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Nuevas metodologías analíticas para el control de compuestos quimioterápicos en matrices biológicas

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Academic year: 2020

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(1)UNIVERSIDAD DE CASTILLA LA MANCHA Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas Departamento de Química Analítica y Tecnología delos Alimentos. NUEVAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS PARA EL CONTROL DE COMPUESTOS QUIMIOTERÁPICOS EN MATRICES BIOLÓGICAS. Isabel Lizcano Sanz. Tesis Doctoral Ciudad Real, 2019.

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(3) FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍAS QUÍMICAS Departamento de Química Analítica y Tecnología de los Alimentos. NUEVAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS PARA EL CONTROL DE COMPUESTOS QUIMIOTERÁPICOS EN MATRICES BIOLÓGICAS Por Isabel Lizcano Sanz Visado en Ciudad Real, 24 de abril de 2019. Fdo.: Dra. Dª Juana Rodríguez Flores Catedrática del Departamento de Química Analítica y Tecnología de los Alimentos. Universidad de Castilla-La Mancha.. Fdo.: Dr. Dº Gregorio Castañeda Peñalvo Profesor Titular de Universidad del Departamento de Química Analítica y Tecnología de los Alimentos. Universidad de Castilla-La Mancha.. Trabajo presentado para optar al grado de Doctor en Química. Fdo.: Dª Isabel Lizcano Sanz Licenciada en CC. Químicas.

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(5) Departamento de Química Analítica y Tecnología de los Alimentos. Dº. GREGORIO CASTAÑEDA PEÑALVO, profesor Titular de Universidad y secretario del Departamento de Química analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha. CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación titulado “Nuevas metodologías analíticas para el control de compuestos quimioterápicos en matrices biológicas” constituye la Tesis Doctoral que presenta Dª. Isabel Lizcano Sanz, para aspirar al grado de Doctor en Química, y que ha sido realizada en el Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha, cumpliendo todos los requisitos necesarios, bajo la dirección de la Dra. Dª. Juana Rodríguez Flores y el Dr. Dº. Gregorio Castañeda Peñalvo. Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a 24 de abril de 2019. VºBº. Fdo.: Dra. Dª Rosa de Carmen Rodríguez Martín-Doimeadios Directora del Departamento. Fdo.: Dr. Dº Gregorio Castañeda Peñalvo Secretario del Departamento.

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(7) “Me enseñaron que el camino del progreso no es ni rápido ni fácil” Marie Curie.

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(9) A mis padres.

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(11) AGRADECIMIENTOS Cuando algo llega a su fin, es inevitable no pensar en cómo empezó todo. Mis inicios como investigadora comenzaron en mi último año de carrera, cuando decidí matricularme en la asignatura de experimentación en química avanzada. De todos los departamentos que ofrecían este tipo de trabajo experimental, me llamó mucho la atención la temática del trabajo propuesto por los que hoy en día son mis directores de Tesis. Aquel día, cuando entré por primera vez en el laboratorio de métodos de separación, jamás imaginé que se convertiría en mi laboratorio, mi segunda casa, donde he pasado todo el tiempo que ha durado esta aventura. En mi etapa como doctoranda, he coincidido y conocido a mucha gente, la cual ha contribuido en mayor o menor medida a que todo esto sea posible y, es por ello que me gustaría dar las gracias a todas esas personas por el apoyo que me han dado durante todo este tiempo y, también agradecer a las que ya estaban desde el principio. En primer lugar, me gustaría dar las gracias a mis directores de Tesis, la Dra. Juana Rodríguez Flores y el Dr. Gregorio Castañeda Peñalvo, por haberme dado la oportunidad de realizar la Tesis en su grupo de investigación. Al departamento de Química Analítica, en especial a Lorena por su ayuda y consejos en mis inicios en el laboratorio y, a todos los profesores/as, así como a las técnicos que lo conforman. A todo el personal de la facultad, profesores y conserjes (María y Teresa), por recibirme con una sonrisa nada más cruzar la puerta. Especialmente a Mari Paz, por todo el cariño que ha demostrado tener hacia mí. A lo largo de estos años he tenido varios compañeros que, a pesar de su corta estancia en el laboratorio, me han hecho más amenos los tiempos de espera entre medida y medida. Los primeros en llegar fueron Julieta y Armando, dos mexicanos con muchas ganas de viajar, les dio tiempo a recorrer media España y parte de Europa en tan sólo cuatro meses. Aún recuerdo nuestras conversaciones en las que me contaban lo diferente que era la vida en México. Poco después llegó Pilar, esa chica de ojos azules,.

(12) una madre todoterreno capaz de sacrificarse y luchar por lo mejor para sus hijos. El último en pasar por el laboratorio fue Alberto, un chico ambicioso que sopesa mucho su futuro. El resto del tiempo no me he sentido sola, porque ahí, una planta más arriba, estaban ellos, Almudena, Raúl, Iván, Rosa, José Miguel… en definitiva ¡mis amigos los orgánicos!, aquellos que me han dado muestras de orina aun cuando no tenían ganas. Ellos, con los que he vivido muchos momentos, tanto dentro como fuera de la facultad. Siempre recordaré nuestros desayunos en el sofá, la cañita de los viernes, los miércoles de lasaña, los cumpleaños, el amigo invisible y las cenas de navidad. De verdad gracias por hacer que esta etapa haya sido maravillosa. Tampoco puedo olvidarme de mis compañeras de carrera o mejor dicho mis amigas, Ana, Almudena y Cristina que han estado y están ahí siempre que las necesito, dándome consejos y su apoyo en los momentos más difíciles. A mis amigas del pueblo, las de toda la vida, que me llevan acompañando desde que tengo uso de razón. Aunque no entienden muy bien a que me dedico, siempre han estado ahí, ofreciéndome su apoyo incondicional en todo lo que hago. Y para el final he dejado a las personas más importantes de mi vida, ellos son mis padres y mi hermano. Gracias por vuestra infinita paciencia, por haberme aguantado en mis días malos, gracias por animarme y apoyarme en todo. Sin vosotros esto no hubiese sido posible. ¡Gracias!.

(13) ÍNDICE RESUMEN ACRÓNIMOS OBJETIVO. 1. INTRODUCCIÓN. 5. 1. El cáncer 1.1 Aspectos farmacológicos del melanoma 1.2 Aspectos farmacológicos del cáncer de pulmón 1.3 Aspectos farmacológicos del cáncer de próstata 1.4 Aspectos farmacológicos de la leucemia 2. Tratamiento de las muestras para su posterior análisis 3. Validación de métodos analíticos. 7 8 20 30 38 47 52. PARTE EXPERIMENTAL. 77. Instrumentación. 81. Reactivos y disoluciones. 85. BLOQUE I. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS QUIMIOTERÁPICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS 87 CAPÍTULO I. Micellar electrokinetic chromatographic method for the dabrafenib determination in biological samples 99 CAPÍTUO II. Preconcentration with dispersive nanomaterial for melanoma drugs determination in serum samples. 119 BLOQUE II. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS QUIMIOTERÁPICOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN 147 CAPÍTULO III. Simultaneous Determination of Erlotinib and its Metabolites in Human Urine and Serum Samples by High‑Performance Liquid Chromatography. 161.

(14) CAPÍTULO IV. A Rapid, Direct and Validated HPLC- Fluorescence Method for the Quantification of Abiraterone and Abiraterone Acetate in Urine and Serum Samples from Patients with Castration- Resistant Prostate Cancer. 181 BLOQUE III. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS QUIMIOTERÁPICOS MEDIANTE TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS 199 CAPÍTULIO V. Electrochemical sensor for leukemia drug imatinib determination in urine by adsorptive striping square wave voltammetry using modified screen-printed electrodes. 217 CONCLUSIONES. 245.

(15) RESUMEN.

