MODELO CINÉTICO HIPERBÓLICO PARA EVALUAR LA
DEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS POR HONGOS
FILAMENTOSOS
M. CRISTINA ROMERO•1, M. INÉS URRUTIA2 , ENSO H. REINOSO1 & ALEJANDRO MORENO KIERNAN2
1Micología Médica e Industrial, Dep. Microbiología, Fac. Cs. Veterinarias, 2Fac. Cs. Agrarias
y Forestales - Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina
[email protected], [email protected]
RESUMEN
La detoxificación de suelos contaminantes por especies fúngicas es un fenómeno muy complejo y difícil de controlar sin una herramienta matemática que cuantifique las variables que intervienen. Condicionan este proceso factores ambientales, fisico-químicos, climáticos, edáficos y antrópicos. Por lo tanto, el objetivo fue evaluar el ajuste de los datos experimentales a la ecuación de 1er. orden o cinética hiperbólica, comparar los parámetros cinéticos e interpretar biológicamente las variables matemáticas que intervienen. El modelo propuesto interpreta y cuantifica el mecanismo de transporte de membrana de aromáticos ligados al esquema enzima-sustrato S1 + E k 1/ k -1 ES k2/ k -2 E + S2.Los parámetros Vmax, velocidad de consumo (µmol/min.mg biomasa), y Km (µmol), constante de afinidad se obtuvieron aplicando las transformaciones de Lineweaver-Burke, Eadie-Hofstee y Hanes-Woolf. Las gráficas fueron consistentes y lineales, interpretándose que el consumo respondió al modelo Michaelis-Menten. La comparación de las estimaciones con los datos experimentales fue significativa, demostrando que la respuesta hiperbólica fue altamente significativa. En conclusión, las respuestas cinéticas representan adecuadamente los datos obtenidos in-vitro con especies fúngicas y xenobióticos. Estos modelos aportan información para tomar decisiones racionales relevantes, entre las variables ambientales, morfológicas y fisiológicas fúngicas.
ABSTRACT
hyperbolic kinetics, to comparethe parameters and to assess biological interpretation of the mathemathical variables. The model quantified the membrane transport mechanisms of aromatics with theenzyme-substrate coupling scheme S1 + E k 1/ k -1 ES k2/ k-2 E + S2. The Vmax, maximum uptake rate (µmol/min.mg biomass), and Km (µmol), affinity constant were obtained by the double-recciprocal Lineweaver-Burke, Eadie-Hofstee and Hanes-Woolf transformations The plots were consistent and lineal, indicating that the uptake occurred according to Michaelis-Menten model. The comparation of the estimated values with the experimental data was significative, denoting the goodness of the the hyperbolic relation. In conclusion, the kinetic response properly represented the in-vitro data with fungi species and xenobiotics. This model gave conspicous information to take relevant and rational decisions on environmental factors with fungal morphology and physiology.
Palabras claves: ajuste significativo - hongos filamentosos - modelo hiperbólico -
parámetros cinéticos - transformaciones lineales.
Key-words: filamentous fungi - hyperbolic model - kinetic parameters - lineal
transformations - significative fit
INTRODUCCIÓN
La detoxificación de suelos contaminantes por especies fúngicas es un fenómeno muy complejo y difícil de controlar sin una herramienta matemática que cuantifique las variables que intervienen. Condicionan este proceso diversos factores ambientales, fisico-químicos, climáticos, edáficos y la actividad antrópica [1]. El empleo de modelos cinéticos para la interpretación de procesos metabólicos supone la aceptación de diferentes premisas que deben cuantificarse a fin de poder validar las ecuaciones propuestas [2,3]. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el ajuste de los datos experimentales a la ecuación de 1er. orden o cinética hiperbólica de Michaelis-Menten, comparar los parámetros cinéticos correspondientes e interpretar biológicamente las variables matemáticas que intervienen.
MATERIAL Y MÉTODOS
inoculados. Las diferencias entre los tratamientos fueron evaluados mediante el principio de los cuadrados mínimos (LSD-test), las correlaciones entre las concentraciones de los polutantes y la actividad degradadora por el test de Spearman. Los resultados se obtuvieron mediante la aplicación de Statistical Software, version 5.0 (Statsoft, Inc., Tulsa, Okla.); se trabajó con P < 0.5 significativo, P < 0.01 altamente significativo.
Cultivos fúngicos: Se cultivaron en medio basal con 35 mg de fenantreno, pireno o fluoranteno como única fuente de carbono y energía, en un reactor de 5 l, pH 5.5, temperatura 27 ºC, oxígeno 98 % saturación a 120 rpm. La tasa de biotransformación de cada hidrocarburo se cuantificó después de 35 días de incubación, en microcosmos inoculados con 0.65 gr.l-1 de 3 especies fúngicas dominantes.
