Evaluación de la capacidad antioxidante por el método DPPH de nuevas cromonas haloalquil sustituidas

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA E

INDUSTRIAS

CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Evaluación de la Capacidad Antioxidante por el Método

DPPH de Nuevas Cromonas Haloalquil Sustituidas.

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA DE ALIMENTOS

ZAIDA PAULINA DUFFEY CASTILLO

DIRECTOR: Dr. CRISTIAN ALCIVAR LEÓN

DERECHOS DE AUTOR

© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2018

FORMULARIO DE REGISTRO BIBLIOGRÁFICO

PROYECTO DE TITULACIÓN

DATOS DE CONTACTO

CÉDULA DE IDENTIDAD: 0201937059

APELLIDO Y NOMBRES: DUFFEY CASTILLO ZAIDA PAULINA

DIRECCIÓN: MACHALA Y RÍO TULIPE

EMAIL: pauduffey_23@hotmail.com

TELÉFONO FIJO: 022491712

TELÉFONO MOVIL: 0984651460

DATOS DE LA OBRA

TITULO: Evaluación de la Capacidad Antioxidante

por el Método DPPH de Nuevas Cromonas Haloalquil Sustituidas.

AUTOR O AUTORES: ZAIDA PAULINA DUFFEY CASTILLO

FECHA DE ENTREGA DEL PROYECTO DE

TITULACIÓN:

Marzo de 2018

DIRECTOR DEL PROYECTO DE TITULACIÓN: Dr. CRISTIAN ALCIVAR LEÓN

PROGRAMA PREGRADO POSGRADO

TITULO POR EL QUE OPTA: INGENIERA EN ALIMENTOS

RESUMEN: Mínimo 250 palabras

Las cromonas son compuestos heterocícliclos, distribuidos en plantas y pigmentos. Los compuestos derivados de cromona con sustituyentes haloaquilo obtenidos por síntesis, muestran mejores propiedades de liposolubilidad. Asimismo, diversas actividades biológicas, como actividad antiinflamatoria, antimicótica, antimicrobiana, antiviral, antitumoral y anticancerígena. El presente trabajo evaluó la capacidad antioxidante de 13 nuevas cromonas haloalquil sustituidas, correlacionando los resultados experimentales con la entalpía de disociación de enlace (EDE). El

hidroxilo, dando lugar a un radical más estable. Debido a la actividad biológica de las cromonas, al contener actividad antioxidante nos permite abrir una puerta hacia la creación de novedosos compuestos útiles para la industria alimentaria y la industria farmacológica.

PALABRAS CLAVES:

2-Trifluorometilcromonas-3-metilsustituidas, DPPH, entalpía de disociación de enlace (EDE).

ABSTRACT: _{Chromones are heterocyclic}

DEDICATORIA

Este trabajo va dedicado a mi familia que siempre me ha apoyado y de una u otra manera han estado presentes en cada paso de mi vida.

A mi madre porque gracias a ella soy la mujer que soy, por su fortaleza, porque nunca dejó de creer en mí, ha sabido mantenerse de pie ante cualquier adversidad y me ayudó a llegar a este punto de mi vida, con sus palabras siempre acertadas y su ejemplo de vida. ¡Te amo!

A mi padre por su paciencia, amor, ejemplo y tolerancia, me ayudó a formar mi carácter y a saber que quiero en la vida.

A Doris por ser ejemplo de fuerza y de superación, nada es capaz de derrotarte.

A Sofía porque siempre has sido amiga y hermana.

A Amanda por ser mi luz, cada vez que me abrazas el mundo se detiene, eres parte de mi fuerza.

Andrea porque la vida nos hizo hermanas, siempre tuviste las palabras justas para levantarme cuando sentía que el mundo se venía abajo.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco en primer lugar a mi Director el Dr. Cristian David Alcivar León por su tiempo, paciencia y dedicación a este trabajo, por impartirme sus conocimientos, experiencia y sus palabras de apoyo en todo este proceso, por su amistad, Muchas Gracias.

Al personal del CIAL especialmente a la Bioq. María José Andrade y la Ing. Michelle Guijarro quienes en su momento supieron guiarme y ayudarme para el desarrollo del presente trabajo.

A mis padres por estar siempre presentes con su apoyo incondicional, por no dudar de mí.

A mi tía Ana Alicia que siempre está apoyándome y fue parte importante en el desarrollo de mi carrera, fue luz al final del túnel, millón Gracias.

A mi primo César Vega, sin tu ayuda esto no hubiese sido posible, estoy agradecida eternamente contigo.

A mis amigas Andre, Gise, Pame, Edu, Taty, Dany que siempre me hicieron barras y me ayudaron cuando necesité.

A mis amigos anónimos que con llamadas o mensajes siempre me animaron a continuar.

i

ÍNDICE DE CONTENIDOS

PÁGINA

RESUMEN ………1

ABSTRACT ………..2

1. INTRODUCCIÓN ...3

1.1. EL PROCESO DE GENERACIÓN DE RADICALES LIBRES ...3

1.2. EL NÚCLEO ESTRUCTURAL CROMONA Y LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ...5

2. METODOLOGÍA ...9

2.1. PRODUCTOS QUÍMICOS Y SOLVENTES ...9

2.2. ACTIVIDAD SECUESTRANTE DE RADICALES LIBRES ...9

2.3. CÁLCULO DE LAS ENTALPÍAS DE DISOCIACIÓN DE ENLACES Y DISTRIBUCIÓN DE LA DENSIDAD ESPÍN. ...10

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...12

2.4.1. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA .. 12

2.4.2. PRUEBA TUKEY PARA 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA... 13

2.4.3. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS DE 3-AZIDOMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA. ... 14

2.4.4. PRUEBA TUKEY DE 3-AZIDOMETIL-2 TRIFLUOROMETILCROMONA ... 15

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...17

3.1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ...17

3.1.1. CURVAS DOSIS-RESPUESTA PARA LA CAPACIDAD DE CAPTACIÓN DPPH DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA. ... 21