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(17) RESUMEN. El cáncer, así como su tratamiento, a menudo producen diversos efectos secundarios, es decir, problemas que afectan a tejidos u órganos sanos. Estos efectos, en la mayoría de los casos, van asociados con la dosis de los fármacos utilizados y varían de una persona a otra, aun recibiendo la misma dosis en el tratamiento. Sería de gran utilidad poder realizar un tratamiento personalizado a cada paciente, con el fin de poder mitigar este tipo de efectos adversos. Desde la química analítica cabe la posibilidad de desarrollar métodos capaces de cuantificar los compuestos quimioterápicos en los fluidos biológicos de los pacientes, con el fin de ver cuán de eficaz es la dosis que estos reciben. En este sentido, esta Tesis se ha centrado en el desarrollo de metodologías analíticas validas que puedan servir como herramientas en el ámbito médico para controlar la disponibilidad de estos quimioterápicos en el organismo. En la introducción se recogen los datos referentes al cáncer, los aspectos farmacológicos, así como los principales fármacos empleados para el tratamiento del melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de próstata y la leucemia. La parte experimental está divida en tres bloques, correspondientes con las tres técnicas empleadas. El primer bloque engloba a los capítulos I y II, en los cuales se ha recurrido al uso de la electroforesis capilar como técnica de separación para abordar la determinación de dabrafenib o la determinación conjunta de dabrafenib y trametinib (dos compuestos empleados en el tratamiento del melanoma), en suero y orina mediante MECK usando detección UV- Vis. El bloque dos hace referencia a los métodos desarrollados mediante cromatografía líquida, y abarca los capítulos III y IV. El capítulo III se ha centrado en la determinación de erlonitib (un quimioterápico usado en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas) y tres de sus metabolitos en muestras de suero y orina mediante detección UV. En el capítulo IV se ha usado la detección fluorescente para abordar la detección y cuantificación de abiraterona y su prodroga acetato de abiraterona, empleada en el tratamiento del cáncer de próstata. Finalmente, en el tercer bloque se recurre a las técnicas electroquímicas, las cuales han sido de gran utilidad para abordar la.

(18) RESUMEN. determinación de imatinib en orina. En este caso, se ha descrito un sensor basado en electrodos serigrafiados modificados con nanotubos de carbono, que permitió alcanzar límites de cuantificación adecuados para efectuar el análisis de este compuesto en muestras reales de pacientes oncológicos..

(19) ACRÓNIMOS. AA. Acetato de abiraterona. ABR. Abiraterona. ACN. Acetonitrilo. ACS. American Chemical Society. B-R. Britton Robinson. CE. Electroforesis capilar. CMC. Concentración micelar crítica. CML. Leucemia crónica mieloide. CNTs. Nanotubos de carbono. CV. Voltametría cíclica. CYP17. Citocromo con actividad 17α-hidroxilasa / C17, 20 liasa. CZE. Electroforesis capilar en zona. DAD. Detector diodo array. DAERLOT Desmetil erlotinib acetato DB. Dabrafenib. DDERLOT Didesmetil erlotinib DERLOT. Desmetil erlotinib. DHT. Dihidrotestosterona. DPV. Voltametría diferencial de pulso. EGFR. Receptor del factor de crecimiento epidérmico. ELISA. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. EPA. Agencia de Protección Ambiental. ERK. Extracellular Regulated Kinasa. ERLOT. Erlotinib. EXEM. Exemestano.

(20) ACRÓNIMOS. FDA. Food and Drug Administration. FEO. Flujo electroosmótico. IMA. Imatinib. IS. Estándar interno. LC. Cromatografía Liquida. LOD. Límite de detección. LOQ. Límite de cuantificación. MAPK. Proteína quinasa activada por mitógeno. mCRPC. Cáncer de próstata metastásico resistente a la castración. MEK. Quinasa extracelular activada por mitógeno. MEKC. Cromatografía electrocinética micelar. MeOH. Metanol. MWCNTs Nanotubos de carbono de pared múltiple NA. Número de agregación. NACE. electroforesis capilar en medios no acuosos. NSCLC. Cáncer de pulmón de células no pequeñas. PGR. Progesterona. RA. Receptor de andrógenos. RAF. Componente acelerada de fibrosarcoma. RSD. Desviación estándar relativa. RTK. Receptor tirosina quinasa. SD. Desviación estándar. SDS. Dodecilsulfato de sodio. SG. Supervivencia General. SPCEs. Electrodos serigrafiados de carbono.

(21) ACRÓNIMOS. SPEs. Electrodos serigrafiados. SWV. Voltametría de onda cuadrada. T. Testosterona. TBME. t-butil-metil-eter. THF. Tetrahidrofurano. TK. Tirosina quinasa. TKI. Inhibidores tirosina quinasa. TT. Trametinib. USEPA. Agencia americana de protección del medio ambiente.

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(23) OBJETIVO.

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(25) OBJETIVO. El objetivo de la presente Tesis Doctoral es desarrollar nuevas metodologías analíticas, que permitan llevar a cabo la separación y determinación de compuestos anticancerígenos en fluidos biológicos tales como suero y orina. Para ello se emplearán diferentes técnicas como son la electroforesis capilar, la cromatografía líquida y la electroquímica, con el fin de establecer herramientas analíticas útiles en el ámbito médico, que permitan realizar tratamientos personalizados a pacientes oncológicos. Este objetivo principal puede dividirse en otros más específicos: − Desarrollar metodologías que permitan llevar a cabo la determinación de compuestos quimioterápicos empleados en el tratamiento del melanoma, leucemia, cáncer de pulmón y cáncer de próstata. − Evaluar la capacidad de ciertos nanomateriales para mejorar la sensibilidad del análisis tanto a nivel de pretratamiento de muestras biológicas como a nivel de la señal analítica. − El estudio de la viabilidad analítica de nuevos dispositivos electródicos como son los electrodos serigrafiados, en la determinación de compuestos quimioterápicos en muestras biológicas. − Aplicar los métodos propuestos en muestras reales de pacientes oncológicos bajo tratamiento con los compuestos objeto de estudio.. 3.

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(27) INTRODUCCIÓN.

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(29) INTRODUCCIÓN. 1. EL CANCER. El término cáncer engloba un grupo numeroso de enfermedades que se caracterizan por el desarrollo de células anormales, que se dividen, crecen y se diseminan sin control en cualquier parte del cuerpo. Las células normales se dividen y mueren durante un periodo de tiempo programado. Sin embargo, la célula cancerosa o tumoral pierde la capacidad para morir y se divide casi sin límite. Tal multiplicación en el número de células llega a formar unas masas, denominadas tumores o neoplasias, que en su expansión pueden destruir y sustituir a los tejidos normales[1]. Los efectos del cáncer son un conjunto de signos y síntomas de pronóstico y tratamiento diferentes, que dependen de la localización anatómica en la que se encuentren y del tipo celular o histológico del que procedan. Según datos encontrados en la página de la Organización Mundial de la Salud, el cáncer es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. En 2012 se registraron alrededor de 14 millones de nuevos casos, ocasionando 8,8 millones de defunciones en 2015. Casi una de cada seis defunciones en el mundo se debe a esta enfermedad [2]. El informe emitido en 2017 por la Sociedad Española de Oncología Médica estima que el número total de nuevos casos de cáncer en España en 2015 fue de 247.771. Siendo los tipos de cáncer más frecuentes: colorectal (41.441 casos), próstata (33.370 casos), pulmón (28.347 casos), mama (27.747 casos) y vejiga (21.093 casos). Se estima que a nivel mundial el número de nuevos casos aumente en las dos próximas décadas a un ritmo de 22 millones de casos nuevos por año. Este dato es realmente alarmante, por lo que sería de gran interés poder llevar a cabo un seguimiento, así como poder personalizar el tratamiento oncológico de los enfermos con cáncer.. 7.

(30) INTRODUCCIÓN. A lo largo de la presente tesis doctoral se han desarrollado diversos métodos analíticos que permiten la determinación y cuantificación de varios compuestos empleados en tratar diversos tipos de cáncer como son el melanoma, el cáncer de pulmón, cáncer de próstata o la leucemia.. 1.1 ASPECTOS FARMACOLÓGICOS DEL MELANOMA. La piel es el órgano encargado de protegernos contra el calor, la luz solar, las lesiones y las infecciones. Además, ayuda a controlar la temperatura corporal al igual que almacena agua, grasa y vitamina D. La piel se divide en varias capas, donde cabe destacar principalmente la epidermis que es la capa externa y la dermis que corresponde a la capa interna. La epidermis está formada principalmente por un tipo de células llamadas queranocitos, las cuales son las encargadas de producir una proteína llamada queratina, que ayuda a la piel a protegerse del resto del cuerpo. El melanoma se caracteriza por una transformación maligna de las células productoras de pigmentación en la piel, los melanocitos. Estas células se encuentran en la capa más profunda de la piel, en la capa intermedia del ojo, en el interior del oído y en algunos órganos internos. El melanoma es el cáncer de piel más peligroso y, en su etapa avanzada, es agresivo y mortal. Al contrario que muchos tumores sólidos, esta enfermedad afecta a personas jóvenes y de mediana edad. Existen diversos factores que dan lugar a sufrir un melanoma, entre los que se encuentran: -. La exposición prolongada a los rayos del sol, y principalmente las quemaduras solares. Siendo las quemaduras más graves para el desarrollo de un melanoma aquellas que ocurren en la infancia y. 8.