Periódicamente se analizaron submuestras para determinar los hidrocarburos residuales. Alícuotas de 3 ml se mezclaron con 6 ml de hexano-acetona (1:1), se agitó 10 min y separaron las partículas por centrifugación a 1800 rpm 6 min. El sobrenadante, 1.5 ml, se filtró y colocó en un vial-HPLC, y los niveles de cada polutante fueron analizadas por 1090-HPLC, acorde a [4]. Todas las determinaciones se efectuaron por duplicado, con eficiencia de extracción de 93.5 ± 4.9 %, 75.7 ± 3.2 %, 81.9 ± 3.5 % para fenantreno, pireno y fluoranteno, respectivamente
RESULTADOS
El modelo propuesto interpreta y cuantifica el mecanismo de transporte de membrana de aromáticos ligados al esquema enzima-sustrato k 1 k 2
S1 + E k -1 ES k -2 E + S2
donde: S1 y S2 (µmol/mg) son las concentraciones extracelulares e intracelulares del polutante, E es el sistema enzimatico interviniente (µmol/l), ES es el complejo enzima-sustrato (mmol/l), k1, k2 son las constantes de reacción del consumo (mg/µmol. min), k -1 y k -2 las constantes de reacción del proceso fisiológico inverso (mg/µmol.min).
El modelo supone que el pasaje del complejo ES es rápido y que los niveles de E y ES son pequeños comparados con S1 y S2. Es decir que se avala que el mecanismo es un pseudo-estado fijo donde no hay acumulación del complejo ES: d (ES) / d t = 0.
De esta premisa se obtienen las velocidades de formación v1 y descomposición v2 de ES: v1 = k 1[ S1][ E ] - k -1[ ES ] y v2 = k 2[ S2][ E ] - k -2[ ES ]
niveles de sustratos se empleron para una estimación precisa de ambos parámetros cinéticos. La comparación de las estimaciones con los datos experimentales fue significativa, demostrando que los datos obtenidos con el modelo hiperbólico fueron reproducibles.
Las transformaciones doble-recíproca de Lineweaver-Burke, Eadie-Hofstee y Hanes-Woolf y sus gráficas fueron consistentes (Fig. 1), permitiendo estimar Vmax, velocidad máxima de consumo del polutante obtenida a partir de la pendiente de la recta, y Km, constante de afinidad valorada como la intersección entre x e y. De las transformaciones resultaron respuestas lineales con R saltamente significativos, interpretándose que el consumo respondió al modelo de Michaelis-Menten, y de estos gráficos se obtuvieron Km y Vmax. (a)
0.3 ∗ ∗
R = 0.98 0.2 ∗ ∗
0.1 ∗∗ ∗
0.3
(b)
0.2
° ° R = 1.0 °° °
0.1 °°
0.3 • • (c) •
•° R = 0.99 0.2 • •
• • ••
0.1
0 0.025 0.050 0.075 0.10 1/ S µM-1
Figura 1: Gráfica de Lineweaver-Burke para las especies fúngicas y los aromáticos ensayados. ((a)
fenantreno ∗, (b) pireno °, (c) fluoranteno •; valores proomedio de 3 replicas con DS no mayor a 0.1).
La resolución de las ecuaciones arrojó los siguientes resultados: para el fenentreno y = 0.01 + 4.9 x R = 0.98, con pireno y = 0.006 + 3.57 x R = 1.0, con fluoranteno y = 0.05 + 28.06 x R = 0.99, ecuaciones resueltas con Apple L.C. y Crick Graph Programme.
aplicación de modelos cinéticos proveen un soporte conspicuo para la interpretación de los ensayos. Estos modelos aportan información para tomar decisiones racionales relevantes, aportan información respecto de las interrelaciones con las variables de los cultivos y las variaciones morfológicas y fisiológicas de los hongos ensayados.
Paecilomyces lilacinus, Fusarium oxysporum y Aspergillus ochraceus fueron seleccionadas
por su crecimiento manifiesto con fenantreno, pireno y fluoranteno, y ser dominantes. La capacidad degradadora se estimó mediante la disminución de los aromáticos y los parámetros Vmax, Km.
Tabla 1: Parámetros cinéticos de la degradación de aromáticos para las especies fúngicas
(media aritmética ± SD).
Parámetros calculados P. lilacinus F. oxysporum A. ochraceus
Km (µmol) 34 ± 6 33 ± 1 148 ± 61
Vmax (µmol/min.mg biomasa) 548 ± 55 65 ± 6 331 ± 89
k1 (mg biomasa/µmol. Min) 16 1.5 2.5
S1 (µmol) 160 - 230 50 – 70 90 - 150
biomasa (mg/ml) 0.11 ± 0.01 0.090 ± 0.001 0.013 ± 0.001
Los valores de Vmax para los aromáticos empledos (tabla 1) nos permitieron deducir que el fluoranteno resulto más tóxico por sus anillos bencénicos, y en concordancia la estimación matemática de Vmax disminuyó 14 ± 0.07 %.