3.2. ENTALPIA DE DISOCIACIÓN DE ENLACE ...22

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...27

4.1. CONCLUSIONES ...27

ii

5. BIBLIOGRAFÍA ...29

iii

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA

Tabla 1. ANOVA 3-nitrometil-2-triflurometilcromona ...12

Tabla 2. Prueba TUKEY 3-nitrometil-2-triflurometilcromona ...13

Tabla 3. Diferencia significativa 3-nitrometil-2-triflurometilcromona ...13

Tabla 4. ANOVA 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ...14

Tabla 5. Prueba TUKEY 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ...15

Tabla 6. Diferencia significativa 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ....15

Tabla 7. Resumen de resultados de la capacidad antioxidante ...17

Tabla 8. Concentración Efectiva EC50 ...18

Tabla 9. Energía de disociación de enlace………...22

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

Figura.1 Generación de radicales libres ...33

Figura.2 Radical libre y molécula normal ...4

Figura 3. Estructura de flavonoides y sus anillos A, B y C. ...5

Figura 4. Nuevas Moléculas ...7

Figura 5. Reacción química entre especie antioxidante y el radical. ...8

Figura 6. Capacidad Antioxidante DPPH ...19

Figura 7. Cinética de estabilización de la molécula A ...19

Figura 8. Cinética de estabilización de la molécula B ...19

Figura 9. Curva dosis-respuesta 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona ....20

Figura 10. Curva dosis-respuesta 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ..21

Figura 11. Curva dosis-respuesta trolox ...22

v

ÍNDICE DE ANEXOS

PÁGINA

ANEXO 1 Cálculo de UPM6 ...31

1

RESUMEN

Las cromonas son compuestos heterocícliclos, distribuidos en plantas y pigmentos. Los compuestos derivados de cromona con sustituyentes haloaquilo obtenidos por síntesis, muestran mejores propiedades de liposolubilidad. Asimismo, diversas actividades biológicas, como actividad antiinflamatoria, antimicótica, antimicrobiana, antiviral, antitumoral y anticancerígena. El presente trabajo evaluó la capacidad antioxidante de 13 nuevas cromonas haloalquil sustituidas, correlacionando los resultados experimentales con la entalpía de disociación de enlace (EDE). El estudio teórico de la EDE permite inferir en la capacidad de molécula antioxidante de donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable. La actividad antioxidante se determinó mediante el radical estable DPPH y los resultados se expresaron como EC50 utilizando el estándar Trolox como referencia. De las 13 moléculas analizadas, 2 actuaron como anti radicales efectivos correspondientes a las estructuras de 3-nitrometil-2-triflurometilcromona (A) y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (B). Se determinó un EC50 de 0.00185; 0.00093 y 0.000043 g para A, B y Trolox, respectivamente. En cuanto al poder anti radical (P.A.) expresado como 1/EC50 se obtuvo valores de 541.23; 1080.5 y 23081.8 A, B y Trolox respectivamente. Los resultados muestran una relación directamente proporcional entre el poder anti radical y la capacidad antioxidante. Por otro lado, los valores de EDE fueron 331.4 kJ/mol (A) y 280.7 kJ/mol (B) y evidencian una mayor facilidad para escindir el enlace C-H, en el compuesto

B con el grupo azido (N3), donde el grupo funcional N3 que presenta características electro-atractoras favorece la deslocalización del radical a lo largo del anillo cromona. Asimismo, la densidad spin mostró la deslocalización del electrón en ambos compuestos y la capacidad del nitrógeno en el grupo azida de favorecer la potencia antioxidante. Finalmente, se observó que cuanto menor es el EDE, mayor es la capacidad de donar un átomo H de un grupo hidroxilo, dando lugar a un radical más estable. Debido a la actividad biológica de las cromonas, al contener actividad antioxidante nos permite abrir una puerta hacia la creación de novedosos compuestos útiles para la industria alimentaria y la industria farmacológica.

2

ABSTRACT

Chromones are heterocyclic compounds, distributed in plants and pigments. Compounds derived from chromone with haloacyl substituents obtained by synthesis, show better liposolubility properties. furthermore, various biological activities, such as anti-inflammatory, antifungal, antimicrobial, antiviral, antitumor and anticancer activity. The present work evaluated the antioxidant capacity of 13 new haloalkyl substituted chromones, correlating the experimental results with enthalpy of bond dissociation (BDE). The theoretical study of BDE allows to infer the capacity of antioxidant molecule to donate an atom of H, to form an stable radical. The antioxidant activity was determined by the stable DPPH radical and the results were expressed as EC50 using Trolox as reference. Of the 13 molecules analyzed, 2 acted as effective anti-radicals corresponding to the structures of 3-nitromethyl-2-trifluoromethylchromone (A) and 3-azidomethyl-2-trifluoromethyl-chromone (B). An EC50 of 0.00185 was determined; 0.00093 and 0.000043 g for A, B and Trolox, respectively. Regarding the anti-radical power (P.A.) expressed as 1 / EC50, values of 541.23 were obtained; 1080.5 and 23081.8 A, B and Trolox respectively. The results show a directly proportional relationship between anti-radical power and antioxidant capacity. On the other hand, the BDE values were 331.4 kJ / mol (A) and 280.7 kJ / mol (B) and show a greater facility to cleave the CH bond, in compound B with the azido group (N3), where the functional group N3 that presents electro-actractor characteristics favors the delocalization of the radical along the chromone ring. Likewise, the spin density showed the delocalization of the electron in both compounds and the nitrogen capacity in the azide group to favor the antioxidant potency. Finally, it was observed that the smaller the BDE, the greater the capacity to donate an H atom of a hydroxyl group, giving rise to a more stable radical. Due to the biological activity of chromones, since it contains antioxidant activity, it allows us to open a door towards the creation of novel compounds useful for the food industry and the pharmaceutical industry.