(31) INTRODUCCIÓN. -. -. adolescencia. Las quemaduras producidas en edad adulta aumentan el riesgo de padecer melanoma en los próximos 10 años. Presentar piel sensible, personas con piel clara que sufren quemaduras a menudo y presentan dificultad para broncearse, siendo más sensibles a la luz solar. Presentar múltiples lunares o nevus, las personas con más de 50 nevus tienen un factor de riesgo añadido en padecer melanoma. La existencia de lunares atípicos que constituyen por si solos riesgo de convertirse en melanoma. Los antecedentes familiares, al igual que ocurre con otro tipo de canceres, el melanoma se asocia a una predisposición genética, de modo que si algún familiar lo ha sufrido el riesgo de padecerlo aumenta.. Tipos de melanoma •. •. •. Melanoma de propagación superficial: es el tipo más común de melanoma, representa aproximadamente el 70% de todos los casos. Suele diagnosticarse en pacientes con edades comprendidas entre 30 y 50 años. Generalmente aparece como una lesión plana o apenas elevada, a menudo con bordes irregulares y variaciones de color. Suele aparecer comúnmente en el tronco de los hombres, las piernas de las mujeres y en la parte superior de la espalda de ambos sexos. Melanoma nodular: se manifiesta como un área elevada de color azul-negruzco oscuro o rojo-azulado, aparece con mayor frecuencia en hombres que en mujeres. Generalmente se localiza en el tronco, la cabeza o el cuello, y representa entre el 10% y el 15% de todos los melanomas. Melanoma Lentigo Maligna: deriva de un lentigo preexistente, este tipo de melanoma es poco común ya que solo representa a al 5% de los casos. Ocurre con mayor frecuencia en adultos, manifestándose en la cara y otras áreas que se encuentran expuestas al sol de forma habitual. Su progresión es más pausada, 9.

(32) INTRODUCCIÓN. •. ya que su crecimiento e invasión es más lenta que la de otros tipos de melanoma. Melanoma lentigoso Acral: este tipo de melanoma se localiza usualmente en las palmas de las manos y bajo las uñas. Tiene un comportamiento biológico más agresivo que otros tipos de melanoma. Representa el 5% de los melanomas malignos, aparece con más frecuencia en asiáticos o en personas de raza negra [3].. La incidencia de melanomas metastásicos está creciendo de forma constante y, en última instancia, aumenta la tasa de mortalidad en comparación con otros cánceres [4]. Casi el 50% de los pacientes que padecen melanoma tienen una mutación en el gen BRAF (pertenece a la familia de proteínas quinasas de transducción de la señal de crecimiento de la quinasa). El melanoma y el cáncer en general se producen debido a la acumulación de mutaciones en los genes afectados que conducen a la programación anormal, proliferación celular y muerte. La mutación BRAF más común es la sustitución de un residuo del aminoácido valina en el codón 600 por el ácido glutámico (BRAFV600E) que ocurre en el 80-90% de los casos y BRAFV600K en el 10-20% [5–7]. Esta lesión molecular se puede bloquear de manera efectiva mediante el uso de una combinación de inhibidores BRAF y MEK, estos últimos son un tipo de quinasas extracelulares activadas por mitógeno[8]. Inhibidores de la vía MAPK Los sistemas de transmisión de señales son un proceso mediante el cual se identifican las señales extracelulares y se transforman en intracelulares, produciendo respuestas celulares específicas. La vía MAPK (de sus siglas en inglés, Mitogen-Activated Protein Kinases, o proteína quinasa activada por mitógeno), es una vía de señalización intracelular importante, que juega un papel fundamental en el control de la diferenciación celular, proliferación y apoptosis [9]. Es por ello, que los fallos que ocurren en la regulación de la vía MAPK contribuyen a la transformación celular y están implicados en la progresión tumoral, siendo la vía Ras-ERK la ruta de transducción de. 10.

(33) INTRODUCCIÓN. señales con mayor implicación en los procesos carcinogénicos de diversos tumores, es por ello, que se conoce como diana antitumoral.. Figura 1. Vía de señalización Ras-ERK.. La activación de esta ruta se produce en condiciones fisiológicas a través de la unión extracelular de los factores de crecimiento a receptores tirosina quinasas (RTK), iniciando así la vía por Ras. Las proteínas Ras junto con el gen que lleva el mismo nombre, actúan como interruptores moleculares, que, en función del nucleótido unido, se encontraran en estado inactivo, cuando estén unidas a GDP, o en estado activo, al intercambiar el GDP por GTP. Cuando el Ras se encuentra activado hace que las proteínas RAF sean capaz de activarse gracias a la unión Ras-GTP, de modo que RAF fosforila a MEK el cual, a su vez, fosforila y activa la última quinasa de la ruta que es ERK (del inglés, extracellular regulated kinasa). ERK se transloca al núcleo estimulando la progresión del ciclo celular y la proliferación celular. Es decir, se trata de una vía de señalización importante que comunica las señales extracelulares con el núcleo de las células. 11.

(34) INTRODUCCIÓN. BRAF es un oncogén de la familia de serina/treonina quinasas RAF y participa en la transducción de señales de la vía MAPK , siendo la mutación del oncogén BRAF la dominante en el melanoma [10]. Las células de melanoma que albergan una mutación BRAFV600, sufren una activación de la ruta MAPK de forma diferente. En estas células, la activación no requiere la activación de Ras a través de la interacción RTK – ligando, de modo que los monómeros BRAFV600 permanecen activados, activando así continuamente MEK, seguida de la activación de ERK, promoviendo así el crecimiento y diferenciación celular. Los pacientes que son tratados con inhibidores BRAF suelen desarrollar resistencia al tratamiento, con la consiguiente progresión de la enfermedad. Este fenómeno se denomina resistencia adquirida y se produce a través de la reactivación de la vía MAPK por distintos mecanismos como la activación de la vía a través de MEK [11], [12]. El estudio de los mecanismos de resistencia a los inhibidores BRAF llevó al desarrollo de inhibidores de MEK, con el objetivo de retrasar la resistencia tumoral a la inhibición de la vía MAPK [13]. Tratamiento del melanoma El manejo terapéutico de los pacientes con melanoma avanzado ha sufrido grandes modificaciones en los últimos años, pasando de ser una enfermedad en la que la única opción terapéutica era la quimioterapia paliativa con una expectativa de vida limitada a una situación con múltiples opciones terapéuticas asociadas a un incremento de la supervivencia. El uso de inhibidores selectivos del gen BRAF, como dabrafenib y vemurafenib, ha logrado tasas de respuesta de aproximadamente el 50% además de prolongador la supervivencia general (SG) en comparación con dacarbazina, en pacientes con la mutación BRAF V600E [14–16]. Dabrafenib, cuya actividad inhibe MEK 1 y 2, actualmente está indicada como monoterapia o en combinación con trametinib para el tratamiento. 12.

(35) INTRODUCCIÓN. de pacientes adultos con melanoma metastásico irresecable y mutación BRAF V600 confirmada [17]. Dabrafenib y trametinib, utilizados como agentes únicos o en combinación, han producido una mejora significativa en el resultado de pacientes con melanoma metastásico que alberga mutaciones BRAF, y han cambiado el alcance del tratamiento en este entorno[18]. Dabrafenib y trametinib actúan a dos niveles diferentes de la ruta de señalización Ras-ERK, como puede observarse en la Figura 1.. DABRAFENIB Dabrafenib (Figura 2) denominado químicamente como {3- [5- (2Amino-4-pirimidinil) -2- (1,1-dimetiletil) -, 3-tiazol-4-il] -2-fluorofenil} -2,6difluorobenceno sulfonamida, es un potente inhibidor selectivo de la quinasa RAF. Las propiedades fisicoquímicas de esta molécula se recogen en la tabla 1. En la mayoría de los casos los valores obtenidos fueron calculados mediante los programas ACD/ChemSketch y un programa de estimación para el cálculo de propiedades físico / químicas desarrollado por la Agencia de Protección Ambiental (EPA). Dabrafenib es un medicamento oralmente biodisponible para el tratamiento de cánceres asociados con una versión mutada del gen BRAF, se comercializa bajo el nombre de Tafinlar. Actúa como un inhibidor de la enzima asociada BRAF, la cual como se ha mencionado anteriormente, juega un papel fundamental en la regulación del crecimiento celular. Dabrafenib fue aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de los EE. UU. en el año 2013 para el tratamiento de pacientes con melanoma irresecable o metastásico que presentan mutaciones BRAF V600E. Este fue certificado para uso clínico en base a los resultados que se muestran en ensayos clínicos de fase 3, donde mostró mejoras. 13.

