capacidad de remover fenol. Luego de que las bacterias hayan crecido en el medio con fenol, se procede a realizar los montajes para comparar la degradabilidad de fenol en las cepas. Estos consisten en sembrar en medio de fenol las cepas de estudio e incubarlas durante 3 días (72 horas). Los montajes se realizaron en tubos falcón con medio de soporte plástico y con 15 mL de medio de fenol a una concentración de 30 ppm, se incubaron en el Lab-‐line Max 4000 a una temperatura de 30.5ºC y a una velocidad de 150 rpm. Se realizó un control abiótico, un montaje para cada uno de los inóculos descritos anteriormente y un duplicado para cada uno de ellos. Al tercer día se tomó una muestra de 1mL de cada ensayo y se determinó la capacidad de degradación de fenol por el método 4 amino antipirina, con el fin de escoger la cepa que mejor degrada fenol.
Determinación de parámetros cinéticos. Luego de determinar la cepa más eficiente para degradar fenol, Paenibacillus lactis, se procede a determinar los parámetros cinéticos de está. Para la determinación de los parámetros cinéticos se realizó tres ensayos. Cada ensayo consistía en frascos de agitación con medio de soporte que contenían 15 mL de medio fenol a concentraciones de 0, 5 10, 20 y 30 ppm (para cada montaje se hizo un duplicado). Dos de los ensayos fueron inoculados por una colonia de la cepa a analizar1, y el ensayo restante no fue inoculado y se utilizó como control abiótico.
Determinación concentración inicial de biomasa. Para la determinación de la concentración de biomasa se pesaron colonias en la balanza Duzico (Ohaus). Para ello se utilizó palillos de madera con los que se cogió una colonia sembrada en medio LB. En el plato de la balanza se colocó el palillo sobre un clínex y se calculó la diferencia de peso entre el palillo con y sin la colonia
Resultados
Para cada análisis de lectura de la concentración de fenol (4-‐aminoantipirina) se realizó una curva de calibración, en la que se aseguro que el coeficiente de regresión fuera mayor a 0.95, con el fin de reducir la incertidumbre al calcular concentraciones a partir de las absorbancias leídas en el espectrofotómetro. A continuación se enseña la curva de calibración realizada para determinar la concentración remanente de fenol en los ensayos realizados para comparar la capacidad de degradación de cada cepa (Grafica 2).
1 No se logró inocular los montajes con el mismo contenido de biomasa debido a la dificultad de la
Grafica 1. Curva de calibración. Esta curva se modifico con el fin de obtener un coeficiente de correlación lineal
de 0,99. Los puntos azules corresponden a los que fueron omitidos al realizar la regresión.
Luego de analizar y manejarlos datos obtenidos se concluye que la cepa Paenibacillus lactis
es la única cepa que muestra una degradación estadísticamente relevante de fenol, alcanzando un porcentaje de aproximadamente 65% en 72 horas. De estos resultados también se puede determinar que la degradación biológica no es la única fuente de remoción de fenol, sino que también otros mecanismos como la adsorción demuestran un decaimiento de la concentración de fenol en el tiempo, esto es evidente ya que en el control abiótico se reduce la concentración inicial de fenol que corresponde a 30 ppm (Ver Gráfica 2).
Grafica 2.Concentración remanente de fenol. En está gráfica se muestra la concentración de fenol pasadas las
72 horas de realizados los montajes. La concentración inicial de fenol fue de 30 ppm para todos los montajes.
Debido a la sobresaliente degradación de la cepa Paenibacillus lactis comparada con las otras cepas, se eligió está para realizar el análisis cinético y determinar la tasa máxima de utilización del sustrato k y la concentración de sustrato que alcanza la mitad de la velocidad máxima Ks. Los resultados de los ensayos muestran que hay una
y = 0,0103x R² = 0,99149
-‐0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4
0 5 10 15 20 25 30 35
A
b
so
rb
an
ci
a
Concentración (ppm)
Microbacteriu mparaoxydans
Paenibacillus lactis
gran variabilidad en los resultados obtenidos, a pesar que las concentraciones iniciales y las condiciones de los montajes son las mismas (Grafica 3).
Grafica 3. Sustrato final de los ensayos para calcular parámetros cinéticos. En esta gráfica se observa la concentración remanente de fenol para cada concentración inicial de fenol conocida. Para ambos ensayos se
realizaron montajes con 0, 5, 10, 20 y 30 ppm inoculados con una colonia de Paenibacillus lactis.
La velocidad de degradación presenta un comportamiento lineal respecto a la concentración inicial de fenol a las concentraciones trabajadas en este estudio (menores a 30 ppm), lo que indica que a mayor sustrato inicial será menor el tiempo de degradación del fenol, esto es consistente con el supuesto de que se está trabajando muy por debajo de la concentración de inhibición de fenol y por tanto el comportamiento inhibitorio del fenol es despreciable. Este comportamiento puede observarse en la Grafica 4. En dicha gráfica está incluida la velocidad de remoción del control abiótico que es independiente de la degradación de las bacterias, y es pequeña comparada con la remoción total2. Esto indica que la mayor parte de la remoción de fenol se debe a la degradación por parte de la cepa Paenibacillus lactis.