3

1. INTRODUCCIÓN

1.1. EL PROCESO DE GENERACIÓN DE RADICALES

LIBRES

Los procesos de oxidación provocan deterioro en la composición de algunos productos, por ende daños en la función nutricional y sensorial (Figura 1). Estos procesos son causados por la acción de los radicales libres (Figura 2), que son moléculas o intermediarios muy reactivos, que en su estructura química presenta un electrón desapareado o libre, por lo tanto tienden a captar un electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su propia estabilidad. Actualmente, se busca retardar este tipo de reacciones con el uso de bajas temperaturas, reducción de presión y oxígeno, enzimas que catalizan la oxidación y material de empaque adecuado (J. Pokorny, Yanishlieva, Alonso, & Gordon, 2004).

Una vía para detener el proceso oxidativo es la utilización de compuestos inhibidores de la oxidación que eviten la iniciación y/o propagación de reacciones en cadena de los radicales libres, que son causantes de problemas a la salud por una exposición prolongada a diversos contaminantes responsables de producir distintos tipos de radicales libres (Avello & Suwalsky, 2006).

4 Los procesos oxidativos provocan diferentes patologías como trastornos cardiovasculares, procesos neurodegenerativos e incluso cáncer (Machado & Marques, 2010). Como una alternativa para contrarrestar los efectos nocivos de formación de radicales libres en la última década se ha investigado una variedad importante de antioxidantes naturales que muestran diversas actividades biológicas como, agentes antibacteriales, antivirales, antiinflamatorios, antialergénicos, antitrombóticos y vasodilatadores (Valenzuela & Pérez, 2016). La variada actividad biológica muestra una estrecha relación con las propiedades curativas de una gran cantidad de plantas medicinales (García Bacallao, Vicente García Gómez, Rojo Domínguez, & Sánchez García, 2001)

Por otra parte, las condiciones de estrés oxidativo, son reconocidas por estar directamente relacionados al daño de varios procesos bioquímicos en células, afectando a lípidos, ADN y proteinas (Halliwell, 2007; Riboli & Norat, 2003; von Zglinicki, 2002). El análisis de evidencia epidemiológica muestra la capacidad de reducir el riesgo de enfermedades como el cáncer, promoviendo una dieta rica en frutas y vegetales, que promueven un balance oxidativo homeostático para el organismo (Riboli & Norat, 2003).

5

1.2. EL NÚCLEO ESTRUCTURAL CROMONA Y LA

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

La relación estructura-actividad anti-radicalaria u antioxidante, depende de la estructura química y se encuentra fuertemente influenciada por los sustituyentes, que son determinantes en la eficiencia de la actividad antioxidante. En moléculas con el anillo estructural cromona, como los flavonoides tres porciones estructurales determinan la potencia antioxidante o actividad secuestrante de radicales libres.

(a) La estructura de catecol en el anillo B,

(b) Los dobles enlaces en posición 2 y 3 en conjugación con el grupo carbonilo en el anillo C,

(c) La presencia de grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 5.

La Figura 3, muestra la relación estructura actividad antioxidante de los flavonoides, que presentan el anillo estructural cromona.

Particularmente, es conocido el efecto antioxidante y nutracéutico de diversas cromonas, (Balasundram, Sundram, & Samman, 2006) ubicuas en el reino vegetal (K Sharma et al., 2011) representando una característica relevante, la capacidad antioxidante de estos compuestos, que promueven la disminución de radicales libres (Phosrithong, Samee, Nunthanavanit, & Ungwitayatorn, 2012). Por lo tanto, la evaluación de la capacidad antioxidante de cromonas y análogos estructurales (Dias, Machado, & Marques, 2011) (por ejemplo: flavoniodes, isoflavonoides) sugieren un rol importante en procesos oxidativos (Li & Yang, 2010). En recientes años este tipo de compuestos han suscitado gran interés, debido a que son altamente reactivos como donadores de hidrógeno o electrones y por lo tanto Figura 3. Estructura de flavonoides y sus anillos A, B y C. El recuadro de color gris señala

6 presentan facilidad para interaccionar en la disminución y bloquear la formación de radicales libre (Seyoum, Asres, & El-Fiky, 2006). Esta evidencia motiva el interés y busqueda de nuevos compuestos antioxidantes, consistentes con la relación estructura-actividad de un nucleo estructural cromona y sustituyentes que presenten átomos de halógeno.

Por otra parte, la industria de alimentos tiene entre sus retos más importantes la conservación de productos. Evitar la descomposición por microorganismos, proteger la salud de los consumidores y evitar pérdidas económicas, se encuentran entre las metas comunes de toda empresa (Jan Pokorny, Yanishlieva, & Gordon, 2005). Es aquí, donde los antioxidantes son elementos relevantes, debido a su capacidad para controlar el daño oxidativo, presente de forma natural en lípidos y proteínas, componentes mayoritarios de algunos alimentos (Valenzuela & Pérez, 2016). En la actualidad variados antioxidantes naturales son empleados por la industria de alimentos, estos son provenientes de frutas y vegetales. Sin embargo, su aplicación a veces no resulta viable o efectiva ya que modifican el aroma, sabor y valor nutricional. Es así, que el estudio de nuevas moléculas, que presenten el núcleo cromona y sustituyentes que favorezcan la capacidad antioxidante suscita un interés constante (De la Vega, Cañarejo, & Pinto, 2017).

7 De los diversos métodos para evaluar la capacidad antioxidante, uno muy utilizado se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) el cual se controla mediante la reducción de la absorbancia a una longitud de onda. El DPPH presenta una coloración violeta cuando está presente como radical libre, y absorbe alrededor de 520 nm produciendo una disminución de la absorbancia que cambia a color amarillo (Figura 5). Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que puede donar una átomo de hidrógeno o con otra especie radical, se produce la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R (Muñoz Juárez & Gutiérrez, 2009).