(36) INTRODUCCIÓN. significativas en diversos parámetros de cáncer, como la supervivencia libre de progresión, la supervivencia general, la razón de riesgo, etc [16].. Figura 2. Estructura química de dabrafenib. Dabrafenib se une a las proteínas plasmáticas en un 99.7%, alcanzandose una concentración plasmática máxima a las 2 horas de su administración. Tafinlar está disponible en cápsulas de 50 y 75 mg, de modo que resulta sencillo poder ajustar de manera efectiva las modificaciones de dosis necesarias. Tras su administración oral, la principal ruta de eliminación de dabrafenib es metabólica. Los productos de degradación se excretan principalmente a través de las heces 71% frente al 23% excretado a través de la orina.. 14.

(37) INTRODUCCIÓN. Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de dabrafenib. Parámetro DABRAFENIB Fórmula Molecular C23H20F3N5O2S2 Peso Molecular 519.5646 C (53.17%) H(3.88%) Composición F(10.97%) N(13.48%) O(6.16%) S(12.34%) 3 Refractividad Molar (cm ) 127.4 ± 0.4 Volumen Molar (cm3) 359.8 ± 3.0 Parachor (cm3) 1005.7 ± 6.0 Índice de Refracción 1.63 ± 0.02 Tensión superficial (dyne/cm) 61.0 ± 3.0 3 Densidad (g/cm ) 1.44 ± 0.06 Polarizabilidad (cm3) 50.48 ± 0.5 10-24 Masa Monoisotópica (Da) 519.101051 Masa Nominal (Da) 519 Masa Media (Da) 519.569579 Solubilidad en agua (mg/L) 0.0096 Log Kow 5.56 1.72±0.10 pKa 6.24±0.50. TRAMETINIB Trametinib (Figura 3) denominado químicamente como N-(3-{3cyclopropyl-5-[(2-fluoro-4-iodophenyl) amino]-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxo3,4,6,7- tetrahydropyrido[4,3-d] pyrimidin-1(2H)-yl} p henyl) acetamide, es un inhibidor alostérico, reversible, altamente selectivo, de la señal extracelular activada por mitógenos que regula la activación y la actividad quinasa, de las quinasas MEK1 y MEK2. Las proteínas MEK son las responsables de la proliferación de las células de melanoma[19]. En la tabla 2 se muestran los valores de las propiedades fisicoquímicas de trametinib obtenidos mediante los programas ACD/ChemSketch y el programa de estimación para el cálculo de propiedades físico / químicas proporcionado por la EPA.. 15.

(38) INTRODUCCIÓN. Figura 3. Estructura química de trametinib.. En base a ensayos clínicos en fase 3, en el año 2013 se aprobó el uso de trametinib para pacientes con melanoma irresecable o metastásico con mutación BRAF V600E o V600K [20]. Se trata del primer inhibidor de MEK aprobado por la FDA para uso clínico. Para su administración oral, trametinib se comercializa bajo el nombre de Mekinist, y se presenta en forma de comprimidos recubiertos con película, disponible en formato de 0.5 y 2 mg [21]. La unión de trametinib a las proteínas plasmáticas es del 97,4 %. Tras la administración de una única dosis, la media de la semivida de eliminación es de 127 horas (5.3 días)[22]. La principal ruta de eliminación es la excreción fecal representada por un 80 %, siendo la excreción urinaria inferior al 19 %, donde menos de un 0.1 % de la dosis excretada en la orina es recuperada como trametinib inalterado. Se observó que la combinación de dabrafenib y trametinib mejoran la actividad antitumoral en los pacientes con melanoma en comparación con aquellos tratados únicamente con dabrafenib. Es por ello, que se sugirió la obstrucción absoluta de la vía MAPK empleado la combinación de un inhibidor de BRAF e inhibidor de MEK, superando así la resistencia del inhibidor de BRAF, el cual produce la muerte celular en pacientes con melanoma BRAF V600 [23]. Como consecuencia, en 2014 la FDA aprobó el uso combinado de dabrafenib y trametinib.. 16.

(39) INTRODUCCIÓN. La dosis recomendada para el tratamiento combinado es de 2 mg de trametinib una vez al día y 150 mg de dabrafenib dos veces al día [24, 25].. Tabla 2. Propiedades fisicoquímicas de trametinib. Parámetro TRAME C26H23FIN5O4 Fórmula Molecular 615.395 Peso Molecular Composición Refractividad Molar (cm3) Volumen Molar (cm3) Parachor (cm3) Índice de Refracción Tensión superficial (dyne/cm) Densidad (g/cm3) Polarizabilidad (cm3) Masa Monoisotópica (Da) Masa Nominal (Da) Masa Media (Da) Solubilidad en agua (mg/L) Log Kow pKa. C(50.74%) H(3.77%) F(3.09%) I(20.62%) N(11.38%) O(10.40%) 141.49 ± 0.40 353.0 ± 5.0 1043.9 ± 6.0 1.73 ± 0.03 76.4 ± 5.0 1.74 ± 0.10 56.09 ± 0.5 10-24 615.077875 615 615.404112. 1.553 2.24 -. Antecedentes bibliográficos para la determinación de dabrafenib y trametinib Tafinlar y Mekinist cuyos principios activos son dabrafenib y trametinib respectivamente, son drogas de reciente utilización como se ha mencionado anteriormente, empleadas para el tratamiento del melanoma metastásico con mutación BRAF V600E o V600K. Debido a su reciente utilización, las referencias bibliográficas encontradas que aborden el estudio de la determinación de ambos en fluidos biológicos son muy escasas. Desde el lanzamiento de estas drogas hasta la actualidad los métodos analíticos propuestos para llevar a cabo la determinación de inhibidores. 17.

(40) INTRODUCCIÓN. BRAF e inhibidores MEK en fluidos biológicos se basan en el uso de cromatografía líquida (LC) como técnica de separación. En la mayoría de las metodologías encontradas en la literatura científica se propone una precipitación de las proteínas plasmáticas como método de tratamiento de la muestra [26–30] o bien una precipitación y extracción simultánea [31]. Sparidans y col. [26] en 2013 propusieron un método para determinar dabrafenib en plasma de rata, realizando una precipitación de las proteínas plasmáticas con acetonitrilo y una posterior dilución del sobrenadante con agua antes de realizar el análisis mediante cromatografía líquida acoplada a un detector de masas. Otros autores sugieren realizar la precipitación de las proteínas plasmáticas con una mezcla acetonitrilo-metanol en proporción 9:1 (v/v)[27]. Recientemente Cardoso y col. [28] han desarrollado una metodología para determinar seis inhibidores proteína quinasa en plasma humano entre los que se incluyen dabrafenib y trametinib. La metodología propuesta recurre a la precipitación proteica con metanol para realizar una limpieza de la muestra. Durante la etapa de pretratamiento de la muestra, el sobrenadante resultante de la centrifugación se lleva a sequedad bajo corriente de nitrógeno a temperatura ambiente siendo éste un proceso largo ya que su duración es de una hora. Huynh y col. [29] determinaron de forma simultánea 14 inhibidores tirosina quinasa (TKI) en plasma humano mediante LC con detección de masas. Estos autores al igual que Cardoso realizan una precipitación de las proteínas plasmáticas como tratamiento de previo de la muestra, mediante adición de acetonitrilo y sulfato de zinc. El método propuesto fue aplicado con éxito para la cuantificación de dabrafenib y trametinib entre otros, a pacientes bajo tratamiento con TKI. Nijenhius y col. [31] fueron de los primeros en proponer un método para determinar dabrafenib y trametinib de forma simultánea en muestras de plasma humano. Estos autores proponen una extracción. 18.