Km estima la afinidad de la cepa por el sustrato, guardando una relación inversa, es decir a mayor Km menor afinidad o mayor toxicidad del compuesto. Los Km calculados fueron congruentes con la toxicidad de los aromáticos, con fenantreno se observaron Km menores, es decir con mayor afinidad, con pireno se obtuvieron resultados intermedios, siendo el fluoranteno el aromático menos tolerado por los hongos (tabla 2).
Tabla 2: Valores de Km (µmol, media aritmética ± desvío standard) de las especies fúngicas frente a los hidrocarburos aromáticos.
Aromáticos P. lilacinus F. oxysporum A. ochraceus
fenantreno 1.4 ± 0.12 2.5 ± 0.08 1.2 ± 0.08
pireno 4.2 ± 0.13 2.2 ± 0.10 2.5 ± 0.09
fluoranteno 9.4 ± 0.18 4.2 ± 0.08 2.2 ± 0.08
interpretación biológica.
DISCUSIÓN
Los modelos hiperbólicos y el empleo de los parámetros Vmax y Km, han sido aplicados a cultivos de algas en presencia de metales pesados con éxito [5,6], cepas fúngicas frente a insecticidas [7], y metales [8]. La cinética de 2do. orden o de Monod ha sido en general aplicada con frecuencia al mismo proceso, pero cuando se verifica incremento de la biomasa fúngica [9]. Acorde a nuestros resultados la ecuación de Michaelis-Mentes sigue siendo una herramienta de valor para obtener las variables biológicas en bioensayos [10]. En conclusión, se comprueba que las respuestas cinéticas representan adecuadamente los datos obtenidos in-vitro con especies fúngicas en presencia de xenobióticos. El modelo aplicado es de importancia para interpretar las relaciones entre las poblaciones microbianas heterogéneas y sus relaciones con los sustratos naturales, sugiriendo que podrían ser de interés para el estudio de la bioremediación de otros xenobióticos.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio se realizó con aportes del CONICET y de la Universidad Nacional de La Plata, Cát. Micología Médica, Industrial y Ambiental.
REFERENCIAS
[1] Jacques RJS, Okeke BC, Bento FM, Teixeira AS, Peralba MCR, Camargo FAO (2008). Microbial consortium bioaugmentation of polycyclic aromatic hydrocarbons in contaminated soil. Biores. Technol. 99: 2637-2643.
[2] Ghosh U, Talley JW, Luthy RG (2001). Particle-scale investigation of PAH desorption kinetics and thermodynamics from sediment. Environ. Sci. Technol. 35: 3468-3475.
[3] O’Donnel GA, Young YM, Rushton SP, Shirley MD, Crawford JW (2007). Visualization, modelling and prediction in soil microbiology. Nature 5: 689-699.
[4] Romero MC, Urrutia MI, Reinoso EH, Moreno Kiernan M (2010). Benzo[a]pyrene degradation by soil filamentous fungi. J. Yeast Fungi Research vol 1, http://www.academicjournals.org/JYFR.
[5] Ting YP, Lawson F, Prince IG (1991). Uptake of cadmium and zinc by the alga Chlorella vulgaris II. Multi-ion-situation. Biotechnol. Bioeng. 37: 445-455.
[6] Garnham GW, Codd GA, Gadd GM (1992). Kinetics of uptake and intracellular location of cobalt, maanganese and zinc in the estuarine green alga Chlorella salina. Appl. Microbiol. Biotechnol 37: 270-276.
[8] Garcia-Toledo A, Babich H, Stotzky G (1985). Training of Rhizopus stolonifer and Cunninghamella blakesleeana to copper: cotolerance to cadmium, cobalt, nickel and lead.
Can J. Microbiol. 31: 485-492.
[9] Paris DF, Steen WC, Baughman GL, Barnett JT (1981). Second-order model to predict microbial degradation of organic compounds in natural waters. Appl. Environ. Microbiol. 41: 603-609.
[10] Wang S, Chanock S, Tang D, Li Z, Jedrychowski W, Perera F (2008). Assessment of interactions between PAH exposure and genetic polymorphisms on PAH-DNA adducts in African American, Dominican and Caucasian mothers and newborns. Cancer Epidemiol. Biomark. Preven. 17: 2.
(Contactos: Dra M. Cristina Romero, Investigador Conicet, calle 528 bis nro 1632, 1900 La Plata, Argentina, [email protected]_ Ing M. Inés Urrutia, Prof. Estadística, Fac. Cs.
Agrarias y Forestales, UNLP, calle 60 e/ 119 y 120, s/n, La Plata, Argentina,