8 Figura 5. Reacción química entre la especie antioxidante y el radical DPPH.

N N

NO₂ O₂N

O₂N _Antioxidante

DPPH (color: violeta)

NH N

NO₂ O₂N

O₂N

DPPH--H (color: amarillo) Antioxidante: cromona

Respecto a la relación estructura – actividad observada en compuestos que presentan el anillo cromona, se ha observado que el número y posición de los grupos hidroxilos, influencia en la actividad frente a radicales, debido a que determinan el carácter de la actividad secuestrante (Muñoz Jauregui & Ramos Escudero, 2007). En este trabajo se estudiará la capacidad antioxidante experimental de nuevos derivados que presentan el núcleo cromona y sustituyentes perhaloalquilo en posiciones 2 y 3. Evaluando la energía de disociación de enlace (EDE) por métodos teóricos y la densidad espín de las de los nuevos compuestos. Las correlaciones observadas de relación estructura – actividad, permitirá inferir en la influencia de grupos funcionales y su efecto en la tendencia a reaccionar con moléculas radicalarias (Vakarelska-Popovska & Velkov, 2016)

Por otra parte, la energía de disociación de enlace (EDE) se define como la cantidad de energía necesaria para romper o formar un enlace. Esta característica específica del enlace , varía en su valor entre enlace fuertes y enlaces débiles (Morrison & Boyd, 1998). Otra propiedad teórica evaluada, la densidad espín pone en evidencia la deslocalización del electrón a lo largo del sistema conjugado π de la molécula (Bort, 2001).

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la capacidad antioxidante de una serie de nuevas cromonas haloalquil sustituidas con diversos grupos funcionales por el método DPPH. Se asistió la interpretación de los resultados experimentales por estudios téoricos ab initio, que permitieron la predicción de entalpías de formación de enlace (EDE), debido a su conocida influencia en la disminución de radicales libres y su capacidad para eliminar

9

2. METODOLOGÍA

2.1. PRODUCTOS QUÍMICOS Y SOLVENTES

Los 13 compuestos estudiados en la presente tesis, fueron provistos por el Dr. Cristian Alcivar León (Facultad de Ciencias de la Ingeniería. CIAL. UTE, Quito, Ecuador), los mismos fueron sintetizados y estudiados en la tesis doctoral de tema ¨Estudio de nuevos benzopiranos haloalquilsustituidos¨ (Alcívar León, 2016).

A continuación, se describen los nombres químicos: 2-difluorometil-3-metilcromona (1); 2- diclorometil-3-metilcromona (2); 3-metil-2-pentafluoroetilcromona (3); 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona (4); 3-azidometil-2-trifluorometilcromon (5); 3-ftalimidoilmetil-2 trifluorometilcromona (6); 2-clorodifluorometil-3-metilcromona (7); 6-cloro-3-metil-2-trifluorometilcromona (8); 3-bromometil-2-trifluoroometilcromona (9); 3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona (10); 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona (11); 3-bromometil-2 clorodifluorometilcromona (12); 3-cianometil-2-trifluorometilcromona (13).

2.2. ACTIVIDAD SECUESTRANTE DE RADICALES LIBRES

Se evaluó la actividad secuestrante de radicales libres para los 13 derivados haloalquil sustituidos, a través del ensayo DPPH, utilizando TroloxTM (6-hidroxi- 2,5,7,8 - tetrametilcromona - 2 - carboxílico) como estándar (Dias et al., 2011). El método consiste en la reducción de una solución metanólica de DPPH en presencia de un antioxidante donador de hidrógeno. Tras la reacción, el DPPH de color violeta (máximo de absorción a 515 nm) produce una solución amarilla de DPPH2. El cambio de color de violeta a naranja nos indica que el compuesto analizado presenta capacidad antioxidante, esta variación de color es determinada utilizando un espectrofotómetro que mide la absorbancia.

10 absorbancia. El porcentaje de DPPH en la solución se determinó, mediante la ecuación 1

%DPPH en solución

El porcentaje de DPPH en solución se representó frente a la concentración de los compuestos ensayados, con el fin de obtener los correspondientes valores de EC50 que muestran la concentración efectiva que conduce a una pérdida del 50 % de la actividad de DPPH (Dias, Machado, & Marques, 2011).

Los valores de EC50 (mM) obtenidos con su respectiva desviación estándar son:460 ± 0,015 C-NO2; 59 ± 0,036 C-N3; 8,3 ± 0,0977 Trolox.

Para todos los compuestos analizados se utilizó metanol como disolvente. Se utilizó una solución DPPH_metanólica como control negativo y Trolox como control positivo. Las medidas fueron realizadas por triplicado con la finalidad de estimar el coeficiente de variación experimental en cada medida.

2.3. CÁLCULO DE LAS ENTALPÍAS DE DISOCIACIÓN DE

ENLACES Y DISTRIBUCIÓN DE LA DENSIDAD ESPÍN.

Para predecir las entalpías de disociación de enlace (EDE) y distribución de la densidad de spin en especies radicalarias. Se utilizó cálculos téoricos ab

initio, mediante el software Gaussian 09.

Para las moléculas neutras se realizó un cálculo de optimización de energía con el nivel de teoría PM6.

Asimismo, de cada molécula neutra optimizada, se generaron radicales por la eliminación de un átomo de hidrógeno. Se realizó de cada posible radical un calculó de optimización de geometría, utilizando multiplicidad de spin 2, al nivel de teoría de capa abierta uPM6. Se tomó en cuenta las estructuras radicalarias que presentaron menor energía de disociación del enlace C-H (BDE), asociadas con la formación de radicales, se calculó de acuerdo a la ecuación 2:

[2]

11 Donde Hf (M

.