(41) INTRODUCCIÓN. líquido-líquido para aislar los dos compuestos de interés del plasma. El proceso propuesto para el tratamiento de muestra resultó algo tedioso, ya que conlleva varias etapas: en primer lugar, se descongela el suero en un baño de hielo, a continuación, para extraer los analitos se añade t-butil-metil-eter (TBME), realizando posteriormente una agitación y centrifugación. Para eliminar la capa orgánica se congela la muestra en un baño con hielo seco y etanol. Finalmente se realiza una evaporación de la fase orgánica bajo corriente de nitrógeno, reconstituyendo el extracto seco con acetonitrilo. A diferencia de otros autores Romero y col. [32] en su metodología para la determinación de dabrafenib en plasma realizan un tratamiento de la muestra diferente, que consiste en una dilución 1/5 del plasma con una solución micelar de SDS 0.05 M y tampón fosfato 0.01 M a pH7. Posteriormente se realiza una agitación vigorosa y una filtración con filtro de membrana de nylon de 0,45 μm. Dicha metodología fue empleada para analizar muestras de 15 pacientes, de las cuales solo se pudo determinar dabrafenib en 4 de ellas. Los métodos mencionados anteriormente proponen una precipitación proteica como método de tratamiento de la muestra o bien una precipitación y extracción simultánea. Sin embargo, otros autores recurren a la extracción en fase sólida como método de limpieza y enriquecimiento de la muestra [33, 34]. De todos los métodos comentados anteriormente solo tres de ellos fueron aplicados para llevar a cabo el análisis de muestras de pacientes bajo tratamiento con las drogas de interés [29], [32, 33].. 19.

(42) INTRODUCCIÓN. 1.2 ASPECTOS FARMACOLÓGICOS DEL CÁNCER DE PULMÓN. A nivel mundial el cáncer de pulmón es uno de los más frecuentes en ambos sexos [35], aunque afecta con más frecuencia a varones. Uno de los factores de riesgo más asociado al desarrollo de este tipo de cáncer es el tabaquismo. Afecta con mayor frecuencia a personas entre 50 y 60 años. A continuación, se detallan algunos factores de riesgo para el cáncer de pulmón: -. -. -. -. -. Humo del tabaco: aproximadamente el 80% de las muertes asociadas al cáncer de pulmón están asociadas al hábito de fumar. Exposición al gas noble radón: Según la agencia americana de protección del medio ambiente (USEPA), el radón es la segunda causa principal de cáncer de pulmón, y es la causa principal entre los no fumadores. En Estados Unidos suelen encontrarse niveles relativamente altos en los sótanos de las viviendas. Exposición al asbesto o amianto: el riesgo de cáncer de pulmón es mucho mayor en los trabajadores expuestos al asbesto y que también fuman. Sustancias cancerígenas inhaladas en el área de trabajo, como pueden ser el arsénico, berilio, cadmio, sílice, cloruro de vinilo, compuestos de níquel, compuestos de cromo, productos de carbón, gas mostaza y éteres de clorometilo. Productos de la combustión del diesel. Radioterapia a los pulmones, las personas que han recibido radioterapia en el pecho para tratar otros tipos de cáncer tienen un mayor riesgo de padecer cáncer de pulmón, particularmente si fuman. Esto incluye, por ejemplo, a personas que recibieron tratamiento contra la enfermedad Hodgkin o mujeres con cáncer de mama que recibieron radiación en el pecho después de una mastectomía. Antecedentes familiares de cáncer de pulmón[36].. 20.

(43) INTRODUCCIÓN. Las formas más comunes de cáncer de pulmón reciben nombres que dependen de las características de las células de las cuales derivan, distinguiéndose dos grandes grupos: Carcinomas de células pequeñas o microcíticos: Su nombre deriva del tamaño de sus células (microcítico: células muy pequeñas). Un 20% de los cánceres de pulmón son de este tipo. Se localiza preferentemente en la zona central de los pulmones, pudiendo comprimir vasos u órganos localizados a ese nivel. Se caracterizan por su alta agresividad y crecimiento rápido. Carcinomas no microcíticos: (non-small cell lung cancer, NSCLC) representa el 80% restante de los cánceres de pulmón. Se origina cuando las células sanas del pulmón cambian y crecen descontroladamente, formando una masa denominada tumor, lesión o nódulo. Un tumor de pulmón puede comenzar en cualquier lugar del pulmón, una vez que el tumor canceroso de pulmón crece, este puede desprender células cancerosas que pueden ser transportadas por la sangre o la linfa, y llegar a los ganglios linfáticos. Los tipos más frecuentes son: •. •. Carcinoma escamoso o epidermoide: es la variedad de cáncer broncopulmonar más frecuente en nuestro país, representando el 40% de los carcinomas no microcíticos. Suele localizarse en la parte central de los pulmones, y con frecuencia se necrosa en su interior asemejándose a un absceso. Su crecimiento es relativamente lento. Adenocarcinoma: representa el 30% de los carcinomas no microcíticos. Es la forma más frecuente de cáncer de pulmón en las mujeres y en las personas que no han fumado nunca. Suele localizarse en la zona periférica de los pulmones, por lo que frecuentemente afecta a la pleura y pared torácica. En los últimos años, esta variante histológica ha cobrado especial interés al descubrirse que un subgrupo de pacientes tiene una alteración molecular, lo que permite que estos pacientes sean tratados con fármacos de diana terapéutica.. 21.

(44) INTRODUCCIÓN. •. Carcinoma de células grandes: se denomina así por el tamaño de las células que lo componen. Es el tipo menos frecuente de los carcinomas broncopulmonares, representando el 10% de ellos.. La alteración genética más frecuente en el cáncer de pulmón es la mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Se trata de un tipo de receptor tirosina quinasa (TK), el cual está involucrado en la regulación de la diferenciación y proliferación celular. La sobreexpresión de EGFR se ha relacionado con muchos tumores sólidos, incluidos las de pulmón, cabeza y cuello, ovario , próstata, mama, riñón, colon, cerebro y vejiga [37]. La sobreexpresión de EGFR está presente en carcinomas de pulmón de células no pequeñas , observándose en el 40-85% de los pacientes con NSCLC [38, 39]. Tratamiento Las opciones de tratamiento disponibles para NSCLC incluyen cirugía, radiación, quimioterapia y terapia biológica. Los pacientes cuyos tumores no pueden ser operados son tratados con radioterapia junto con quimioterapia. La quimioterapia es utilizada cuando el NSCLC se diagnostica en una etapa avanzada y se ha extendido a otras partes del cuerpo. El EGFR es el receptor que contiene la célula en su superficie, constituye un blanco de gran interés dado su importante papel en el desarrollo tumoral, y representa una diana molecular en las actuales y futuras estrategias terapéuticas contra el cáncer. El desarrollo de moléculas para inhibir TKs comenzó en los años sesenta cuando empezaron a aparecer los detalles de caracterización y señalización de las quinasas. A lo largo de estos años la FDA ha aprobado diversos inhibidores, los cuales se clasifican como inhibidores de primera, segunda o tercera generación.. 22.

(45) INTRODUCCIÓN. ERLOTINIB Erlotinib clorhidrato (ERLOT), denominado químicamente como N- (3etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi) quinazolin-4-amina (Figura 4), es un inhibidor de primera generación y está indicado para tratar cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas y otros tipos de cáncer. Se comercializa bajo el nombre de Tarceva, y se encuentra disponible en dosis de 25, 100 y 150 mg. ERLOT se dirige específicamente a la TK, que está altamente expresada y ocasionalmente mutada en diversas formas de cáncer. Esta droga se presenta como un agente oral que bloquea la transducción de la propagación de señales mediadas por los EGFR [40]. En noviembre de 2004 la FDA aprobó el uso de ERLOT para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas tras el fallo de unos ciclos previos de quimioterapia [41, 42]. Para pacientes con cáncer de pulmón no microcítico, la dosis diaria recomendada de Tarceva es 150 mg administrada al menos una hora antes o dos horas después de la ingestión de alimentos. El ERLOT es ampliamente metabolizado en el organismo, originando una gran cantidad de metabolitos, siendo los más importantes los que se muestran en la figura 5; (A) desmetil erlotinib (DERLOT), (B) didesmetil erlotinib (DDERLOT) y (C) desmetil erlotinib acetato (DAERLOT). La principal ruta de excreción de este compuesto y sus metabolitos son las heces, en las que se excreta el 83%, seguido de la orina donde se excreta aproximadamente el 8% del global. Solamente menos del 2% de la dosis administrada se excreta tanto en heces como en orina, como compuesto original[43]. En la tabla 3 se recogen los valores teóricos de las propiedades fisicoquímicas de erlotinib y sus metabolitos obtenidos a través del programa ACD/ChemSketch y el programa de estimación para el cálculo de propiedades físico / químicas proporcionado por la EPA.. 23.

(46) INTRODUCCIÓN. Figura 4. Estructura química de erlotinib.. B. A. C. Figura 5. Estructura química de los principales metabolitos de erlotinib (A) desmetil erlotinib, (B) didesmetil erlotinib y (C) desmetil erlotinib acetato.. 24.