2 Para el control abiótico se realizo la lectura de fenol al inicio y a los tres días de transcurrido el
montaje, con el fin de eliminar el error correspondiente a la degradación de la solución de fenol a través del tiempo. En la gráfica 4 se puede observar que para las cantidades de la solución agregadas
(0,5,10,20 y 30) la concentración resultante de fenol fue significativamente menor, lo cual indica que es importante tener este factor en cuenta.
0 2 4 6 8 10 12 14
0 5 10 20 30
Con
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7
2
h
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as
(p
p
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)
Montaje (Concentraión inicial de fenol en ppm)
Grafica 4. Relación entre velocidad de degradación y la concentración inicial de fenol. En esta gráfica se muestra la velocidad de degradación de fenol
Los datos tienen una tendencia a comportarse como el modelo de Monod (Ver gráfica 5), sin embargo el coeficiente de correlación para el modelo de Monod se encuentra alejado de 1, lo que no es aconsejable. Como el ensayo 1 se acerca mas al comportamiento de Monod (R=0,95) , se calcularon los parámetros cinéticos con estos valores. La concentración de biomasa inicial para un volumen de 0.015 L (volumen de medio contenido en cada montaje) y un peso promedio por colonia de 0,105 mg es de 7mg/L (Ver Tabla2). Con ello se obtiene la tasa máxima de utilización del sustrato k= 0,084 mg fenol/mg biomasa; y la concentración de sustrato que alcanza la mitad de la velocidad máxima Ks 48,02 mg fenol/L.
y = 0,0148x R² = 0,97892
y = 0,0137x R² = 0,9729
y = 0,0035x R² = 0,89951
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
0 5 10 15 20 25 30 35
velo
ci
dad de r
emo
ci
ón (h-‐1
)
Concentración inicial de fenol (ppm)
Ensayo 1 Ensayo 2
Control Abiótico Lineal (Ensayo 1)
Grafica 5. Linealización modelo de Monod. En la siguiente gráfica se presenta la regresión entre el inverso de la velocidad de degradación y del inverso de la concentración inicial de sustrato (0,5,10,20,30 ppm) con el fin de
comprobar si el comportamiento de los ensayos se ajustan al modelo de Monod.
Tabla 2. Datos obtenidos de pesar la colonia Paenibacillus lactis de una siembra en LB. El peso de la clonia se
Peso Colonia (g) Peso Colonia (mg)
Muestra 1 0,000225 0,225 Muestra 2 7,5E-‐05 0,075 Muestra 3 0,00013 0,13 Muestra 4 2,5E-‐05 0,025 Muestra 5 7E-‐05 0,07 Peso Promedio de la colonia 0,105 Desviación Estándar 0,076730046
Conclusiones
La bacteria Paenibacillus lactis evidenció una degradación significativa de fenol a concentraciones inferiores a 30 ppm. Se determina que la remoción de fenol no solo se da por la actividad enzimática de las bacterias, sino que también la adsorción del fenol a las paredes de los tubos falcon y al medio de soporte es una fuente que debe tenerse en cuenta. Ambos tipos de remoción son cuantificables y deben realizarse ensayos para determinar la capacidad máxima de adsorción del medio de soporte con el fin de determinar la capacidad de degradación real de la cepa.
y = 81,58x + 1,6988 R² = 0,95179 y = 114,58x + 1,6485
R² = 0,81685
0 5 10 15 20 25 30
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
1
/v
d
(
h
or
as)
1/So (mg/L)-‐1
Puede haber alteraciones en la solución de fenol a medida que pasa el tiempo, y esto puede afectar los resultados. Es recomendable tener precaución en este tema, y realizar el análisis de lectura de la concentración de fenol al inicio y al final del montaje, con el fin de reducir la incertidumbre y obtener mejor calidad en los resultados. También es necesario conservar la solución de fenol refrigerada y en condiciones de oscuridad para evitar la pérdida del material por la degradación de luz o la volatilización.
Aunque los datos presentan un comportamiento similar al establecido en el modelo de Monod, se recomienda repetir los ensayos con un rango de concentraciones iniciales más amplio para disminuir la incertidumbre y lograr entender más a fondo el comportamiento cinético de la cepa Paenibacillus lactis. Puede ser necesario el estudio e implementación de otro modelo cinético que pueda ajustarse mejor al comportamiento de la cepa.
En este estudio se logró determinar el coeficiente medio de saturació Ks y la tasa de utilización del sustrato. Es necesario realizar la cinética bacteriana para lograr calcular otros parámetros cinéticos como la velocidad máxima y la tasa de producción de lodos, y así utilizar dicha cepa y optimizar su degradación para su futura implementación en la industria.