), Hf (H) y Hf (M-H) representan, las entalpías de formación de la especie radical, hidrógeno y neutra formado por la eliminación de un enlace C-H. El átomo de hidrógeno presentó un valor de energía de 0.0830298 Hartrees, calculado al mismo nivel de teoría (uPM6) mostrados en el Anexo 1.

Por otra parte, los valores de densidad de espín (DE) corresponden a la probabilidad de localización del electrón desapareado en la molécula. De los radicales que presentaron actividad antioxidante por el ensayo experimental de DPPH se generó los orbitales que muestran la distribución de densidad de espín, los mismos que ponen en evidencia los átomos de la estructura radicalaria donde se produce la deslocalización electrónica.

Finalmente, se correlacionó los valores EC50 (µM) y la entalpía de disociación de enlace EDE (kJ mol -1) de los compuestos que presentaron actividad antioxidante, respecto a Trolox.

A continuación se detalla el cálculo de la EDE para los compuestos que

presentaron actividad antioxidante.

𝑬𝑫𝑬𝑵𝟑 𝑯𝒇 𝑴 + 𝑯𝒇 𝑯 − 𝑯𝒇 𝑴 − 𝑯 [4]

𝐸𝐷𝐸_𝑁3 − 36,5924443 + − ,5 2257 − − 37.228855 2 = 0,134154

EDE N3 = 0,134154 Hartree EDE N3 = 352,221 kJ/mol

𝑬𝑫𝑬_𝑵𝑶𝟐 𝑯_𝒇 𝑴 + 𝑯_𝒇 𝑯 − 𝑯_𝒇 𝑴 − 𝑯

𝐸𝐷𝐸𝑁𝑂2 − 77.5 66 235 + − ,5 2257 − − 78. 67 75 4 = 0,158216

12

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los valores experimentales se ajustaron con funciones de regresión no lineal, y los resultados se compararon con los determinados utilizando el agente antioxidante de referencia Trolox. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

2.4.1. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR

TRATAMIENTOS DE

3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA

La Tabla 1 muestra los resultados del análisis de varianza de un factor para los datos experimentales de absorbancia. Se compararon los valores medios de absorbancias para los 4 diferentes niveles de concentraciones. La prueba-F en la tabla ANOVA permite determinar, si hay diferencias

significativas entre las medias.

Fuente Suma de Cuadrados

Gl* Cuadrado Medio

Razón-F Valor-p

Entre grupos

0.00237 3 0.00079 15.88 0.010

Intra grupos 0.000398 8 0.00004975

Total (Corr.) 0.002768 11 *Gl: grados de libertad

En vista que el valor-p de la prueba-F es menor que 0.05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de absorbancias, con un nivel del 95.0 % de confianza. Para determinar cuáles son las concentraciones significativamente diferentes, se realizó una prueba de significación de Tukey, se seleccionó esta prueba debido a que el proceso aún no es estandarizado y se lo realizó a baja escala.

Donde el valor F es una estrategia para poner a prueba la hipótesis de igualdad de medias, refleja el grado de parecido entre las medias que se están comparando. Si la hipótesis nula es verdadera, la relación será alrededor de 1 (Pérez López, 2005).

13 El ―valor de p‖ representa una seguridad del 95% que la asociación que estamos estudiando no sea por el azar. Por conceso se ha aceptado un 0.05% de arbitrariedad, es decir, de error (MANTEROLA & PINEDA, 2008)

Los grados de libertad Gl nos describe al espacio e hiperespacios de libertad a través de los cuales una medida de resumen puede moverse y tomar diferentes valores (La Cruz-Oré & Luis, 2013)

2.4.2. PRUEBA TUKEY PARA

3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA

En la Tabla 2 se muestra los resultados de la prueba de Tukey para la 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

M

étodo: 95.0 porcentaje Tukey HSD

Se han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X's en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X's.

La Tabla 3 aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 4 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza.

Concentraciones Casos Media Grupos Homogéneos

1 3 0.2583 X

2 3 0.2663 X

3 3 0.2873 X 4 3 0.2920 X

Contraste Diferencia +/- Límites

1 – 2 -0.008 0.0184359 1 – 3 * -0.029 0.0184359 1 – 4 * -0.0336667 0.0184359

Tabla 2. Tabla prueba TUKEY para la para 3-nitrometil-2-triflurometilcromona

14 * indica una diferencia significativa.

El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que uno o más pares son significativamente diferentes, cuando la diferencia real es igual a 0.

Este análisis estadístico ayuda a identificar cuál es la concentración adecuada para que la cromona presente actividad antioxidante. En este caso la concentración que presenta una mejor respuesta en capacidad antioxidante es la solución con mayor concentración.

2.4.3. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR

TRATAMIENTOS DE

3-AZIDOMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA.

En la Tabla 4 se realizó un análisis de varianza de un factor para los resultados de absorbancia. Se compararon los valores medios de absorbancias para los 4 diferentes niveles de concentraciones. La prueba-F en la tabla ANOVA determina si hay diferencias significativas entre las medias

Fuente Suma de Cuadrados

Gl Cuadrado Medio

Razón-F Valor-p

Entre grupos

0.0124476 3 0.00414919 13.04 0.0019

Intragrupos 0.00254533 8 0.000318167

Total (Corr.) 0.0149929 11

 Gl: grados de libertad

En vista que el valor-p de la prueba-F es menor que 0.05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de absorbancias, con un nivel del 95.0 % de confianza. Para determinar cuáles son las

2 – 3 * -0.021 0.0184359 2 – 4 * -0.0256667 0.0184359 3 – 4 -0.00466667 0.0184359

15 concentraciones significativamente diferentes, se realizó una prueba de significación de Tukey, se seleccionó esta prueba debido a que el proceso aún no es estandarizado y se lo realizó a baja escala.

2.4.4. PRUEBA TUKEY DE 3-AZIDOMETIL-2

TRIFLUOROMETILCROMONA

En la Tabla 5 indican los resultados de la prueba de Tukey, se han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X's en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X's.