(47) INTRODUCCIÓN. Tabla 3. Propiedades Fisicoquímicas de ERLOT, DERLOT, DDERLOT y DAERLOT Parámetro ERLOT DERLOT DDERLOT DAERLOT Fórmula Molecular C22H23N3O4 C21H21N3O4 C20H19N3O4 C23H23N3O5 Peso Molecular 393.43572 379.40914 365.38256 421.44582 C(66.48%) C(67.16%) C(65.74%) C(65.55%) H(5.58%) H(5.89%) H(5.24%) H(5.50%) Composición N(11.08%) N(10.68%) N(11.50%) N(9.97%) O(16.87%) O(16.27%) O(17.52%) O(18.98%) Refractividad Molar (cm3) Volumen Molar (cm3) Parachor (cm3) Índice de Refracción Tensión superficial (dyne/cm) Densidad (g/cm3) Polarizabilidad x 1024 (cm3) Masa Monoisotópica (Da) Masa Nominal (Da) Masa Media (Da) Solubilidad en agua (mg/L) Log Kow pKa. 110.06 ± 0.4. 105.22 ± 0.4. 100.39 ± 0.4. 114.81 ± 0.4. 315.4 ± 5.0. 290.5 ± 5.0. 265.6 ± 5.0. 328.3 ± 5.0. 877.6 ± 6.0. 834.2 ± 6.0. 790.8 ± 6.0. 1.614 ± 0.03. 1.644 ± 0.03. 1.679 ± 0.03. 922.9 ± 6.0 1.616 ± 0.03. 59.9 ± 5.0. 67.9 ± 5.0. 78.5 ± 5.0. 62.4 ± 5.0. 1.24 ± 0.1. 1.30 ± 0.1. 1.37 ± 0.1. 1.28 ± 0.1. 43.63 ± 0.5. 41.71 ± 0.5. 39.79 ± 0.5. 45.51 ± 0.5. 393.168856. 379.153206. 365.137556. 421.163771. 393 393.4357. 379 379.4091. 365 365.3826. 21 421.4458. 14.02. 67.64. 146.6. 5.143. 2.79 5.6±0.7. 2.09 5.1±0.7. 1.79 5.1±0.7. 3.09 5.1±0.7. 25.

(48) INTRODUCCIÓN. Antecedentes bibliográficos en la determinación de erlotinib Tras realizar una revisión bibliografía desde el lanzamiento de ERLOT hasta la actualidad, se han encontrado un gran número de trabajos que aborden la separación y/o cuantificación de ERLOT. La gran mayoría de las metodologías descritas en la literatura realizan el estudio en muestras de plasma, siendo los tratamientos previos más habituales la precipitación proteica con acetonitrilo o bien una extracción líquido- líquido. La cromatografía liquida es sin duda la técnica más empleada tal y como puede observarse en la tabla 4, usando distintos tipos de detección, destacando la detección por espectrometría de masas o UV-Vis. En algunos trabajos el objetivo ha sido la determinación única de ERLOT en plasma humano [44, 45] o de ratón [46–48], utilizando la cromatografía liquida con detección UV-Vis o bien con detección por masas. Debido a que ERLOT es ampliamente metabolizado en el organismo generando distintos metabolitos resultantes de la O-desmetilación de cualquiera de sus cadenas laterales, entre los que se encuentran DERLOT, DDERLOT y DAERLOT. La determinación de ERLOT y su principal metabolito (DERLOT) ha sido objeto de estudio en muestras de plasma por diferentes autores [49–54]. Básicamente en estos trabajos se utiliza la cromatografía líquida hibridada con espectrometría de masas y un sistema MS/MS que permite mejorar la sensibilidad y selectividad a la hora de la determinación. Sin embargo, en algún caso se propone la cromatografía líquida con detección UV-Vis para la determinación de estos compuestos en estas muestras biológicas. La determinación conjunta de ERLOT y varios de sus metabolitos fue llevada a cabo por Svedberg y col [55], proponiendo un método de HPLCMS/MS que fue aplicado con éxito a muestras reales de plasma de pacientes oncológicos bajo tratamiento con dicho compuesto.. 26.

(49) INTRODUCCIÓN. Debido a que ERLOT es muy utilizado en el tratamiento del cáncer, en su uso oncológico, éste es administrado de forma concomitante con una gran variedad de fármacos. Por ello en literatura científica podemos encontrar una gran cantidad de trabajos para la determinación de esta droga mediante HPLC asociada generalmente a la espectrometría de masas para la determinación conjunta con varios TKIs [29], [56–64], tamoxifen [65] y otros anticancerígenos [66–71]. En los últimos años se han desarrollado algunos métodos que emplean técnicas alternativas a la cromatografía líquida. En nuestro grupo de investigación se ha propuesto una metodología basada en el uso de electroforesis capilar (CE) con detección UV para abordar la cuantificación de ERLOT y tres de sus metabolitos en muestras de orina [72]. Para separar ERLOT y sus metabolitos de la matriz, se realizó una extracción líquido-líquido. 1 mL de orina se trató con tres porciones sucesivas de 1 ml de 1-clorobutano / butanol (70:30 v / v). Después de una agitación vertical (10 min) y una posterior centrifugación (5000 rpm, 15 min), se recuperó la capa orgánica superior y se llevó a sequedad bajo una corriente de nitrógeno. Por último, el residuo seco se reconstituyó en 250 µl de tampón electrolítico. El método fue aplicado con éxito a muestras de pacientes bajo tratamiento con ERLOT. Zhang y col. [73] propusieron una ruta de síntesis de carbon dots dopados con azufre y nitrógeno, los cuales presentan fluorescencia entre el azul y el verde. Estos carbon dots actúan como sensores ópticos en la determinación espectrofluorimétrica de ERLOT. Para realizar el análisis se prepara una disolución de carbon dots dopados con nitrógeno y azufre en tampón fosfato de pH 4. Tras adicionar la muestra se espera 10 minutos para completar la reacción entre ERLOT y los carbon dots y finalmente se registra la disminución de intensidad de fluorescencia a 408 nm, utilizando una longitud de onda de excitación de 340 nm. Este método está basado en el efecto quenching que provoca el ERLOT sobre los carbon dots, pudiendo ser utilizado, según los autores, como un sensor. 27.

(50) INTRODUCCIÓN. para la determinación de este anticancerígeno en muestras de agua y suero. Yamamoto y col. [74] han desarrollado un método selectivo basado en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el cual ha sido validado para cuantificar ERLOT en muestras de suero humano. En la tabla 4 se recogen los métodos encontrados en bibliografía indicando los analitos y el tipo de matriz en el que se lleva a cabo el análisis, así como la técnica y sistema de detección empleados.. Tabla 4. Revisión bibliográfica de métodos para determinar erlotinib. Analito Matriz Separación Detección ERLOT Plasma HPLC-UV ERLOT Plasma HPLC-MS/MS ERLOT Plasma de ratón HPLC-MS/MS ERLOT Plasma de rata HPLC-UV ERLOT Plasma de rata HPLC-MS/MS ERLOT y DERLOT Plasma HPLC- MS/MS ERLOT y DERLOT Plasma HPLC-UV ERLOT y DERLOT Plasma HPLC-MS/MS ERLOT y DERLOT Plasma HPLC-MS/MS ERLOT, DERLOT y 4 Plasma HPLC-MS/MS drogas más ERLOT y DERLOT Suero UHPLC-UV ERLOT, DERLOT Y Plasma HPLC-MS/MS DDERLOT ERLOT, Genitib, Sunitinib Plasma HPLC-MS/MS y Sorafenib Suero Sangre EELOT y Genitinib Plasma HPLC-UV ERLOT y 6 TKIs Plasma HPLC-MS/MS ERLOT, 6 TKIs y SAHA Plasma de rata UPLC-MS/MS ERLOT y Lapatinib Plasma HPLC-UV ERLOT y 10 TKIs Plasma HPLC-MS/MS ERLOT junto a 13 TKIs Plasma HPLC-MS/MS. 28. Ref [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56]. [57] [58] [59] [60] [61] [29].

(51) INTRODUCCIÓN Tabla 4. Continuación. Analito. Matriz. ERLOT e Imatinib ERLOT junto a 7 TKIs ERLOT junto a 4 TKIs ERLOT y Tamoxifen ERLOT junto a 8 drogas ERLOT, Valatinib, Bosutinib, Canertinib, Tandutinib,Pazopatinib y Dasatinib ERLOT, Imatinib, Lapatinib, Nilotinib, Sorafenin y Sunitinib ERLOT y Vemurafenib ERLOT y 8 drogas más ERLOT, dasatinib y nilotinib ERLOT, DERLOT, DDERLOT y DAERLOT ERLOT ERLOT. Plasma de ratón Sangre Plasma Plasma de rata Plasma Suero. Separación Detección UPLC-PDA HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS UPLC-MS/MS UPLC-MS/MS HPLC-DAD. [62] [63] [64] [65] [66] [67]. Plasma. HPLC-MS/MS. [68]. Plasma Plasma Plasma Suero Orina Orina. HPLC-UV HPLC-MS/MS HPLC-UV. [69] [70] [71]. CE-UV. [72]. Agua. Carbon dots fluorescentes ELISA. [73]. Suero. 29. Ref. [74].