Bibliografía
Pawlowsky, U., & Howell, J. (1973). Mixed culture bioxidation of phenol. I.
Determination of kinetic parameters. Biotechnology and bioengineering , 15 (5), 889-‐896.
Hill, G., & Robinson, C. (1975). Substrate inhibition kinetics: phenol degradation by Pseudomonas putida, . Biotechnology and Bioengineering , 17 (11), 1599-‐1615. Loh, K., Chung, Y., & Ang, W. (2000). Inmobilized-‐cell Membrane Bioreactor for High-‐ Strength Phenol Wastewater. Journal of Environmental Engineering , 126 (1), 75-‐79.
Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial. (27 de 11 de 2003). Guia 14-‐ Fenol. Recuperado el 2014, de minambiente.gov.co:http://www.minambiente.gov.co/
documentos/ Guia14.pdf
Kumar, A., Kumar, S., & Kumar, S. (2004). Biodegradation kinetics of phenol and catechol using Pseudomonas putida MTCC 1194. Biochemical Engineering Journal , 22, 151-‐159.
Mahammedilyas, K., & Thangavelu, V. (2010). Recent advances in the Biodegradation of Phenol: A review. ASIAN J. EXP. BIOL. SCI. , 1 (2), 219-‐234.
Puentes Jácome, L. A. (2008). Biodegradacion de fenoles en un reactor de lecho fijo anaerobio para el agua residual industrial proveniente de la batería Payoa. Recuperado el 05 de 2013, de http://repository.upb.edu.co:8080/jspui/ bitstream/123456789/59/1/digital_15298.pdf
Diaz, A., Rincon, N., Marin, J. C., Behling, E., Chacin, E., & Ferrnaández, N. (2005). Degradación de fenoles totales durante el tratamiento biológico de aguas de producción petroleras . scielo , 13 (1).
Yang, & Humprey. (1975). Dynamic and steady state studies of phenol biodegradation in pure and mixed cultures . Biotechnology and bioengineering , 17 (8), 1211-‐ 1235.
Chi, C., & J.A., H. (1976). Transient behaviour of a continuous stirred tank biological reactor utilizing phenol as an inhibitory substrate . Biotechnology and bioengineering , 18, 68-‐80.
Hutchinson, D., & Robinson, C. (1990). A microbial regeneration process for granular activated carbon—II. regeneration studies . Science Direct , 24 (10), 1217-‐1223. Koturi, G., Robinson, C., & William, I. (1991). Phenol degradation by a psychrotrophic strain of Pseudomonas putida. Applied Microbiology Biotecnology , 34 (4), 539-‐ 543.
Livinstong, A., & Chase, H. (1989). Modeling phenol degradation in a fluidized-‐bed bioreactor, . Aiche Journal , 35 (12), 1980-‐1992.
Okaygun, M., Green, L., & Akgerman, A. (1992). Effects of consecutive pulsing of an inhibitory substrate on biodegradation kinetics . Environmental Science & Technology , 26 (9), 1746-‐1752.
Kumaran, P., & Paruchuri, Y. (1997). Kinetics of phenol biotransformation. ScienceDirect , 31 (1), 11-‐22.
Tanyolac, A., & Beyenal, H. (1998). Prediction of substrate consumption rate, average biofilm density and active thickness for a thin spherical biofilm at pseudo-‐ steady state . Science Direct , 2 (3), 207-‐216.
Brooks, D., & Michael, M. (2012). Investigación de la Universidad de Boston sobre la Enfermedad Renal Crónica en Occidente de Nicaragua, 2009-‐2012 . Asociación Nicaraguense de Salud Pública (ANSAP) , 1 (3), 2-‐5.
Smith, A., Lingas, E., & Rahman, M. Contamination of drinking-‐water by arsenic in Bangladesh: a public health emergency. Bulletin of Word Health Organization , 78 (9).
ATSDR. (s.f.). Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Obtenido de Phenol: Relevance in public health: http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp115-‐ c2.pdf
Environmental Health and Safety . (2003). University of Maryland. Obtenido de Phenol, crystals: http://terpconnect.umd.edu/~choi/MSDS/J.T.Baker/PHENOL,
%20CRYSTALS.htm
Dey, S., & Mukherjee, S. (2010). Performance and kinetic evaluation of phenol biodegradation by mixed microbial culture in a batch reactor . International Journal of Water Resources and Environmental Engineering , 2 (3), 40-‐49. Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible. (2012). Andi. Obtenido de Proyecto Normativo de Vertimientos: www.andi.com.co/downloadfile.aspx?Id= 5E6736FE-‐09F3-‐425D-‐916F-‐DD9C1E5AEF3D
NPDES. (1978). Water EPA. Obtenido de Phenolics (Spectrophotometric, Manual 4-‐ AAP With Distillation): http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/
upload/2007_07_10_methods_method_420_1.pdf