Tabla 5. Tabla prueba TUKEY para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona

Método: 95.0 porcentaje Tukey HSD

La Tabla 6 muestra los resultados de aplicar un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 3 pares indica que estos pares de contraste, muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza.

Tabla 6. Tabla prueba TUKEY para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona- diferencia significativa

* indica una diferencia significativa.

El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey.

Tratamientos Casos Media Grupos Homogéneos

A1 3 0.4050 X

A2 3 0.4173 X

A3 3 0.4200 X

A4 3 0.4873 X

Contraste Diferencia +/- Límites

17

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

En la Tabla 7 se muestra un resumen de todos los datos calculados para la determinación de la capacidad antioxidante.

La Ecuación 3 nos indica el cálculo para determinar la concentración molar

, 7 _{25 ,24 ,}

,67 2 2 ,67 ,8 2 25 2 , 42

MTRA

Vfinal bco DPPH

(l

mtra/...) Absorbancia (515 nm) %

DPPH mM y=a+bx desviación 1/2 Abs EC50 1/EC50

gr

cromona (abs) (l) (ml) (/ml

DPPH) 1 2 3 prom cons. x µM

(l mtra/mlDPPH) (g cromonaj) 1/g cromona C-NO2

10 0,0107 0,963 220 1 220 0,262 0,260 0,253 0,2583 73,17 0,63 460 0,01586305 1726,761453 1,85E-03 541,2325 10 0,0107 0,963 200 1 200 0,273 0,274 0,252 0,2663 72,34 0,578

10 0,0107 0,963 180 1 180 0,290 0,290 0,282 0,2873 70,16 0,515 10 0,0107 0,963 160 1 160 0,293 0,291 0,292 0,2920 69,68 0,458

C-N3

10 0,0085 0,963 120 1 120 0,404 0,376 0,435 0,4050 57,94 0,3811 59 0,036918727 1088,826135 9,26E-04 1080,494 10 0,0085 0,963 80 1 80 0,414 0,413 0,425 0,4173 56,66 0,2540

10 0,0085 0,963 60 1 60 0,421 0,418 0,421 0,4200 56,39 0,1905 10 0,0085 0,963 40 1 40 0,509 0,475 0,478 0,4873 49,39 0,1270

Trolox

10 0,0017 0,969 80 1 80 0,103 0,104 0,104 0,1037 89,30 0,042 8,3 0,097707665 254,847764 4,33E-05 23081,83 10 0,0017 0,969 60 1 60 0,167 0,161 0,169 0,1657 82,90 0,032

10 0,0017 0,969 40 1 40 0,217 0,218 0,226 0,2203 77,26 0,0214 10 0,0017 0,969 20 1 20 0,357 0,357 0,357 0,3570 63,16 0,0107

18 Se evaluó una serie de cromonas con diferentes sustituyentes, se evaluó su capacidad para capturar el 2,2-difenil-1-picrilhidracil (DPPH), y determinar su actividad para secuestrar radicales libres. La actividad antiradicalaria para los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, con sustituyentes nitro y azida en posición del anillo cromona presentaron los valores de EC50 mostrados en la Tabla 8.

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE 1/EC50

Nombre Molécula 1/g cromona

3-nitrometil-2-triflurometilcromona NO2 541.2325

3-azidometil-2-trifluorometilcromona N3 1.080.494

Trolox Trolox 23081.83

Los valores medios de la concentración efectiva y de la desviación estándar se representan para cada molécula con una concentración conocida obtenida a partir de experimentos independientes llevados a cabo por triplicado.

Los valores EC50 se calcularon a partir de cada curva como la concentración efectiva capaz de reducir 50 % de DPPH. La Figura 6, muestra los resultados obtenidos para los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, con sustituyentes NO2 y N3 en contraste con trolox. En el caso de Días (2011) se realizó un procedimiento similar, con un tiempo de estabilización de 20 minutos, determinando el porcentaje de DPPH para cada compuesto y cada concentración, los compuestos reaccionaron de diferente forma y algunos no presentaron reducción de radicales DPPH, lo que indica que el centro de cromona es importante pero no es el único responsable de la capacidad secuestrante de radicales libres (Dias et al., 2011).

Según el estudio realizado por Sharma (2011), se comparó la actividad antioxidante de un grupo de cromonas con medicamentos estándar utilizados en el tratamiento de hongos. Los resultados arrojan resultados más prometedores para el grupo de cromonas, incluso mejor que los fármacos, este ensayo se lo realizó por el ensayo de DPPH, mostrando capacidad antioxidante a una concentración de 1mg/ml.

Por otra parte, se calculó el porcentaje de DPPH (Tabla 7) utilizado en la soluciones para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona y la

19 trifluorometilcromona. La actividad antioxidante mostró un perfil dependiente del tiempo y de cada nivel de concentración de cromona.

El DPP H mue stra un máxi mo de

absorción típico a

515 nm, que desaparece tras la reducción a la correspondiente hidrazina (DPPH2). Este ensayo colorimétrico se utiliza comúnmente para establecer relaciones estructura-actividad.

En primer lugar se determinó el tiempo de estabilización para la reducción del DPPH, las Figuras 7 y 8 muestran la cinética de estabilización de los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona. La decoloración de la mezcla de DPPH con la solución de cromona se realizó en estado estacionario y se comprobó que el tiempo para que se estabilice el DPPH era de 8 horas para los dos moléculas que mostraron actividad antioxidante, de las 13 cromonas estudiadas.

Figura 6. Capacidad Antioxidante DPPH

0 500 1000 1500 2000 2500 3-nitrometil-2-triflurometilcromona 3-azidometil-2-trifluorometilcromona TROLOX 1 /E C 5 0 Móleculas

20

0,4 0,5 0,6 0,7

9:36 12:00 14:24 16:48

Ab

so

rb

an

ci

as

Tiempo

Cinética de estabilización de C-NO

Figura 7. Cinética de estabilización de 3-nitrometil-2-triflurometilcromona.