(52) INTRODUCCIÓN. 1.3 ASPECTOS FARMACOLÓGICOS DEL CÁNCER DE PROSTATA La próstata es una glándula del aparato urogenital masculino que se encuentra debajo de la vejiga y cuya principal función es producir el líquido seminal. La glándula prostática tiene el tamaño de una nuez y está formada en un 30% de tejido muscular y en un 70% de tejido glandular. El tejido de la glándula prostática rodea la uretra y puede ser dividido en tres zonas diferentes, que de la más interna a la más externa son: a) zona de transición: se encuentra dentro de la glándula y es la parte más pequeña de la próstata (aproximadamente el 10%). Rodea la uretra entre la vejiga y el tercio superior de la uretra. b) zona central: constituye un cuarto de la masa total de la próstata y es donde se encuentra el conducto común a la próstata, el conducto seminal y las vesículas seminales (conducto eyaculador). c) zona periférica: representa la parte principal de la glándula prostática (aproximadamente el 70%).. Figura 6. Glándula Prostática. 30.

(53) INTRODUCCIÓN. Las enfermedades más comunes de la próstata son la prostatitis, la hiperplasia prostática benigna y el cáncer de próstata, el cual es común en hombres de edad avanzada, suelen desarrollarse mayormente en la zona periférica de la próstata. Este tipo de cáncer es raro en hombres menores de 40 años. El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte en estados unidos y Europa. Según el estadio de la neoplasia, los tratamientos varían, desde la cirugía y radioterapia con fines curativos hasta tratamientos paliativos con hormonoterapia y quimioterapia. El crecimiento y progresión del cáncer de próstata es estimulado por los andrógenos que actúan a través del receptor de andrógenos (RA). La mayoría de los andrógenos se sintetizan en los testículos y las glándulas suprarrenales a partir de precursores del esteroide pregnano. Los testículos son la principal fuente de testosterona en los hombres, aportando aproximadamente el 90-95% de los andrógenos circulantes [75,76]. La castración quirúrgica o médica tiene como consecuencia la ablación de la producción de testosterona por los testículos [77]. Las glándulas suprarrenales son responsables de los andrógenos restantes, que se convierten enzimáticamente en testosterona (T) y dihidrotestosterona (DHT) en la próstata y en los tejidos periféricos. La dependencia de las células prostáticas en la señalización RA persiste después de la transformación neoplásica, y por tanto forma la base de la terapia de cáncer de próstata metastásica. Desde este punto de vista, la presencia de CYP17 juega un papel importante, ya que se trata de un miembro de la superfamilia enzimática del citocromo P-450 localizado en el retículo endoplasmático. Las proteínas de esta familia son del tipo monooxigenasas que catalizan muchas reacciones involucradas en el metabolismo de drogas. Tienen actividad tanto 17 α- hidroxilasa como actividad 17,20 liasa, siendo una enzima clave en la ruta esteroidogénica.. 31.

(54) INTRODUCCIÓN. ABIRATERONA Abiraterona (ABR) es un medicamento altamente potente y selectivo, inhibidor irreversible de 17α-hidroxilasa / C17, 20 liasa (CYP17) [78]. ABR (Figura 7) cataliza reacciones críticas en la síntesis de andrógenos en tumor testicular, tejidos suprarrenal y prostático [79]. Acetato de abiraterona (AA) es el profármaco que se comercializa bajo el nombre de Zytiga, fue aprobado por los EE. UU. y la FDA en abril de 2011 para el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (mCRPC) [80]. La dosis recomendada de AA es de 1,000 mg en una única toma al día [81] . Después de la administración oral, el AA se metaboliza ampliamente y la hidrólisis del éster es la vía primaria de biotransformación, seguido de hidroxilación adicional, sulfatación y Noxidación [82] . AA debe tomarse en estado de ayuno debido a que la biodisponibilidad puede aumentar hasta 10 veces cuando se administra después de una comida rica en grasas. ABR tiene un gran volumen aparente de distribución, que se define como el volumen teórico necesario para que en todos los órganos haya una concentración de éste igual a la que hay en el plasma sanguíneo, y está altamente unido a la proteínas plasmáticas (99.8%) [83] . Tras la administración oral de una dosis, la recuperación de la droga en las heces y la orina es del 88% y 5% respectivamente. El máximo de concentración plasmática de ABR se alcanza aproximadamente tras las 2 horas siguientes a su administración, con una vida media promedio en plasma de aproximadamente 12 horas [80] . En la tabla 5 se recogen los valores teóricos de las propiedades fisicoquímicas de abiraterona y acetato de abiraterona obtenidos mediante el programa ACD/ChemSketch y el programa de estimación para el cálculo de propiedades físico / químicas proporcionado por la EPA.. 32.

(55) INTRODUCCIÓN N N CH3 CH3 CH3 CH3 O H3C. O HO. ABR. AA. Figura 7. Estructura química de acetato de abiraterona y abiraterona.. Tabla 5. Propiedades fisicoquímicas de abiraterona y acetato de abiraterona. Parámetro Fórmula Molecular Peso Molecular Composición. Refractividad Molar (cm3) Volumen Molar (cm3) Parachor (cm3) Índice de Refracción Tensión superficial (dyne/cm) Densidad (g/cm3) Polarizabilidad (cm3) Masa Monoisotópica (Da) Masa Nominal (Da) Masa Media (Da) Solubilidad en agua (mg/L) Log Kow pKa. ABI C24H31NO 349.50904 C(82.47%) H(8.94%) N(4.01%) O(4.58%) 105.18 ± 0.4 305.1 ± 5.0 811.7 ± 6.0 1.605 ± 0.03. AA C26H33NO2 391.54572 C(79.76%) H(8.50%) N(3.58%) O(8.17%) 114.77 ± 0.4 343.0 ± 5.0 900.3 ± 6.0 1.583 ± 0.03. 50.0 ± 5.0. 47.4 ± 5.0. 1.14 ± 0.1 41.70 ± 0.5 10-24 349.240565 349 349.509 0.5026 5.39 5.11±0.12. 1.14 ± 0.1 45.49 ± 0.5 10-24 391.251129 391 391.5457 0.0119 6.40 5.11±0.12. 33.

(56) INTRODUCCIÓN. Antecedentes bibliográficos en la determinación de abiraterona Fruto de la revisión bibliográfica realizada, se ha comprobado que hay propuestos diversos métodos analíticos para llevar a cabo la determinación de abiraterona. Los principales métodos descritos en la literatura científica recurren a la cromatografía líquida, empleando distintos sistemas de detección como son la detección UV, detección por fluorescencia o detección por espectrometría de masas. En la mayoría de las metodologías se suele trabajar en fase inversa, empleando una columna C18 bien en modo isocrático [84–87] o gradiente [88–92]. Kumar et al. [84] propusieron una metodología para determinar ABI en plasma de rata utilizando un sistema de HPLC-UV, realizando la detección a 255 nm. Dicha metodología requiere de un tratamiento previo de la muestra en el cual se realizó una extracción líquido- líquido con acetato de etilo y una posterior evaporación a sequedad bajo corriente de nitrógeno a una temperatura de 50ºC, reconstituyendo el residuo seco en acetonitrilo. Esta metodología permitió limpiar la muestra, sin embargo, no fue lo suficientemente sensible para llevar a cabo el control de la droga en plasma de pacientes con mCRPC. Chandra y col. [85] desarrollaron otro método de HPLC con detección UV con el fin de determinar AA en el producto de síntesis y en formulaciones farmacéuticas. Esta metodología puede ser aplicada para llevar a cabo controles de calidad de los formulados farmacéuticos. Como ya es sabido, la espectrometría de masas acoplada a los sistemas de separación cromatográficos se caracteriza por su selectividad y buena sensibilidad, es por ello, que numerosos autores recurren a este tipo de sistema para abordar la determinación de ABR en muestras biológicas tales como suero y plasma [86–92]. Gurav y col. [86] propusieron un método para determinar ABI tanto en plasma de rata como en plasma humano mediante LC-MS/MS-ESI.. 34.

(57) INTRODUCCIÓN. Únicamente es necesario realizar una precipitación de las proteínas plasmáticas con acetonitrilo como etapa previa al análisis. Gracias a la sensibilidad que ofrece este tipo de detector el límite de detección fue del orden de ppb. Alyamani y col. [87] desarrollaron un método capaz de determinar ABI y siete de sus metabolitos esteroideos en suero mediante LC–MS/MS trabajando en modo isocratico. Los analitos se separaron utilizando una columna Zorbax Eclipse Plus C18 150 x 2.1 mm, de 3.5 µm a 40 ° C y una fase móvil compuesta por un 35% A (ácido fórmico al 0.1% en agua) y un 65% B (0.1% de ácido fórmico en metanol: acetonitrilo (60:40)). Siendo la detección de ABI lineal de 2 a 400 ng / mL. Este método solo fue aplicado a muestras de suero dopadas previamente, pero no en suero de pacientes bajo tratamiento. Martins y col. [88] abordaron la determinación conjunta de ABR y AA en plasma humano. El método propuesto requiere un tratamiento previo de la muestra en el cual se acidifica el plasma con ácido fórmico al 2% y se centrifuga durante 10 minutos antes de realizar un proceso de extracción en fase sólida. Este tratamiento, implica la utilización de un cartucho de extracción en fase sólida catiónico de modo mixto Strata X-C 33µM, donde la elución de los compuestos se lleva a cabo con hidróxido amónico al 5% en acetonitrilo-metanol (80:20 v/v). Posteriormente, la muestra se lleva a sequedad, y es reconstituida en acetonitrilo – agua (80:20 v/v). Este método presentó un intervalo de respuesta lineal comprendido entre 5 y 500 nM. Nuland y col. [90] elaboraron un método de HPLC-MS/MS para determinar de forma conjunta dos fármacos empleados en el tratamiento de mCRPC, ABI, enzalutamida y sus metabolitos. Al igual que otros autores recurren a la precipitación de proteínas plasmáticas usando acetonitrilo. El método propuesto fue validado para ABI en plasma en el intervalo lineal comprendido entre 1 y 100 ng/mL. Posteriormente éstos autores [91] desarrollaron otra metodología basada en la anterior, en la que incluyeron la determinación simultanea de un metabolito activo de. 35.

(58) INTRODUCCIÓN. ABI en plasma, el cual permite obtener información adicional sobre el metabolismo de este fármaco en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata tratados con AA. El método fue aplicado a 15 muestras de pacientes. Benoist y col. [92] llevaron a cabo la validación de un método para la cuantificación de ABI en plasma mediante HPLC–MS/MS. El método también propone una precipitación de las proteínas plasmáticas con acetonitrilo. Una vez realizada la precipitación se realizó una centrifugación, transfiriendo el sobrenadante a un vial para su inyección en el sistema. Este método fue aplicado para analizar muestras de pacientes con cáncer de próstata tratados con AA. Belleville y col. [93] propusieron un método para cuantificar solo ABI en plasma empleando un método de HPLC con detección fluorescente. Esta metodología requiere de varias etapas para preparar la muestra tales como: precipitación de las proteínas con acetonitrilo, centrifugación, adición de agua y éter dietílico, mezcla y nuevamente centrifugación, evaporación bajo corriente de nitrógeno y por último reconstitución en fase móvil. Todas estas etapas hacen que el tiempo requerido sea mayor, alargando así el proceso. Finalmente, el método permitió alcanzar límites de detección similares a los alcanzados con un detector de masas. El método fue aplicado para determinar ABI en el plasma de pacientes con mCRPC. Debido a que tanto AA y ABI presentan fluorescencia, Gong y col. [94] elaboraron un método espectrofluorimétrico para la determinación de AA en formulaciones farmacéuticas y de ABI en muestras de suero y orina. El método estudia la fluorescencia nativa de estas moléculas y la posibilidad de mejorar su intensidad de emisión cuando estas se incluyen dentro de una ciclodextrina, concretamente β-ciclodextrina. Estos autores realizaron estudios de cómo afectan diferentes variables a la intensidad de emisión, tales como son la temperatura, la fuerza iónica, pH y concentración de ciclodextrinas entre otras. Además, estudiaron las constantes de inclusión de las moléculas en las ciclodextrinas. El método fue aplicado a muestras. 36.

(59) INTRODUCCIÓN. dopadas de suero y orina que se trataron previamente en proporción 1:10 con acetonitrilo, con el fin de eliminar los compuestos interferentes. Tras un proceso de agitación y centrifugación se midió la fluorescencia de estos compuestos en la disolución sobrenadante. Este método presenta la ventaja se ser más económico que los basados en cromatografía líquida los cuales requieren de equipos más costosos. Pero sin embargo, aunque presenta límites de detección algo inferiores a los obtenidos mediante HPLC-UV [95], tiene LODs superiores a los obtenidos mediante HPLCMS/MS-ESI [86].. 37.

(60) INTRODUCCIÓN. 1.4 ASPECTOS FARMACOLÓGICOS DE LA LEUCEMIA. La médula ósea es el tejido conectivo suave y flexible que se encuentra dentro de los huesos. Es un componente del sistema linfático, y sus funciones principales son producir células sanguíneas y células para almacenar grasa. Hay dos categorías de tejido de médula ósea: la médula ósea roja y amarilla. La médula roja contiene células madre sanguíneas que se pueden convertir en glóbulos rojos, glóbulos blancos o plaquetas, mientras que la médula amarilla está compuesta, en mayor parte, de grasa. Los glóbulos blancos o leucocitos participan en la defensa del organismo frente a cualquier microorganismo dañino, también actúan destruyendo las células cancerosas, y están formados por tres tipos de células denominadas linfocitos, monocitos y granulocitos. La célula inmadura de los granulocitos se llama mieloblasto, de éste viene el nombre de leucemia mieloide. Una vez maduros, se diferencian en tres tipos de células llamadas neutrófilos, eosinófilos y basófilos, éstos se distinguen por el tamaño y por el color de sus gránulos. Hay dos tipos de linfocitos, linfocitos B y linfocitos T. Los linfocitos B reconocen las bacterias y se unen a ellas. Los granulocitos y los monocitos únicamente pueden reconocer y destruir a las bacterias cuando los linfocitos están unidos a éstas. Los linfocitos T reconocen a las células infectadas y las destruyen con ayuda de los macrófagos. La leucemia mieloide crónica (chronic myeloid leukemia, CML), es un tipo de cáncer que se inicia en ciertas células productoras de sangre de la médula ósea. Se produce un cambio genético en una versión temprana de células mieloides, es decir, aquellas células que producen glóbulos rojos, plaquetas, y la mayoría de los tipos de glóbulos blancos (excepto linfocitos). Este cambio forma un gen anormal llamado BCR-ABL [96], que convierte la célula en una célula CML. Las células leucémicas crecen, se. 38.

(61) INTRODUCCIÓN. dividen más rápido de lo habitual y no mueren cuando deberían hacerlo, de modo que se acumulan en la médula ósea, desplazando a las células normales. En algún momento, las células de leucemia salen de la médula ósea y entran al torrente sanguíneo, causando a menudo un aumento en el número de glóbulos blancos en la sangre. Una vez en la sangre, las células leucémicas pueden propagarse a otros órganos, en donde pueden evitar el funcionamiento normal de otras células corporales. La CML es una leucemia cuyo crecimiento es relativamente lento, pero también puede transformarse en una leucemia aguda de crecimiento rápido, la cual es difícil de tratar. Según la Organización Mundial de la Salud la CML se clasifica en tres fases que ayudan a determinar el pronóstico. Estas se basan principalmente en el número de glóbulos blancos inmaduros o mieloblastos (blastos), que se observan en la sangre o en la médula ósea. Se definen las siguientes fases: a) Fase crónica: pacientes con menos del 10% de blastos en las muestras de sangre o médula ósea. Estos presentan síntomas muy leves y usualmente responden a tratamientos convencionales. b) Fase acelerada: cuando las muestras de sangre o de médula ósea tienen más del 10% pero menos del 20% de blastos, altos recuentos de basófilos en la sangre, de glóbulos blancos, recuentos de plaquetas muy altos o muy bajos que no son causados por el tratamiento o nuevos cambios cromosómicos en las células leucémicas. La CML en la fase acelerada no responde tan bien a los tratamientos como la CML en la fase crónica. c) Fase blástica: pacientes que tienen más de un 20% de blastos. Con frecuencia las células blásticas se propagan de la médula ósea a otros tejidos y órganos. En esta fase, la CML actúa agresivamente como una leucemia aguda.. 39.

Referencias

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