Figura 8. Cinética de estabilización de 3-azidometil-2-trifluorometilcromona.

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

9:36 10:48 12:00 13:12 14:24 15:36 16:48

Ab

so

rb

an

ci

as

Tiempo

21 Figura 9. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante del compuesto 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

y = 0,0633x + 59,304 R² = 0,942

68 69 70 71 72 73 74 75

160 170 180 190 200 210 220

% D P P H µl cromona

Compuesto C-NO

3.1.1. CURVAS DOSIS-RESPUESTA PARA LA CAPACIDAD DE CAPTACIÓN DPPH DE

3-NITROMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA.

Las curvas dosis-respuesta correspondientes para los compuestos antiradicales más eficaces se muestran en las Figuras 9 y 10 junto con trolox (Figura 11) como control. Muestran una relación de proporción directa entre los microlitros de cromona agregada y el porcentaje de DPPH cosumido.

Figura 10. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante del compuesto 3-azidometil-2-trifluorometilcromona

y = 0,0903x + 48,321 R² = 0,6385

48 50 52 54 56 58 60

30 50 70 90 110

% D P P H µl cromona

22 Figura 11. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante de trolox

y = 0,4204x + 57,138 R² = 0,9487

60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00

20 30 40 50 60 70 80 90

%

D

P

P

H

µl de cromona

TROLOX

La Figura 10 una curva de calibración para el compuesto 3-azidometil-2-trifluorometilcromona con un bajo valor del coeficiente de determinación (R2 = 0.639). Por lo tanto, los datos no se ajustarían a la respuesta directamente proporcional de una ecuación lineal. Sin embargo, el aumento de niveles de microlitros de cromona (µl) incrementaría el tamaño de la muestra corregiendo la repuesta lineal (Restrepo & González, 2007).

Los dos compuestos que mostraron actividad antioxidante (Figura 4) presentaron como caracteristica en común al grupo CF3 en la posición 2 del anillo cromona y sustituyentes electroatrayentes específicos como el grupo funcional nitro y azido, que favorecen la actividad antioxidante.

El procedimiento experimental realizado asegura un análisis reproducible y fiable de los datos, ya que las condiciones se mantienen constantes para cada evaluación de barrido de radicales y los resultados se interpretan de acuerdo a parámetros calculados relevantes para la capacidad antioxidante.

3.2.

ENTALPIA DE DISOCIACIÓN DE ENLACE

23

Compuesto Método uPM6*

(EDE/kJ mol-1)

3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona 246.5 3-azidometil-2-trifluorometilcromona 280.7 3-ftalimidoilmetil-2-trifluorometilcromona 297.5 3-cianometil-2-trifluorometilcromona 313.1 3-bromometil-2-clorodifluorometilcromona 316.3 3-metil-2-pentafluoroetilcromona 316.7 2-clorodifluorometil-3-metilcromona 317.3 6-cloro-3-metil-2-trifluorometilcromona 317.9 2- diclorometil-3-metilcromona 318.2 3-bromometil-2-trifluoroometilcromona 319.8 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona 331.4 2-difluorometil-3-metilcromona 345.4 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona 570.7

Trolox 131.1

* Método de capa cerrada uPM6.

Los valores de EDE de todas las moléculas estudiadas se obtuvieron utilizando modelos de capa abierta con el nivel de teoría semi-empírico PM6 (Stewart, 2007). Cuanto menor es la EDE, mayor es la capacidad de donar un átomo H de un grupo, dando lugar a un radical estable, que deslocaliza el electrón desapareado alrededor del sistema conjugado que posea la molécula, favoreciendo el proceso de actividad anti-radicalario (Dias et al., 2011). El detalle del cálculo de la energía de disociación de enlace C-H, determinado por el método de capa abierta uPM6 se detalla en el Anexo 1. Por otra parte, la Tabla 10 muestra los resultados de la EDE y potencial de ionización (PI) calculados para los compuestos que presentaron actividad antioxidante.

La aplicabilidad de métodos PM6 implementados en el modelado de la actividad antioxidante o anti-radicalaria de flavonoides, muestra que la entalpía de disociación de enlace (EDE) de los grupos -OH podría calcularse mucho más rápido con el método semiempírico PM6 y con una calidad similar a los métodos de la Teoría del Funcional de la Densidad (DFT) (Amić & Lučić, 2010). Por lo tanto, los cálculos de la EDE mostrados en la Tabla 9, presentan un buen grado de confiabilidad, que permite inferir tendencias generales y correlaciones entre los resultados de capacidad antioxidante determinados por el ensayo DPPH y valores teóricos de la EDE.

Sin embargo, con la finalidad de verificar la tendencia determinada con el método semiempírico uPM6, se desarrolló para los compuestos 5 (C-N3) y 11 (C-NO2) que mostraron actividad antioxidante, un cálculo de la EDE con

24 un nivel de teoría más sofisticado uB3LYP/6-311++ g (d,p). La Tabla 10 muestra los resultados de la EDE (kJ/mol) y presentan una tendencia similar entre los métodos estudiados.

Compuesto

Método

uB3LYP/6-311++ g (d,p)

P. I.* (kcal/mol) (EDE/kJ mol-1)

3-nitrometil-2-trifluorometilcromona 352,221 175,7

3-azidometil-2-trifluorometilcromona 415,396 165,9

* P.I.: Potencial de ionización determinado con el método uB3LYP/6-311++ g (d,p).

La EDE permite inferir en la capacidad de la potencial molécula antioxidante de donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable, el cual dependiendo de sus características estructurales podría deslocalizar la carga, favoreciendo procesos de actividad secuestrante de radicales libres, por lo tanto de acuerdo a los resultados obtenidos se puede observar que el valor de EDE del compuesto 11 con el sustituyente nitro es menor que el compuesto 5 con el sustituyente azida. Los resultados de EDE son respectivamente 352,2 y 415,4 kJ/mol respectivamente. Este resultado sugiere una mayor facilidad de la3-azidometil-2-trifluorometilcromona para donar un átomo de hidrógeno que la 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

En cuanto al valor del potencial de ionización (P.I.) se define de manera general como la energía necesaria para sustraer un electrón de un sistema en equilibrio. Por tanto, el P.I. presenta relación con la energía del orbital HOMO, siendo el orbital HOMO el orbital molecular ocupado de más alta energía. Por lo tanto, una eficiente atracción de carga requiere que el P.I presente un valor bajo de energía, resultando concordante el valor menor de 175,7 kcal/mol de la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, respecto al valor de P.I. de 165,9 kcal/mol de 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

La Figura 12 a – b, muestran las especies radicalarias más estables calculadas, de los compuestos que presentaron actividad antioxidante. Se observa deslocalización electrónica desde el enlace doble C2-C3 del anillo 4-pirano hacia los grupos electroatractores, azida (-C-N3) y nitro (-C-NO2). Asimismo, la densidad de espín mostrada en las figuras 12 c – d, de los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, localiza orbitales sobre los átomos en los cuales se deslocaliza el electrón desapareado del radical. Se puede inferir que la coplanaridad observada entre el sustituyente –CH-N3 y el anillo cromona en

25 el radical formado del compuesto 3-azidometil-2-trifluorometilcromona favorece el eficiente traslape de orbitales p, que contribuyen a una mejor deslocalización del electrón a lo largo de los enlaces conjugados.

Se sugiere que la planaridad del sustituyente –CH-N3 favorece una mayor eficiencia para deslocalizar el electrón en la especie radicalaria, estando correlacionada la relación de estructura con el comportamiento antioxidante. Como puede notarse el radical del compuesto 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona, no muestra el grupo CH-NO2 en el mismo plano del núcleo estructural cromona.

Criterios estructurales para la actividad antioxidante de flavonoides que presentan una cercanía estructural con los compuestos estudiados en la presente tesis, muestran una alta dependencia con su estructura química, donde planaridad y conjugación extendida π, a lo largo de los anillos muestra una marcada influencia en la capacidad antioxidante (Amic et al., 2007).

La distribución de la densidad de espín en las especies de radicales, se correlacionan con los valores calculados de energía de disociación de enlace EDE. Los zonas de color azul y verde muestran los orbitales donde se deslocaliza el electrón del radical, el compuesto con el sustituyente azida (N3) presenta mayor conjugación alternada π, respecto al grupo nitro (NO2)

Figura 12. Especies radicalarias de 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (a) y 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona (b).

(a) (b)

26 para deslocalizar el electrón. Esta observación se condice con la mejor capacidad antioxidante y un valor de EDE menor para la cromona con el sustituyente electro-atractor metilazida (-CH2N3) en posición 3 del heterociclo cromona.

De las 13 cromonas estudiadas, el radical de 3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona, es el que presenta menor valor de EDE mientras que el radical de 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona es el que presenta mayor valor de EDE.

27

4.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1. CONCLUSIONES

 Se evaluó las propiedades antioxidantes de 13 cromonas haloalquil sustituidas, de las cuales dos mostraron actividad antioxidante, 3-azidometil-2-trifluorometilcromona y 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

 Se realizó cálculos teóricos químico cuánticos, utilizando modelos semi-empíricos PM6 para determinar la energía de disociación de enlace (EDE) de las especies radicalarias. Sin embargo del conjunto de moléculas estudiadas (1 - 13), el estudio teórico de EDE con el método semiempírico uPM6 no permite inferir que a menor valor de EDE existiría una mayor capacidad antioxidante.

 Las cromonas que presentaron actividad antioxidante, presentan sustituyentes nitrometil (-CH2NO2) y azidometil (-CH2N3) en posición 3 y el grupo trifluorometilo (-CF3) en posición 2. Estos rasgos estructurales relevantes evidencian la influencia de los sustituyentes electroatractores mencionados, en el comportamiento químico y actividad antioxidante observada. Se mostró los sitios de deslocalización a lo largo del anillo cromona y sustituyentes utilizando los mapas de distribución de densidad de espín.

 Los resultados del presente trabajo permiten inferir una relación estructura-actividad diferente a los observados en diversos derivados de flavonoides. La capacidad antioxidante observada en este grupo de compuestos muestra una marcada influencia de los sustituyentes electroatractores nitro y azida en posición 3 del anillo cromona y se infiere que la coplanaridad y conjugación π, del sustituyente en el radical favorece en gran medida la deslocalización del electrón a lo largo del sistema conjugado.

28

4.2.

RECOMENDACIONES

 Para continuar con el estudio de actividades biológicas de los compuestos analizados, se recomienda realizar un posterior ensayo de toxicidad de los compuestos que presentaron capacidad antioxidante, con el objetivo de poder utilizar este tipo de cromonas en la industria de alimentos.

29

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6. ANEXOS

32

ANEXO 1

Cálculo de uPM6

𝐸𝐷𝐸𝑁3 − . 577948 + . 83 298 − − . 8 6722 = 0,1069072

EDE N3 = 0,1069072 Hartree EDE N3 = 280,7 kJ/mol

𝑬𝑫𝑬_𝑵𝑶𝟐 𝑯_𝒇 𝑴 + 𝑯_𝒇 𝑯 − 𝑯_𝒇 𝑴 − 𝑯

𝐸𝐷𝐸𝑁𝑂2 − .266857 + . 83 298 − − .3 427 = 0,1262154

33

ANEXO 2

Imágenes del trabajo experimental realizado en el

laboratorio

Medición de absorbancias de las nuevas cromonas

Segundo grupo de soluciones de cromonas